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Estadstica de los ensayos de toxicidad

Dra. Leda Giannuzzi Ctedra de Toxicologa

Introduccin Segn Repetto (1997), el conocimiento de la toxicidad de las sustancias slo puede conocerse (aparte de las previsiones tericas) por los estudios retrospectivos de casos de intoxicacin y por la experimentacin con plantas y animales. La experimentacin con seres humanos se realiza nicamente en contadas ocasiones debido a sus implicaciones ticas y legales. El uso de animales de experimentacin para la determinacin de la dosis letal hoy da est siendo reorientado debido a la presin de las asociaciones protectoras de animales y a una mayor sensibilizacin por parte de la sociedad. Se emplean menos animales, las tcnicas de ensayo se han refinado para provocar menos sufrimiento y para optimizar la cantidad de informacin extrada de la experiencia. Los requerimientos de las Good Laboratory Practices son de obligado cumplimiento si queremos asegurar la calidad de los resultados obtenidos experimentando con animales. Pero no nos podemos detener ms en los protocolos de toxicologa experimental con animales, sino adentrarnos en las tcnicas estadsticas que nos permitan establecer algunos parmetros del ensayo de toxicidad y su intervalo de confianza.

Ensayos de toxicidad con animales. Establecimiento de la LD50. Todas las sustancias son txicas cuando se administran a dosis convenientemente altas. Para que una sustancia que posea efectos farmacolgicos pueda utilizarse como medicamento, es preciso que su actividad tenga lugar con dosis exentas de toxicidad. Adems de la toxicidad, hay que considerar tambin la especificidad de la accin farmacolgica. Los ensayos de toxicidad acompaan a los del establecimiento de la actividad en el curso de la investigacin de nuevas sustancias qumicas. La toxicidad puede apreciarse de diversas maneras, siendo la determinacin de la toxicidad aguda el ensayo ms corriente. Esta determinacin permite apreciar los sntomas de intoxicacin y la dosis txica: * Dosis mnima mortal * Dosis Letal 50 (LD50) Como los efectos txicos no se muestran a menudo ms que despus de una larga estancia en el organismo, los ensayos de toxicidad crnica efectuados con animales se hacen cuando la sustancia qumica presenta un inters teraputico. Por ltimo existen riesgos teraputicos que no se manifiestan en estos ensayos de toxicidad y que son objeto de ensayos especiales: evaluacin de efectos teratognicos, carcinognicos y mutgenos. Como ya hemos dicho, en el estudio de la toxicidad aguda hay algunos trminos que definir: La dosis letal 50 (LD50) corresponde a la dosis capaz de acabar, en condiciones determinadas, con la vida de la mitad de los animales (de una misma especie) sometidos a la experiencia. Esta determinacin se basa en la evaluacin de respuestas de todo nada: muerte o supervivencia del animal.

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Como es imposible obtener de manera inmediata el 50% de muertes a partir de un nico grupo, el mtodo consiste en experimentar con 5 6 lotes de 10 a 20 animales a los cuales se administran dosis crecientes de la sustancia a ensayar, de manera que el porcentaje de mortalidad vare entre 0-100%. El procedimiento para estimar la LD50 con su tolerancia fue propuesto hace ms de setenta aos por Trevan (1927) y consiste en transformar la relacin obtenida entre el % de mortalidad y la dosis en una relacin final lineal que permita interpolar la dosis que corresponde al 50% de mortalidad. Podemos considerar una serie de pasos: (a) Representar el % de mortalidad frente al logaritmo de las dosis correspondientes (Curva de Trevan), pues la distribucin de frecuencias que se construye despus parece ajustarse mejor a la log-normal que a la normal.

La curva obtenida es sigmoidea y se aproxima al 0% de mortalidad con dosis bajas y al 100 % con dosis altas. La dosis soportada por todos los animales es la LD0 (dosis mxima tolerada), la dosis ms pequea que mata a todos los animales es la LD100.

(b) La curva sigmoidea de Trevan es una curva de frecuencia acumulativa y una integral de la curva de Gauss, en la que puede transformarse fcilmente. El resultado es un histograma de frecuencias (no acumulativas), donde la frecuencia de mortalidad (%) se expresa ahora como el % de los animales que mueren a cada dosis menos el % de los mismos que murieron a la dosis inmediatamente inferior.

El histograma resultante representa una curva log-normal en la cual la frecuencia ms alta de animales que responden aparece a dosis intermedias, con relativamente pocos animales que respondan a dosis altas o bajas. La razn de este hbito es la diferente susceptibilidad entre individuos dentro de una poblacin (variacin biolgica). En una poblacin normalmente distribuida (la distribucin log-normal lo que significa es que, al tomar logaritmos la hacemos normal), tenemos dos parmetros fundamentales: la medida de la localizacin del valor representativo o ms probable del conjunto y la medida de la dispersin del conjunto de datos. Una estimacin adecuada para el valor ms probable sera la media de las dosis (--sus logaritmos--), y para la dispersin, la desviacin estndar (SD)

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que puede tomarse como la magnitud que mide la distancia desde la media a cualquiera de las dos inflexiones de la curva (simtrica) segn nos ensea la teora.

El rea de la curva limitada por la media 1SD contiene un 68% de la poblacin; para la media 2SD y 3SD llegamos a un 95 y un 99.7% de la poblacin. As, siempre podemos relacionar el valor de la frecuencia de mortalidad como un nmero de veces la SD (positivo o negativo) contando desde la media (NED = Normal Equivalent Deviations). Como existe una relacin entre la curva de Trevan (curva de frecuencia acumulativa) y la de Gauss (curva de frecuencia no acumulativa) siempre ser posible expresar el % de mortalidad en unidades NED. Por ejemplo, est claro que el mximo de la curva de Gauss corresponde a la inflexin de la curva de Trevan. Como esta inflexin corresponde al 50% de mortalidad, para un 50%, NED = 0 (pues la media, el mximo de la curva de Gauss, es el origen de medidas de la NED). Se demuestra fcilmente que un 16% de mortalidad corresponde a NED = -1 y un 84% a un NED = +1. En 1934, Bliss sugiri que las unidades NED deberan convertirse siempre en nmeros positivos sumndoles 5. A estas unidades se les llaman Probits (de la contraccin de probability units) y la construccin es tan fcil como se indica en la Tabla 1:

Tabla 1: Relacin entre % Mortalidad, NED y Probits % de Mortalidad NED Probit

0.1 -3 2 2.3 -2 3 15.9 -1 4 50.0 0 5 84.1 1 6 97.7 2 7 99.9 3 8

Pero para el caso de convertir cualquier valor de % de mortalidad en unidades probit es mejor emplear la tabla de doble entrada publicada por Finney (1971):

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Tabla2.- Conversin de % de mortalidad en Probits

De este modo es muy sencillo pasar de % de mortalidad a probit: un 42% es equivalente a 4.80 probits (mirar en la interseccin de la fila 40 y la columna 2).

(c) Una vez que el % de mortalidad se ha convertido en probits y se representa frente al logaritmo de la dosis, se obtiene una lnea recta. Lo que ocurre con la transformacin es que ajustamos los datos de mortalidad a una supuesta poblacin de distribucin normal y el resultado es una lnea recta. De la ecuacin de la recta interpolamos el valor de la LD50 como el valor de la dosis correspondiente a un % de mortalidad de 5 probits.

Para establecer una tolerancia del valor calculado de LD50, el mtodo ms sencillo es el procedimiento originalmente grfico de Miller y Tainter (1944), que consiste en evaluar los log-dosis correspondientes a los % de mortalidad para 6 y 4 probits y calcular la SD de la LD50 como:

SD = (dosis 6 probit dosis 4 probit) / 2

Lo cual es razonable ya que 6 probit = +1SD y 4 probit = -1SD y por lo tanto,

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SD = (1SD (-1SD))/n (trasladados ahora a los datos de dosis), donde n es el nmero total de animales utilizados en el experimento

Ejemplo ilustrativo: Estudio de la toxicidad del sulfato de estricnina por va subcutnea en ratones. Este ejemplo est tomado de Wepierre (1981). Consiste en aplicar los ensayos de toxicidad para evaluar el valor LD50 y su tolerancia. Para ello disponemos de los datos de la Tabla 3:

Tabla 3.- % de mortalidad vs dosis de sulfato de estricnina log dosis x 10 Dosis

(mg/Kg) N de animales N muertes % mortalidad

0.84 0.7 20 0 0 0.95 0.9 20 1 5 1.08 1.2 20 8 40 1.18 1.5 20 15 75 1.30 2.0 20 19 95 1.41 2.6 20 20 100

Lo primero es obtener la curva de Trevan representando el % de mortalidad frente al log de la dosis. En este caso el autor multiplica por 10 las dosis para evitar manipular datos negativos. Esto no importa si los cambios se deshacen al final.

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Usando la Tabla 2, calculamos los probits correspondientes y obtenemos: % mortalidad

% 0 5 40 75 95 100

Probit 2.5* 3.36 4.75 5.67 6.64 17.5*

* En el caso de 0 y 100% de mortandad, cuyos probits se disparan al infinito, pueden reemplazarse segn el autor por 50/n y (n-(50/n)) siendo n el numero de animales por lote. En nuestro caso, tendremos 50/20 = 2.5 y 20 - (50/20) = 17.5

No obstante, se observa fcilmente que el primer y el ltimo punto, correspondientes a estos valores, se desvan notoriamente del comportamiento lineal. Si se emplean los 4 puntos restantes obtenemos:

% mortalidad (probits) = -5.46 +9.371 log (dosis x 10)

La DL50 corresponde al 50% de mortalidad, es decir 5 probits, lo cual nos da log (dosis x 10) = 1.116, y por lo tanto, dosis = LD50 = 101.116 /10 = 1.31 mg/Kg. La tolerancia la evaluamos por el mtodo de Miller y Tainter, es decir buscamos los valores de las dosis que producen un 16% (4 probits) y 84% (6 probits) de mortalidad: log (dosis x 10) = (4+5.46)/9.371 = 1.009; dosis (4 probit) = 1.022 log (dosis x 10) = (6+5.46)/9.371 = 1.223; dosis (6 probit) = 1.671 SD (LD50) = (1.671-1.022)/100 = 0.06; por tanto,

LD50 = 1.3 0.06 mg/Kg

Todos los clculos pueden hacerse grficamente en un tipo de papel probit-logartmico como indica el autor.

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Bibliografa Bliss, C.I. The method of probits, Science 1934, 79, 38-39. Finney, D.J. Probit analysis: A statistical treatment of the sigmoid response curve. Cambridge University Press, London, 1971. (pag. 25). Miller, L.C. & Tainter, M.L. The estimation of ED50 and its error by means of logarithmic-probit graph paper. Proceedings of the Society of Experimental Biology (NY) 1944, 57, 261-264. Repetto, M. Toxicologa Fundamental. 3 edicin, Daz de Santos, Madrid, 1997. Trevan, J.W. The error determination of toxicity. Proceedings of the Royal Society, Series B 1927, 101, 483-514. Wepierre, J. Abrg de pharmacologie gnerale et molculaire, Masson et Cie, Paris, 1981.

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FUNDAMENTOS DE TOXICOLOGIA EXPERIMENTAL

Cuestionario

1) Discuta conceptualmente cul es la importancia de las relaciones dosis respuesta en el campo de la toxicologa.

2) (a) Qu clase de respuestas debe ser provocada por una sustancia txica en un organismo para que pueda determinarse su toxicidad? (b) Qu tipo de coordenadas se utilizan en las curvas de toxicidad? Por qu deben utilizarse las mismas?

3) (a) Defina los siguientes parmetros: DE, DE50, DL5o. DL100 CL50 y TV50. (b)Cmo determina el parmetro DL50 en animales de exposicin y en seres humanos

4) En el marco del estudio de la droga A para su potencial empleo a nivel teraputico, se obtuvieron las siguientes curvas dosis - efecto.

(a) Cul de las dos curvas corresponde a la DL y cul a la DE? (b) Indique si la sustancia A puede considerarse o no segura. (c) Las curvas deben ser de la misma especie o no necesariamente?

5) En una planta de sntesis orgnica se han obtenido tres pesticidas (A, B, C) con costos equivalentes en lo que se refiere a su produccin. Las curvas dosis/respuesta se presentan a continuacin:

% de

in

div

idu

os

Dosis

A

B

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a) en virtud de dicha informacin, qu sustancia elegira para su incorporacin al mercado? b) Cmo modificarla su respuesta a la pregunta anterior en los siguientes casos: c) (i) Coeficiente de selectividad = CS CS= DL50vertebrados / DL50 Insectos (ii) El pesticida A se degrada ms rpidamente por accin de la luz solar y el objetivo es aplicarlo a cultivos de cereales. (iii) Los plaguicidas A y B son altamente persistentes y provocan trastornos neurolgicos severos en mamferos.

6) Los siguientes datos de mortalidad se obtuvieron en un estudio de toxicidad aguda. Calcular la DL50, el SE de DL50 y la pendiente de la curva dosis - respuesta.

Dosis (mg/Kg) 1 2 4 8 16 32 Mortalidad 0/10 1/10 3/10 4/10 7/10 10/10

7) En un estudio realizado sobre la sustancia X se obtuvo la siguiente curva dosis - respuesta:

Que modificaciones pueden registrarse en dicha figura contemplando las siguientes situaciones:

% de

le

talid

ad

Dosis

A B

C

Dosis

% de

in

div

idu

os

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a) presencia de una sustancia que facilita la absorcin de X b) presencia de una sustancia que facilita la metabolizacin de X en un

producto fisiolgico no activo c) Presencia de una sustancia sinergista.

Considere en todos los casos que no se modifica el mecanismo de accin de X. Justifique su respuesta en cada caso.

8) Estudio de la toxicidad del clorhidrato de cocana. Fabre, R. & Truhaut, R. Toxicologa (1976).

En este caso el nmero de animales por lote es diferente, pero no importa. Los valores de probits correspondientes al 0 y 100% de la mortalidad no se calculan y se estudia la recta con los restantes 4 puntos. Establzcase la LD50 con su intervalo de confianza. a) Cmo se obtiene la curva de Trevan? b) Cmo se obtendra la curva de Gauss (histograma no acumulativo) a partir de los datos de la curva de Trevan?