funktion der deacetylase sirt2 in neurodegenerativen...

Funktion der Deacetylase SIRT2 in neurodegenerativen

Erkrankungen

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH

Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der

Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Biologin

Daniela Otten

aus Stolberg

Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Bernhard Lüscher

Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Werner Baumgartner

Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2012

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Zusammenfassung

Die Acetylierung und Deacetylierung von Proteinen ist ein unverzichtbarer Bestandteil

der zellulären Homöostase, welche durch die Aktivität von Histonacetyltransferasen

(HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) aufrechterhalten wird. In neurodegenerativen

Erkrankungen ist diese Balance in den Nervenzellen häufig gestört. Um die Zell-

physiologie wieder ins Gleichgewicht zu bringen, wurde in den letzten Jahren vermehrt

der Einsatz von HDAC-Inhibitoren als potenzielle Therapeutika erforscht.

Aufgrund seiner vielfältigen Funktionen und Interaktionspartner im Zellkern und

Zytoplasma ist unter anderem die Klasse III Histondeacetylase SIRT2 in den Fokus der

wissenschaftlichen Untersuchungen gerückt. Das Enzym kann die Gentranskription

beeinflussen und über zytoplasmatische Substrate beispielsweise die Dynamik des

Zytoskeletts regulieren. SIRT2 kommt vermehrt im zentralen Nervensystem vor,

weshalb es im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen besonders

interessant ist.

Viele solcher oft altersassoziierten Erkrankungen, wie die Parkinson-, die Alzheimer-,

oder die Huntington-Krankheit, werden von der Bildung intrazellulärer Protein-

aggregate begleitet. Aus diesem Grund spielen in ihrer Pathogenese neben

transkriptionsbedingten Veränderungen auch die Mechanismen des zellulären

Proteinumsatzes eine entscheidende Rolle.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von SIRT2 auf die Pathologie der

Huntington-Krankheit näher untersucht. Der Knockdown der Deacetylase führte zu einer

Reduktion von sich bildenden Huntingtin-Aggregaten im Zellkulturmodell, welche

zudem von einem Rückgang der Zellsterblichkeit begleitet war. Darüber hinaus

begünstigte eine verminderte SIRT2-Expression einen beschleunigten Proteinumsatz

durch die Autophagie, ein Prozess, über welchen bevorzugt größere Strukturen und

Organellen degradiert werden. Die Überexpression von SIRT2 oder verschiedenen

Mutanten des Proteins hatte im Gegenzug keine Auswirkung auf die Huntingtin-

induzierte zelluläre Toxizität oder die Anzahl an Aggregaten. Dies indiziert, dass im Falle

der Huntington-Krankheit und eventuell auch weiteren neurodegenerativen

Erkrankungen weniger die katalytische Aktivität von SIRT2, als die Anwesenheit des

Proteins von Bedeutung ist. Dieses Ergebnis konnte auch in getesteten Drosophila-

Modellen bestätigt werden.

Summary

The acetylation and deacetylation of proteins is an essential component of cellular

homeostasis which is maintained by the activity of histone acetyltransferases (HAT’s)

and histone deacetylases (HDAC’s). In neurons affected by degenerative diseases this

dynamic equilibrium is often disrupted. Hence in the recent years HDAC inhibitors were

increasingly explored as potential therapeutics to restore cell physiology.

Amongst others the class III histone deacetylase SIRT2 was brought into focus of

scientific research due to its multiple functions and interaction partners in cell nucleus

and cytoplasm. For instance it can regulate gene transcription and influence

cytoskeleton dynamics. SIRT2 is highly abundant in the central nervous system and thus

it is of special interest regarding neurodegenerative diseases.

Many of these commonly age-related disorders such as Parkinson's, Alzheimer's and

Huntington's disease are accompanied by the formation of intracellular protein

aggregates. For this reason the mechanisms of cellular protein turnover, in addition to

transcriptional changes, are crucial to their pathogenesis.

Within this thesis the impact of SIRT2 on Huntington's disease pathogenesis was

examined. Knockdown of the deacetylase resulted in a reduction of the forming

huntingtin aggregates in cell culture models which was accompanied by a decrease in

cell death. In addition a reduced SIRT2 expression accelerated protein turnover by

autophagy, a degradation process which targets larger structures and organelles

particularly. Overexpression of SIRT2 or various mutants of the protein revealed no

effect on the huntingtin-induced cellular toxicity or the number of aggregates in return.

This indicates that in case of Huntington's disease and possibly other neurodegenerative

disorders not the catalytic activity of SIRT2 is the determining factor, but the presence of

the protein in the cellular system. This result was also confirmed in tested Drosophila

models.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ___________________________________________________________________ 1

1.1 Histone und Histondeacetylasen ____________________________________________ 1

1.1.1 Klasse I und II HDACs in neuronalem Gleichgewicht und Pathologie _______________________ 2

1.2 Die Familie der Sirtuine ____________________________________________________ 4

1.3 SIRT2 __________________________________________________________________ 5

1.3.1 SIRT2 in neuronalen Erkrankungen _________________________________________________ 7

1.4 Neurodegenerative Erkrankungen ___________________________________________ 9

1.4.1 Huntington-Krankheit ____________________________________________________________ 9

1.5 Intrazellulärer Proteinumsatz ______________________________________________ 16

1.5.1 Ubiquitin-Proteasom-System _____________________________________________________ 17

1.5.2 Autophagie ___________________________________________________________________ 18

1.6 Zielsetzung _____________________________________________________________ 21

2 Material und Methoden __________________________________________________ 22

2.1 Material _______________________________________________________________ 22

2.2 Verbrauchsmaterial ______________________________________________________ 22

2.2.1 Chemikalien und Reagenzien _____________________________________________________ 22

2.2.2 Puffer ________________________________________________________________________ 22

2.2.3 Plasmide _____________________________________________________________________ 26

2.2.4 Antikörper ____________________________________________________________________ 27

2.3 Methoden _____________________________________________________________ 30

2.3.1 Arbeiten mit eukaryotischen Zellen ________________________________________________ 30

2.3.2 Arbeiten mit Drosophila _________________________________________________________ 33

2.3.3 Proteinchemische Methoden _____________________________________________________ 35

3 Ergebnisse _________________________________________________________________ 40

3.1 Endogenes SIRT2 in humanen Zelllinien ______________________________________ 40

3.2 Aggregation von Myc-Huntingtin-590 im Zellmodell ____________________________ 41

3.2.1 Filter-Retardation in HEK293 _____________________________________________________ 41

3.2.2 Immunfluoreszenz in SH-SY5Y ____________________________________________________ 46

3.2.3 Acetylierung von Huntingtin-590 __________________________________________________ 46

Inhaltsverzeichnis

II

3.3 Aggregation und Toxizität von GFP-Huntingtin-Exon 1 im Zellmodell ______________ 49

3.3.1 Filter-Retardation in HEK293 _____________________________________________________ 49

3.3.2 Korrelation von Huntingtin-Aggregation und zellulärer Toxizität in HEK293 und SH-SY5Y _____ 50

3.3.3 Einfluss von SIRT2-Überexpression auf Huntingtin-Aggregation _________________________ 56

3.4 Einfluss von SIRT2 auf die Autophagie _______________________________________ 62

3.5 SIRT2 in Drosophila-Modellen zur Neurodegeneration __________________________ 63

4 Diskussion _________________________________________________________________ 68

5 Referenzen _________________________________________________________________ 76

6 Anhang ______________________________________________________________________ 95

6.1 Abbildungsverzeichnis____________________________________________________ 95

6.2 Abkürzungsverzeichnis ___________________________________________________ 96

6.3 Danksagung ____________________________________________________________ 98

6.4 Eidesstattliche Erklärung __________________________________________________ 99

Einleitung

1

1 Einleitung

Histone und Histondeacetylasen 1.1

Als Histone wird eine Gruppe stark basischer Proteine bezeichnet, welche mit der DNA

(DNS, Desoxyribonukleinsäure) zusammen sogenannte Nukleosomen ausbilden.

Gemeinsam mit weiteren Proteinen formen sie somit das Chromatin und daraus

resultierend die Chromosomen [1]. Unterschiedliche strukturelle Umwandlungen an den

Histonen führen zu Veränderungen der Chromatinstruktur und tragen auf diese Weise

zur Steuerung der Gentranskription bei. Die Modifikationen sind vielfältig und können

sich gegenseitig beeinflussen [2]. Neben der Histon-Acetylierung wurden bisher auch

Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Crotonylierung und

ADP (Adenosindiphosphat)-Ribosylierung beschrieben [3, 4]. Die Acetylierung der

Histone an ihren N-terminalen Lysin-Seitenketten ermöglicht den Übergang vom

kondensierten zum geöffneten Zustand des Chromosoms, in dem die DNA für die

Transkription zugänglich ist [5, 6, 7]. Zudem vermittelt sie, zusammen mit anderen

posttranslationalen Modifikationen, die Interaktion verschiedener Proteine mit den

Histon-Enden [8]. Reguliert wird der Acetylierungsstatus über Histonacetyltransferasen

(HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) [9].

Anhand ihrer Phylogenie unterscheidet man vier Klassen von humanen

Histondeacetylasen. Die Klasse I wird als Homolog zum Hefegen Rpd3 (reduced

potassium deficiency 3) definiert. Ihr gehören HDAC1-3 und 8 an, welche im Nukleus

lokalisiert sind. Zur Klasse II gehören HDAC4-7 sowie 9 und 10. Diese Histon-

deacetylasen sind homolog zum Hefegen Hda1 (Histondeacetylase 1) und können

zwischen Nukleus und Zytoplasma pendeln. Zur Klasse III der HDACs, auch Sirtuine

genannt, zählen die Proteine SIRT1-7, benannt nach ihrem Hefehomolog Sir2 (silent

information regulator 2). HDAC11 ähnelt Klasse I und Klasse II Histondeacetylasen,

bildet jedoch eine eigene Klasse [10, 11, 12].

Neben den Histonen gibt es eine Reihe weiterer HDAC-Substrate im Nukleus und

Zytoplasma. Dazu zählen Transkriptionsfaktoren, Importine, Chaperone und Teile des

Zytoskeletts [13, 14]. Die Histondeacetylasen erfüllen daher vielfältige Funktionen,

unter anderem in der Regulation des Zellzyklus und der Zelldifferenzierung sowie der

Einleitung

2

Entstehung von Krebs, in der Apoptose, der Immunregulation und in neuronalen

Prozessen [15, 16, 17, 18]. Aufgrund ihrer breitgefächerten Aufgabengebiete haben sich

die Histondeacetylasen zu vielversprechenden Zielobjekten für therapeutische Ansätze

entwickelt. Aktuell werden eine Reihe von HDAC-Inhibitoren in klinischen Studien

erprobt [19]. In dieser Arbeit soll der Fokus auf dem Einfluss von Histondeacetylasen

auf neurodegenerative Erkrankungen liegen.

1.1.1 Klasse I und Klasse II HDACs in neuronalem Gleichgewicht und Pathologie

Im gesunden Organismus herrscht eine Homöostase zwischen Acetylierung und

Deacetylierung von Proteinen, welche durch die Aktivität von HATs und HDACs

aufrechterhalten wird. Dieses stetige Gleichgewicht ist für ein Zellsystem und seine

normale Physiologie unverzichtbar [20]. In neurodegenerativen Erkrankungen ist diese

Balance in den Nervenzellen häufig gestört. So wurde in Zellkultur- und Maus-Modellen

sowohl der Rückgang von HAT-Aktivität als auch eine gesteigerte HDAC-Aktivität

beobachtet, was im Ganzen zu einer Hypoacetylierung führte [21, 22]. Es liegt nahe,

HDAC-Inhibitoren als potenzielle Therapeutika einzusetzen, um die gestörte Zell-

physiologie wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Dabei müssen jedoch mehrere Dinge

beachtet werden. Die Funktionen der HDACs sind vielfältig, sie unterscheiden sich in

intrazellulärer Lokalisation, Zelltypspezifität und in ihren Substraten. So kann eine

Hemmung der HDACs durch gesteigerte Histonacetylierung allgemein Gentranskription

fördern, aber auch gezielt durch das Wechselspiel mit Transkriptionsfaktoren in die

Expression einer Gen-Gruppe eingreifen [18, 23]. Des Weiteren führt eine gesteigerte

HDAC-Aktivität nicht generell zu zytotoxischen Effekten. Ebenso wurden

neuroprotektive und antiapoptotische Effekte von bestimmten HDACs beschrieben [24,

25]. Bei einer unspezifischen Anwendung von HDAC-Inhibitoren können daher

unerwünschte Nebenwirkungen auftreten. Um eine gerichtete Therapie zu ermöglichen,

ist es das Ziel, spezifische Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl auf die Art der HDAC

und ihrer Interaktionspartner als auch auf das Zielgewebe abgestimmt sind [12, 18, 26,

27].

Wie diverse Studien zeigten, können HDAC-Inhibitoren auf unterschiedliche Weise in

neurodegenerative Prozesse eingreifen. Zum einen sind nukleäre Effekte wichtig, da die

Gentranskription direkt oder indirekt durch Wirkstoffe beeinflusst werden kann.

Daneben gibt es eine Reihe zytoplasmatischer Vorgänge, die ebenfalls beachtet werden

Einleitung

3

müssen. Bei mehreren sogenannten Polyglutaminerkrankungen, welche durch eine

verlängerte Glutamin-Abfolge im krankhaften Gen verursacht werden, wurde eine

reduzierte Histonacetylierung beobachtet. Diese kann durch den Einsatz von HDAC-

Inhibitoren kompensiert werden und somit gegebenenfalls die Zellvitalität steigern [28].

Auf diese Weise wurden bereits Verbesserungen in Modellen der Huntington Krankheit,

der Spinobulbären Muskelatrophie (SBMA), der Dentatorubralen Pallidoluysischen

Atrophie (DRPLA) und der Spinozerebellären Ataxie Typ 3 (SCA3) erzielt [29, 30, 31, 32,

33]. In neurodegenerativen Erkrankungen wie Ischämie, Spinaler Muskelatrophie (SMA)

oder Friedreich-Ataxie konnte die fehlerhafte Expression verantwortlicher Gene durch

HDAC-Inhibitoren ausgeglichen oder die Expression neuroprotektiver Gene gesteigert

werden [34, 35, 36, 37, 38].

Krankheiten wie die Alzheimer- oder die Parkinson-Krankheit werden mit oxidativem

Stress in Zusammenhang gebracht [39, 40]. Auch hier konnten in Modellstudien durch

den Einsatz von HDAC-Inhibitoren positive Effekte erzielt werden. Dabei spielten vor

allem die mitochondriale Funktion, das Inflammasom und die Modulation von

Transkriptionsfaktoren wie Sp1 (specificity protein 1) und dessen Zielgen p21, oder das

Onkogen Myc eine Rolle [23, 41, 42]. Auch in Nagetier-Studien, in denen ein Huntington-

Phänotyp durch oxidativen Stress ausgelöst wurde, zeigten sich Verbesserungen durch

die Gabe von HDAC-Inhibitoren [23, 43].

Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen (darunter die Amyotrophe

Lateralsklerose (ALS) sowie die Alzheimer-, Parkinson- und Huntington-Krankheit)

wurde neben epigenetischen Dysregulationen vor allem das Auftreten von

Proteinaggregaten in den Nervenzellen beobachtet. Aus diesem Grund sind in den

letzten Jahren die Mechanismen des Proteinabbaus als potenzielle Therapieansätze in

den Fokus gerückt. Vor allem der Prozess der Autophagie, über welche bevorzugt

größere Strukturen und Organellen degradiert werden, scheint eine entscheidende Rolle

für das physiologische Gleichgewicht der Zellen zu spielen [44, 45]. Auch hier erfüllen

die HDACs, über zytoplasmatische Substrate wie -Tubulin oder FoxO1 (forkhead-box-

Protein-O1), wichtige Funktionen [46, 47].

Einleitung

4

Die Familie der Sirtuine 1.2

Die Familie der humanen Klasse III HDACs oder Sirtuine besteht aus sieben Homologen

des ursprünglich in Saccharomyces cerevisiae entdeckten Sir2 (silent information

regulator 2). Zunächst als Repressor der Gentranskription identifiziert [48, 49],

erkannte man später die Deacetylaseaktivität des Proteins [50, 51]. Sirtuine (Sir2-artige

Proteine) sind sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten konserviert, man findet sie

in diversen Organismen von Bakterien über Hefen und Pflanzen bis hin zu Säugetieren.

Sie sind an der Regulation wichtiger zellulärer Abläufe beteiligt, unter anderem an

Prozessen des Stoffwechsels, der Zellteilung und des Alterns.

Im Menschen wurden die Sirtuine vor allem mit altersbedingten Erkrankungen wie

Diabetes, kardiovaskulären Störungen, Krebs und Neurodegeneration in Zusammenhang

gebracht, was die Enzymgruppe besonders für klinische Anwendungen interessant

macht [52]. Der positive Einfluss von Sir2 auf den Alterungsprozess wurde für

verschiedene Organismen beschrieben. So verlängerte eine erhöhte Sir2-Expression die

Lebensdauer von Saccharomyces cerevisiae sowie von Caenorhabditis elegans und

Drosophila melanogaster in Abhängigkeit von der Nahrungsaufnahme [53, 54, 55].

Aktuelle Revisionsstudien konnten diese Ergebnisse jedoch nicht bestätigen [56].

Die sieben humanen Sirtuine können in vier phylogenetische Klassen unterteilt werden,

wobei SIRT1 die größte Ähnlichkeit zum Hefehomolog Sir2 aufweist. SIRT1, 2 und 3

bilden Klasse I, SIRT4 Klasse II, SIRT5 Klasse III und SIRT6 und 7 Klasse IV [57, 58].

Allen Sirtuinen gemeinsam ist eine zentrale Domäne von etwa 200-275 Aminosäuren

[57, 59, 60], wohingegen Unterschiede an den C- und N-terminalen Enden ihre

subzelluläre Lokalisation und Funktion bestimmen [61, 62]. Im Gegensatz zu den Zink-

abhängigen HDACs der Klassen I, II und III nutzen die Sirtuine NAD+

(Nicotinamidadenindinukleotid) als enzymatischen Kofaktor [63, 64, 65]. Die Sirtuine1,

6 und 7 befinden sich hauptsächlich im Nukleus. Dort haben sie Einfluss auf genetische

Stabilität, Zellproliferation, Metabolismus und Immunreaktionen [62, 66, 67].

Demgegenüber sind SIRT3, 4 und 5 in den Mitochondrien lokalisiert, wo sie an der

metabolischen Regulation und zellulären Homöostase beteiligt sind [68]. SIRT2 nimmt

eine besondere Stellung unter den Sirtuinen ein. Es ist überwiegend im Zytoplasma zu

finden [69], verlagert sich jedoch während des G2-/M-Phasen-Übergangs des Zellzyklus

in den Zellkern und assoziiert in der Mitose mit den kondensierten Chromosomen [70,

71].

Einleitung

5

Eine solide Deacetylaseaktivität wurde einzig für die Sirtuine 1, 2 und 3 nachgewiesen

[72]. Demgegenüber besitzt SIRT4 die Fähigkeit zur ADP-Ribosylierung [73]. Ferner hat

sich SIRT5 als Regulator der kürzlich entdeckten Lysin-Modifikationen Succinylierung

und Malonylierung erwiesen, welche durch das Enzym entfernt werden [74, 75]. Die

Deacetylaseaktivität von SIRT4, 6 und 7 ist schwach, phylogenetische Analysen

indizieren aber Funktionen bei der Entfernung von anderen Acyl-Modifikationen [72,

76].

Im Folgenden soll näher auf SIRT2 eingegangen werden.

SIRT2 1.3

SIRT2 ist ein ubiquitär synthetisiertes Protein, welches vermehrt im zentralen

Nervensystem vorkommt [77, 78]. Besonders stark exprimiert wird es in

Oligodendrozyten und Schwannzellen, welche die Myelinscheide der Neurone formen

[64, 79] (vgl. Abbildung 1 und Abbildung 2). SIRT2 ist sowohl an der Myelinisierung der

peripheren Nerven während der embryonalen Entwicklung als auch an der

Remyelinisierung nach einer Verletzung beteiligt [80]. Auch in Neuronen selbst wurde

das Protein nachgewiesen [81, 82].

Abbildung 1: Aufbau einer Nervenzelle.

Einleitung

6

Im Menschen kommen mindestens zwei Varianten des Proteins vor. Die längere

Isoform 1 umfasst 389 Aminosäuren, wohingegen Isoform 2 um die 37 N-terminalen

Aminosäuren verkürzt ist [59, 83]. Für die hauptsächlich zytoplasmatische Lokalisation

von SIRT2 ist eine NES (nukleäres Exportsignal)-Sequenz zwischen Aminosäure 41 und

51 des Proteins (Isoform 1) verantwortlich [71]. Es ist noch unklar, wie SIRT2 in den

Zellkern gelangt, da bisher keine NLS (nukleäres Lokalisierungssignal)-Sequenz

identifiziert wurde. Das Pendeln zwischen beiden Orten ist jedoch auch für das SIRT2-

Hefe-Ortholog HST2 (homolog of Sir two 2) bekannt. HST2 ist primär zytoplasmatisch,

kann aber ebenfalls in den Kern pendeln, wo es die Gentranskription beeinflusst [84, 85]

Das humane SIRT2 deacetyliert im Zellkern Histon H4 an Lysin 16 (H4K16) und

-Tubulin an Lysin 40, wodurch es regulierend auf den Zellzyklus und den Austritt aus

der Mitose wirkt [86, 87, 88]. Daneben gibt es weitere SIRT2-Substrate

und -Interaktionspartner, über die die Genexpression gesteuert werden kann. Dazu

zählt das Tumorsuppressorgen p53, die Transkriptionsfaktoren FoxO1, FoxoO3a und

HOXA10 (Homeobox A10) sowie das Protein 14-3-3/ [89, 90, 91].

Abbildung 2: Funktionale Einteilung des Nervensystems; nach [92].

Neben der nukleären Funktion ist die Interaktion von SIRT2 mit -Tubulin entscheidend

für die Erhaltung des Zytoskeletts und der Zellbeweglichkeit. So wurde beschrieben,

dass SIRT2 die Differenzierung von Oligodendrozyten inhibiert, einhergehend mit

reduzierter Tubulin-Acetylierung [79]. Außerdem hemmt SIRT2 das Neuritenwachstum

in hippocampalen Neuronen und die Beweglichkeit ihrer Wachstumskegel [82].

Wahrscheinliche Ursache dieser Effekte ist der Einfluss auf das Zytoskelett. So wird

Nervensystem

Neurone

Sensorische Neurone

Motorische Neurone

Interneurone

Gliazellen

Astrozyten Oligodendrozyten/

Schwannzellen Mikroglia

Einleitung

7

angenommen, dass acetylierte Mikrotubuli stabiler sind als nicht acetylierte [93, 94].

Dies wird unter anderem von der Beobachtung gestützt, dass die acetylierte Form in

Axonen häufiger vorkommt als in Dendriten [95]. Nennenswert ist auch die Interaktion

von überexprimiertem SIRT2 in Koimmunopräzipitationen mit HDAC6. Diese

Deacetylase modifiziert ebenfalls -Tubulin an Lysin 40, was auf eine Kooperation der

beiden Enzyme hindeutet [71]. Andererseits wurde HDAC6 bisher hauptsächlich in

Neuronen nachgewiesen, während SIRT2 überwiegend in Oligodendrozyten und der

Myelinscheide vorkommt [78].

Die Aktivität von SIRT2 wird durch verschiedene posttranslationale Modifikationen

reguliert. Derzeit sind zwei Phosphorylierungsstellen bekannt, Serin 368 und Serin 372

(bezogen auf Isoform 1). Die Phosphorylierung an Serin 368 durch Zyklin B1/CDK1

(CDK, cyclin-dependent kinase) ist erforderlich, um den Zellzyklus durch SIRT2 zu

verzögern [83]. Dieselbe Stelle kann auch durch die Kinasekomplexe Zyklin E/CDK2,

Zyklin A/CDK2, p35/CDK5 und schwach durch Zyklin D3/CDK4 modifiziert werden, was

eine Reduktion der katalytischen Aktivität von SIRT2 bewirkt [82]. Eine

Phosphorylierung an Serin 372 alleine verursacht keine Enzyminhibition, die beiden

Modifikationsstellen scheinen jedoch zu kooperieren [96]. Die direkte Phosphorylierung

an Serin 368 induziert eine indirekte Phosphorylierung von Serin 372, vermutlich durch

die Aktivierung von CDK16 durch CDK5 [97]. Die Rückreaktion der Dephosphorylierung

von SIRT2 wird durch CDC14A und CDC14B (CDC, cell division cycle) vermittelt [83].

Eine weitere Regulationsmöglichkeit für SIRT2 ist die Acetylierung durch p300. Ein

genauer Zielpunkt in der Aminosäuresequenz ist noch nicht bekannt, aber auch diese

Modifikation inhibiert die katalytische Aktivität des Proteins [98].

1.3.1 SIRT2 in neuronalen Erkrankungen

Aufgrund seines verstärkten Vorkommens im Gehirn ist SIRT2 besonders interessant

hinsichtlich seiner Beteiligung an neuronalen Prozessen und Pathologien. So wurde eine

reduzierte Expression des Enzyms in Gliomen beobachtet. In denselben Studien störte

hingegen die ektope Expression von SIRT2 in Zelllinien das Mikrotubuli-Netzwerk und

verringerte die Kolonienbildung, was Eigenschaften als Tumorsuppressor indiziert [99].

Die Anwesenheit und katalytische Aktivität von SIRT2 war in Untersuchungen zur

Wallerschen Degeneration ebenfalls von Bedeutung. Hierbei waren wiederum

Modifikationen an den Mikrotubuli ein zentraler Faktor [81]. In Studien zu

Einleitung

8

verschiedenen Tauopathien, vornehmlich zur Alzheimer-Krankheit und Fronto-

temporalen Demenz, erzielten SIRT2-Inhibitoren positive Effekte [100, 101]. Generell

scheint SIRT2 in solchen Erkrankungen eine wichtige Rolle zu spielen, welche mit dem

Vorkommen von intrazellulären Proteinaggregaten assoziiert sind. So reduzierte der

Einsatz von SIRT2-Inhibitoren in Zellkultur- und Drosophila-Experimenten zur

Parkinson-Krankheit die durch mutiertes -Synuklein verursachte Zelltoxizität [102].

Auffällig hierbei war die verstärkte Bildung von morphologisch größeren Aggregaten

unter SIRT2-Hemmung anstelle von kleineren fibrillären Strukturen, welche

hauptsächlich für die zellschädigenden Auswirkungen verantwortlich gemacht werden.

Auch in Zellmodellen zur Multisystematrophie, welche durch zytoplasmatische

Einschlusskörper von -Synuklein in den Gliazellen charakterisiert ist, zeigten sich

protektive Effekte durch SIRT2-Inhibition [103]. In Studien zur Huntington-Krankheit

wurden positive Resultate durch den Einsatz von Breitband-HDAC- und Sirtuin-

Inhibitoren beschrieben. In Drosophila-Experimenten führten diese zu einem

gesteigerten Überleben der Neurone, wobei kein Bezug zum Aggregationsverhalten des

Huntingtin-Proteins hergestellt wurde [29, 104]. In anderen Huntington-Studien

wurden neuroprotektive Effekte auch mit einem spezifischen SIRT2-Inhibitor erzielt.

Die positiven Auswirkungen wurden auf die Herabregulation der Sterol-Biosynthese

zurückgeführt und betonen somit mehr den Einfluss von SIRT2 auf Transkriptionsebene

[105]. Dennoch ist das Auftreten von Huntingtin-Aggregaten ein typisches Phänomen in

den Zellen und Geweben betroffener Patienten [106, 107]. Eine Reihe von

Untersuchungen konzentrieren sich daher auf den Einfluss von Mechanismen des

intrazellulären Proteinumsatzes, insbesondere der Autophagie, auf die Huntington-

Krankheit und andere neurodegenerative Erkrankungen wie die Parkinson-Krankheit

oder Alzheimer-Krankheit [108, 109, 110]. Generell spielt die Proteinacetylierung eine

wichtige Rolle für den proteasomalen und lysosomalen Abbau [72]. Auch SIRT2 wurde

bereits mit diesen Prozessen in Zusammenhang gebracht [111, 112], unter anderem

über seinen Interaktionspartner FoxO1, welcher an der Regulation der Autophagie

beteiligt ist [47]. Neben transkriptionsbedingten Effekten und dem Einfluss auf das

Zytoskelett sowie dem davon abhängigen axonalen Transport, wäre dies eine weitere

Möglichkeit, wie durch SIRT2 neurodegenerative Prozesse beeinflusst werden können.

Einleitung

9

Neurodegenerative Erkrankungen 1.4

Viele degenerative Erkrankungen der Nervenzellen sind durch das Vorkommen von

spezifischen intrazellulären Proteinaggregaten gekennzeichnet. Typische Beispiele

hierfür sind die Akkumulation von -Synuklein in der Parkinson-Krankheit, die Bildung

von -Amyloid-Fibrillen bei der Alzheimer-Krankheit, oder SOD1 (Superoxid-

Dismutase 1)-Aggregate in der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS). Ursächlich für die

Erkrankungen sind häufig Mutationen in den verantwortlichen Genen [113, 114]. Viele

Fälle treten jedoch auch sporadisch auf, wie im Falle der Alzheimer-Krankheit [115]. Für

eine Gruppe von neurodegenerativen Krankheiten ist eine erhöhte Anzahl von

Wiederholungen der Aminosäure Glutamin charakteristisch. Dazu zählen die

Dentatorubrale Pallidoluysische Atrophie (DRPLA), die Spinobulbäre Muskelatrophie

(SBMA), die Spinozerebellären Ataxien (SCA) 1, 2, 3, 6, 7 und 17 sowie die Huntington-

Krankheit [116]. Letztere ist zentraler Gegenstand dieser Arbeit und wird im Folgenden

detaillierter beschrieben.

1.4.1 Huntington-Krankheit

1.4.1.1 Geschichte und Prävalenz

Die Huntington-Krankheit oder Chorea Huntington ist eine progrediente degenerative

Erkrankung der Nervenzellen. Auffälligstes Merkmal sind zunehmende motorische

Störungen bei den Patienten, welche im fortgeschrittenen Stadium zu unwillkürlichen,

torkelnden oder tanzartigen Bewegungen führen. Auf diesen typischen Symptomen

beruht auch der Name „Chorea“, abgeleitet von griechisch „choros“ = Tanz [117]. Erste

Beschreibungen der Krankheit reichen zurück bis in die Pharaonenzeit und das Alte

Testament. In Deutschland wurde die Erkrankung seit dem Mittelalter auch als

„Veitstanz“ bezeichnet [118]. Ihren heutigen Namen erhielt die Chorea nach einer

Veröffentlichung von George Huntington im Jahre 1872, in der er unter anderem ihren

erblichen Charakter herausstellte [119]. Von der Huntington-Krankheit werden andere

hereditäre und symptomatische choreatische Bewegungsstörungen abgegrenzt [118].

Die Huntington-Krankheit wird autosomal-dominant vererbt. In Europa, Amerika und

Australien sind etwa 4-10 von 100.000 Menschen akut betroffen, in Asien erkrankt

weniger als eine Person unter 100.000. Die genetische Prädisposition ist jedoch

wesentlich höher [120, 121].

Einleitung

10

1.4.1.2 Krankheitsbild

Die Huntington-Krankheit ist durch das fortschreitende Absterben von Nervenzellen im

Gehirn gekennzeichnet. Makroskopisch ist dies vor allem an Veränderungen des

Striatums zu beobachten [122]. Daneben sind unter anderem auch der cerebrale Cortex

und der Thalamus betroffen (vgl. Abbildung 3). Im fortgeschrittenen Stadium kommt es

zu einer ausgedehnten zerebralen Atrophie [123]. Da das Striatum für die Verarbeitung

von kognitiven und motorischen Reizen zuständig ist [124], zeigen sich bei den

Betroffenen im Verlauf der Krankheit verschiedene neurologische Auffälligkeiten. Neben

zunehmender Einschränkung der Motorik entwickeln sich vor allem psychische

Störungen und es kommt zu einem Rückgang der kognitiven Fähigkeiten [125].

Abbildung 3: Lage der Basalganglien und des Thalamus im menschlichen Gehirn; nach [126]. Globus pallidus, Putamen und Nucleus caudatus bilden zusammen das Striatum.

Die Verhaltensauffälligkeiten und geistigen Veränderungen gehen den motorischen

Störungen oft voraus [125, 127]. Kognitive Einschränkungen können bereits 15 Jahre

vor den ersten Beeinträchtigungen im Bewegungsablauf auftreten. Zentrale Probleme

sind unter anderem eine generelle Verlangsamung des Denkvermögens bzw. der

Fähigkeit zur Problemlösung, das Einschätzen von Zeit, das Erkennen von Emotionen

sowie ein nachlassendes Erinnerungsvermögen. Einige der Symptome tragen zusätzlich

Einleitung

11

zur Beeinträchtigung der Kommunikation mit anderen Personen bei [128]. Daneben

treten verschiedene psychische Probleme auf. Bereits in einem sehr frühen Stadium der

Huntington-Krankheit zeigt sich bei einem Großteil der Patienten eine gesteigerte

Reizbarkeit und Aggressivität, welche gewöhnlich erst im Nachhinein mit der

Erkrankung in Zusammenhang gebracht wird. Später entwickeln sich häufig

Obsessionen und Zwangsneurosen, nicht selten auch Psychosen. Hinzu kommen sehr oft

Phasen der Apathie und Angstzustände. Viele Patienten entwickeln Depressionen,

welche zu einer hohen Suizidrate, vor allem um den Zeitpunkt der Diagnose und beim

beginnenden Verlust der Selbstständigkeit, beitragen [127, 129].

Deutlichste Anzeichen der Huntington-Krankheit sind die fortschreitenden motorischen

Störungen. Neben den hyperkinetischen choreatischen Bewegungen treten auch

Dystonien und Bradykinesie auf, wobei die Ausprägung von Patient zu Patient

unterschiedlich ist. Der Verlust der motorischen Fähigkeiten zeigt sich häufig zunächst

in kleinen unfreiwilligen Bewegungen der distalen Extremitäten, die anfangs wie

nervöse Tics wirken. Im späten Stadium überwiegen bei allen Betroffenen Hypokinesie

und Rigidität. Zu einem großen Problem in der Endphase der Erkrankung wird die

Unfähigkeit der Patienten zu sprechen und zu schlucken [123, 127, 130].

1.4.1.3 Therapie

Die Therapie der Huntington-Krankheit kann bis heute nur symptomatisch erfolgen.

Allerdings befindet sich eine Reihe von Wirkstoffen, welche auf die unten genannten

zellulären Mechanismen abzielen, in der präklinischen Phase; darunter auch HDAC- und

Sirtuin-Inhibitoren [131, 132]. Zur Behandlung eingesetzt werden derzeit Tetrabenazin

sowie Neuroleptika und Antidepressiva, um die motorischen Störungen und

psychischen Symptome zu lindern. Je nach Zustand des Patienten muss zunächst

abgewogen werden, ob eine medikamentöse Behandlung überhaupt nötig ist. Wichtiger

sind anfangs nicht-medikamentöse Maßnahmen. Physiotherapie und Logopädie können

helfen, das Bewegungsvermögen sowie die Sprach- und Schluckfähigkeit möglichst lange

zu erhalten. Essentiell sind außerdem eine psychologische und soziale Betreuung des

Patienten sowie die Einbindung und Unterstützung der Familie. Die Krankheitsdauer

beträgt nach der Diagnose gewöhnlich 15-20 Jahre, was angesichts der unaufhaltsam

fortschreitenden körperlichen Degeneration, Demenz und Persönlichkeitsveränderung

des Erkrankten für alle Beteiligten eine Langzeitbelastung bedeutet [127, 133, 134, 135].

Einleitung

12

Da die Huntington-Krankheit dominant vererbt wird, können sich potenziell Betroffene

einer DNA-Analyse unterziehen, auch eine Pränataldiagnostik ist möglich. Vorteile kann

dies im Hinblick auf ein frühzeitige therapeutische Intervention und die eigene

Kinderplanung haben [127, 135]. Dennoch entscheiden sich nur 5-25% der gefährdeten

Personen für einen Test [136].

1.4.1.4 Ätiologie

1993 wurde das verantwortliche Huntingtin-Gen auf Chromosom 4 lokalisiert [137].

Exon 1 dieses Gens enthält einen Abschnitt mit Wiederholungen des Basentripletts CAG

(Cytosin-Adenin-Guanin), welches für die Aminosäure Glutamin (Q) kodiert. Eine

Verlängerung dieses polyQ-Segments ist ursächlich für das Ausbrechen der Huntington-

Krankheit. Genanalysen an Patienten haben gezeigt, dass die Anzahl der CAG-Abfolgen

im Exon 1 mit dem Ausbruchsalter und der Schwere der Krankheit korreliert [138]. In

geringerem Maß tragen weitere genetische und umweltbedingte Faktoren hierzu bei

[139]. Über 35 Glutamin-Wiederholungen gelten als pathologisch. 90% aller Patienten

weisen ein polyQ-Segment mit 40-55 CAG-Tripletts auf. In diesen Fällen manifestiert

sich die Huntington-Krankheit im mittleren Lebensalter [125]. Bei einer Anzahl von

36-39 Tripletts treten die ersten Symptome erst im fortgeschrittenen Alter (> 65 Jahre)

auf [140]. Demgegenüber leiden etwa 7% der Huntington-Patienten an einer juvenilen

Form der Krankheit mit einem Eintrittsalter von unter 20 Jahren und gewöhnlich über

60 Glutamin-Abfolgen in Exon 1 [141]. Während der Gametogenese ist die Anzahl der

CAG-Wiederholungen im Huntingtin-Gen nicht stabil. Dadurch kommt es häufig zu einer

genetischen Antizipation in der nachfolgenden Generation, wobei eine verlängerte CAG-

Frequenz fast ausschließlich väterlicherseits vererbt wird [142, 143]. Die paternale

Vererbung trägt damit auch zur Entstehung der juvenilen Variante bei [141]. In 5-10%

aller Fälle entsteht die Huntington-Krankheit aus Neumutationen [134].

1.4.1.5 Normale Huntingtin-Funktion und Pathogenese

Über die normale Funktion von Huntingtin ist bislang nur wenig bekannt. Verschiedene

Studien haben gezeigt, dass die Anwesenheit des Proteins essentiell für die embryonale

Entwicklung und das Überleben von Nervenzellen ist. In Mausmodellen wirkte die

Überexpression des Gens neuroprotektiv und antiapoptotisch, während eine Reduktion

der Huntingtin-Level zum Absterben von Nervenzellen und einem Huntington-

Krankheit-ähnlichem Phänotyp führte. Darüber hinaus milderte die zusätzliche

Einleitung

13

Expression des Wildtyp-Proteins die zelltoxischen Effekte der mutierten Variante [121,

144, 145].

Huntingtin ist mit einer Länge von 3144 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von

348 kDa ein relativ großes Protein. Es enthält daher zahlreiche funktionale Domänen

und kann höchstwahrscheinlich vielfältige Aufgaben in der Zelle übernehmen, welche

jedoch nur ungenügend verstanden sind [145]. Von den 67 Exons des Gens ist Exon 1 am

besten studiert, da es das krankheitsassoziierte polyQ-Segment enthält. Daneben gibt es

eine Reihe weiterer Elemente, die für die Huntingtin-Funktion von Bedeutung sind

(Abbildung 4). Die sogenannten HEAT-Repeats (Huntingtin, Elongationsfaktor 3,

Proteinphosphatase 2A, Hefe-Kinase TOR1) vermitteln Interaktionen mit anderen

Proteinen und spielen vermutlich eine Rolle für intrazelluläre Transportprozesse [146].

Zudem besitzt Huntingtin eine NES-Sequenz und eine Interaktionsstelle für das

Kernporenprotein Trp (translocated promoter region), welches am nukleären Export

beteiligt ist [147, 148]. Ferner gibt es eine Reihe von Angriffsstellen zur

Proteinfragmentierung durch Caspasen, Calpain und Aspartyl-Proteasen. Huntingtin

unterliegt außerdem diversen posttranslationalen Modifikationen, darunter

Phosphorylierung, Sumoylierung, Palmitoylierung und Acetylierung [121]. Wichtige

Hinweise auf die Funktion des Proteins kann auch seine subzelluläre Lokalisation

liefern. So ist Huntingtin mit verschiedenen Organellen assoziiert; außer im Zellkern

wurde es am Golgi-Apparat und dem endoplasmatischen Retikulum (ER), an den

Mitochondrien und Mikrotubuli sowie an vesikulären Strukturen in den Synapsen der

Nervenzellen beobachtet [149, 150, 151]. Darüber hinaus besitzt Huntingtin eine Reihe

von Interaktionspartnern, welche in vielseitige zelluläre Prozesse wie Endozytose,

Apoptose, Vesikeltransport, Signalübertragung, Morphogenese sowie synaptische

Aktivität involviert sind [152, 153]. Hervorzuheben ist vor allem auch der Einfluss von

Huntingtin auf die Genexpression über unterschiedliche Transkriptionsfaktoren [154].

So fördert es die Expression und den vesikulären Transport von BDNF (brain-derived

neurotrophic factor), ein neurotropher Faktor, welcher wichtig für das Überleben von

striatalen Neuronen ist [155, 156].

Obwohl das Huntingtin-Gens in nahezu allen Geweben exprimiert wird, sind bestimmte

Zelltypen im Krankheitsfall besonders empfindlich. Wie bei anderen neuro-

degenerativen Erkrankungen auch, sind dafür neben der genetischen Prädisposition

spezielle zelluläre Eigenschaften ausschlaggebend. Bei der Huntington-Krankheit sind

Einleitung

14

besonders Projektionsneurone von der Degeneration betroffen, welche 95% des

Striatums bilden und Gamma-Aminobuttersäure (GABA) als Neurotransmitter nutzen.

Die genauen molekularen Zusammenhänge sind bislang nicht geklärt [157, 158].

Abbildung 4: Struktur und funktionale Domänen des Huntingtin-Proteins; nach [121]. Posttranslationale Modifikationen: Ubiquitinierungs- und Sumoylierungs-Stellen (hellgrün), Palmitoylierungsstelle (gelb), Phosphorylierungsstellen (blau); Acetylierung (orange).

Aufgrund seiner vielfältigen Funktionen gibt es verschiedene Wege, über die das

mutierte Huntingtin-Protein die Zellpathologie beeinflussen kann. Die wichtigsten sind

in Abbildung 5 dargestellt. Von großer Bedeutung sind die Auswirkungen auf die

Genexpression durch Veränderung der Chromatinstruktur und Fehlinteraktionen mit

Transkriptionsfaktoren, z.B. p53 oder SREBP (sterol regulatory element-binding protein),

was weitreichende Folgen für die Zellhomöostase haben kann [29, 121]. Nennenswert

ist außerdem die Veränderung der mitochondrialen Funktion, was eine Störung des

Energiestoffwechsels und oxidativen Stress verursacht [159]. Dazu kommen

Beeinträchtigungen der Synapsenfunktion, welche auf mangelhaften vesikulären

Einleitung

15

Transport und Excitotoxizität zurückgeführt werden können [121]. Auch Dysfunktionen

des sekretorischen ER- und Golgi-Systems wurden mit mutiertem Huntingtin in

Zusammenhang gebracht [160, 161].

Abbildung 5: Beteiligte Faktoren in der Huntingtin-Pathologie [132].

Von entscheidender Bedeutung für die Krankheitsentwicklung sind Konformations-

änderungen und die inkorrekte Faltung des fehlerhaften Proteins. Das von Caspasen

geschnittene N-terminale Fragment, welches das verlängerte polyQ-Segment enthält,

kann sich in fibrillären Strukturen zusammenlagern und Aggregate bilden [106, 121,

123]. Diese Aggregate werden über die Mikrotubuli in Richtung der Zentrosome

transportiert und bilden dort ein zumeist einzelnes Aggresom [162, 163]. Ob die

Aggregate bzw. Aggresomen selbst für eine Zelle toxisch sind, oder lediglich Anzeichen

für einen gestörten Stoffwechsel, ist umstritten. Dennoch beschäftigen sich eine Reihe

Einleitung

16

von Studien mit Mechanismen des intrazellulären Proteinumsatzes und axonalen

Transports [164, 165, 166]. Neben dem Ubiquitin-Proteasom-System ist in den letzten

Jahren vermehrt der Prozess der Autophagie in den Fokus gerückt [108, 167, 168].

Huntingtin-Aggregate finden sich außer in den Nervenzellen auch in vielen peripheren

Geweben, z.B. den Muskeln, die begleitenden zellschädigenden Symptome sind hier

jedoch deutlich milder [107]. Möglicherweise spielt dabei eine Rolle, dass

postmitotische Neurone im Gegensatz zu teilungsfähigen Zellen nicht in der Lage sind

fehlgefaltete, toxische Proteine auf ihre Tochterzellen aufzuteilen [169]. Diese Arbeit

konzentriert sich auf die Korrelation von Huntingtin-Aggregaten und parallel dazu

auftretenden zelltoxischen Effekten. Es soll untersucht werden, inwieweit die

Anwesenheit und Aktivität der Deacetylase SIRT2 Einfluss auf die Huntington-

Pathogenese nehmen kann und über welche Mechanismen dies reguliert wird.

Intrazellulärer Proteinumsatz 1.5

Die Zellphysiologie ist durch einen stetigen Auf- und Abbau von Zellstrukturen und

Proteinen gekennzeichnet. Um die korrekte Funktionsfähigkeit der Zelle zu

gewährleisten, müssen fortlaufend neue Komponenten synthetisiert, fehlerhafte

Proteine und Organellen abgebaut und intrazelluläres Material recycelt werden [170]. In

der Zelle haben sich verschiedene Systeme entwickelt, welche diese spezifischen

Aufgaben erfüllen. Es existieren zwei Hauptwege, über die Proteine degradiert werden

können, das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) und der Autophagie-Lysosom-Pfad.

Daneben gibt es den ERAD-Weg (ER-assoziierte Degradation), über welchen

fehlgefaltete Proteine des Endoplasmatischen Retikulums im Zytosol ebenfalls durch

Proteasomen abgebaut werden [171]. Das UPS und die Autophagie unterscheiden sich in

diversen Punkten, grundlegende Schritte haben jedoch beide Systeme gemein. Essentiell

sind die Erkennung des Substrats, der Transport zum proteolytischen System sowie die

Degradation und Verwertung der einzelnen Aminosäuren [172]. Während über

Proteasome ausgediente oder fehlgefaltete aber lösliche Proteine abgebaut werden, ist

die Autophagie hauptsächlich für unlösliche Polymere, Aggregate und Organellen

zuständig [113, 171]. Die beiden Systeme arbeiten dabei nicht unabhängig voneinander,

sondern können sich gegenseitig beeinflussen und ggf. kompensieren [173, 174]. Im

Folgenden soll detaillierter auf die beiden Mechanismen eingegangen werden.

Einleitung

17

1.5.1 Ubiquitin-Proteasom-System

Über das UPS werden lösliche und oftmals kurzlebige Proteine des Zytoplasmas,

Zellkerns und Endoplasmatischen Retikulums abgebaut. Zentrale Bestandteile des

Systems sind die Proteasomen (Abbildung 6), über 2,5 MDa große Multi-

proteinkomplexe, welche sich in einen tonnenförmigen 20 S Kernteil (CP, core particle)

und 19 S Regulationseinheiten (RP, regulatory particle) unterteilen lassen [175]. Um

über ein Proteasom degradiert zu werden, müssen abzubauende Proteine zunächst

markiert werden. Dies erfolgt über die Anbindung des 76 Aminosäuren-langen Peptids

Ubiquitin, welches über seinen C-Terminus mit Lysinresten des Zielproteins interagiert.

Die Reaktion wird durch drei Enzyme vermittelt, dem Ubiquitin-aktivierenden Enzym

(E1), dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2) und der Ubiquitin-Ligase (E3). Da in

der Sequenz des Ubiquitins selbst auch Lysinreste vorhanden sind, können mehrere

Peptide zu polymeren Ubiquitinketten zusammen gelagert werden. Durch die Mono-

oder verschiedene Polyubiquitinierungen wird das weitere Schicksal des Proteins

innerhalb der Zelle festgelegt. Neben der Markierung zum Abbau ist die Ubiquitinierung

auch für viele weitere Vorgänge von Bedeutung, wie zum Beispiel während der

Zellzyklusregulation, der DNA-Reparatur, des Zellwachstums und im Immunsystem

[172, 175, 176]. Um von der regulatorischen Einheit des Proteasoms erkannt zu werden,

muss ein Protein mit einer Kette aus mindestens vier Ubiquitinen, welche über Lysin 48-

Seitenketten verknüpft sind, markiert sein [177, 178]. Entsprechende Rezeptoren an der

Regulatoreinheit können das zum Abbau bestimmte Protein dann binden. Anschließend

wird es deubiquitiniert und entfaltet. Erst in diesem Zustand kann es in den

Proteasomkern vorrücken. Dieser besteht aus jeweils zwei - und -Ringen, von denen

die Untereinheiten 1, 2 und5 proteolytisch aktiv sind und die langen

Aminosäureketten in kurze Peptide schneiden. Die Untereinheiten differieren in ihren

Zielsequenzen. So bevorzugt 1 saure Aminosäuren (Caspase-artige Aktivität), 2

basische Aminosäuren (Trypsin-artige Aktivität) und 5 hydrophobe Aminosäuren

(Chymotrypsin-artige Aktivität) [172, 175]. Nach der proteolytischen Spaltung werden

die Peptide ins Zytosol abgegeben und dort durch Peptidasen weiter abgebaut.

Aggregierte Proteine tragen zwar auch Ubiquitin-Markierungen, können aber nicht

entfaltet werden. Sie gelangen daher nicht durch die schmale Eingangspore des

Proteasoms in den proteolytischen Kern und werden stattdessen über den lysosomalen

Weg abgebaut [171, 179].

Einleitung

18

Abbildung 6: Aufbau und Funktionsweise des Proteasoms [176] Ub: Ubiquitin, RE: Regulationseinheit, KE: Kerneinheit.

1.5.2 Autophagie

Der Begriff „Autophagie“ stammt aus dem Griechischen und bedeutet so viel wie „selbst“

und „essen“. Der Prozess ist ein in Eukaryoten konservierter Mechanismus zum

lysosomalen Abbau von intrazellulärem Material [180]. Während über das UPS lösliche

Proteine abgebaut werden, ist die Autophagie vorrangig für die Degradation von

größeren Strukturen wie Proteinaggregaten und Organellen zuständig. Es gibt drei

verschiedene Formen von Autophagie: Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA,

chaperone mediated autophagy), Mikroautophagie und Makroautophagie [170]. In der

CMA erfolgt die spezifische Erkennung der Substrate über Chaperone, welche auch den

weiteren Kontakt mit Rezeptoren an der Lysosomenmembran vermitteln [181].

Demgegenüber werden in der Mikroautophagie die Substrate selektiv oder nicht-

selektiv durch direkte Einstülpung und Abschnürung der Lysosomenmembran ins

Lumen der Organelle transportiert [182]. Diese Arbeit befasst sich vor allem mit dem

Prozess der Makroautophagie. Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich daher der

allgemeine Begriff Autophagie stets auf die Makroautophagie.

Einleitung

19

Wie auch das UPS, dient die Autophagie der Erhaltung der zellulären Homöostase. Sie

läuft stetig auf einem basalen Level ab, kann aber unter Stressbedingungen wie

Nährstoffmangel, mikrobiellen Infektionen oder der Anhäufung von Proteinaggregaten

vermehrt aktiviert werden [183]. Bisher wurden 32 Gene identifiziert, welche am Ablauf

der Autophagie in Säugetieren beteiligt sind (Atg, autophagy related genes). Zur

Initiation ist vor allem die Hemmung des mTOR-Komplexes 1 (mTORC1, mammalian

target of rapamycin complex 1) ausschlaggebend, welcher den ULK1-Kinasekomplex

(bestehend aus Atg1/ULK1 [unc-51-like kinase 1], Atg13, Atg17/FIP200 [focal adhesion

kinase family interacting protein of 200 kD] und Atg101 reguliert [184, 185].

Zentraler Bestandteil der Autophagie ist die Bildung eines sogenannten Autophagosoms.

Dieses ist eine von einer Doppelmembran umschlossene Phagophore, welche aus

verschiedenen anderen Membranen, z.B. des ERs oder der Plasmamembran,

abgeschnürt wird. In ihr werden zelluläre Bestandteile aufgenommen, bevor sie an ein

Lysosom weitergegeben und degradiert werden (Abbildung 7). Die Bildung des

Autophagosoms ist ein komplizierter, hierarchisch organisierter Vorgang [180].

Essentieller Bestandteil ist die Bildung eines Komplexes aus PI3K (Phosphoinositid-3-

Kinase), Beclin1/Atg6 und p150. Während einer Elongationsphase der

Autophagosomen-Membran sind zudem Atg5, 7, 12 und 16 aktiv. Zuletzt wird die

Membran mit dem Protein LC3 (light chain 3, Atg8) konjugiert. Dafür wird LC3 durch

Atg4 geschnitten und über Atg3 mit dem Phospholipid PE (Phosphatidylethanolamin)

verbunden. Die Konversion von LC3-I (ungebunden) zu LC3-II (membranständig) wird

häufig als Marker der Autophagie-Aktivität verwendet [184, 185].

Ein weiterer wichtiger Punkt im Prozess der Autophagie ist die Selektion der Substrate.

Hierbei spielt wiederum die Ubiquitinierung von fehlerhaften Proteinen und Organellen

eine Rolle [184]. Diese können durch HDAC6, welches eine Ubiquitin-Bindedomäne

besitzt, erkannt und daran angehängt werden. HDAC6 bindet zusätzlich an das

Motorprotein Dynein und sorgt damit für den Transport der ausgewählten Substrate

entlang der Mikrotubuli [165, 186, 187]. Für die Assoziation mit dem Autophagie-

System ist des Weiteren das Protein p62 (SQSTM1, sequestosome 1) essentiell. Auch p62

kann ubiquitinierte Proteine binden, außerdem interagiert es mit dem

membranständigen LC3-II. Dadurch fungiert es als Adapterprotein zwischen den

fehlgefalteten Proteinen und dem Autophagosom und vermittelt die Inkorporation der

Substrate in die Phagophore [113, 188, 189]. Unterstützt wird p62 von den Proteinen

Einleitung

20

NBR1 (neighbor of Brca1) und Alfy, welche ebenfalls mit ubiquitinierten Proteinen und

Autophagosomen assoziiert sind [190]. Mittlerweile wurden auch Formen des

Ubiquitin-unabhängigen Abbaus über die Autophagie beschrieben, wobei auch hier die

Mitwirkung von HDAC6 und p62 erforderlich war [191].

Abbildung 7: Grundlegende Schritte der Degradation über die Autophagie. Dargestellt sind: abzubauendes Protein (gelb), Ubiquitin (grün), p62 (rot), LC3 (blau).

Nachdem zum Abbau bestimmte Proteine oder Organellen im Autophagosom

eingeschlossen wurden, verschmilzt dieses mit einem Lysosom. Für diesen Prozess sind

das Zytoskelett und die Aktivität von Dynein von Bedeutung, da sich die beiden

Organellen zunächst aufeinander zubewegen müssen [192, 193]. Auch die

Notwendigkeit von HDAC6-Aktivität wurde beschrieben [194]. Die Fusion selbst wird im

Wesentlichen durch Rap (Ras related proteins)-, SNARE (soluble N-ethylmaleimide-

sensitive factor attachment protein receptor)- und HOP (homotypic fusion and protein

sorting)-Proteine vermittelt. Im gebildeten Autophagolysosom werden anschließend die

innere Membran des Autophagosoms sowie sein Inhalt enzymatisch abgebaut [195].

Das System der Autophagie ist von großer Bedeutung für verschiedene

Krankheitsprozesse. Es ist unter anderem in Herzerkrankungen, Infektionen und

Immunreaktionen, Alterungsprozesse und Neurodegeneration involviert. Eine

Steigerung des zellulären Umsatzes über die Autophagie wirkt sich allerdings nicht

grundsätzlich positive auf die Gesundheit aus. So unterstützt der Prozess das Überleben

Einleitung

21

und die Vermehrung von Krebszellen. Darüber hinaus kann durch eine übermäßig

aktivierte Autophagie auch Apoptose ausgelöst werden [47, 183, 196, 197].

Zielsetzung 1.6

Intention dieser Arbeit war es den Einfluss von SIRT2 auf zelluläre Prozesse zu

untersuchen, welche zum Entstehen und Fortschreiten von degenerativen Störungen

führen. Im Fokus stand dabei die Pathogenese der Huntington Krankheit, welche in

Zellkulturmodellen unter Knockdown und Überexpression der Deacetylase untersucht

werden sollte. Ergänzend sollten potenzielle Veränderungen der Neurotoxizität durch

SIRT2 in Drosophila-Modellen zur Huntington Krankheit und weiteren neuro-

degenerativen Erkrankungen studiert werden.

Zur Induktion eines Huntington-Phänotyps sollten mutierte Varianten des Huntingtin-

Proteins in den Zellsystemen exprimiert und deren Aggregationsverhalten sowie

Auswirkungen auf die zelluläre Vitalität analysiert werden. Untersucht werden sollte

neben der Korrelation der Faktoren Aggregation und Toxizität vor allem eine mögliche

Einflussnahme durch die Anwesenheit und Aktivität von SIRT2. Darüber hinaus sollte

ein zugrunde liegender Wirkmechanismus identifiziert und die Beteiligung der

Deacetylase daran aufgezeigt werden.

Material und Methoden

22

2 Material und Methoden

Material und Methoden sind nach Standardprotokollen des Instituts für Biochemie und Molekularbiologie, RWTH Aachen, verfasst und entsprechend individueller experimenteller Änderungen modifiziert.

Material 2.1

Verbrauchsmaterial 2.2

Das verwendete Verbrauchsmaterial stammte von folgenden Firmen:

Amersham Biosciences, Ansell, Becton Dickinson, Biometra, Bio-Rad, Biosan, Biotron, Biozym, Brand, Braun, Cellstar, Costar, Eppendorf, eBioscience, Falcon, Fisher Scientific, Fuji, Gibco BRL, Gilson, Greiner Bio-One, Hartmann, Heidolph, Hirschmann, Integra Biosciences, Kimberly-Clark, Kojair, Langenbrinck, MaiMed, Marienfeld, Millipore, Nalgene, Nerbe Plus, Omnilab, Rainin, Roth, Sanyo, Sarstedt, Sartorius, Schott Duran, Semper med, Siemens, Starlab, TPP, VWR, Whatman.

2.2.1 Chemikalien und Reagenzien

Die verwendeten Reagenzien und Reaktionskits stammten von folgenden Firmen:

Amersham Pharmacia Biotech, AppliChem, Bayer, Becton Dickinson, Bode, Biochrom AG, Biometra, Bio-Rad, Calbiochem, Chroma, Clontech, Eurogentec, Fermentas, Finnzymes, Fluka BioChemika, GE Healthcare, Gibco, Invitrogen, InvivoGen, Lonza, Merck, New England Biolabs, PAA, Pierce, Promega, Qiagen, Roche, Roth, Santa Cruz Biotechnology, Seromed, Serva, Sigma, Zymo Research.

2.2.2 Puffer

2.2.2.1 Dynabeads®-Puffer

140mM NaCl 2,6mM KCl 2mM Na2HPO4

1,45mM KH2PO4

0,1% (w/v) BSA 2mM EDTA

2.2.2.2 Gele für SDS-PAGE

5% Sammelgelpuffer

250 ml Aqua bidest. 100 ml Upper Tris 50 ml 30% Acrylamid/

Bisacrylamid (37,5 : 1)

5% Sammelgel

5 ml 5% Sammelgelpuffer 25 µl 20% APS 8 µl TEMED


23

10% Trenngelpuffer

200 ml Aqua bidest. 100 ml Lower Tris

10% Trenngel

16,7 ml 10% Trenngelpuffer 8,3 ml 30% Acrylamid/

Bisacrylamid (37,5 : 1) 125 µl 20% APS 25 µl TEMED

12% Trenngelpuffer

175 ml Aqua bidest. 125 ml Lower Tris

12% Trenngel

15 ml 12% Trenngelpuffer 10 ml 30% Acrylamid/

Bisacrylamid (37,5 : 1) 125 µl 20% APS 25 µl TEMED

2.2.2.3 HEPES-Puffer

142 mM NaCl 10 mM HEPES 6,7 mM KCl pH 7,3

2.2.2.4 10x HEPS-Puffer

40 g NaCl 25 g HEPES 1,85 g KCl 0,63 g Na2HPO4.2H2O Ad 500 ml Aqua bidest.

2.2.2.5 1x HEPS -Puffer

1:10 Verdünnung von 10x HEPS-Puffer in Aqua bidest., pH 6,95

2.2.2.6 2x HEPS -Puffer

274 mM NaCl 42 mM HEPES 9,6 mM KCl 1,5 mM Na2HPO4 pH 7,1


24

2.2.2.7 Laemmli-Laufpuffer

25 mM Tris-Base 250 mM Glycin 0,1 % (w/v) SDS

2.2.2.8 Lower Tris

1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 0,4% SDS

2.2.2.9 PBS

140 mM NaCl 2,6 mM KCl 2 mM Na2HPO4 1,45 mM KH2PO4

2.2.2.10 PBST

PBS 0,05% (v/v) Tween-20

2.2.2.11 Ponceau-Färbelösung

0,5% (w/v) Ponceau S 1% Essigsäure

2.2.2.12 2x-Probenpuffer

160 mM Tris-HCl, pH 6,8 20% (v/v) Glycerol 10% (w/v) SDS 0,25% (w/v) Bromphenolblau 100 mM ß-Mercaptoethanol

2.2.2.13 4x-Probenpuffer

320 mM Tris-HCl, pH 6,8 40% (v/v) Glycerol 8% (w/v) SDS 0,5% (w/v) Bromphenolblau 200 mM ß-Mercaptoethanol


25

2.2.2.14 6x-Probenpuffer für Filter-Retardations-Versuche

7 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 3 ml Glycerol 1,2 g SDS 0,46 g DTT

2.2.2.15 RIPA-Puffer zur Lyse eukaryotischer Zellen

10 mM Tris pH 7,4 150 mM NaCl 1% NP40 1% Desoxycholat (DOC) 0,1% SDS 0,5% Trasylol (Aprotinin) Frisch zufügen: Protease Inhibitor Cocktail

2.2.2.16 RIPA-Puffer zur Lyse von Drosophila

50 mM Tris, pH 8,0 150 mM NaCl 1% NP-40 0,5% Desoxycholat (DOC) 0,1 % (v/v) SDS Protease Inhibitor Cocktail Lagerung bei -20°C

2.2.2.17 Semidry-Transfer-Puffer für Nitrozellulose-Membranen

25 mM Tris-Base 192 mM Glycin 20% (v/v) Methanol

2.2.2.18 TBST

50 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 0,05 % (v/v) Tween-20

2.2.2.19 Upper Tris

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,4% SDS


26

2.2.3 Plasmide

Name Beschreibung

GW-pHA

Dieser Vektor ist abgeleitet von pEVRF0-HA und durch Einsetzen der Gateway-Kassette (Leseraster C1, RfC1) in die SmaI-Schnittstelle zum Gateway-System kompa-tibel gemacht. (R. Lilischkis)

pBluescript II KS+ (pBS)

Dieser Vektor wurde zur Angleichung der transfizierten DNA-Mengen verwendet. (Stratagene)

CMV-CBP-HA

Die Sequenz des CREB-bindenden Proteins (CBP) mit einem C-terminalen HA-Tag wurde über die Schnittstellen HindIII und NotI in einen pcDNA3-Vektor kloniert. (R. Janknecht)

pRC/CMV-Htt-Q25, -Q47, -Q72, -Q103 (GFP-Htt-Ex1)

Diese Vektoren basieren auf pRC/CMV (Invitrogen) und steuern die Expression von Huntingtin-Exon1 mit verschiedenen polyQ-Verlängerungen und einem GFP-Tag. (J. Senderek)

Myc-Htt-590-Q25, -Q97, -Q97KR

Diese Vektoren basieren auf pcDNA3.1/myc-His(-)A (Invitrogen) und steuern die Expression der 590 N-terminalen Aminosäuren von Huntingtin mit verschiedenen polyQ-Verlängerungen und einem Myc-Tag. [198]

GW-pHA-SIRT2-WT, - H150Y, -S331A, ,-S335A, -S331A-S335A,

Diese Vektoren wurden nach dem Gateway-System durch eine LR-Reaktion mit GW-pHA und den entsprechenden pDONR/Zeo Eingangsvektoren hergestellt. Sie steuern die Genexpression von SIRT2 und den entsprechenden Mutanten mit einer N-terminalen HA-Sequenz. (F. Flick)

pMACS 4.1

Die Sequenz des humanen CD4-Rezeptors wurde über die Schnittstellen XhoI und HindIII in den pMACS 4.1-Vektor kloniert. Dieser Vektor wurde als Selektionsmarker zusätzlich transfiziert. (Molecular Biology Reagents)


27

pSC2+Flag-p27

Die humane cDNA von p27 wurde über die BamHI/XhoI-Schnittstellen in den Vektor kloniert. p27 wird unter Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert und liegt nach Expression in der Zelle als Flag-Fusionsprotein vor.

pSuper

Dieser Vektor wurde für die Expression von short hairpin RNA (shRNA) in eukaryotischen Zellen eingesetzt. Er verfügt über einen Histon 1-RNA Promotor und kodiert eine Resistenz gegen Ampicillin. [199]

pSuper-Luc2, -r Ash #5 falsch (shKontrolle)

Diese Vektoren sind abgeleitet von pSuper und steuern die Genexpression der gegen Luciferase oder eine veränderte Ash-Sequenz gerichteten shRNAs. Da sie keine bekannte Ziel-mRNA im humanen System besitzen, wurden sie als Kontrollen verwendet. (C. Cornelissen, J. Lüscher-Firzlaff)

pSuper-sh-hSIRT2#3, #4, -1, -2 (shSIRT2-1, -2, -3, -4)

Diese Vektoren sind abgeleitet von pSuper und steuern die Genexpression der gegen SIRT2 gerichteten shRNAs. (F. Flick, C. Cornelissen, R. Pandithage)

pSuper FoxO1

Dieser Vektor ist abgeleitet von pSuper und steuert die Genexpression einer gegen FoxO1 gerichteten shRNA. (F. Flick)

2.2.4 Antikörper

Primäre Antikörper

Name Beschreibung

-GAPDH

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) detektiert. (AbD Serotec)

-GFP

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher gegen das Volllängen-Antigen von rekombinantem GFP gerichtet ist. (Rockland)


28

-HA

Monoklonaler Antikörper aus der Ratte, welcher die HA-Peptidsequenz (YPYDVPDYA) von Hämagglutinin des Influenza-Virus erkennt. (Roche)

-Lysine-Ac

Polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen, welcher an acetylierte Lysine bindet. (Cell Signaling)

-Myc 9E10

Monoklonaler Antikörper aus der Ratte, welcher den N-Terminus von c-Myc erkennt. (E. Kremmer)

-Myc-Tag

Polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen, welcher das humane c-Myc-Epitop EQKLISEEDL erkennt. (Cell Signaling)

-MW1

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher die polyQ-Sequenz von Huntingtin erkennt. (DSHB)

-p62

Polyklonaler Antikörper aus dem Meerschweinchen, welcher die C-terminale Domäne des humanen p62-Proteins erkennt. (PROGEN)

-p62

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher die lck-bindende Domäne von p62 erkennt. (BD Transduction Laboratories™)

-PARP1Polyklonales Kaninchenserum gegen PARP1. (Roche)

-Cleaved PARP1

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher das durch Caspasen geschnittene 89 kDa-Fragment von PARP1 detektiert. (Cell Signaling)

-SIRT2 3C8

Monoklonaler Antikörper aus der Ratte, welcher S331-phosphoryliertes und S335-unphosphoryliertes SIRT2 erkennt. (E. Kremmer)

-SIRT2 7G5

Monoklonaler Antikörper aus der Ratte, welcher SIRT2 unabhängig vom Phosphorylierungsstatus erkennt. (E. Kremmer)

-SIRT2 T749 Polyklonales Kaninchenserum gegen SIRT2. (E. Kremmer)


29

-Tubulin (--Tubulin) (B-5-1-2)

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher an ein α-Tubulin-Epitop am C-Terminus bindet. (Sigma)

-Tubulin-Ac -acetyliertes-Tubulin)

Monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher ein α-Tubulin-Epitop mit acetyliertem Lysin 40 erkennt. (Sigma)

Sekundäre Antikörper

Name Beschreibung

-Kaninchen

Sekundärer α-Kaninchen-Antikörper aus der Ziege, kovalent gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. (Jackson Immuno Research)

-Maus

Sekundärer α-Maus-Antikörper aus der Ziege, kovalent gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. (Jackson Immuno Research)

-Meerschweinchen

Sekundärer α-Meerschweinchen-Antikörper aus der Ziege, kovalent gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. (Santa Cruz Biotechnology®)

-Ratte

Sekundärer α-Ratte-Antikörper aus der Ziege, kovalent gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. (Jackson Immuno Research)

Alexa Fluor® 555 -Maus

Sekundärer α-Maus-Antikörper aus der Ziege, gekoppelt mit rot-fluoreszierendem Alexa Fluor 555-Farbstoff. (Invitrogen)

Alexa Fluor® 488-Kaninchen

Sekundärer α-Kaninchen-Antikörper aus der Ziege, gekoppelt mit grün-fluoreszierendem Alexa Fluor 488-Farbstoff. (Invitrogen)


30

Methoden 2.3

2.3.1 Arbeiten mit eukaryotischen Zellen

2.3.1.1 Zelllinien

Name Beschreibung

HEK293

Adhärente epitheliale Zelllinie aus humanen embryonalen Nierenzellen (HEK), die mit Ad5-DNA transformiert wurden. Das Ad5-Insert liegt auf 19q13.2. 293 ist eine hypotriploide Zelllinie mit der modalen Chromosomenzahl n = 64, die man in 30% der Zellen findet. (ATCC CRL-1573)

NSC-34 Murine Motorneuron-ähnliche Hybrid-Zelllinie. (Cellutions Biosystems CLU140)

Neuro-2a Adhärente murine Neuroblastomzelllinie. (ATCC CCL-131)

SH-SY5Y

Gemischt adhärente und Suspensions-Zelllinie aus humanen Neuroblastomzellen (Knochenmarkmetastasen) mit der modalen Chromosomenzahl n = 47 und einer Trisomie des 1q-Segments. (ATCC CRL-2266)

HeLa Flp-In T-REx

Von der adhärenten Epithelzellline HeLa abstammend (ATCC CCL-2). Die Zelllinie exprimiert das Tet-Repressorgen aus pcDNA6/TR und enthält eine einzelne integrierte Flp-Rekombinationsstelle (FRT, recombination target) aus pFRT/lacZeo, welche zur Expression des lacZ-Zeocin Fusionsgens führt. Die Zelllinie kann zur Herstellung einer Tetrazyklin-induzierbaren Zelllinie benutzt werden. (Invitrogen #R714-07)

HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-H150Y, HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-S331A-S335A HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-S331E-S335E

Diese Zelllinien wurden durch Kotransfektion von HeLa Flp-In T-REx-Zellen mit dem epcDNA5/FRT/TO Expressionsvektor und dem Flp-Rekombinase-Expressionsplasmid pOG44 hergestellt. epcDNA5/FRT/TO enthielt das jeweils erwünschte Zielgen. Die Zelllinien wurden durch stetige Selektion mit Hygromycin B und Blasticidin S stabil gehalten. (F. Flick, N. Schall)


31

2.3.1.2 Kulturbedingungen

Alle Zelllinien wurden in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5% CO2 bei

37°C kultiviert. Als Nährmedium wurde DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit

einem Zusatz von 10% FCS und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin verwendet. Zur

Kultivierung der stabilen Zelllinien wurden dem Medium außerdem 200 μg/ml

Hygromycin B und 15 μg/ml Blasticidin S zugesetzt.

Bei entsprechender Konfluenz in der Zellkulturschale wurden die Zellen alle zwei bis

drei Tage mit PBS gewaschen, mittels Trypsin/EDTA vom Boden der Schale gelöst (1 ml

pro Ø 10 cm-Schale) und ein Teil der Kultur in frischem Medium weiter geführt.

2.3.1.3 Kryokonservierung

Zum Einfrieren wurden Zellen einer 80-90% konfluenten Ø 10 cm-Kulturschale in 1 ml

eiskaltem FCS mit 10% DMSO aufgenommen und in ein Einfriergefäß überführt. In

Zellstoff eingewickelt wurden die Zellen bei -80°C über Nacht langsam abgekühlt und

anschließend bei -150°C gelagert. Zum Auftauen wurden die Zellen in 10 ml

handwarmen Mediums resuspendiert und in einer Zellkulturschale weiter kultiviert.

2.3.1.4 Bestimmung der Zellzahl

Die Zellzahl wurde entweder mit einem CASY Cell Counter der Firma Roche oder durch

Auszählung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Für letztere Methode wurde ein Aliquot der Zellsuspension unter das Deckgläschen

einer Neubauer-Zählkammer pipettiert und die Zellen in jeweils 4 x 4 Quadraten der

Kammer gezählt. Aus vier Werten wurde ein Mittelwert gebildet und die Zellzahl/ml

nach folgender Formel bestimmt:

Zellen/ml = M x V x K

M = Mittelwert V = Verdünnungsfaktor K = 1 x 104 = Konstante der Zählkammer

2.3.1.5 Transfektion mit Kalziumphosphat

HEK293- und HeLa-Zellen wurden nach der Methode von Chen und Okayama [200]

transfiziert. Dabei kopräzipitiert die DNA in einem Komplex mit Kalziumphosphat und

wird von den Zellen vermutlich über Endozytose aufgenommen. Anschließend wird die

DNA extrachromosomal transkribiert. Die Angaben in dieser Arbeit beziehen sich


32

jeweils auf eine Ø 35 mm-Kulturschale mit einem Mediumvolumen von 2 ml. Bei

anderen Größen wurden die benötigten Mengen entsprechend angepasst. Die Zellen

wurden einen Tag vor der Transfektion ausgesät, für die benötigte Konfluenz waren

hierbei 2,5-3 x 105 Zellen ausreichend.

Pro Transfektion wurden 3 µg Plasmid-DNA in 160 µl 1x-HEPS aufgenommen und mit

8,5 µl 2,5 M CaCl2-Lösung gemischt. Alternativ wurde die Plasmid-DNA in 80 µl 0,25 M

CaCl2-Lösung pipettiert und tropfenweise mit 80 µl 2x-HEPS-Puffer gemischt. Nach einer

Inkubationszeit von etwa 10-20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die

Transfektionslösung in das Kulturmedium getropft und die Zellen mindestens fünf

Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit HEPES-Puffer gewaschen

und bis zur Ernte in DMEM weiter kultiviert.

2.3.1.6 Transfektion mit FuGENE® HD

SH-SY5Y-Zellen wurden mit FuGENE® HD-Reagenz nach Herstellerangaben transfiziert.

Dazu wurden am Vortag 2 x 105 Zellen pro Kulturschale einer 12-Loch-Platte ausgesät.

Pro Transfektion wurden 1 µg Plasmid-DNA in 50 µl Opti-MEM aufgenommen und mit

4 µl FuGENE® HD-Reagenz vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei

Raumtemperatur wurde die Transfektionslösung in das Kulturmedium getropft und die

Zellen mindestens fünf Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte ein Mediumwechsel

mit frischem DMEM.

2.3.1.7 Präparation von Zelllysaten

Zunächst wurden die Zellen von der Kulturschale gelöst und zusammen mit ihrem

Überstand bei 1500x g und 4°C zentrifugiert. Die Pellets wurden mit PBS gewaschen und

erneut zentrifugiert. Für die Lyse wurden die Zellen einer konfluenten Ø 35 mm

Zellkulturschale in 300 µl RIPA-Puffer aufgenommen, 30 Minuten auf Eis inkubiert und

anschließend 15 Minuten sonifiziert (Bioruptor®). Gegebenenfalls wurden die

Zelltrümmer 20 Minuten bei 16000x g und 4°C pelletiert. Die Gesamtzelllysate im

Überstand wurden sofort weiter verwendet oder bei -20°C gelagert. Wenn nachfolgend

ein Filter-Retardations-Versuch durchgeführt werden sollte, wurde auf den letzten

Zentrifugationsschritt verzichtet.


33

2.3.2 Arbeiten mit Drosophila

2.3.2.1 Aufzucht

Alle Drosophila-Linien wurden in der Neurologischen Klinik, Arbeitsgruppe

Neurodegeneration in Drosophila, gezüchtet. Die Fliegen wurden bei 18°C auf Standard-

Nährboden gehalten, welcher auf Maismehl, Agar, Hefe und Melasse basiert. Kreuzungen

wurden bei 25°C durchgeführt [201].

2.3.2.2 Das UAS/GAL4 Expressionssystem

Zur Expression von Transgenen in Drosophila wird üblicherweise das zweistufige

UAS/GAL4-System verwendet [201, 202, 203]. Dabei nutzt man den hefespezifischen

Transkriptionsfaktor GAL4 (Galaktosidase 4), welcher in das Genom einer Fliegenlinie

(Treiberlinie) integriert wurde und unter der Kontrolle eines gewebespezifischen

Promotors steht. Beispiele solcher Promotoren sind ELAV (embryonic lethal abnormal

vision, [204]) oder GMR (glass multimer reporter, [205]), welche eine gezielte pan-

neurale bzw. augenspezifische Expression steuern. Das zu exprimierende Transgen

befindet sich in einer zweiten Fliegenlinie (Responderlinie), unter der Kontrolle eines

GAL4-Zielgens (UAS, upstream activation sequence). In Folge einer Verkreuzung kann

GAL4 an die UAS-Sequenz binden und die Expression des Transgens aktivieren

(Abbildung 8).

Abbildung 8: Schema des UAS/GAL4 Expressionssystems.


34

2.3.2.3 Transgene Linien

Linie Herkunft

ELAV-GAL4 Bloomington Drosophila Stock Center

GMR-GAL4 Bloomington Drosophila Stock Center

UAS-ATXN1 Q82 erhalten von J. Botas

UAS-ATXN3tr-Q78 Bloomington Drosophila Stock Center

UAS-Htt-Exon1-Q97 erhalten von L. Marsh

UAS-SIRT2-WT, -H150Y, -S331A

Die entsprechenden SIRT2-Varianten wurden in den Vektor pUAST kloniert (P. Karsten), welcher die UAS-Enhancer-Sequenz enthält. Die entsprechenden transgenen Drosophila-Linien wurden durch Keimbahn-Übertragung generiert. (BestGene)

UAS-TDP43 Die transgene Drosophila-Linie wurde durch Keimbahn-Übertragung generiert. (BestGene)

RNAi-Linien

Die RNAi-Fliegenlinien wurden durch zufällige Integration von shRNA-transkribierenden Palindromen in das Drosophila-Genom hergestellt und über das UAS-GAL4-System reguliert. (Vienna Drosophila RNAi Centre [206])

2.3.2.4 Herstellung von Lysaten

Diese Methode wurde für transgene Fliegen mit pan-neuraler und augenspezifischer

Expression verwendet. Die Fliegen wurden in Reaktionsgefäße überführt und in

flüssigem Stickstoff schockgefroren. Durch Vortexen wurden die Köpfe der gefrorenen

Fliegen von den Körpern getrennt und in frische Reaktionsgefäße mit RIPA-Puffer (10 µl

pro Kopf) und einigen Keramikkügelchen überführt. Die Proben wurden mit einem

SpeedMill P12 Homogenisierer (Analytik Jena AG) aufgeschlossen, zweimal zwei

Minuten nach einem vordefinierten Programm für Insektengewebe. Anschließend

wurden die Proben 20 Minuten bei 16000x g und 4°C zentrifugiert. Die Überstände

wurden sofort weiter verwendet oder bei -20°C gelagert.


35

2.3.3 Proteinchemische Methoden

2.3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in Zelllysaten wurde das DC™ Protein Assay

Kit von Bio-Rad verwendet, welches auf der Methode von Lowry basiert [207].

Grundlage der Messung ist eine zweistufige Reaktion, bei der gelöste Proteine mit

Kupfer-Ionen interagieren, wodurch nachfolgend das Folin-Ciocalteu-Reagenz reduziert

wird. Dieses erfährt in Folge dessen einen Farbumschlag, welcher bei einer Wellenlänge

von 750 nm kolorimetrisch gemessen werden kann. Die Konzentrationen der

präparierten Proteinlösungen wurden in 96-Loch-Platten zumindest im Doppelansatz

bestimmt und einander durch Zugabe von Lysepuffer angeglichen.

2.3.3.2 Immunpräzipitation

Unter Immunpräzipitation (IP) von Proteinen versteht man die gezielte Abtrennung

eines Antigens mit Antikörpern aus einer Lösung. Dabei bindet der Antikörper sowohl

an das zu isolierende Protein, als auch an eine mit Protein A oder Protein G markierte

Matrix. Diese kann anschließend durch Zentrifugation von der Lösung getrennt werden

[208].

Für die Immunpräzipitation wurden Zellen von ein bis drei konfluent bewachsenen

Ø 10 cm Zellkulturschalen lysiert und mit 25 µl Protein A-Sepharose sowie 5 µl

monoklonalem Antikörper oder 15 µl polyklonalem Serum zwei Stunden bei 4°C auf

einem Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend wurde die Sepharose durch

Zentrifugation bei 500x g pelletiert und der Überstand verworfen. Es folgten drei

Waschschritte mit jeweils 1 ml RIPA-Puffer und nachfolgender Zentrifugation. Zuletzt

wurde die Sepharose in 20 µl 4x Probenpuffer resuspendiert und die präzipitierten

Proteine durch Aufkochen eluiert. War zuvor das p27-Konstrukt mit FLAG-Tag

exprimiert worden, wurde mit 20 µl ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel Beads (Sigma) pro

Ansatz immunpräzipitiert.

2.3.3.3 CD4-Selektion

Um transfizierte von nicht-transfizierten Zellen zu trennen, wurde eine Zell-

Immunpräparation mittels des Dynabeads® CD4 Positive Isolation Kit (Invitrogen)

durchgeführt. Bei diesem Verfahren werden kleine magnetische Kugeln genutzt, welche

mit spezifischen Antikörpern überzogen sind, über die sie mit entsprechenden

Antigenen auf der Zelloberfläche interagieren können.


36

Hierzu wurden die Zellen mit einem Zehntel pMACS 4.1-Plasmid (CD4-

Selektionsmarker) der gesamten zu transfizierenden DNA-Menge kotransfiziert. Am Tag

der Zelllyse wurden pro Ansatz 15 µl magnetische Beads zweimal mit 1 ml Dynabeads®-

Puffer gewaschen und anschließend in 30 μl des Puffers resuspendiert. Die Zellen

wurden von den Kulturschalen gelöst, mit PBS gewaschen und bei 200x g zentrifugiert.

Anschließend wurden sie in 1 ml Dynabeads®-Puffer resuspendiert, mit den

gewaschenen Dynabeads® vermischt und 30 Minuten bei 4°C über Kopf rotiert. Zum

Sammeln der CD4-positiven Zellen wurden die Proben zwei Minuten auf einen

Magneten gestellt und der Überstand abgenommen. Es folgten drei Waschschritte mit

jeweils 1 ml Dynabeads®-Puffer, bevor die Zellen in RIPA-Puffer lysiert wurden.

2.3.3.4 Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist ein Verfahren zur

Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht und basiert auf der Methode

von Laemmli [209]. Diskontinuierliche Gele bestehen aus einem oberen großporigen

Sammelgel und einem unteren engporigen Trenngel. Beide unterscheiden sich in Bezug

auf das Acryl-/Bisacrylamid-Verhältnis, pH-Wert und Ionenstärke. Nur im Trenngel

kommt der Molekularsiebeffekt zum Tragen, welcher zur Auftrennung der Proteine

führt. Die Funktion des Sammelgels besteht darin, die Proteine am Übergang des

Trenngels zu einer Lauffront zu fokussieren [210, 211].

Das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) im Lauf- und Ladepuffer bindet

an die durch Hitzebehandlung denaturierten Proteine. Die Zahl der angelagerten SDS-

Moleküle ist proportional zum Molekulargewicht der Polypeptide, so dass im

elektrischen Feld eine Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht möglich

ist. Aufgrund der negativen Nettoladung wandern die denaturierten Polypeptide im

elektrischen Feld in Richtung der Anode. Die Ladung der Aminosäurereste braucht

aufgrund der starken negativen Ladung der SDS-Moleküle nicht berücksichtigt zu

werden.

Die zuvor präparierten Zelllysate wurden abhängig vom benötigten Gesamtvolumen mit

2x- oder 4x-Probenpuffer 5-10 Minuten bei 98°C denaturiert, auf ein Gel aufgetragen

(5%iges Sammelgel, 10-12%iges Trenngel) und 50 Minuten bei 200 V aufgetrennt. Es

wurde ein Elektrophorese-System von Bio-Rad benutzt.


37

2.3.3.5 Western Blot

Beim Western Blot werden die in einer SDS-PAGE aufgetrennten Proteinlysate aus der

Polyacrylamidmatrix über ein senkrecht zum Gel angelegtes elektrisches Feld auf eine

Membran aus Nitrozellulose übertragen. Bei diesem Vorgang wird das an die Proteine

angelagerte SDS ausgewaschen, weshalb die Proteine renaturieren und teilweise ihre

Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen. Daher können sie durch spezifische

Antikörper erkannt werden.

Abbildung 9: Schematischer Aufbau eines Semidry-Western Blots.

Zur elektrophoretischen Übertragung wurde das Semidry-Blot System von PHASE

verwendet. Der schematische Aufbau des Systems ist in Abbildung 9 dargestellt. Die

Nitrozellulose-Membran und die Whatman-Papiere wurden in Semidry-Transfer-Puffer

vorinkubiert und die Proteine bei 1,2 mA/cm2 für 80 Minuten aus dem Trenngel auf die

Membran transferiert. Zur Kontrolle wurden die Proteine auf der Nitrozellulose-

Membran anschließend mit Ponceau S-Lösung reversibel angefärbt. Danach wurde die

Membran bei Raumtemperatur für 30 Minuten in 5%iger Magermilch (in PBST oder

TBST) geschwenkt, um freie Bindungsstellen der Proteine zu sättigen. Die Inkubation

mit den in 0,8% BSA (in PBST oder TBST) verdünnten primären Antikörpern erfolgte

über Nacht bei 4°C. Anschließend wurde die Nitrozellulose-Membran dreimal mit PBST

oder TBST gewaschen und mit einem passenden Peroxidase-gekoppelten sekundären

Antikörper für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (1:5000 in PBST oder

TBST). Nach erneutem dreimaligem Waschen der Membran erfolgte die

Chemilumineszenz-basierte Detektion mittels ECL (enhanced chemiluminescence) an

dem automatischen Kamera-assoziierten Dokumentations-System Las 3000 (Fuji).


38

2.3.3.6 Filter-Retardations-Versuche

Für die Filter-Retardations-Versuche wurde eine Filtrationssystem von Bio-Rad

(Bio-Dot® SF Microfiltration Apparatus) verwendet (Abbildung 10). Whatman-Papier

und eine Nitrozellulose-Membran wurden in Semidry-Transfer-Puffer vorinkubiert und

nach Herstellerangaben in die Kammer eingespannt. Die Membran wurde zunächst mit

200 µl Semidry-Transfer-Puffer pro Probentasche rehydriert, dieser dann unter Vakuum

abgesaugt. In gleicher Weise wurden anschließend je 10 µg Proteinlösung in einem

Gesamtvolumen von 200 µl in die Probentaschen pipettiert und ebenfalls durch die

Nitrozellulose-Membran gesaugt. Zuletzt folgte ein Waschschritt mit je 200 µl PBS.

Unlösliche Bestandteile der Proteinlösungen konnten durch dieses Verfahren mit der

Nitrozellulose-Membran aufgefangen und an sie gebunden werden. Die Membran wurde

analog zum Western Blot (2.3.3.5) mit 5%iger Milch geblockt und assoziierte Proteine

mittels Antikörpernachweis spezifisch detektiert.

Abbildung 10: Aufbau des Bio-Dot® SF Microfiltration Apparatus; nach www.bio-rad.com.

2.3.3.7 Beschichtung von Glasplättchen mit Kollagen A

Glasplättchen wurden in 12-Loch-Kulturschalen ausgelegt, mit 70% Ethanol sterilisiert

und mit PBS gewaschen. Die Kollagen A-Lösung wurde 1:10 in PBS verdünnt und auf die

Glasplättchen gegeben, jeweils 1 ml pro 10 cm2. Es folgte eine Inkubation für 30 Minuten


39

im Zellinkubator bei 37°C. Anschließend wurde die überschüssige Kollagen A-Lösung

abgesaugt. Die beschichteten Glasplättchen wurden einmal mit PBS gewaschen und

direkt für die Zellkultur eingesetzt.

2.3.3.8 Immunfluoreszenz-Färbung

Auf beschichteten Glasplättchen gewachsene Zellen wurden mit PBS gewaschen und

15 Minuten bei Raumtemperatur in 3,7% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Anschließend

wurden sie einmal mit PBS und einmal mit 0,1% Triton-X100/PBS gewaschen. Es folgte

eine Inkubation mit 0,1% Triton-X100/PBS und zusätzlichen 1% BSA, wobei die Zellen

durch Triton-X100 permeabilisiert und unspezifische Antikörperbindungsstellen durch

BSA blockiert wurden. Die Primärantikörper wurden in 0,2% BSA/PBS verdünnt und

45-60 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Nach drei Waschschritten

mit 0,2% BSA/PBS wurden passende Sekundärantikörper 1:2000 in 0,2% BSA/PBS

verdünnt und 45-60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach

wurden die Zellen einmal mit 0,2% BSA/PBS, einmal mit PBS und einmal mit

destilliertem Wasser gewaschen. Es folgte eine Kernfärbung für etwa eine Minute mit

0,2 µg/ml Hoechst 33258-Farbstoff. Nach zwei weiteren Waschschritten mit

destilliertem Wasser wurden die Proben auf einem Objektträger mittels Mowiol 4-88

(5-10 µl pro Glasplättchen) eingebettet und bei 4°C im Dunkeln gelagert. Die Färbungen

wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Olympus IX50) dokumentiert.

Ergebnisse

40

3 Ergebnisse

Endogenes SIRT2 in humanen Zelllinien 3.1

Grundlegende Voraussetzung, um den Einfluss von SIRT2 auf zelluläre Toxizität und

Aggregatbildung zu untersuchen, ist das Vorhandensein des Proteins im verwendeten

Zellsystem. Durch Immunpräzipitation mit anschließendem Western Blot konnte

endogenes SIRT2 in den humanen Zelllinien HEK293 (human embryonic kidney) und

SH-SY5Y nachgewiesen werden, nicht aber in den murinen Zelllinien NSC-34 und

Neuro-2a (Abbildung 11). Während in den Nierenzellen die Isoformen 1 und 2 zu

erkennen waren, zeigte sich in den SH-SY5Y-Neuroblastomzellen lediglich Isoform 2.

Dies entspricht einer Publikation von Luthi-Carter et al. [105], in welcher ebenfalls

ausschließlich die 43 kDa-Bande in diesen Zellen detektiert wurde.

Abbildung 11: Nachweis von endogenem SIRT2 in humanen Zelllysaten. HEK293-, NSC-34, Neuro2a oder SH-SY5Y-Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert und SIRT2 mittels eines polyklonalen Immunserums (-SIRT2 T749) präzipitiert. Die Detektion von SIRT2 erfolgte im Western Blot (A) durch einen monoklonalen Antikörper (-SIRT2 3C8). (B) Ponceau-Färbung der entsprechenden Nitrozellulose-Membranen.

Des Weiteren war es für einige der folgenden Experimente sinnvoll, SIRT2 aus dem

Zellsystem zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde der Knockdown durch verschiedene

shRNA-Plasmide (short hairpin ribonucleic acid) in HEK293-Zellen getestet (Abbildung

12). Die Expression aller gegen SIRT2 gerichteten Sequenzen führte zu einer effektiven

Reduktion der Proteinspiegel. Unter Verwendung des Plasmids shSIRT2-1 war der

Effekt am deutlichsten, weshalb dieses auch in weiteren Versuchen eingesetzt wurde.

Ergebnisse

41

Abbildung 12: Knockdown von endogenem SIRT2. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden und einem für CD4 kodierenden Plasmid transient transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen geerntet, selektioniert und in RIPA-Puffer lysiert. SIRT2 wurde mit Hilfe eines polyklonalen Immunserums (-SIRT2 T749) präzipitiert und im Western Blot mittels eines monoklonalen Antikörpers (-SIRT2 3C8) nachgewiesen. Als Ladekontrolle wurde in den Zelllysaten Tubulin detektiert.

Aggregation von Myc-Huntingtin-590 im Zellmodell 3.2

3.2.1 Filter-Retardation in HEK293

Charakteristisches Merkmal der Huntington-Krankheit ist das Vorkommen von

spezifischen Proteinaggregaten in den betroffenen Zellen. Um eine Aussage darüber

treffen zu können, wie sich diese Aggregate unter verschiedenen Konditionen im

Zellkultursystem darstellen und inwiefern sie mit zytotoxischen Effekten korrelieren,

müssen sie zunächst sichtbar gemacht werden. Das Huntingtin-Protein enthält an seiner

N-terminalen Seite ein polyQ-Segment, welches durch Mutationen zusätzlich verlängert

sein kann. Da dieses N-terminale Fragment für die Pathogenese der Huntington-

Krankheit verantwortlich gemacht wird, wurde auch in den folgenden Versuchen nicht

das vollständige 348 kDa-Protein eingesetzt. Stattdessen wurde zunächst ein Plasmid

benutzt, welches die ersten 590 Aminosäuren von Huntingtin exprimiert, gemessen an

der Wildtyp-Variante mit 25 Glutamin-Wiederholungen in Exon 1 (Htt-590-Q25).

Zusätzlich wurde eine mutierte Variante mit 97 Glutamin-Wiederholungen verwendet

(Htt-590-Q97). Beiden Sequenzen ist ein Myc-Tag für die immunologische Detektion

angehängt. Nach Expression der Plasmide in HEK293-Zellen waren im Western Blot

gleichmäßige Proteinlevel des Wildtyp-Proteins und der Mutante zu erkennen

(Abbildung 13A). Die verwendeten Zelllysate wurden zusätzlich im Filter-Retardations-

Versuch getestet. Während Htt-590-Q97 eindeutig detektiert werden konnte, zeigte sich

Ergebnisse

42

unter Verwendung von Htt-590-Q25 oder eines leeren Kontrollplasmids nur ein

schwaches Hintergrundsignal (Abbildung 13B). Daraus lässt sich folgern, dass die

Expression von Htt-590-Q97 in HEK293-Zellen, nicht aber die des Wildtyp-Plasmids

Htt-590-Q25, zur Bildung intrazellulärer Huntingtin-Aggregate führt, welche mit Hilfe

einer Nitrozellulose-Membran gebunden und anschließend detektiert werden können.

Abbildung 13: Nachweis von Htt-590-Q97-Aggregaten im Filter-Retardations-Versuch. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 24 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Als Kontrolle dienten untransfizierte Zellen. Gleiche Mengen an Lysat wurden im Western Blot (A) und in der Filter-Retardation (B) eingesetzt. Die Proteinlösungen wurden unter Vakuum durch eine Nitrozellulose-Membran gesaugt, wobei aggregierte Proteine aufgefangen und mittels spezifischen Antikörpers nachgewiesen werden konnten. Zur Kontrolle wurden im Western Blot die Gesamtmengen der synthetisierten Proteine detektiert.

Als nächstes stellte sich die Frage, ob die Bildung der Huntingtin-Aggregate durch

HDAC-Inhibitoren beeinflusst werden kann, wie es für ein anderes Modellsystem

beschrieben ist [105]. Analog zum vorherigen Versuch wurden HEK293-Zellen mit den

Plasmiden, welche für Htt-590-Q25 oder Htt-590-Q97 kodieren, transfiziert. Zusätzlich

erfolgte eine Behandlung mit dem Klasse I- und Klasse II-spezifischen HDAC-Inhibitor

TSA (Trichostatin A) oder dem SIRT2-spezifischen Inhibitor AGK2 in vorher getesteten

Konzentrationen. Die im Western Blot nachgewiesenen Proteinkonzentrationen waren

Ergebnisse

43

annähernd ausgeglichen, mit einer leichten Zunahme des Htt-590-Q97-Levels unter

TSA-Behandlung (Abbildung 14A und B). Gleichzeitig wurde die Menge an acetyliertem

-Tubulin durch TSA deutlich erhöht. In der Filter-Retardation zeigte sich eine starke

Zunahme der Huntingtin-Aggregate durch Hemmung der Klasse I und Klasse II HDACs.

Die Behandlung der Zellen mit dem SIRT2-spezifischen Inhibitor AGK2 ließ keine

nennenswerten Effekte erkennen.

Abbildung 14: Einfluss von verschiedenen HDAC-Inhibitoren auf die Aggregation von Htt-590-Q97. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und teilweise über Nacht mit 0,1 µg/µl TSA oder 5 µg/µl AGK2 behandelt. 24 Stunden nach der Transfektion erfolgte die Lyse in RIPA-Puffer mit anschließender Bestimmung der Proteinkonzentration. Jeweils 15 µg Proteinlysat wurden im Western Blot (A) und 10-40 µg in der Filter-Retardation (C) eingesetzt. Die angegebenen Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern detektiert. (B) Ponceau-Färbung der Nitrozellulose-Membran des Western Blots.

Das Aggregationsverhalten von Htt-590-Q97 sollte zusätzlich zur chemischen Inhibition

von SIRT2 (Abbildung 14) auch unter Abwesenheit des Proteins getestet werden. In

Ergebnisse

44

Abbildung 15 sind die Ergebnisse der Koexpression von Htt-590-Q97 und shSIRT2 bzw.

eines Kontrollplasmids dargestellt. Mit Rücksicht auf die etwas höhere Gesamtmenge an

Huntingtin unter SIRT2-Knockdown, war in diesem Fall eine Reduktion der Aggregate

messbar.

Abbildung 15: Aggregation von Htt-590-Q97 unter SIRT2-Knockdown. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Jeweils gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) oder in der Filter-Retardation (B) eingesetzt. Die Gesamtmenge an Huntingtin sowie aufgefangene Aggregate wurden mittels spezifischen Antikörpers detektiert.

Huntingtin-Aggregate können über den Weg der Autophagie degradiert werden [198].

Um die Beteiligung dieses Prozesses in dem hier verwendeten Modellsystem zu

bestätigen, wurden die beiden Huntingtin-Plasmide erneut in HEK293-Zellen

exprimiert. Gleichzeitig wurde der Ablauf der Autophagie über zwei verschiedene

Ergebnisse

45

Abbildung 16: Auswirkungen von Autophagie-Hemmung auf die Aggregation von Htt-590-Q97. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Zuvor wurden die Zellen ggf. 16 Stunden mit 200 nM Bafilomycin A oder als Kontrolle mit Ethanol behandelt. Für Western Blot (A) und Filter-Retardation (B) wurden jeweils gleiche Mengen Proteinlysat eingesetzt. Gezeigt sind die Huntingtinspiegel eines repräsentativen Western Blots sowie die Auftragung von jeweils drei parallel transfizierten Proben im Filter-Retardations-Versuch. (C) HEK293-Zellen wurden mit Bafilomycin A oder Ethanol behandelt und die Wirkung des Autophagie-Inhibitors durch Detektion von p62 im Western Blot kontrolliert.

Ergebnisse

46

Methoden gehemmt, zum einen durch den spezifischen Inhibitor Bafilomycin A (Baf A).

Dieser unterdrückt die Aktivität der vakuolären H+-ATPasen und damit den Abbau der

in den Autophagolysosomen eingeschlossenen Substrate und assoziierten Proteine

[212] (vgl. Abbildung 17). In einem weiteren Inhibitionsansatz wurde die Expression

von FoxO1 durch eine zuvor getestete shRNA herabreguliert. Dieses Protein aktiviert in

acetylierter Form die Autophagie über eine Interaktion mit Atg7 [47]. Im getesteten

Modellsystem ergab sich, sowohl durch die Behandlung der Zellen mit Bafilomycin A als

auch durch den Knockdown von FoxO1, eine deutliche Steigerung der detektierten

Huntingtin-Aggregate (Abbildung 16). Zwar war die Expression des Htt-590-Q97 nicht

in allen Ansätzen gleichmäßig ausgeprägt, das Verhältnis von aggregierten Proteinen in

der Filter-Retardation zur Gesamtmenge an Protein im Western Blot ließ jedoch eine

merkliche Zunahme der Aggregation erkennen.

3.2.2 Immunfluoreszenz in SH-SY5Y

Das Aggregationsverhalten von Htt-590-Q97 sollte im Folgenden näher untersucht

werden. Zu diesem Zweck wurden SH-SY5Y-Neuroblastomzellen mit Htt-590-Q25 oder

Htt-590-Q97 transfiziert und die angegebenen Proteine mit Fluoreszenzfarbstoffen

angefärbt (Abbildung 17). Jeweils einer der Ansätze wurde mit Bafilomycin A behandelt,

um die Degradation des Huntingtins über die Autophagie zu verhindern. Als Kontrolle

hierfür wurde das Adapterprotein p62 angefärbt. Zellen, welche dem Inhibitor

ausgesetzt waren, zeigten eine deutlich gesteigerte Menge an p62 im Vergleich zu

unbehandelten Zellen, ein Beleg für die effektive Hemmung des Abbaus (Abbildung 16

und Abbildung 17). In keinem der Ansätze war eine Akkumulation von Huntingtin

erkennbar. Sowohl Htt-590-Q25 als auch Htt-590-Q97 zeigten eine gleichmäßige

zytoplasmatische Verteilung, welche unabhängig von der Behandlung mit Bafilomycin A

war.

3.2.3 Acetylierung von Huntingtin-590

In einer Studie wurde gezeigt, dass der Abbau von Huntingtin-590 über die Autophagie

abhängig von seiner Acetylierung an Lysin 444 ist [198]. Da SIRT2 als Deacetylase

fungiert, wäre es denkbar, dass es über eine direkte Interaktion die Degradation von

Huntingtin beeinflussen kann. Um dies zu untersuchen, sollte zunächst die Acetylierung

Ergebnisse

47

Abbildung 17: Immunfluoreszenz-Färbung von Htt-590 in SH-SY5Y-Zellen. SH-SY5Y-Zellen wurden auf beschichteten Glasplättchen ausgesät und im Doppelansatz mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert. Jeweils ein Ansatz wurde für 16 Stunden mit 200 nM Bafilomycin A behandelt. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in Paraformaldehyd fixiert und mit spezifischen Antikörpern gegen Huntingtin (-Myc-Tag, grün) oder endogenes p62 (rot) gefärbt. Gezeigt sind repräsentative konfokale Bilder in 600-facher Vergrößerung.

von Huntingtin nachgewiesen werden. Wie unter [198] beschrieben, wurden die

Huntingtin-Plasmide in HEK293-Zellen zusammen mit der Acetyltransferase CBP (CREB-

bindendes Protein), welche Lysin 444 von Huntingtin acetylieren kann, exprimiert. Als

Negativkontrolle wurde die nicht-acetylierbare Mutante Htt-590-Q97-KR verwendet

[198]. Nach einer Immunpräzipitation waren alle Huntingtin-Varianten im Western Blot

Ergebnisse

48

detektierbar. Die Acetylierung des Proteins konnte jedoch mit einem Acetyl-Lysin-

spezifischen Antikörper, welcher anstelle des in genannter Publikation verwendeten

Acetyl-Lysin-444-spezifischen Antikörpers eingesetzt wurde, nicht sichtbar gemacht

werden (Abbildung 18). Aus diesem Grund waren eine weitere Untersuchung der

Modifikation und deren möglicher Zusammenhang mit dem Abbau des Proteins durch

Autophagie nicht möglich.

Abbildung 18: Test auf Acetylierung von Huntingtin-590. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und vor der Ernte drei Stunden mit TSA und Nicotinamid behandelt. Anschließend erfolgte die Lyse in RIPA-Puffer. Das synthetisierte Huntingtin wurde mittels eines spezifischen Antikörpers (-Myc 9E10) präzipitiert und im Western Blot detektiert (A). Zum Nachweis der Huntingtin-Acetylierung wurde ein spezifischer Antikörper gegen acetylierte Lysine (-Lysine-Ac) verwendet (B). Der -Lysine-Ac-Antikörper erkannte p27 und die 72 kDa-Marke des Proteinstandards (C).

Ergebnisse

49

Aggregation und Toxizität von GFP-Huntingtin-Exon 1 im Zellmodell 3.3

3.3.1 Filter-Retardation in HEK293

In weiteren Versuchen wurde ein anderes Huntingtin-Plasmid getestet, welches für

Exon 1 des Proteins kodiert und GFP (grün fluoreszierendes Protein)-markiert ist. Eine

Wildtyp-Variante mit 25 Glutamin-Wiederholungen (GFP-Htt-Ex1-Q25) und eine

Mutante mit 103 Glutamin-Wiederholungen (GFP-Htt-Ex1-Q103) wurde zunächst im

Filter-Retardations-Versuch getestet (Abbildung 19). Durch den GFP-Tag des Proteins

konnte die zytoplasmatische Verteilung des Huntingtins schon vor der Zelllyse durch ein

Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden (Abbildung 22). In einigen Zellen bildete das

GFP-Htt-Ex1-Q103 deutlich sichtbare Aggregate, welche auch in der Filter-Retardation

nachweisbar waren (Abbildung 19). Für das GFP-Htt-Ex1-Q25-Fragment war keine

Tendenz zur Akkumulation erkennbar.

Abbildung 19: Filter-Retardationsversuch mit GFP-Htt-Ex1. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) und Filter-Retardations-Versuch (B) eingesetzt und die Menge an Huntingtin mit einem GFP-spezifischen Antikörper detektiert.

Des Weiteren sollte der Einfluss von SIRT2 auf die GFP-Htt-Ex1-Q103-Aggregation

analysiert werden. Zu diesem Zweck wurden eine Kontroll-shRNA oder eine shSIRT2

mit dem Plasmid in HEK293-Zellen kotransfiziert und die Zelllysate in der Filter-

Retardation getestet (Abbildung 20). Entsprechend den Ergebnissen für Htt-590-97

(Abbildung 15) zeigte sich auch hier eine deutliche Reduktion der detektierten

Aggregate.

Ergebnisse

50

Abbildung 20: Filter-Retardations-Versuch mit GFP-Htt-Ex1-Q103 unter SIRT2-Knockdown. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) und Filter-Retardations-Versuch (B) eingesetzt und die Proteine mit spezifischen Antikörpern detektiert. (C) Quantifizierung der Aggregatbildung im Verhältnis zur Gesamtexpression von Huntingtin im Western Blot.

3.3.2 Korrelation von Huntingtin-Aggregation und zellulärer Toxizität in HEK293 und SH-SY5Y

Das Aggregationsverhalten von Huntingtin alleine gibt keinen Aufschluss über die

daraus resultierenden zellulären Konsequenzen. Von besonderem Belang sind

zytotoxische Effekte, welche durch das mutierte Protein ausgelöst werden können. Im

Folgenden wurde daher die Zellviabilität in Abhängigkeit von der Länge des polyQ-

Segments genauer betrachtet. Getestet wurden vier verschiedene Varianten des

Huntingtin-Exon 1-Fragments, der Wildtyp mit 25 Glutamin-Wiederholungen sowie

mehrere Mutanten mit 47, 72 oder 103 Glutamin-Wiederholungen (Abbildung 21). Als

Marker für die Zellviabilität diente ein 89 kDa großes Fragment von PARP1 (Poly ADP-

Ribose Polymerase 1), welches durch Caspase-abhängige Spaltung des Ausgangs-

proteins in apoptotischen Zellen entsteht. Wie in Abbildung 21 zu sehen, hatte die

Expression des Wildtyp-Huntingtins keinen nennenswerten Effekt auf die Spaltung von

PARP1 als Marker für die Apoptoserate der HEK293-Zellen. Die Zunahme der Glutamin-

Ergebnisse

51

Wiederholungen innerhalb des Proteins korrelierte jedoch mit einem starken Anstieg

des PARP1-Signals. Die Expression von GFP-Htt-Ex1-Q103 verursachte mit Abstand den

größten zytotoxischen Effekt innerhalb der getesteten Proben.

Abbildung 21: Auswirkungen von zunehmenden Glutamat-Wiederholungen im Huntingtin-Exon 1-Fragment auf die Apoptoserate von HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Die verschiedenen Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern im Western Blot detektiert. Als Maß für die Apoptoserate und Zytotoxizität wurde die Menge des 89 kDa PARP1-Fragments (-Cleaved PARP1) bestimmt.

Als nächstes war es von Interesse, inwieweit die in Abbildung 19 und Abbildung 20

beobachtete Akkumulations-Eigenschaft von mutiertem Huntingtin mit dem

gemessenen Anstieg der Apoptoserate (Abbildung 21) zusammenhängt. HEK293-Zellen

wurden mit Plasmiden für GFP-Htt-Ex1-Q25 und GFP-Htt-Ex1-Q103 oder einem GFP-

Kontrollplasmid transfiziert und der Verlauf des Versuchs durch Fluoreszenzbilder der

unfixierten Proben dokumentiert. Anhand ihrer Morphologie und der zytoplasmatischen

Verteilung des GFP-markierten Huntingtins (bzw. der GFP-Kontrolle) wurden die Zellen

in vier verschiedene Gruppen unterteilt (Details in Abbildung 22). Abgerundeten,

geschrumpften Zellen wurde die Kategorie „apoptotischer Phänotyp“ zugeordnet. Die

Auszählung der unterschiedlichen Gruppen ergab, dass zwei Tage nach der Transfektion

etwa 40% der GFP-Htt-Ex1-Q103-exprimierenden Zellen einen apoptotischen Phänotyp

ausgebildet hatten, während diese Population bei den GFP-Htt-Ex1-Q25-transfizierten

Zellen oder Kontrollansätzen nur 5-10% ausmachte (Abbildung 22G). Dies bestätigt die

Ergebnisse

52

Abbildung 22: Expression von GFP-Htt-Ex1-Q103 in HEK293. Die Zellen wurden transient transfiziert und nach 24 und 48 Stunden mit einem Fluoreszenzmikroskop (EVOS) fotografiert und die transfizierten Proteine aufgrund der GFP-Expression identifiziert („grüne Fluoreszenz“ jeweils links, „Durchlicht“ jeweils rechts gezeigt). Die Bilder bildeten die Grundlage für die statistischen Auswertungen in dieser Abbildung sowie in Abbildung 23 und Abbildung 24. (A) GFP, (B) GFP-Htt-Ex1-Q25, (C-F) GFP-Htt-Ex1-Q103; es erfolgte eine Einteilung der Zellen in folgende Gruppen: (C) Zellen ohne Aggregat, (D) Zelle mit apoptotischem Phänotyp ohne Aggregat, (E) Zelle mit Aggregat, (F) Zelle mit apoptotischem Phänotyp mit Aggregat. (G) Auszählung der Zellen mit apoptotischem Phänotyp innerhalb der Gesamt-populationen von GFP-positiven Zellen.

Ergebnisse

53

toxischen Effekte der mutierten Huntingtin-Variante, welche in Abbildung 21 durch das

Auftreten des Spaltprodukts von PARP1 beobachtet wurden.

Eine genauere Analyse der Populationen zeigte außerdem, dass der apoptotische

Phänotyp direkt mit dem Vorhandensein eines intrazellulären Aggregats korreliert

(Abbildung 23). In den dargestellten Versuchsansätzen wurde GFP-Htt-Ex1-Q103

zusätzlich mit shSIRT2 oder einer Kontroll-shRNA exprimiert. Bei Betrachtung der

Einzelgruppen „Diffuse Verteilung“ und „Aggregat“ ergab sich kein signifikanter

Unterschied zwischen den einzelnen Proben. Während aber bei allen Zellen ein

gleichmäßig verteiltes Huntingtin kaum mit einem apoptotischen Phänotyp einherging,

korrelierte ein intrazelluläres Aggregat nach 24 Stunden zu 40% und nach 48 Stunden

zu 70% mit diesem.

Abbildung 23: Korrelation von Huntingtin-Aggregaten und apoptotischem Phänotyp. Quantifizierung der Zellpopulationen nach Transfektion mit den angegebenen Plasmiden, basierend auf der in Abbildung 22 beschriebenen Klassifizierung. Pro Gruppe wurden jeweils mindestens 100 Zellen aus drei Transfektionen ausgezählt.

Protektive Effekte durch den SIRT2-Knockdown traten erst durch Analyse der

Gesamtpopulation zutage (Abbildung 24). So bildeten nach 48 Stunden gut 20% der

Zellen mit herabreguliertem SIRT2 einen apoptotischen Phänotyp aus, während es in

den Kontrollgruppen beinahe 40% waren (Abbildung 24A). Gleichzeitig führte die

Entfernung von SIRT2 aus dem System zu einer deutlichen Reduktion der Aggregat-

enthaltenden Zellen im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 24C). Der SIRT2-

Knockdown wurde parallel auch auf die Expression des Huntingtin-Wildtyps

Ergebnisse

54

GFP-Htt-Ex1-Q25 angewendet (Abbildung 24B). Auch hier konnte ein leichter Rückgang

in der Häufigkeit des apoptotischen Phänotyps beobachtet werden, die Sterblichkeit der

Zellen war gegenüber den Experimenten mit GFP-Htt-Ex1-Q103 im Ganzen jedoch

gering. Der positive Einfluss des SIRT2-Knockdowns auf die GFP-Htt-Ex1-Q103-

induzierte Apoptose wurde durch weitere Methoden bestätigt. Ein kommerzieller Test

zur Quantifizierung von geschädigten Zellen, welcher die aus sterbenden Zellen

freigesetzte Menge an Adenylat-Kinase misst, ermittelte gemessen an den Kontrollen

eine um etwa 50% reduzierte Zytotoxizität durch Koexpression von GFP-Htt-Ex1-Q103

mit shSIRT2 (Abbildung 24D). Die Western Blot-Analyse der zuvor fotografierten und

ausgezählten Zellen zeigte entsprechend einen Rückgang der PARP1-Spaltung

(Abbildung 24E und F), wobei der 89 kDa-Fragment-spezifische Antikörper (-Cleaved

PARP1) in diesem Experiment ein deutlich klareres Ergebnis erzielte. Insgesamt

reduziert die Expression von shSIRT2 also die Aggregatbildung und Zytotoxizität von

Huntingtin. Sofern es aber zur Entstehung eines Aggregats kommt, ist die Apoptoserate

unabhängig von shSIRT2.

Da von der Huntington-Krankheit in besonderem Maße Nervenzellen betroffen sind,

sollte des Weiteren untersucht werden, ob die in HEK293-Zellen beobachteten Effekte

auch auf ein neuronales Zellsystem übertragbar sind. Zu diesem Zweck wurden

SH-SY5Y-Zellen mit Plasmiden, welche für GFP-Htt-Ex1-Q103 und shSIRT2 kodieren,

oder einem Kontrollplasmid transfiziert und über 48 Stunden beobachtet. Zu den

angegebenen Zeitpunkten wurden einzelne Ansätze für eine Immunfluoreszenz-Analyse

fixiert. Um die Vitalität der Zellen im Verlauf des Versuchs beurteilen zu können, wurden

anschließend eine Färbung gegen das 89 kDa PARP1-Fragment sowie eine Kernfärbung

durchgeführt (Abbildung 25). Analog zu den Versuchen mit HEK293-Zellen zeigte sich

eine deutliche Korrelation zwischen dem Vorhandensein eines intrazellulären

Huntingtin-Aggregats und der Apoptoserate, welche unabhängig von der SIRT2-

Expression war (Abbildung 25A). Eine vollständige Quantifizierung apoptotischer

SH-SY5Y war wegen Verlusten von nicht-adhärenten Zellen während der Fixierung und

einer generell niedrigen Transfektionseffizienz nicht möglich. Stichprobenartige

Auszählungen deuteten jedoch auf ein gesteigertes Überleben der Zellen unter SIRT2-

Knockdown hin (Abbildung 25B).

Ergebnisse

55

Abbildung 24: Auswirkungen von GFP-Htt-Ex1-Q103-Expression auf HEK293-Zellen. (A-C) Quantifizierung von Zellen mit apoptotischem Phänotyp und Aggregat-enthaltenden Zellen nach Transfektion mit den angegebenen Plasmiden. Auf Basis von Fotos, wie in Abbildung 22 dargestellt, wurden jeweils mindestens 100 Zellen von drei Transfektionen ausgezählt. (D) Die Überstände der Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion zur Bestimmung der Zytolyse im ToxyLight™ Non-destructive Cytotoxicity BioAssay (Lonza) eingesetzt. (E-F) Die Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert und die Spaltung von PARP1 als Maß für die Apoptoserate mit einem Pan-Antikörper gegen PARP1 (E) und einem Cleaved PARP1-spezifischen Antikörper (F) im Western Blot detektiert (oben). Darunter ist jeweils die Quantifizierung des Western Blots gezeigt.

Ergebnisse

56

Abbildung 25: Apoptoserate von SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit GFP-Htt-Ex1-Q103. SH-SY5Y-Zellen wurden auf beschichteten Glasplättchen ausgesät und transient mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. 7-42 Stunden danach wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und mit -Cleaved PARP1-Antikörper und Höchst-Farbstoff gefärbt. (A) Auszählung der -Cleaved PARP1-positiven Zellen. (B) Prozentsatz transfizierter, GFP-positiver Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. (C) Repräsentatives Bild einer apoptotischen Zelle mit Huntingtin-Aggregat. In der Hintergrundebene sind zwei untransfizierte Zellen zu erkennen.

3.3.3 Einfluss von SIRT2-Überexpression auf Huntingtin-Aggregation

Neben der Entfernung von SIRT2 aus den getesteten Zellsystemen sollten ferner auch

die Auswirkungen einer verstärkten SIRT2-Expression auf die Aggregation von

Huntingtin untersucht werden. Zusätzlich zu GFP-Htt-Ex1-Q103 wurden die Wildtyp-

Form der Deacetylase sowie verschiedene Mutanten in HEK293-Zellen exprimiert und

potenzielle Effekte im Filter-Retardations-Versuch getestet (Abbildung 26). SIRT2-

H150Y ist aufgrund eines Aminosäuren-Austauschs im aktiven Zentrum des Proteins

katalytisch inaktiv. Die Varianten SIRT2-S331A, SIRT2-S335A und SIRT2-S331A-S335A

wurden an bekannten Phosphorylierungsstellen mutiert, was die Inhibition ihrer

katalytischen Aktivität durch CDKs unterdrückt [82, 97]. Alle Varianten des Proteins

Ergebnisse

57

wurden exprimiert, wobei die Laufhöhen in der SDS-PAGE aufgrund leicht

abweichender chemischer Eigenschaften etwas differieren. Bei der Wildtyp-Form von

SIRT2 sowie der H150Y- und der S335A-Mutante waren eine unphosphorylierte und

eine einfach phosphorylierte Form des Proteins deutlich zu erkennen (vgl. [97]). Keine

der SIRT2-Varianten hatte einen signifikanten Einfluss auf die in der Filter-Retardation

detektierte Menge an Huntingtin-Aggregaten (Abbildung 26).

Abbildung 26: Einfluss von SIRT2-Überexpression auf die Aggregation von GFP-Htt-Ex1-Q103. HEK293-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) und Filter-Retardations-Versuch (B) eingesetzt und die Proteine mit spezifischen Antikörpern detektiert.

Um potenzielle Nebeneffekte durch eine übermäßige Transfektion möglichst klein zu

halten, war es sinnvoll, für die weiteren Experimente auch ein stabil exprimierendes

Zellsystem zu testen. Zunächst wurde das Wachstumsverhalten bisher nicht näher

Ergebnisse

58

charakterisierter HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-Zelllinien beobachtet. Die Expression zweier

Phosphorylierungs-Mutanten des Proteins wurde durch Zugabe von Doxycyclin

dauerhaft induziert. Über einen Zeitraum von 5 Wochen zeigten sich keine

Auffälligkeiten in der Wachstumsgeschwindigkeit (Abbildung 27) oder der

Zellmorphologie (Abbildung 28).

Abbildung 27: Wachstumsverhalten von HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter SIRT2-Expression. Die Expression von stabil transfiziertem SIRT2 wurde durch Zugabe von 1 µg/µl Doxycyclin in das Kulturmedium induziert und das Wachstumsverhalten der Zellen über einen Zeitraum von fünf Wochen beobachtet. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich passagiert, gezählt (A) und mit einer Dichte von 5 x 105 pro Platte neu ausgesät. Die Expression von SIRT2 wurde am Ende der Kultivierungsphase im Western Blot mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper überprüft (B). Als Kontrolle dienten Zellen mit stabil transfiziertem Kontrollplasmid sowie Zellen, welche ohne Doxycyclinzugabe kultiviert wurden.

Analog zu den Versuchen in HEK293-Zellen (Abbildung 22) wurden HeLa Flp-In T-REx-

Zellen mit GFP-Htt-Ex1-Q25- oder GFP-Htt-Ex1-Q103- exprimierenden Plasmiden

transfiziert, parallel dazu wurde die SIRT2-Expression induziert. Die Zellkulturen

wurden über 48 Stunden beobachtet und ihre Entwicklung anhand von

Fluoreszenzbildern begutachtet. Wie in Abbildung 22 bereits für HEK293-Zellen

gesehen, entwickelten auch ein Großteil der HeLa Flp-In T-REx-Zellen durch die

Expression von GFP-Htt-Ex1-Q103 einen apoptotischen Phänotyp (ca. 35%), während

Ergebnisse

59

GFP-Htt-Ex1-Q25 die Zellen kaum beeinträchtigte (Abbildung 29A). Etwa 40% der mit

GFP-Htt-Ex1-Q103 transfizierten HeLa Flp-In T-REx-Zellen entwickelten innerhalb von

48 Stunden ein Aggregat (Abbildung 29B). Die Induktion von SIRT2-S331A-S335A

führte zu einer Steigerung der Huntingtin-Q103-induzierten Zytotoxizität und zu einer

vermehrten Aggregatbildung (Abbildung 29C und D), die Daten waren statistisch jedoch

Abbildung 28: Morphologie der HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter Langzeitinduktion von SIRT2. Durchlichtaufnahmen der Zellen vor (A) und nach (B) Langzeitinduktion mit Doxycyclin wie in Abbildung 27 beschrieben. Als Kontrolle dienten Zellen mit stabil transfiziertem Kontrollvektor sowie Zellen, welche ohne Doxycyclinzugabe kultiviert wurden.

Ergebnisse

60

nicht signifikant. Demgegenüber bewirkte die Expression von SIRT2-S331E-S335E einen

leichten, aber ebenfalls nicht signifikanten Rückgang des apoptotischen Phänotyps

sowie der Aggregatbildung (Abbildung 29E und F).

Abbildung 29: Auswirkungen von GFP-Htt-Ex1-Expression auf HeLa Flp-In T-REx-Zellen. Auszählung von lebensfähigen und Aggregat-enthaltenden Zellen nach Induktion der SIRT2-Expression und Transfektion mit GFP-Htt-Ex1. Die Daten basieren auf Fotos der unfixierten Zellen wie in Abbildung 22 beschrieben. (A) und (B) HeLa Flp-In T-REx-Kontrollzellen, (C) und (D) HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-S331A-S335A, (E) und (F) HeLa Flp-In T-REx-SIRT2-S331E-S335E.

Ergebnisse

61

Die Ergebnisse aus Abbildung 29 sollten des Weiteren im Filter-Retardations-Versuch

validiert werden. Zusätzlich wurde eine Zelllinie verwendet, welche die katalytisch

inaktive SIRT2-Mutante H150Y exprimiert. Sowohl die Huntingtin-Proteine als auch die

unterschiedlichen SIRT2-Varianten konnten im direkten Western Blot detektiert werden

(Abbildung 30A). Die Menge des akkumulierten GFP-Htt-Ex1-Q103 in der Filter-

Retardation war für alle Ansätze in etwa gleich (Abbildung 30B).

Abbildung 30: Aggregation von GFP-Htt-Ex1 in HeLa Flp-In T-REx-Zellen nach Induktion von SIRT2. Die stabilen Zellen wurden mit Doxycyclin induziert und mit GFP-Htt-Ex1 transfiziert. Nach 48 Stunden erfolgte die Lyse in RIPA-Puffer. Jeweils gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) oder Filter-Retardations-Versuch (B) eingesetzt und die Proteine mit spezifischen Antikörpern detektiert.

Ergebnisse

62

Das Modellsystem mit GFP-Htt-Ex1 in HeLa Flp-In T-REx-Zellen wurde durch einen

transienten Knockdown von SIRT2 erweitert. Wie in Abbildung 31 dargestellt führte die

Koexpression des shSIRT2-Plasmids mit GFP-Htt-Ex1-Q103 zu einer reduzierten PARP1-

Spaltung in der Zellpopulation im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 31A). Darüber

hinaus verringerte sich die Menge des in der Filter-Retardation detektierten Huntingtins

(Abbildung 31B). Diese Ergebnisse entsprechen damit den Resultaten, welche für

HEK293-Zellen erzielt wurden (vgl. Abbildung 20).

Abbildung 31: Filter-Retardations-Versuch in HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter SIRT2-Knockdown. HeLa Flp-In T-REx-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert und nach 48 Stunden in RIPA-Puffer lysiert. Gleiche Mengen Proteinlysat wurden im Western Blot (A) und Filter-Retardations-Versuch (B) eingesetzt und die Proteine mit spezifischen Antikörpern detektiert. (C) Quantifizierung der Aggregatbildung im Verhältnis zur Gesamtexpression von Huntingtin im Western Blot.

Einfluss von SIRT2 auf die Autophagie 3.4

Die protektiven Effekte des SIRT2-Knockdowns auf die Huntingtin-induzierte

Zytotoxizität werden möglicherweise über den Prozess der Autophagie reguliert. Um

dies zu testen wurde in HEK293- und HeLa Flp-In T-REx-Zellen durch oxidativen Stress

Autophagie induziert und die Geschwindigkeit des Proteinumsatzes anhand des

Ergebnisse

63

Adapterproteins p62 beobachtet (Abbildung 32). In HEK293 nahm die Menge des

Autophagosom-assoziierten Proteins unter Kontrollbedingungen innerhalb von vier

Stunden stetig zu. Dagegen erreichte der p62-Level unter Reduktion von SIRT2

innerhalb von zwei Stunden sein Maximum und fiel anschließend deutlich ab, was für

einen beschleunigten Abbau spricht (Abbildung 32A). In HeLa Flp-In T-REx-Zellen

konnten ähnliche Beobachtungen gemacht werden. Während in den Kontrollansätzen

das p62-Niveau nach Induktion der Autophagie annähernd konstant blieb, verminderte

sich die Proteinmenge unter SIRT2-Knockdown bereits nach zwei Stunden. Dieser Effekt

konnte durch die Zugabe von Bafilomycin A unterdrückt werden, eine Bestätigung dafür,

dass die Autophagie ursächlich für den Abbau des Proteins ist (Abbildung 32B).

Abbildung 32: Umsatz von p62 nach Induktion von Autophagie. HEK293- (A) oder HeLa Flp-In T-REx-Zellen (B) wurden mit den angegebenen Plasmiden transient transfiziert. Nach 24 Stunden erfolgte die Zugabe von H2O2 und Bafilomycin A für die aufgeführte Zeit. Endogene Mengen von p62 und GAPDH wurden im Western Blot mit spezifischen Antikörpern detektiert.

SIRT2 in Drosophila-Modellen zur Neurodegeneration 3.5

Eine verbreitete Methode zur Erforschung von neurodegenerativen Erkrankungen ist

die Verwendung von Drosophila melanogaster als Modellorganismus. Um potenzielle

Effekte von SIRT2 in der Fliege zu untersuchen, wurden verschiedene Tierlinien

generiert, welche die humane Version des Proteins bzw. die Mutanten SIRT2-H150Y und

Ergebnisse

64

SIRT2-S331A exprimieren (Abbildung 33). Auch in Drosophila war eine phosphorylierte

Isoform von SIRT2 präsent (zu erkennen an der Doppelbande), was vermutlich auf die

hohe Konservierung der verantwortlichen Kinase CDK5 zurückzuführen ist [213].

Abbildung 33: Expression von SIRT2 in Drosophila. SIRT2 wurde unter Kontrolle des ELAV-Promotors in unterschiedlichen Drosophila-Linien exprimiert. Zur Kontrolle der Proteinsynthese wurden die Fliegenköpfe in RIPA-Puffer lysiert und im Western Blot analysiert. Der Nachweis erfolgte über spezifische Antikörper. SIRT2 erscheint in zwei Isoformen, unphosphoryliert (untere Bande) und einfach-phosphoryliert (obere Bande). In den mit * markierten Spuren wurden Lysate von Drosophila-Linien eingesetzt, welche in nachfolgenden Versuchen für weitere Verpaarungen genutzt wurden.

Das Komplexauge der Fruchtfliege besteht aus ca. 800 einzelnen Ommatidien, welche

wiederum aus jeweils acht Photorezeptoren aufgebaut sind. Da diese in direktem

Kontakt zu den Nervenzellen stehen, können neuronale Schäden bei Drosophila leicht an

Veränderungen der Retina erkannt werden. Typischerweise entsteht ein sogenannter

rough eye-Phänotyp (REP), begleitet vom Rückgang der Pigmentierung. In dieser Arbeit

wurden neurodegenerative Erkrankungen durch die Augen-spezifische Expression von

mehreren polyQ-enthaltenden Sequenzen sowie des mit der Amyotrophen

Lateralsklerose assoziierten TDP43 (TAR [trans-activation response element]-DNA-

bindendes Protein 43) simuliert. Jedes dieser Proteine löste, im Vergleich zu

ausschließlich den Kontrollvektor exprimierenden Fliegen (Abbildung 35), einen REP im

Fliegenauge aus (Abbildung 34).

Ergebnisse

65

Nachfolgend sollten die Effekte von SIRT2 auf die Krankheitsmodelle untersucht

werden. Die Expression von SIRT2 oder seinen Mutanten alleine ließ keine

offensichtliche Veränderung des Drosophila-Phänotyps erkennen (Abbildung 35).

Abbildung 34: Rough eye-Phänotyp in verschiedenen Drosophila-Modellen zur Neurodegeneration. Die angegebenen Gene wurden unter Kontrolle des GMR-Promotors in Drosophila-Augen exprimiert. Neuronale Schäden sind an makroskopischen Veränderungen des Facettenauges zu erkennen. Gezeigt sind repräsentative Bilder von wiederholten Verpaarungen.

Abbildung 35: Effekte der SIRT2-Expression auf den Phänotyp des Drosophila-Auges. SIRT2 wurde unter Kontrolle des GMR-Promotors in Drosophila-Augen exprimiert. Gezeigt sind repräsentative Bilder von wiederholten Verpaarungen.

Im Modell zur Huntington-Krankheit wurden Exon 1 des ursächlichen Gens mit

97 Glutamin-Wiederholungen (Htt-Ex1-Q97) und SIRT2 gleichzeitig unter Kontrolle des

augenspezifischen GMR-Promotors exprimiert. Weder der SIRT2-Wildtyp noch die

Mutanten –H150Y und -S331A hatten Einfluss auf den Huntingtin-induzierten REP

Ergebnisse

66

(Abbildung 36). Zur Kontrolle wurde ein Knockdown von Drosophila-SIRT2 im

Huntington-Modell durchgeführt. Dieser konnte die Degeneration des Auges leicht

verbessern, wie schon von Pallos et al. beschrieben [104]. Die Expression einer CDK5

RNAi zeigte keine Veränderung des REP.

Abbildung 36: Effekte von SIRT2 und CDK5 im Huntington-Modell. Die angegebenen Gene wurden unter Kontrolle des GMR-Promotors in Drosophila-Augen exprimiert. Gezeigt sind repräsentative Bilder von wiederholten Verpaarungen.

Abbildung 37: Effekte von SIRT2 und HDAC6 im Ataxin1-Modell. Die angegebenen Gene wurden unter Kontrolle des GMR-Promotors in Drosophila-Augen exprimiert. Gezeigt sind repräsentative Bilder von wiederholten Verpaarungen.

Sowohl die Überexpression als auch der Knockdown von SIRT2 wurden zusätzlich in

einem Modell zur Spinozerebellären Ataxie getestet. Im Gegensatz zum Huntington-

Modell verschlechterte die Expression der SIRT2 RNAi hier den induzierten REP,

während das Hinzufügen von humanem SIRT2 erneut keinen Effekt erkennen ließ

(Abbildung 37). Zusätzlich wurde in diesem Experiment HDAC6 herab reguliert, eine

Histondeacetylase, für welche bereits in verschiedenen neurodegenerativen Modellen

eine protektive Wirkung nachgewiesen wurde [174]. Auch in diesem Modell führte der

Ergebnisse

67

Knockdown von HDAC6 zu einer Verschlechterung des Phänotyps. Analog zum SIRT2-

Knockdown entwickelten sich über den REP hinaus nekrotische Bereiche im Fliegenauge

(Abbildung 37).

Weitere Experimente zur Neurodegeneration sind in Tabelle 1 zusammen gefasst.

Kreuzungen SIRT2-

WT SIRT2-H150Y

SIRT2-S331A

SIRT2 RNAi CDK5 RNAi HDAC6 RNAi

Htt-Ex1-Q97 Kein Effekt Kein Effekt Kein Effekt Verbesserung* Kein Effekt Nicht

getestet

PolyQ (Ataxin3-

Fragment) Kein Effekt Kein Effekt Kein Effekt letal*

Verschlech-terung,

verkürzte

Lebenszeit*

Verschlech-

terung*

Ataxin1-Q82 Kein Effekt Nicht

getestet Nicht

getestet Verschlech-

terung Nicht

getestet Verschlech-

terung

TDP-43 Kein Effekt Kein Effekt Kein Effekt Nicht

getestet Nicht

getestet Nicht

getestet

Tabelle 1: Übersicht über die Effekte von SIRT2 und Interaktionspartnern in Drosophila-Modellen zur Neurodegeneration. Die angegebenen Gene wurden unter Kontrolle des GMR-Promotors wiederholt in Drosophila-Augen exprimiert und eventuelle Veränderungen wie in den Abbildungen 34-37 makroskopisch bewertet. Die mit * gekennzeichneten Daten stammen aus einem früheren RNAi-Screen von H. Voßfeldt.

Diskussion

68

4 Diskussion

In den letzten Jahren ist die Klasse III Histonacetylase SIRT2 zunehmend in

Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen gebracht worden. Eine Reihe

von Studien beschrieb die protektive Wirkung der SIRT2-Inhibition in verschiedenen

Zellsystemen und Tiermodellen [100, 101, 102, 103, 104, 105]. Im Rahmen dieser

Untersuchungen wurden sowohl Effekte des Proteins auf die Gentranskription als auch

Einflüsse auf das Zytoskelett und intrazelluläre Transportprozesse sowie auf

Mechanismen des Proteinumsatzes in Betracht gezogen. Ziel dieser Arbeit war es die

Beteiligung von SIRT2 an der Pathogenese der Huntington-Krankheit zu analysieren und

den dahinter stehenden Mechanismus zu identifizieren.

SIRT2 wird im menschlichen Körper ubiquitär exprimiert, wobei durch alternatives

Spleißen verschiedene Isoformen entstehen [77, 83]. Als Voraussetzung für die

Experimente mit SIRT2 wurden in dieser Arbeit zunächst verschiedene humane

Zelllinien auf endogene Expression des Proteins getestet (Abbildung 11). Sowohl in den

aus der Niere stammenden HEK293 als auch in SH-SY5Y-Neuroblastomzellen konnte

SIRT2 nachgewiesen werden. In beiden Zelllinien dominierte die 43 kDa schwere

Isoform 1, in HEK293-Zellen war zusätzlich die längere Isoform 2 nachweisbar. Für die

folgenden Versuche wurde hauptsächlich diese Zelllinie benutzt, da sie verschiedene

Vorteile in der Handhabung bietet. Dazu zählen vor allem die einfache Kultivierung und

eine hohe erzielbare Transfektionseffizienz. Einige Experimente erforderten die

Entfernung von SIRT2 aus dem Zellsystem. Zu diesem Zweck wurden verschiedene

shRNAs in HEK293-Zellen exprimiert. Alle gegen Sirt2 gerichteten Sequenzen

beeinträchtigten effektiv die Expression des Gens, wie die anschließende

Immunpräzipitation und Detektion im Western Blot zeigte (Abbildung 12). Den

stärksten Knockdown erzielte shSIRT2-1, weshalb dieses Plasmid auch in weiteren

Versuchen eingesetzt wurde.

Fehlerhaftes Huntingtin enthält eine verlängerte Sequenz von Glutamin-

Wiederholungen in Exon 1, was dazu führt, dass sich das Protein zusammenlagert und

intrazelluläre Aggregate bildet. Diese sind SDS (Sodiumdodecylsulfat)–unlöslich und

lassen sich mit Hilfe einer Nitrozellulose-Membran auffangen [214]. Um zelluläre

Auswirkungen des Huntingtin-Proteins zu analysieren, sollte zunächst seine Löslichkeit

im Filter-Retardations-Versuch getestet werden. Da auch nicht-neuronale Zellen von der

Diskussion

69

Huntingtin-Aggregation betroffen sind [107], wurden HEK293-Zellen für diese

Versuchsreihe als geeignetes Modell erachtet. Zunächst wurde ein Huntingtin-Fragment

getestet, welches die ersten 590 Aminosäuren des Proteins umfasst und somit alle

bekannten Modifikations- und Spaltungsstellen enthält (Abbildung 4). Die Eigenschaft

des fehlerhaften Proteins zu Akkumulieren konnte in dem verwendeten Zellsystem

verifiziert werden. Nach Expression einer mutierten Huntingtin-Variante (Htt-590-Q97)

wurde das Protein auf einer Nitrozellulose-Membran detektiert, nicht jedoch nach

Expression des Wildtyps (Htt-590-Q25) (Abbildung 13).

Verschiedene Studien zur Huntington-Krankheit beschreiben die positive Wirkung von

HDAC- und Sirtuin-Inhibitoren auf das Überleben von Neuronen [29, 104]. Des Weiteren

beobachteten Outeiro et al. (2007) und Luthi-Carter et al. (2010) eine Veränderung des

Aggregationsverhaltens von -Synuklein und Huntingtin unter Verwendung des

spezifischen SIRT2-Inhibitors AGK2 [102, 105]. Dessen Wirkung auf Htt-590-Q97 wurde

im Rahmen dieser Arbeit überprüft (Abbildung 14). Die eingesetzte Konzentration

entsprach den in den oben genannten Arbeiten verwendeten Mengen und lag unterhalb

eines für die Zellen toxischen Bereichs (nicht abgebildet). Im Filter-Retardations-

Versuch war kein Einfluss von AGK2 auf die Huntingtin-Aggregation erkennbar. Zum

Vergleich wurde in dem Experiment der HDAC Klasse I- und Klasse II-Inhibitor TSA

getestet, welcher zu einer deutlichen Steigerung der akkumulierten Huntingtin-Menge

führte (Abbildung 14C). Der Effekt kann eventuell auf eine Störung der HDAC6-Aktivität

zurückgeführt werden, da diese Deacetylase am Abbau von Huntingtin über die

Autophagie beteiligt ist [165]. Dafür spricht auch die starke Zunahme an acetyliertem

Tubulin im Western Blot des gleichen Experiments (Abbildung 14A und B). Hier war

wiederum keine Veränderung durch Zugabe des SIRT2-Inhibitors AGK2 ersichtlich.

Möglicherweise ist in Zellen die Wirkung von SIRT2 auf -Tubulin deutlich schwächer

als die von HDAC6. Aber auch in anderen Studien zeigte sich AGK2 wirkungslos [97].

Letztlich können auch technische Problem nicht ausgeschlossen werden. Um solidere

Erkenntnisse über den Einfluss von SIRT2 auf die Huntingtin-Aggregation zu gewinnen,

wurde das Filter-Retardations-Experiment auch unter Knockdown der Deacetylase

durchgeführt (Abbildung 15). Im Gegensatz zum vorherigen Experiment zeigte sich hier

eine klare Reduktion der Aggregate, was dafür spricht, dass weniger die Aktivität von

SIRT2, sondern vor allem die Anwesenheit des Proteins ausschlaggebend ist.

Diskussion

70

Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die Akkumulation des Huntingtin-Fragments

durch einen Eingriff in die Autophagie modifiziert werden kann. Hierfür wurden

verschiedene Methoden angewendet. Zum einen erfolgte eine chemische Inhibition des

Prozesses durch den Wirkstoff Bafilomycin A, dessen Funktionalität anhand der Menge

des Autophagosom-assoziierten Proteins p62 kontrolliert wurde (Abbildung 16C). Zum

anderen wurde das SIRT2-Substrat FoxO1 herabreguliert, was ebenfalls die Autophagie

beeinträchtigen sollte [47]. In beiden Fällen konnte eine Zunahme der Huntingtin-

Aggregate im Filter-Retardations-Versuch beobachtet werden (Abbildung 16). Dies

bestätigt nicht nur die Beteiligung des Abbauprozesses, sondern spricht auch für die

Mitwirkung von SIRT2 an dessen Regulation.

Die Aggregation von Huntingtin sollte auch in der Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y

untersucht werden. Diese ist, wie auch die für die Huntington-Krankheit anfälligen

striatalen Neurone, GABAerg [215]. Da die Filter-Retardations-Methode wegen zu

niedrigen Transfektionseffizienzen in den SH-SY5Y nicht realisiert werden konnte,

wurde die zytoplasmatische Verteilung von Huntingtin in Immunfluoreszenz-

Experimenten untersucht (Abbildung 17). Sowohl der Wildtyp als auch die mutierte

Variante des Proteins zeigten eine diffuse zytoplasmatische Färbung, es waren keine

Akkumulationen erkennbar. Auch in einer Publikation von Jeong et al. [198] war nur ein

geringes Vorkommen sichtbarer Huntingtin-Punctae beschrieben worden. Das

Erscheinungsbild änderte sich in den Experimenten dieser Arbeit auch unter

Behandlung mit Bafilomycin A nicht sichtlich, obwohl die Hemmung der Autophagie an

der deutlich verstärkten p62-Färbung zu erkennen war. Möglicherweise wird das

exprimierte Fragment anders prozessiert als das vollständige Protein, obwohl alle

bekannten Modifikationsstellen vorhanden sind. Eventuell benötigen die Zellen auch

deutlich mehr Zeit, um ein sichtbares Aggregat zu bilden; im menschlichen Organismus

kann dies Jahre dauern. Für zukünftige Versuche könnte daher eine Zelllinie nützlich

sein, welche Huntingtin stabil exprimiert und eine Beobachtung über einen längeren

Zeitraum ermöglicht.

Das Huntingtin-590-Fragment wurde ferner auf Acetylierung getestet, da diese nach

einer Studie von Jeong et al. seinen Abbau über die Autophagie fördert [198]. Falls

Huntingtin ein SIRT2-Substrat ist, könnte dies eine Möglichkeit darstellen, wie die

Deacetylase in den zellulären Abbau eingreifen kann. Da mit den vorhandenen

Diskussion

71

Antikörpern die Modifikation nicht nachgewiesen werden konnte (Abbildung 18),

wurde der Ansatz in dieser Arbeit nicht weiter verfolgt.

In weiteren Aggregationsstudien wurde ein anderes Plasmid getestet, welches

Huntingtin-Exon 1 exprimiert und GFP-markiert ist (GFP-Htt-Ex1). Seine modifizierte

Form mit einem verlängerten polyQ-Segment bildet bereits nach kurzer Zeit ein deutlich

sichtbares Aggresom, wie in verschiedenen Studien beschrieben wurde [163, 165, 216].

Dieses Modell kommt dem in Patienten beobachteten Phänotyp näher, wo zumeist ein

einzelner Einschlusskörper entsteht, welcher größer ist als der Nukleolus [217]. Solche

Einschlusskörper können im Zellkern oder im Zytoplasma vorkommen [218]; die durch

das GFP-markierte Huntingtin-Exon 1-Fragment verursachten Aggregate waren

hauptsächlich zytoplasmatisch. Unter Verwendung dieses Plasmids wurde ein Teil der

Filter-Retardations-Versuche reproduziert. Die Aggregationstendenz der Q103-Mutante

wurde dabei bestätigt (Abbildung 19), ebenso deren Reduktion durch SIRT2-Knockdown

(Abbildung 20).

Da in Patienten die Länge des polyQ-Segments mit dem Ausbruchsalter und der Schwere

der Huntington-Krankheit korreliert, stellte sich als nächstes die Frage, inwieweit sich

die Anzahl der Glutamin-Wiederholungen im GFP-Htt-Ex1-Fragment auf die Zellvitalität

in dem hier verwendeten Modellsystem auswirkt. Versuche in HEK293-Zellen zeigten

einen klaren Zusammenhang zwischen polyQ-Häufung und Apoptoserate (Abbildung

21). Um herauszufinden, ob diese zytotoxischen Effekte letztlich auch mit der

Aggregatbildung von Huntingtin einhergehen, wurde die Entwicklung der Zellen

während der Expression des GFP-markierten Proteins beobachtet. Es stellte sich heraus,

dass fast ausschließlich diejenigen Zellen apoptotisch werden, in welchen sich zuvor ein

Huntingtin-Aggregat gebildet hat (Abbildung 22 und Abbildung 23). Dieses Ergebnis

lässt jedoch keinen Rückschluss darauf zu, ob ein Aggregat selbst für die Zelle schädlich

ist, oder ob es Anzeichen einer anderen Störung durch das fehlerhafte Huntingtin ist. Da

das Protein diverse Aufgaben innerhalb einer Zelle erfüllt (1.4.1.5), sind auch die

Möglichkeiten eine Fehlregulation zu verursachen vielfältig. Viele mittlerweile

durchgeführte Studien sprechen dafür, dass die Bildung eines Aggresoms protektiv für

die Zelle ist. Krankhafte Proteine können darin gelagert werden, wodurch ihre

intrazelluläre Konzentration sinkt [216, 219]. Es ist daher wahrscheinlich, dass die

durch SIRT2-Knockdown erzielte Reduktion der Huntingtin-Akkumulation und

Diskussion

72

Zytotoxizität (Abbildung 24 und Abbildung 25) ein sekundärer Effekt eines positiv

beeinflussten Zellmetabolismus ist. Interessanterweise war in diesen Versuchen keine

Veränderung der Aggregatform zu beobachten wie sie beispielsweise für -Synuklein

beschrieben wurde [102]. Dies deckt sich mit Beobachtungen von Luthi-Carter et al.

[105], ist aber vermutlich durch die vergleichsweise geringe Auflösung der

Fluoreszenzbilder bedingt. In einer Studie von Pieri et al. wurden sowohl -Synuklein-

Fibrillen als auch Huntingtin-Exon 1-Fibrillen mittels TEM (Transmissions-

elektronenmikroskopie) sichtbar gemacht [219]. In beiden Fällen waren diese

Strukturen Vorläufer größerer Akkumulationen. Sowohl -Synuklein als auch

Huntingtin werden letztendlich in Aggresomen gesammelt und anschließend über die

Autophagie abgebaut [165, 198, 220, 221, 222]. Generell könnte sich eine reduzierte

SIRT2-Funktionalität positiv auf den Transport der fehlgefalteten Proteine in die

Aggresomen auswirken - z.B. über eine Stabilisierung der Mikrotubuli - und somit die

Entfernung der toxischen Spezies aus dem Zytoplasma begünstigen. Darüber hinaus

wurde SIRT2 mehrfach direkt mit der Autophagie in Zusammenhang gebracht, unter

anderem über sein Substrat FoxO1 [47, 111]. Auch in dieser Arbeit beschleunigte die

Herabregulation von SIRT2 den Autophagie-assoziierten Abbau von p62 (Abbildung 32).

Möglicherweise gibt es also mehrere parallel ablaufende Wege, über welche die

Deacetylase Einfluss auf den intrazellulären Proteinumsatz nehmen kann. Eine

multifunktionale Aufgabe von SIRT2 ist auch insofern wahrscheinlich, als dass bis heute

eine posttranslationale Acetylierung für über 2000 Proteine nachgewiesen wurde,

wohingegen nur 18 humane Deacetylasen identifiziert werden konnten [72]. So gibt es

auch Beispiele für die Mitwirkung von SIRT2 an der proteasomalen Degradation [112].

Um ein detaillierteres Bild der SIRT2-Funktionen zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die

Aggregation und Toxizität von Huntingtin ferner in mehreren Zelllinien getestet, welche

verschiedene Mutanten der Deacetylase stabil und induzierbar exprimieren. Da erste

transiente Versuche keine drastischen Effekte erwarten ließen (Abbildung 26), wurde in

dem stabilen HeLa Flp-In T-REx-System mit mehreren modifizierten Varianten von

SIRT2 gearbeitet. Neben der bereits beschriebenen katalytisch inaktiven Mutante

SIRT2-H150Y kamen vor allem zwei Phosphorylierungsmutanten zum Einsatz.

SIRT2-S331A-S335A kann nicht durch CDK5 phosphoryliert und somit inhibiert werden

[97], während SIRT2-S331E-S335E die Doppelphosphorylierung des Proteins imitiert

und dadurch weniger aktiv sein sollte. Die stetige Expression der beiden SIRT2-

Diskussion

73

Varianten hatte keinen Einfluss auf das Wachstum oder die Morphologie der

HeLa Flp-In T-REx-Zellen (Abbildung 27 und Abbildung 28). Entgegen den Erwartungen

konnte keine der getesteten Proteinvarianten das Akkumulationsverhalten und die

Zytotoxizität von mutiertem Huntingtin statistisch signifikant beeinflussen (Abbildung

29 und Abbildung 30), obwohl der SIRT2-Knockdown in diesem Zellsystem wiederum

eine deutliche Veränderung bewirkte (Abbildung 31). Tendenziell schien die nicht-

phosphorylierbare SIRT2-Mutante die Aggregatbildung zu begünstigen, wohingegen die

Phospho-imitierende Variante eine leichte Reduktion erzeugte. Dies würde die Annahme

bestätigen, dass SIRT2-Aktivität und Huntingtin-Aggregation miteinander korrelieren.

Dagegen spricht der fehlende Effekt unter Expression der katalytisch inaktiven SIRT2-

H150Y-Mutante, für welche eine dominant-negative Wirkung angenommen wird [105,

223]. Wahrscheinlich ist es den Zellen möglich eine vermehrte Expression von SIRT2 zu

kompensieren. Darüber hinaus konzentrierten sich die Veränderungen an der

Deacetylase in den dargestellten Experimenten auf zwei bekannte Phosphorylierungs-

stellen im C-Terminus des Proteins. Die SIRT2-Aktivität kann jedoch auch über weitere

Modifikationen reguliert werden kann, z.B. durch Acetylierung [98]. Demgegenüber ist

der C-Terminus möglicherweise auch wichtig für die Interaktion von SIRT2 mit anderen

Proteinen [97], daher könnte er für andere SIRT2-Funktionen von Belang, im

Huntingtin-Modell aber sekundär sein. Der Bezug zu den CDK5-regulierten

Phosphorylierungsstellen war in diesem Fall von besonderem Interesse, da die Kinase

auch mit Huntingtin interagiert. Derzeit sind mindestens drei Stellen bekannt, an denen

Huntingtin durch CDK5 phosphoryliert werden kann, Serin 1181, Serin 1201 [224]

sowie Serin 434 [225]. Die Modifikation bewirkte in alle Studien einen Rückgang der

Aggregation und des Zellsterbens. In anderen Arbeiten wurde die protektive Wirkung

der Kinase mit einem nachgelagerten Effekt auf die Mikrotubuli in Zusammenhang

gebracht [226]. Die Bedeutung der CDK5-Aktivität für neurodegenerative Prozesse

wurde auch in anderen Krankheitsmodellen herausgestellt [227]. Zudem spielt CDK5

eine Rolle für die Induktion der Autophagie [228]. Anzumerken ist, dass zwischen CDK5

und SIRT2 ein Regelkreis besteht. In diesem wird einerseits SIRT2 phosphoryliert,

andererseits wird die Kinase durch SIRT2 deacetyliert [97]. Die zellulären

Konsequenzen dieser Modifikation sind bisher nicht bekannt, das Wechselspiel der

beiden Proteine könnte aber zur Regulation der oben genannten Prozesse beitragen.

Diskussion

74

Als Ergänzung zu den Zellkulturversuchen wurden in dieser Arbeit Experimente zum

Einfluss von SIRT2 auf neurodegenerative Erkrankungen in Drosophila melanogaster

durchgeführt. Die Fruchtfliege bietet diverse Vorteile als Modellorganismus und hat sich

in zahlreichen Studien zu humanen Erkrankungen bewährt. Ihr Genom ist mit ca.

14000 Genen auf vier Chromosomen vergleichsweise einfach, aber eingehend erforscht.

Man geht davon aus, dass etwa 75% der krankheitsassoziierten humanen Gene

funktionelle Homologe in der Fliege besitzen. Zudem sind viele intrazelluläre Prozesse

und Signalwege auch in Drosophila konserviert [202, 229].

In dieser Arbeit wurden drei Tierlinien generiert, welche das humane SIRT2 oder die

Mutanten SIRT2-H150Y oder SIRT2-S331A exprimieren (Abbildung 33). SIRT2 besitzt,

wie viele andere humane Proteine, ein Homolog in Drosophila. Auch in der Fliege ist

dieses an der neuronalen Morphogenese beteiligt und verfügt über Deacetylaseaktivität

[230, 231]. Auf verschiedene Weise wurde im Fliegenauge eine Neurodegeneration

induziert (Abbildung 34). Sowohl die Expression von Htt-Ex1-Q97 oder eines

trunkierten polyQ-Segments aus Ataxin-3, als auch die von Ataxin-1 und TDP-43 lösten

einen REP aus, wie zuvor beschrieben [201, 232, 233]. Im Modell zur Huntington-

Krankheit wurde der REP wie erwartet durch den Knockdown von SIRT2 gemildert (vgl.

[104]). Die Überexpression des Proteins oder seiner Mutanten sowie der Knockdown des

SIRT2-Regulators CDK5 hatten dagegen keinen Einfluss auf die Huntingtin-induzierte

Schädigung (Abbildung 36). In diesen Ergebnissen spiegeln sich somit die Resultate der

Zellkulturversuche wider. Auch in den anderen getesteten Modellen zeigte die

Überexpression von SIRT2 keine Auswirkungen auf den Phänotyp der Fruchtfliegen

(Tabelle 1). Zum einen könnte dies dadurch bedingt sein, dass nötige SIRT2-Substrate in

Drosophila nicht ausreichend konserviert sind. In Anbetracht der Zellkulturversuche ist

es jedoch wahrscheinlich, dass die Aktivität des Sirtuins über einen bislang nicht-

identifizierten Weg kontrolliert wird.

Interessanterweise zeigte sich im Ataxin-1-Modell ein anderes Bild als in den

Experimenten zur Huntington-Krankheit. Während die Überexpression von SIRT2

erneut keine Effekte auf den induzierten REP zeigte, wurde dieser hier durch den

Knockdown des Proteins zusätzlich verschlechtert (Abbildung 37). Die gleiche Tendenz

war für die Herabregulation von HDAC6 zu verzeichnen. Diese Deacetylase hat sich auch

in Drosophila-Modellen als protektiv für neurodegenerative Erkrankungen erwiesen,

Diskussion

75

unter anderem ist sie auch hier am Ablauf der Autophagie beteiligt [174]. Da auch

Ataxin-1 zu den Polyglutamin-Erkrankungen zählt, hätte man ähnliche Effekte wie für

die Huntington-bedingte Degeneration erwartet. Es scheinen aber in beiden Modellen

unterschiedliche Signalwege angesprochen zu werden. Auch wenn das Drosophila-

Modell nur bedingt eine Aussage über die Verhältnisse im menschlichen Organismus

geben kann, muss zukünftig näher untersucht werden, inwieweit den verschiedenen

Erkrankungen die gleichen intrazellulären Mechanismen zugrunde liegen und ab

welchem Punkt etwaige Therapieansätze differenziert werden müssen.

Anhang

76

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[227] B. Ikiz und S. Przedborski, „A Sequel to the Tale of p25/Cdk5 in Neurodegeneration,“ Neuron, Bd. 60, pp. 731-732, 2008.

[228] A. Wong, R. Lee, A. Cheung, P. Yeung, S. Chung, Z. Cheung und N. Ip, „Cdk5-mediated phosphorylation of endophilin B1 is required for induced autophagy in models of Parkinson's disease,“ Nature Cell Biology, Bd. 13, Nr. 5, pp. 568-579, 2011.

[229] M. Mallik und S. Lakhotia, „Modifiers and mechanisms of multi-system polyglutamine neurodegenerative disorders: lessons from fly models,“ Journal of Genetics, Bd. 89, Nr. 4, pp. 497-526, 2010.

[230] J. Parrish, M. Kim, L. Jan und Y. Jan, „Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites,“ Genes & Development, Bd. 20, pp. 820-835, 2006.

[231] A. Griswold, K. Chang, A. Runko, M. Knight und K. Min, „Sir2 mediates apoptosis through JNK-dependent pathways in Drosophila,“ PNAS, Bd. 105, Nr. 25, pp. 8673-8678, 2008.

[232] M. Mallik und S. Lakhotia, „RNAi for the large non-coding hsrω transcripts suppresses polyglutamine pathogenesis in Drosophila models,“ RNA Biology, Bd. 6, Nr. 4, pp. 464-478, 2009.

[233] P. Estes, A. Boehringer, R. Zwick, J. Tang, B. Grigsby und D. Zarnescu, „Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS,“ Human Molecular Genetics, Bd. 20, Nr. 12, pp. 2308-2321, 2011

Anhang

95

6 Anhang

Abbildungsverzeichnis 6.1Abbildung 1: Aufbau einer Nervenzelle. .................................................................................................. 5

Abbildung 2: Funktionale Einteilung des Nervensystems; nach [92]. ...................................................... 6

Abbildung 3: Lage der Basalganglien und des Thalamus im menschlichen Gehirn; nach [126]. .......... 10

Abbildung 4: Struktur und funktionale Domänen des Huntingtin-Proteins; nach [121]. ...................... 14

Abbildung 5: Beteiligte Faktoren in der Huntingtin-Pathologie [132]. .................................................. 15

Abbildung 6: Aufbau und Funktionsweise des Proteasoms [176] ......................................................... 18

Abbildung 7: Grundlegende Schritte der Degradation über die Autophagie. ....................................... 20

Abbildung 8: Schema des UAS/GAL4 Expressionssystems..................................................................... 33

Abbildung 9: Schematischer Aufbau eines Semidry-Western Blots. ...................................................... 37

Abbildung 10: Aufbau des Bio-Dot® SF Microfiltration Apparatus; nach www.bio-rad.com. ............... 38

Abbildung 11: Nachweis von endogenem SIRT2 in humanen Zelllysaten. ............................................ 40

Abbildung 12: Knockdown von endogenem SIRT2. ............................................................................... 41

Abbildung 13: Nachweis von Htt-590-Q97-Aggregaten im Filter-Retardations-Versuch. .................... 42

Abbildung 14: Einfluss von verschiedenen HDAC-Inhibitoren auf die Aggregation von Htt-590-Q97. . 43

Abbildung 15: Aggregation von Htt-590-Q97 unter SIRT2-Knockdown. ............................................... 44

Abbildung 16: Auswirkungen von Autophagie-Hemmung auf die Aggregation von Htt-590-Q97. ...... 45

Abbildung 17: Immunfluoreszenz-Färbung von Htt-590 in SH-SY5Y-Zellen. ......................................... 47

Abbildung 18: Test auf Acetylierung von Huntingtin-590. .................................................................... 48

Abbildung 19: Filter-Retardationsversuch mit GFP-Htt-Ex1. ................................................................. 49

Abbildung 20: Filter-Retardations-Versuch mit GFP-Htt-Ex1-Q103 unter SIRT2-Knockdown. .............. 50

Abbildung 21: Auswirkungen von zunehmenden Glutamat-Wiederholungen im Huntingtin-Exon 1-

Fragment auf die Apoptoserate von HEK293-Zellen. ............................................................................ 51

Abbildung 22: Expression von GFP-Htt-Ex1-Q103 in HEK293. ............................................................... 52

Abbildung 23: Korrelation von Huntingtin-Aggregaten und apoptotischem Phänotyp. ....................... 53

Abbildung 24: Auswirkungen von GFP-Htt-Ex1-Q103-Expression auf HEK293-Zellen........................... 55

Abbildung 25: Apoptoserate von SH-SY5Y-Zellen nach Transfektion mit GFP-Htt-Ex1-Q103. .............. 56

Abbildung 26: Einfluss von SIRT2-Überexpression auf die Aggregation von GFP-Htt-Ex1-Q103. ......... 57

Abbildung 27: Wachstumsverhalten von HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter SIRT2-Expression. ................ 58

Abbildung 28: Morphologie der HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter Langzeitinduktion von SIRT2. ............ 59

Abbildung 29: Auswirkungen von GFP-Htt-Ex1-Expression auf HeLa Flp-In T-REx-Zellen. ................... 60

Abbildung 30: Aggregation von GFP-Htt-Ex1 in HeLa Flp-In T-REx-Zellen nach Induktion von SIRT2. .. 61

Abbildung 31: Filter-Retardations-Versuch in HeLa Flp-In T-REx-Zellen unter SIRT2-Knockdown. ....... 62

Abbildung 32: Umsatz von p62 nach Induktion von Autophagie. ......................................................... 63

Abbildung 33: Expression von SIRT2 in Drosophila. ............................................................................... 64

Abbildung 34: Rough eye-Phänotyp in verschiedenen Drosophila-Modellen zur Neurodegeneration. 65

Abbildung 35: Effekte der SIRT2-Expression auf den Phänotyp des Drosophila-Auges......................... 65

Abbildung 36: Effekte von SIRT2 und CDK5 im Huntington-Modell. ..................................................... 66

Abbildung 37: Effekte von SIRT2 und HDAC6 im Ataxin1-Modell. ......................................................... 66

Anhang

96

Abkürzungsverzeichnis 6.2

°C Grad Celsius x g Vielfaches der Erdbeschleunigung A Ampere ADP Adenosindiphosphat ALS Amyotrophe Lateralsklerose APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure Atg autophagy related genes ATP Adenosintriphosphat ATXN Ataxin Baf A Bafilomycin A BDNF brain-derived neurotrophic factor BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise C- Carboxy- ca. circa CAG Cytosin-Adenin-Guanin CBP CREB-bindendes Protein CD cluster of differentiation CDC cell division cycle CDK cyclin-dependent kinase,

Zyklin-abhängige Kinase CMA chaperone mediated autophagy, Chaperon-vermittelte Autophagie CP core particle CREB cAMP response element- bindendes Protein Da Dalton DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DOC Desoxycholat Dox Doxycyclin DRPLA Dentatorubrale Pallidoluysische

Atrophie E Glutaminsäure ECL enhanced chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat ELAV embryonic lethal abnormal vision ER Endoplasmatisches Retikulum ERAD ER-assoziierte Degradation EtOH Ethanol Ex Exon FCS fetal calf serum,

Fetales Kälberserum FIP focal adhesion kinase family

interacting protein

Fox forkhead-box-Protein g Gramm GABA Gamma-Aminobuttersäure GAL Galaktosidase GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphat- Dehydrogenase GFP Grün fluoreszierendes Protein ggf. gegebenenfalls GMR glass multimer reporter H Histidin HAT Histonacetyltransferase Hda vgl. HDAC HDAC Histondeacetylase HEAT Huntingtin, Elongationsfaktor 3, Proteinphosphatase 2A, Hefe Kinase TOR1 HEK human embryonic kidney HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinyl)-ethansulfonsäure Hop homotypic fusion and protein

sorting HOX Homeobox HST homolog of Sir two Htt Huntingtin IP Immunpräzipitation k Kilo- K Lysin KE Kerneinheit l Liter LC3 light chain 3 M Mega- M Molare Masse m Meter m Milli- mTORC mammalian target of rapamycin

complex N- Amino- n Nano- NAD Nicotinamidadenindinukleotid NBR neighbor of Brca1 NES Nukleäres Exportsignal NLS Nukleäres Lokalisierungssignal NP-40 Nonidet p-40 PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PARP Poly-(ADP-ribose)-Polymerase PBS phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung

Anhang

97

PBST Phosphat-gepufferte Salzlösung mit Tween-20

PE Phosphatidylethanolamin PFA Paraformaldehyd PI3K Phosphoinositid-3-Kinase polyQ poly-Glutamin polyP poly-Prolin

Q Glutamin

R Arginin Rap Ras related proteins

RE Regulationseinheit

REP rough eye-Phänotyp RIPA radio-immunoprecipitation assay RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure RNAi RNA Interferenz RP regulatory particle Rpd reduced potassium deficiency S Serin S Sedimentationskoeffizient SBMA Spinobulbäre Muskelatrophie SCA Spinozerebelläre Ataxie SDS Sodiumdodecylsulfat,

Natriumdodecylsulfat shRNA short hairpin ribonucleic acid Sir silent information regulator SMA Spinale Muskelatrophie SNARE soluble N-ethylmaleimide-sensitive

factor attachment protein receptor SOD Superoxid-Dismutase Sp specificity protein

SQSTM sequestosome

SREBP sterol regulatory element-binding

protein

TAR trans-activation response

element

TBST tris buffered saline with Tween-20

Tris-gepufferte Salzlösung mit

Tween-20

TAR trans-activation response element TDP43 TAR-DNA-bindendes Protein 43 TEM Transmissions-

elektronenmikroskopie TEMED N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin Trp translocated promoter region TSA Trichostatin A UAS upstream activation sequence Ub Ubiquitin ULK unc-51-like kinase

UPS Ubiquitin-Proteasom-System V Volt v Volumen vgl. vergleiche w weight, Gewicht Y Tyrosin z.B. zum Beispiel µ Mikro-

Anhang

98

Danksagung 6.3

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Menschen bedanken, die mich unterstützt und

zur Realisierung dieser Arbeit beigetragen haben.

Als erstes möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Bernhard Lüscher bedanken, der mir die

Möglichkeit gegeben hat an diesem Projekt zu arbeiten und mir jederzeit für Gespräche,

Hilfestellungen oder aufmunternde Worte zur Verfügung stand.

Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Werner Baumgartner für die

Übernahme des Zweitgutachtens bedanken.

Mein Dank gilt außerdem all meinen Kolleginnen und Kollegen der Arbeitsgruppe

Lüscher und unserer kooperierenden Institute sowie meinen „SIRT-Kollegen“ Franziska

Flick und Nadine Schall. Ihr alle habt auf so vielfältige Weise zu diesem Projekt

beigetragen. Ich bin euch verbunden für die ständige Hilfsbereitschaft und guten Tipps

im Labor, die tolle Zusammenarbeit und für die vielen persönlichen Gespräche, Kekse

und Tassen Kaffee, die auch so manch einen Rückschlag erträglich gemacht haben.

Ganz besonders möchte ich mich bei Aaron Voigt, Peter Karsten und Hannes Voßfeldt

sowie allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Drosophila für die großartige Unterstützung

und den regen Austausch bedanken.

Ein herzliches Dankeschön auch an Andrea Ullius, die diese Arbeit auf der Suche nach

Tippfehlern, überflüssigen Kommas und sonstigen Ungereimtheiten durchforstet hat.

Nicht zuletzt gilt besonderer Dank meiner Familie und meinen Freunden für ihre

endlose Unterstützung, ohne die ich niemals an diesen Punkt gekommen wäre!

Anhang

99

Eidesstattliche Erklärung 6.4

Ich erkläre eidesstattlich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst

und alle in Anspruch genommenen Hilfen in der Dissertation angegeben habe. Des

Weiteren erkläre ich, dass die vorliegende Dissertation nicht bereits als Diplomarbeit

oder vergleichbare Prüfungsarbeit verwendet wurde.

Aachen, 28.08.2012 Daniela Otten

funktion der deacetylase sirt2 in neurodegenerativen...

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