MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

Funktionelle Genomanalyse mit Funktionelle Genomanalyse mit Microarray Microarray -- TechnologieTechnologie

DKFZ Lehrerforum, 7. Juli 2006

MarcusMarcus FrohmeFrohmeFunktionelle GenomanalyseFunktionelle Genomanalyse

Deutsches KrebsforschungszentrumDeutsches Krebsforschungszentrum

HeidelbergHeidelberg

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Was ist funktionelle Genomik ?

Was sind DNA Chips und wie werden sie hergestellt ?

Welche Anwendungsgebiete gibt es ?

Wie sehen Experimente mit DNA Chips aus ?

Welche Daten entstehen und was macht man damit ?

Welche anderen Chip-Typen gibt es ?

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Funktionelle GenomikFunktionelle GenomikZiel 1 Möglichst die „Funktionen“ aller Gene eines Organismus kennen

Ziel 2 Zustände anhand ihrer Genexpressionsmuster klassifizieren

Funktion =

Bedingungen für Transkription (räumlich / zeitlich)

wie wird ein Gen transkribiert (alternatives Splicing)

Prozessierung der mRNA

Bedingungen unter denen die mRNA translatiert wird

Modifikation des Proteins

Transport und Lokalisation des Proteins

Interaktionspartner

Aufgabe des Genprodukts im Stoffwechsel

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MethodischMethodisch-- Technische AnsTechnische Ansäätze tze

Systeme mit offener Architektur

Entdeckung neuer Gene möglich

experimentell schwieriger

keine besonderen Geräte

Datenreduktion meist auf molekularbiologischer Ebene

experimentelle Validierung

gut für Systeme mit wenig Vorinformation

Systeme mit geschlossener Architektur

umfangreiche Klon / Sequenz -Resourcen nötig

technisch aufwendiger

spezielle Gerätschaften

statistische Validierung

Datenreduktion auf bioinformatischer Ebene

für Systeme mit viel Vorinformation

MetabolischePathways

Ziele beider Strategien: Identifikation regulierter Gene

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Methoden zur vergleichenden Analyse Methoden zur vergleichenden Analyse transkriptioneller Aktivittranskriptioneller Aktivitäätt

Grundannahme: zwei (oder mehr) zu vergleichende Systeme

System 1 – Normal- oder Grundzustand, KontrolleSystem 2 – gegenüber 1 veränderte Genexpression

>>> RDA, SSH, RNA-Fingerprinting, SAGE (offene Architektur)

>>> Array / Chip – Techniken (geschlossene Architektur)

Basis solcher Analysen sind Veränderungen in der Expression (Herauf- / Herabregulation) von Genen

>>> Expressionsverhältnisse (ratios)

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Was ist ein Chip ?Was ist ein Chip ?„... vermutlich etwas kleines, hartes“

Analyte auf einer

Oberfläche

Mikrofluidische Reaktions Kammer

small moleculesDNA

Oligonukleotide

PCR-Produkte

längere DNAs

ProteinProteine

Antikörper ...

Peptide

Gewebe

Zellen

Organismen

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Biochips (Arrays)Biochips (Arrays)

Target (in Lösung)

geordnete Proben auf Träger (Chip / Array / Mikrotiterplatte)

Bindung / Wechselwirkung

Detektion

Vorteile: Durchsatz, Parallelisierung, Automatisierung

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Prinzip der Prinzip der DNADNA--Array Array

TechnologieTechnologie

markierteNukleinsäure

spezifische Bindungan geordnete Matrixaus DNA-Sequenzen(Hybridisierung)

Datenanalysedurch Muster-Erkennung

*

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DNA DNA -- Arrays = DNA Arrays = DNA -- ChipsChips

Micro und Macroarrays

Arrays mit PCR Produkten und solche mit Oligonukleotiden als probe

Commercial, commercial-custom und selfmade

Spotting arrays undin situ synthetisiserte Arrays

Arrays aus unterschiedlichen Materialienund mit verschiedenen Oberflächen

globale und spezifische Arrays

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Belegungsdichte auf ArraysBelegungsdichte auf Arrays5 / cm2

handmade

bis 120 / cm2

Makroarray

~ 3000 / cm2 Mikroarray> 100.000 / cm2 in situ Synthese Array

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Herstellung von Microarrays (Printverfahren)Herstellung von Microarrays (Printverfahren)

PCR - Produkte

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SpotterSpotter

für Macroarrays

und Microarrays

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Oligomer Oligomer –– ArraysArraysin situ Synthese Arrays Print / Spotted Arrays

Lichtgesteuerte Synthese Inkjet Technologie

Affymetrix System Febit System

Genechip Geniom

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Microarray Microarray -- ExperimentExperimentGen 1 Gen 2 Gen 3

sample 1 sample 2RNA

eingescanntes Bild

Intensitäten bzw. Ratios

cDNA microarray

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Imaging (Scanner)Imaging (Scanner)Slide - Scanner

Hybrid - System

Phospho - Imager

wichtige Eigenschaften:Auflösung, Wellenlängen

auch in Gebrauch:CCD Kamera Systeme

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Ein typisches ArrayEin typisches Array--ExperimentExperiment

Bioinformatische Analyse / Datenbank

Klone / SequenzResource

PCR

MembraneGlasFluoreszenzMarkierung

RadioaktiveMarkierung

Gewebe

Phänotype

krankgesund

Auswahl

Klon / Sequenz -Bibliothek

Beschreibung der Klone / Sequenzen

Beschreibung desExperimentsIntensitäts Werte / Ratios

Phänotyp ~ Genexpression ~ Stoffwechselwege

Hybridisierung

RNA / cDNAMarkierung

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Wie entstehen Arraydaten ?Wie entstehen Arraydaten ?Umsetzung vom Bild in Intensitätswerte >>> Spoterkennung

den Spots Namen zuordnen (Positionen, Gennamen)und Signalintensitäten messen

Arraydaten bestehen zunächst aus Intensitätswerten

A1 A2 A3 A4A5 A6 A7 A8B1 B2 B3 B4B5 B6 B7 B8C1 C2 C3 C4C5 C6 C7 C8D1 D2 D3 D4D5 D6 D7 D8E1 E2 E3 E4E5 E6 E7 E8F1 F2 F3 F4F5 F6 F7 F8G1 G2 G3 G4G5 G6 G7 G8H1 H2 H3 H4H5 H6 H7 H8I1 I2 I3 I4I5 I6 I7 I8J1 J2 J3 J4J5 J6 J7 J8

Block Column Row Name ID X Y Dia.F650 Median

F650 Mean

F650 SD

F550 Median

Ratio of Medians (650/550)

1 1 1 NCU01175.1 123a4_020_804 2190 3170 100 1722 2060 1698 1043 1.6511 2 1 NCU01168.1b 123a4_100_2243 2410 3140 40 0 148 378 0 01 3 1 NCU01160.1 123a4_200_1367 2620 3160 110 0 610 1137 0 01 4 1 NCU01370.1 15e6_030_1569 2840 3150 100 813 1197 1347 418 1.9451 5 1 NCU01361.1 15e6_130_2358 3060 3040 100 0 272 654 0 01 6 1 NCU03742.1 17e5_010_969 3270 3160 90 76 594 997 0 1000001 7 1 NCU01033.1 1a9_090_2678 3490 3150 110 867 1417 1515 206 4.2091 8 1 NCU01021.1 1a9_200_757 3700 3150 100 0 446 799 0 01 9 1 NCU08052.1 1nc100_050_1022 3930 3060 60 0 202 426 0 01 10 1 NCU07439.1 1nc120_140_103 4130 3150 100 3665 4169 2630 3358 1.0911 11 1 NCU07448.1 1nc120_220_732 4420 3100 60 0 148 438 0 01 12 1 NCU07456.1 1nc130_010_555 4560 3150 100 4739 5446 3962 3097 1.531 13 1 NCU09093.1 1nc200_250_1514 4760 3140 100 0 469 853 0 01 14 1 NCU09101.1 1nc200_330_1009 5010 3080 140 0 342 758 0 0

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Wie geht es weiter mit den Arraydaten ?Wie geht es weiter mit den Arraydaten ?(Reihenfolge abhängig vom verwendeten Analysesystem)

(Experiment wiederholen)

Datenbank anlegen / Daten einpflegenexperimentelle Annotation

Korrektur (z. B. Hintergrund)Normalisierung (angleichen)

Filtern / Datenreduktion

Intensitätswerte in Bezug zur experimentellen Fragestellung setzen (Analyse)

Metaanalyse / Dataminingz. B. Pathway Construction, GenAnnotation

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Was der Biologe am Ende gerne sehen mWas der Biologe am Ende gerne sehen mööchte !chte !Beispiel : Lupusnephritis im MausmodellBeispiel : Lupusnephritis im Mausmodell

Gen Kond. 1 Kond. 2 Zelltypspezifisch für CD 52 1,4 3,7 T-Lymphozyten CD 63 -1,2 -1,2 Macrophagen Chemokin Rezeptor 2 -1,4 -2 Cytokin A5 1,4 6 T - Zellen, Macrophagen Cytokin A8 1,3 3,6 Cytokin A19 1,9 4,4 Macrophagen Decorin 1,3 2,5 FcγRIIb 1,4 1,3 Lysozym Sequenz 1 3,2 11,2 Granzyme A 1,4 6,1 cytotox. T - Lymphozyten toll-like Rezeptor 3 -1,2 -1,9 dendritische Zellen ATPsynthase alpha subunit, 1 1,1 1,3 House-keeping Gen beta-Aktin 1,4 2,1 House-keeping Gen Isocitrat Dehydrogenase 1 -1,2 -1,5 House-keeping Gen Interferon regulatory factor 1 1,1 2,1 Cathepsin B 1,2 1,1 Interferon alpha 11 1,7 2,9

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einfache Analyse von Arraydateneinfache Analyse von ArraydatenBeispiel Scatterplot

log

[Sig

nal I

nten

sitä

t in

1]heraufreguliert

in Probe 1

heraufreguliertin Probe 2

log [Signal Intensität in 2]

konstitutivtranskribierte Gene

Housekeeping GenExterne Kontrolle

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Beispiel: Pathogenantwort einer PflanzeBeispiel: Pathogenantwort einer Pflanze

M. Scheideler

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Transkriptraten verschiedener GeneTranskriptraten verschiedener Genenach unterschiedlichen Zeiten

gene annotation FACTOR SI SI FACTOR SI SI FACTOR SI SI FACTOR SI SIno. clone_ID EST_ID description 0h C0 I 0 2h C2 I 2 7h C7 I 7 24h C24 I 24

5248 91I8T__ P_26316___ RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE/OXYGENASE ACTIVASE PRECURSOR 96,85 1 97 1,00 1 1 164,04 1 164 18,49 1 189024 92M17T_ P_3493____ PUTATIVE RECEPTOR PROTEIN KINASE TMK1 PRECURSOR. [dbEST] 1,65 1 2 1,70 1 3 14,49 4 54 1,91 1 2

12639 H4B9T__ P_23091___ Dhm1 protein isolog 1,54 1 2 6,64 2 10 10,00 1 10 1,00 1 110272 132D4T_ P_9050____ FLORAL HOMEOTIC PROTEIN AGL2 [dbEST] 2,44 1 2 1,00 1 1 8,51 2 20 1,00 1 1

1651 VBVJB03 Q_ATTS4188 pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit isolog 2,57 1 3 0,26 7 2 6,00 8 47 1,00 1 17211 G6C3T__ P_21813___ heat shock cognate protein 70-1 - Arabidopsis thaliana [dbEST] 1,02 1 1 0,55 4 2 5,92 1 7 1,00 1 1

13126 143O13T P_9699____ ORF [Lilium longiflorum] [dbEST] 0,72 2 2 0,64 15 10 5,20 3 13 1,57 1 210737 H6E7T__ P_23229___ PHYTOCHROME A [dbEST] 1,00 1 1 0,54 3 2 5,07 1 5 1,00 1 112387 247E18T P_22432___ PROBABLE GLUTATHIONE S-TRANSFERASE PARC (AUXIN-REGULATED PROTEIN PARC) [dbEST] 1,28 1 1 1,05 6 7 4,25 14 60 1,53 1 2

6371 169L7T_ P_13846___ PEROXIDASE C1A PRECURSOR [dbEST] 1,19 18 21 1,81 61 111 3,97 46 182 1,73 9 169433 190P9T_ P_16542___ GLUTATHIONE S-TRANSFERASE ERD11 (CLASS PHI). [dbEST] 2,03 9 18 1,96 178 350 3,96 121 479 3,08 4 12

11527 249K16T P_22681___ tyrosine transaminase (EC 2.6.1.5) - human [dbEST] 1,39 1 1 0,56 12 7 3,90 16 62 1,00 1 19056 VBVQD02 Q_ATTS4790 parC auxin-induced protein isolog 1,25 3 4 1,85 29 54 3,86 92 356 6,58 1 10

13011 VBVUH06 Q_ATTS4866 hin1 [Nicotiana tabacum] [dbEST] 0,71 3 2 0,74 29 21 3,74 25 92 1,76 1 22026 187I4T_ P_16820___ GLUTATHIONE S-TRANSFERASE ERD11 (CLASS PHI). [dbEST] 0,85 18 16 2,13 168 358 3,65 82 300 2,58 5 14

729 169G16T P_13816___ heat shock cognate protein, hsc70 1,03 65 67 1,15 367 423 3,60 202 726 0,98 48 4712876 135L24T P_9390____ GLUCOSE-1-PHOSPHATE ADENYLYLTRANSFERASE SMALL SUBUNIT PRECURSOR 0,84 42 35 1,16 364 422 3,59 141 505 1,80 16 2811741 G6A6T__ P_21803___ heat shock cognate protein 70-1 - Arabidopsis thaliana [dbEST] 1,00 1 1 0,17 6 1 3,57 1 4 1,00 1 1

5839 206N21T P_18405___ GLUTATHIONE S-TRANSFERASE ERD11 (CLASS PHI). [dbEST] 1,81 8 15 1,63 187 304 3,57 134 477 3,07 4 127628 154B14T P_11278___ Highly similar to S. cerevisiae hypothetical protein YD9727.20p, (PIR accession number S52690). Sho 1,54 3 5 1,88 20 38 3,56 10 34 1,27 2 29282 137K24T P_9268____ MALATE OXIDOREDUCTASE (MALIC ENZYME) (ME) (NADP-DEPENDENT MALIC ENZYME) (NADP-ME) 1,10 11 11 1,59 98 156 3,55 56 200 1,27 6 76947 166J4T_ P_12764___ ubiquitin-like protein 12 - Arabidopsis thaliana [dbEST] 0,81 24 20 0,74 251 187 3,48 52 181 1,41 9 12

12070 155M24T P_11791___ PCNT115 auxin-induced protein [dbEST] 1,00 1 1 1,01 1 1 3,42 1 4 1,00 1 14863 167B1T_ P_13298___ BRPK protein kinase isolog 1,28 9 12 0,94 33 31 3,34 25 83 1,31 3 54614 184B22T P_15739___ PDR5-like ABC transporter [Spirodela polyrrhiza] [dbEST] 1,18 10 11 1,40 165 230 3,34 80 268 1,73 4 87951 146P10T P_11128___ HYPOTHETICAL 51.9 KD PROTEIN YCF45 (ORF455). [dbEST] 1,19 10 12 1,10 91 99 3,27 44 145 2,28 5 128070 F2F6T__ P_21073___ S-adenosylmethionine decarboxylase [Arabidopsis thaliana] [dbEST 2,23 14 31 1,19 74 87 3,23 36 116 1,31 8 116368 146N22T P_11122___ polyubiquitin, ubq11 1,00 72 72 1,17 767 894 3,17 186 589 1,03 36 381953 181C24T P_15078___ heat shock cognate protein, hsc70 1,15 64 73 1,31 379 497 3,17 278 879 1,32 45 59

11158 204L23T P_17297___ cytochrome P450CMEF - mouse (fragment) [dbEST] 1,51 11 17 1,38 41 57 3,15 60 188 1,50 4 610784 71G4T__ P_8392____ ribosomal protein L29 isolog 2,37 12 28 1,86 25 46 3,14 27 85 0,79 7 6

9437 F2G4T__ P_21080___ formate--tetrahydrofolate ligase (EC 6.3.4.3) - spinach [dbEST] 2,10 4 8 1,42 47 67 3,12 41 129 2,91 2 51194 141I15T P_9977____ rad8 protein - fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) (fragment) [dbEST 1,21 69 83 0,82 635 523 3,09 128 395 0,58 27 16

1790 166N16T P_13235___ protochlorophyllide reductase (EC 1.3.1.33) precursor - Arabidopsis thaliana [dbEST 1,04 1 1 1,02 2 2 0,27 6 2 1,04 1 17762 VBVYE12 Q_ATTS2146 thioglucoside glucohydrolase, thioglucoside glucohydrolase 1,00 1 1 2,80 2 5 0,27 6 2 1,00 1 1

12643 67F3T__ P_15913___ pEARLI 1 proline-rich protein isolog 1,86 2 3 1,45 16 22 0,27 54 14 1,32 1 16899 VBVZG12 Q_ATTS1157 IAA13 0,89 1 1 2,76 1 3 0,27 4 1 1,00 1 1

11106 185992_ Q_ATTS1224 Cf1 ATPase epsilon subunit 1,63 1 2 0,48 4 2 0,27 9 2 1,00 1 113651 138E9T_ P_9884____ strictosidine synthase - Rauvolfia mannii (fragment) [dbEST] 1,27 1 2 1,84 9 17 0,26 25 7 1,05 1 112650 VBVRB07 Q_ATTS2082 S-adenosylmethionine synthetase 2, sam-2 0,48 11 5 1,77 28 49 0,26 25 7 0,62 4 3

8045 G1C8T__ P_21395___ thioredoxin reductase - Arabidopsis thaliana [dbEST] 0,98 7 6 1,75 25 43 0,26 73 19 1,16 2 35318 45H8T__ P_2211____ E. coli hypothetical 37.6 kDa protein in CLD 5' region isolog 0,87 2 1 0,91 9 8 0,25 15 4 1,00 1 1

12688 VCVCB02 Q_ATTS1637 Bronze-2 protein [Arabidopsis thaliana] [dbEST] 1,00 1 1 1,00 1 1 0,24 4 1 1,00 1 11646 240H5T_ P_20919___ thioredoxin [Lilium longiflorum] [dbEST] 1,08 2 2 0,91 7 7 0,23 28 7 1,06 1 1

12681 132P12T P_9108____ RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 5 PRECURSOR [dbEST] 0,82 2 2 1,78 6 11 0,23 37 9 0,74 2 112041 79G1T__ P_2432____ NAM8 protein - yeast (Saccharomyces cerevisiae) [dbEST] 1,29 1 1 1,57 5 7 0,23 23 5 0,61 2 1

9627 153L19T P_11263___ HYPOTHETICAL 20.2 KD PROTEIN IN PRS2-LEU1 INTERGENIC REGION [dbEST] 0,91 3 3 1,31 14 19 0,23 50 11 1,18 1 2138 143F4T_ P_9674____ receptor-like protein kinase precursor - Arabidopsis thaliana [dbEST] 0,91 1 1 1,23 1 2 0,22 12 3 0,99 1 1

11507 110D18T P_5306____ cytochrome b5 - rice [dbEST] 1,05 5 6 0,63 33 21 0,22 63 14 0,68 4 33180 222N13T P_19548___ 40S RIBOSOMAL PROTEIN S21 [dbEST] 1,36 19 26 2,46 114 282 0,22 694 152 1,17 8 96753 VBVDB08 Q_ATTS3197 ribosomal protein S4 isolog 1,14 2 2 1,71 11 19 0,22 60 13 1,09 1 1

13766 VBVIF07 Q_ATTS1781 ATP synthase B' chain isolog 0,98 1 1 0,71 2 1 0,20 5 1 1,00 1 19811 VBVWB10 Q_ATTS4970 beta-2 tubulin, TUB2 1,00 1 1 0,84 1 1 0,20 7 1 1,00 1 19172 123N21T P_7515____ CRUCIFERIN PGCRURSE5 PRECURSOR (11S GLOBULIN) (12S STORAGE PROTEIN) [dbEST] 1,17 3 3 1,49 9 13 0,20 19 4 1,31 1 13593 VBVTF04 Q_ATTS4937 pollen allergen homolog isolog, hypothetical protein, pollen allergen homolog - garden pea [dbEST 0,98 1 1 1,64 2 3 0,20 11 2 1,00 1 1

13261 VBVWC06 Q_ATTS4972 G-protein subunit [Arabidopsis thaliana] [dbEST] 1,00 1 1 0,78 1 1 0,18 5 1 0,82 1 17469 155I15T P_11765___ dynein light chain, 8k - Chlamydomonas reinhardtii [dbEST] 0,99 1 1 1,80 2 4 0,18 6 1 1,00 1 14888 120592_ Q_ATTS0539 orf04 gene product [Arabidopsis thaliana] [dbEST] 1,00 1 1 1,25 1 2 0,18 9 2 0,91 1 15975 148G18T P_10719___ HYDROXYMETHYLGLUTARYL-COA SYNTHASE (HMG-COA SYNTHASE) 0,53 2 1 0,49 9 5 0,15 10 2 0,87 1 1

567 240K20T P_20678___ Di19 protein - Arabidopsis thaliana [dbEST] 0,74 6 4 0,55 73 40 0,14 134 19 1,25 2 31113 VBVXE09 Q_ATTS5022 SPF1 protein - sweet potato [dbEST] 1,06 1 2 1,33 7 9 0,14 45 6 0,51 2 1

11464 VBVNB12 Q_ATTS4310 PYROPHOSPHATE--FRUCTOSE 6-PHOSPHATE 1-PHOSPHOTRANSFERASE ALPHA SUBUNIT (PFP) 1,01 1 1 1,12 6 7 0,13 15 2 1,00 1 19596 VBVSF02 Q_ATTS2134 HYPOTHETICAL 41.2 KD PROTEIN IN PLC1-SEC21 INTERGENIC REGION [dbEST] 0,82 1 1 0,59 7 4 0,13 24 3 0,92 1 11114 VBVID09 Q_ATTS1095 RNA-binding protein 0,87 1 1 1,00 1 1 0,11 71 8 1,00 1 18984 VBVPH10 Q_ATTS4747 osmotin 0,98 1 1 1,02 3 3 0,11 13 2 1,21 1 1

12461 H10E3T_ P_23877___ plasma membrane H+-ATPase gene 1,00 1 1 12,30 1 12 0,06 17 1 1,00 1 112044 106C1T_ P_4067____ INITIATION FACTOR 5A-2 (EIF-5A) (EIF-4D) [dbEST] 0,93 1 1 2,86 1 3 0,05 21 1 0,80 1 113210 F4G6T__ P_21299___ AQUAPORIN. [dbEST] 1,00 1 1 25,98 1 26 0,03 40 1 0,44 5 2

Scheideler et al. (2002). J Biol Chem 277 (12):10555f

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

Analyse von Analyse von metabolischen metabolischen

Pathways

PHENYLALANINEPHENYLALANINE

5.15.2

4.154.16

ACETYLACETYL--CoACoA

2.1PYRUVATEPYRUVATE

1.10

GLUCOSEGLUCOSE

PENTOSEPHOSPHAT

ECYCLE

33--DEOXYDEOXY--ARABINOARABINO--HEPTULOHEPTULO--SONATESONATE--

77--PHOSPHATEPHOSPHATE

arom

atic

am

ino

aci

d b

iosy

nthe

sis

CHORISMATECHORISMATE

TYROSINETYROSINEP

HE

NY

LPR

OP

AN

OID

S

44--COUMARATECOUMARATE

FLAVONONEFLAVONONE FERULATEFERULATE

5.35.4

5.5

5.65.7

Isoflavonoids

Salicylic acid

Lignins

7.1

7.3

GLYOXYLATEMETABOLISM

FORMYLFORMYL--CoACoA

1.2

1.51.61.71.81.9

1.1

1.41.3

2.32.3

2.4

2.62.7

KREBSCYCLE 2.5

2.2

2.9

GLY

CO

LYS

IS

3.13.2

3.5

3.6

3.3

3.4

7.2

ETH

YLE

NE

SY

NTH

ES

IS

METHIONINEMETHIONINE

ETHYLENEETHYLENE

6.1

6.2

6.3

Glutathione-S-Transferase

PR-ProteinsPR-1PR-3

2.8

4.64.7

4.24.34.44.5

4.1

4.13

4.154.14

4.84.9

4.104.11

4.12TRYPTOPHANTRYPTOPHAN

Pathwaysbei der

Pathogenabwehr

vier Zeitpunkte0, 2, 7, 24 Stunden

Scheideler et al. (2002). J Biol Chem 277 (12):10555f

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

GLYOXYLATEMETABOLISM

AusschnittvergrAusschnittvergrößößerungerung FORMYLFORMYL--CoACoA

7.1

7.3

2.32.3

2.4

7.2

KREBSCYCLE

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

1

2

3

4

5

6

7

8

91 50,2

Zusammenfassen Zusammenfassen (Clustering)(Clustering)

Gene Gene äähnlicher hnlicher Expression Expression

in verschiedenenin verschiedenenTumorprobenTumorproben

Erkennen funktioneller Zusammenhänge zwischen

1) Targets (hier: Tumore)2) Sonden (Gene) M. Nees / F. Diehl

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

Wildtyp, gefüttert

Wildtyp, gefastet

Diabetisch, gefüttert

Diabetisch, gefastet

20 k array

Filter: Sättigung, Min. Intensität, Ratio > 1.5

Komplexe mehrdimensionale AnalyseKomplexe mehrdimensionale AnalyseBeispiel Insulintoleranz im MausmodellBeispiel Insulintoleranz im Mausmodell

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

weitere Anwendungen von Arraysweitere Anwendungen von Arraysneben dem Erstellen von Transkriptionsprofilen werden

(insbesondere Oligomer) Arrays auch verwendet für

Genotyping : Bestimmung des Genotyps (meist sequenzgenau)

- Typisierung von Pathogenen (z. B. Viren)- GVO-Nachweis (gentechnisch veränderte Organismen)

- SNP Analyse - Mutationsdetektion

- Methylierungszustand- (Re)Sequencing by Hybridization

MMARCUSARCUS FFROHMEROHMEMMARCUSARCUS FFROHMEROHME

Was ist ein Chip ?Was ist ein Chip ?

Analyte auf einer

Oberfläche

„... vermutlich etwas kleines, hartes“

Mikrofluidische Reaktions Kammer

DNAProtein

small molecules

Oligonukleotide

PCR-Produkte

längere DNAs

Proteine

Antikörper ...

Peptide

Gewebe

Zellen

Organismen

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AntikAntiköörper Chip rper Chip = Protein Profiling Array= Protein Profiling Array

z. B. Protein-Profilingvon Tumor Proben

ReferenzTest

Markierung mit Fluor.

Farbstoffen

zwei Farbstoffe

ein Farbstoff

Detektion von Markern z. B. Proteine aus

Pathogenen, Tumormarker>>> Diagnostik

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Protein ChipProtein Chip= Funktionelle Protein Arrays= Funktionelle Protein Arrays

Beispiel: Autoantigen-Chip um spezifische Autoantikörper von Autoimmun-Krankheiten in Patientenserum zu detektieren

1152-“feature“ Rheuma Autoantigen Array (Proteine, Peptide), inkubiert mit Patienten Serum (Mischung)

Detektion von Autoantikörpern bei 9 Patienten

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Small Small –– Molecule ArrayMolecule Array…… Chemogenomics, Glycomics Chemogenomics, Glycomics ……

chem. Bibliothek mit Leitstrukturenz. B. zur Identifikation von

Protein-Inhibitorenals mögliche Pharmaka

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Gewebe Gewebe –– MicroarraysMicroarrayszur parallen Untersuchung von Gewebe Schnittenzur parallen Untersuchung von Gewebe Schnitten

540 Blasen-tumore

bspw.zur Analyse von Genenund Proteinen

A – H&E FärbungB – ein Gewebeschnitt (0,6mm)C – RNA-in situ Hybridisierung

>>> Transkription eines best. Gens

D – Immunhistochemie mit Antikörper >>> Expression eines best. Proteins

E – Fluorescenz in situ Hybridisierung >>> Amplifikation eines best. Gens

MMARCUSARCUS FFROHMEROHME

Lebende Zellen im ArrayLebende Zellen im Array--FormatFormatMikrotiterplatte Printarray mit Zelllinien

Analyse mit Antikörpern

StrukturchipsStrukturchips

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ZellulZellulääre Biochips re Biochips –– Typ 1Typ 1

auf einer Oberfläche [A] mit DNA, Proteinen oder anderen Molekülen werden Zellen kultiviert [B]

die Moleküle auf der Oberfläche interagieren mit den Zellen [C]

evtl. wird ein zweites Molekül appliziert [D]

[C][A]

Pharmakon

[D]Zellen

[B]

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Zell Zell –– Biochips Typ 2Biochips Typ 2Zellen werden auf eine Oberfläche aufgebracht und unter verschiedenen

Bedingungen untersucht (v. a. microfluidische Systeme)

Avivas PatchClamp-Chip

Infineon Neuro-Chip

Ayanda Chip for Electrophysiology

Messung von Veränderungen des elektrischen Zell-Potenzials

Applikation von Pharmaka

Untersuchung von Ionen Kanälen

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Vielen Dank !Vielen Dank !