Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук

На правах рукописи

Троянова Наталья Игоревна

Противовоспалительные эффекты БТШ70 в индуцированном

аллергическом воспалении дыхательных путей у мышей

(Специальность 03.03.01 – физиология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Сапожников Александр Михайлович

Москва, 2015г.

2

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................... 7

2.1. Бронхиальная астма ........................................................................................... 7

2.1.1. Клеточный ответ при астме ........................................................................... 8

2.1.2. Гуморальный иммунный ответ при астме ................................................. 17

2.2. Белки теплового шока ...................................................................................... 24

2.2.1. Семейства белков теплового шока ............................................................. 25

2.2.2. Семейство БТШ70 ........................................................................................ 27

2.2.3. БТШ70 и иммунитет .................................................................................... 34

2.2.4. БТШ70 в аллергии и астме .......................................................................... 34

2.2.5. БТШ70 при воспалении дыхательных путей ............................................ 35

2.2.6. БТШ70 в регуляции активности нейтрофилов .......................................... 35

2.3. Активные формы кислорода ........................................................................... 36

2.4. NADPH-оксидаза .............................................................................................. 38

2.4.1. Свойства и функции компонентов NADPH-оксидазы ............................. 39

2.4.2. Ингибиторы NADPH-оксидазы .................................................................. 42

2.4.3. NADPH-оксидаза и цитоскелет ................................................................... 42

2.4.4. Взаимодействие БТШ70 и NADPH-оксидазы ........................................... 43

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................... 43

3.1. Буферные растворы .......................................................................................... 43

3.2. Животные и клеточные модели ...................................................................... 44

3.2.1. Животные ...................................................................................................... 44

3.2.2. Индукция воспаления дыхательных путей с помощью овальбумина .... 44

3.2.3. Определение общего количества и популяционного состава клеток

бронхоальвеолярного лаважа (бронхоальвеолярного смыва) ............................ 45

3.2.4. Определение уровня цитокинов в бронхоальвеолярных лаважах .......... 46

3

3.2.5. Определение уровня иммуноглобулинов .................................................. 47

3.2.6. Выделение клеток и приготовление клеточных суспензий ..................... 47

3.2.7. Регистрация уровня внеклеточной РНК .................................................... 48

3.2.8. Регистрация активных форм кислорода..................................................... 49

3.2.9. Индукция «окислительного взрыва» .......................................................... 50

3.2.10. Ингибиторы продукции АФК ..................................................................... 50

3.3. Выделение белка БТШ70 из внутренних органов мышей ........................... 50

3.3.1. Получение гомогенатов печени и почек мышей ....................................... 51

3.3.2. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии

на АТФ-агарозе ........................................................................................................ 51

3.3.3. Диализ в бикарбонатном буфере ................................................................ 52

3.3.4. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии

на Ni-агарозе ............................................................................................................ 52

3.3.5. Очистка БТШ70 от контаминации бактериальных липополисахаридов 52

3.3.6. Определение концентрации белка .............................................................. 53

3.3.7. Электрофорез в ПААГ ................................................................................. 53

3.3.8. Вестерн-блот анализ ..................................................................................... 53

3.3.9. Определение содержания примеси LPS ..................................................... 54

3.4. Статистическая обработка результатов ............................................................. 54

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ................................................................... 55

4.1. Особенности получения и очистки белка БТШ70 ........................................ 55

4.2. Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического воспаления

дыхательных путей ..................................................................................................... 56

4.3. Общее количество и популяционный состав клеток бронхоальвеолярных

лаважей ......................................................................................................................... 57

4.4. Изменение уровня цитокинов в дыхательных путях ................................... 58

4.5. Продукция аллерген-специфических антител .............................................. 59

4

4.6. Снижение уровня секреции проаллергических цитокинов под действием

БТШ70 .......................................................................................................................... 62

4.7. Влияние БТШ70 на системную и локальную продукцию аллерген-

специфических иммуноглобулинов .......................................................................... 63

4.8. Подавление роста общего количества и изменение популяционного

состава клеток БАЛ мышей с аллергическим воспалением дыхательных путей

после введения БТШ70 ............................................................................................... 64

4.9. Оценка влияния БТШ70 на количество нейтрофилов в костном мозге

мышей с индуцированным аллергическим воспалением ....................................... 66

4.10. Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре

активированных нейтрофилов ................................................................................... 67

4.11. Оптимизация клеточной модели для исследования антиоксидантной

активности БТШ70 ...................................................................................................... 69

4.12. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на продукцию АФК in vitro . 77

4.13. Изменение продукции активных форм кислорода клетками костного мозга

мышей на различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей . 92

5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ......................................... 96

6. ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 102

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................ 103

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................. 105

5

1. ВВЕДЕНИЕ

Во многих странах с различным уровнем развития астма является одной из

основных проблем здравоохранения. Несмотря на внедрение эффективных мер

для лечения и профилактики этого заболевания, даже в странах с высоким

уровнем оказания медицинской помощи до сих пор выявляются случаи

летального исхода, тем или иным образом связанного с астмой.

Астма характеризуется различной степенью аллергического ответа,

обструкцией и воспалением дыхательных путей, что обуславливает такие

симптомы как кашель, хрипы, бронхоспазмы, одышка.

В ряде научных работ продемонстрировано присутствие в сыворотке

периферической крови человека и лабораторных животных циркулирующего

пула внеклеточной формы белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа

(БТШ70) (Johnson, Fleshner, 2006; Pockley et al., 1998). Было показано, что

содержание сывороточных циркулирующих белков БТШ70 в организме

значительно возрастает в условиях стресса и при ряде заболеваний, в том числе

при аллергической астме (Crameri, 2012; Ganter et al., 2006; Jenei et al., 2013;

Ogawa et al., 2011; Pittet et al., 2002; Pockley et al., 2002). Хорошо известны и

охарактеризованы шаперонные функции внутриклеточных БТШ70,

выполняющих протективные и обслуживающие функции в отношении других

внутриклеточных протеинов. В то же время внеклеточные белки БТШ70

рассматривают как эволюционно сформировавшиеся «сигналы опасности» для

иммунной системы, указывающие на возникновение и локализацию очага

воспаления в организме, а также как элементы механизма защиты от стресс-

опосредованных повреждений (Elsner et al., 2010; Fujihara, Nadler, 1999; Hammad

et al., 2009; Johnson, Fleshner, 2006; Sapozhnikov et al., 2002; Wallin et al., 2002).

Важным элементом иммуномодулирующей активности БТШ70 также

является показанная в последние годы способность регулировать процесс

продукции фагоцитами активных форм кислорода (АФК) (Пономарёв и др.,

2005). АФК играют важную роль в первой линии защиты организма от

6

болезнетворных микроорганизмов, однако, повышенная концентрация

внеклеточных АФК в очагах воспаления оказывает повреждающее действие на

окружающие ткани и на сами клетки-продуценты, усиливая воспалительные

процессы.

Несмотря на то, что приведенные выше данные свидетельствуют о

потенциальной протективной активности БТШ70 при воспалительных

процессах, роль данного белка в регуляции аллергического воспаления

дыхательных путей до сих пор не изучена. Исследования регуляторной

активности БТШ70 при астме необходимы как для фундаментальной

физиологии, так и для экспериментальной и практической медицины.

Таким образом, важным для фундаментальной физиологии, так и для

экспериментальной и практической медицины представляется изучение

регуляторной активности БТШ70 при аллергической астме, а также анализ

механизма участия внеклеточных БТШ70 в системе ограничения уровня

продукции фагоцитами АФК.

Исходя из вышесказанного, целью данной работы стало исследование роли

внеклеточного пула БТШ70 в регуляции аллергического воспаления

дыхательных путей.

В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику развития аллергического воспаления дыхательных

путей в мышиной модели овальбумин-индуцированной астмы.

2. Оценить иммуномодулирующие эффекты экзогенного внеклеточного

БТШ70 в модели индуцированного воспаления дыхательных путей.

3. Оценить влияние БТШ70 на продукцию клетками активных форм

кислорода в оптимизированной модели «окислительного взрыва» фагоцитов.

4. Провести анализ молекулярных механизмов антиоксидантного

действия БТШ70.

5. Исследовать механизмы супрессорного воздействия БТШ70 на развитие

аллергического воспаления путем оценки влияния БТШ70 на активацию

нейтрофилов костного мозга мышей с индуцированной астмой.

7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Бронхиальная астма

Бронхиальная астма – хроническое прогрессирующее воспалительное

заболевание дыхательных путей, характеризующееся бронхиальной обструкцией

и гиперреактивностью бронхов. Факторы, способные спровоцировать развитие

данного заболевания, разнообразны (Holtzman, 2012).

Основными клиническими проявлениями аллергической астмы являются

бронхоспазмы, затрудненное дыхание и одышка, обусловленные инфильтрацией

в дыхательные пути тучных клеток и эозинофилов, вызывающих

гиперчувствительность, воспаление и обструкцию дыхательных путей.

Генетические исследования свидетельствуют о том, что астма не является

единым заболеванием, а представлена множеством нарушений как на

генетическом, так и на эпигенетическом уровне (Binia, Kabesch, 2012; Yang,

Schwartz, 2012). Фенотипическое разнообразие проявлений астмы обусловлено

не только генетическими факторами, но и факторами окружающей среды, в

частности изменением образа жизни и климатическими условиями (Custovic,

Simpson, 2012; Dapul-Hidalgo, Bielory, 2012; Renz et al., 2011). Около 300

миллионов людей на планете страдают от астмы и около 250 тысяч смертей в год

связано с астматическим воспалением (Baiz, Annesi-Maesano, 2012). Основными

признаками аллергической астмы являются ассоциированное с Тh2-

лимфоцитами воспаление, эозинофилия, обструкция дыхательных путей,

вызванная гиперплазией бокаловидных клеток и бронхиальная

гиперчувствительность к неспецифическим стимулам (Idzko et al., 2007). Чаще

всего к развитию аллергической астмы приводит IgE-опосредованная

сенсибилизация к «домашним» аллергенам, распространяющимся воздушным

путем. Чем дольше пациент подвергается воздействию аллергена, тем сильнее

становится проявление астматических симптомов. Кроме того, аллергическое

воспаление дыхательных путей усиливается респираторными вирусами и

8

вдыхаемыми патогенами грибной или бактериальной природы (Custovic,

Simpson, 2012; Fukushima et al., 2010).

Основными аллергенами, приводящими к развитию аллергической

бронхиальной астмы, являются клещи домашней пыли (Gaffin, Phipatanakul,

2009), аллергены животного происхождения (Bjerg et al., 2015), споры грибов

(Knutsen et al., 2012) и пыльца растений (D'Amato et al., 2007).

Помимо классической аллергической бронхиальной астмы, где

бронхоспазмы опосредуются в основном гистамином и активацией системы

комплемента, существует также аспириновая астма, сопряженная с

непереносимостью аспирина и других нестероидных противовоспалительных

средств (НПВС), ингибиторов циклоксигеназы (Szczeklik, Nizankowska, 2000). В

диагностике аспириновой астмы выделяют триаду симптомов, состоящую из

непереносимости аспирина, бронхиальной астмы и полипозного синусита

(Samter, Beers, 1968). Основным механизмом развития аспириновой астмы

является дисбаланс метаболизма арахидоновой кислоты. При этом введение

ингибиторов циклоксигеназы приводит к повышенному образованию

лейкотриенов (Antczak et al., 2002). Цистеиновые лейкотриены в свою очередь

способны приводить к бронхостазмам и обструкции дыхательных путей (Liu,

Yokomizo, 2015).

2.1.1. Клеточный ответ при астме

Различные типы клеток вовлечены в патогенез аллергической астмы.

Помимо структурных клеток легочного эпителия, клеток мышечной и нервной

ткани, перманентно ассоциированных с респираторным трактом, множество

клеток иммунной системы приходят в дыхательные пути в процессе воспаления

(Lambrecht, 2003). Типичным для аллергического воспаления дыхательных путей

является участие эозинофилов, тучных клеток, Т-лимфоцитов и дендритных

клеток (Idzko et al., 2007).

9

2.1.1.1. Вовлеченность клеток эпителия в развитие аллергического

воспаления

Выстилающие респираторный тракт клетки представляют собой

гетерогенную популяцию клеток, соединенных между собой различными типами

белковых молекул и образующие систему защиты дыхательных путей (Godfrey

et al., 1994; Schleimer et al., 2007). Основными защитными функциями

эпителиального барьера являются мукоцилиарный клиренс и механическая

защита дыхательных путей. Кроме того, огромное значение имеет сигнальная

функция структурных эпителиальных клеток, отвечающая за активацию

иммунного ответа (Hammad et al., 2009). В состав эпителиального барьера входят

реснитчатые, бокаловидные, вставочные, эндокринные клетки и клетки Клара;

кроме того, хорошо описаны ассоциированные с эпителием интерстициальные

дендритные клетки (Lambrecht, 2005; Reynolds, Malkinson, 2010; Schleimer et al.,

2007). Известно, что такие цитокины как IL-25, IL-33 и TSLP, выделяемые

эпителиальными клетками, принимают непосредственное участие в развитии

иммунного ответа второго типа, опосредуемого Th-2 (Lloyd, Saglani, 2015).

2.1.1.2. Эозинофилы

Исторически астму ассоциируют с наличием эозинофилов в

бронхоальвеолярных лаважах (Calhoun et al., 1991). Повышенный уровень

белков, специфичных для гранул эозинофилов был обнаружен в

бронхоальвеолярных смывах пациентов астматиков, причем концентрация этих

белков была достаточной для того, чтобы вызвать повреждение тканей

организма, в том числе клеток респираторного эпителия (Rothenberg, Hogan,

2006). Считают, что массовый приток эозинофилов в легкие вызван активностью

Th2, продуцирующих IL-5, который и служит аттрактантом для эозинофилов.

Однако, не всегда активация Th2 вызывает аккумуляцию эозинофилов, в

некоторых случаях происходит усиление продукции IL-4 и/или IL-13, которое

приводит к дифференцировке альтернативно-активированных макрофагов

10

(Holtzman, 2012). Под воздействием различных стимулов эозинофилы способны

продуцировать широкий спектр цитокинов, в том числе и Th2 цитокины

(Rothenberg, Hogan, 2006). Основным патологическим эффектом эозинофилов

является дегрануляция в результате кросс-связывания IgE с FcεRI рецепторами

на поверхности эозинофилов (Turner, Kinet, 1999). В результате дегрануляции в

окружающей среде оказываются высокотоксичные вещества, например, такие

как MBP, которые оказывают прямое воздействие на тучные клетки и базофилы,

заставляя их в свою очередь дегранулировать (Rothenberg, Hogan, 2006).

2.1.1.3. Тучные клетки

Тучные клетки являются одним важнейших медиаторов патологий,

связанных с гиперчувствительностью немедленного типа, благодаря высокой

концентрации высокоаффинных рецепторов к IgE (FcɛRI). Дегрануляция тучных

клеток занимает центральное место в немедленных и отложенных

патологических реакциях при бронхиальной астме. Так, бронхоспазмы,

наблюдаемые у астматиков непосредственно после вдыхания аллергена, главным

образом связаны с продуктами дегрануляции тучных клеток – гистамином и

простагландином D2 (PGD2). А такие цитокины как TNFα, IL-4, IL-5 и IL-6,

содержащиеся и экспрессируемые тучными клетками, играют важную роль в

хронических астматических процессах (Bradding et al., 1994). Тучные клетки

содержатся в слизистой оболочке бронхов, располагаясь между эпителиальными

клетками, а также в более глубоких слоях стенки бронхов. Показано, что при

атопической астме содержание тучных клеток (а также эозинофилов) в бронхах

возрастает в 10 раз (Macfarlane et al., 2000).

2.1.1.4. Дендритные клетки в дыхательных путях

Полагают, что мукозальные дендритные клетки, образующие сеть в

подэпителиальном или межэпителиальном пространстве дыхательных путей,

захватывают антигены, попадающие в респираторный тракт, и постепенно

11

мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где и происходит

представление антигена наивным Т-клеткам (Holt, Stumbles, 2000). Однако,

наряду с таким традиционным представлением о формировании адаптивного

ответа на антиген в тканях, существует мнение, что праймирование Т-клеток

также может происходить непосредственно в подэпителиальном пространстве

дыхательных путей (Veres et al., 2013). Исследованиям межэпителиальных

дендритных клеток в последнее время уделяется очень большое внимание, так

как на поверхности этих клеток наблюдают значительную экспрессию

рецепторов, отвечающих за распознавание «чужого» (Blander, Medzhitov, 2006).

Выделяют различные субпопуляции дендритных клеток, присутствующих в

дыхательных путях, как в отсутствии внешних воздействий, так и при

воспалительном процессе (Lambrecht, 2005). Было замечено, что различные

субпопуляции характерны для разных отделов респираторного тракта. По

экспрессии комбинации поверхностных маркеров, а также по морфологии и

местонахождению в легких различают четыре субпопуляции дендритных клеток.

CD11c+ CD11b- дендритные клетки (конвенциальные дендритные клетки)

располагаются в межэпителиальном и подэпителиальном пространстве бронхов.

Конвенциальные дендритные клетки имеют форму «звезды» или «кленового

листа» и характеризуются наличием длинных отростков, проникающих через

эпителиальный барьер в просвет дыхательных путей. Сразу под базальной

мембраной располагаются СD11с+ CD11b+ дендритные клетки, обладающие

характерной шарообразной формой. Также в бронхах присутствуют и

плазмацитоидные дендритные клетки, характеризующиеся промежуточной

экспрессией CD11cint. В паренхимальной ткани, ассоциированной с альвеолами,

присутствуют CD11c+ CD11b- конвенциальные дендритные клетки и небольшое

количество плазмоцитоидных дендритных клеток.

12

2.1.1.5. Вовлеченность нервных клеток в механизмы развития астмы

Нервные волокна располагаются на базальной стороне эпителиального

барьера, причем в процессе аллергического воспаления дыхательных путей PGP+

и CGRP+ нервные окончания находятся в тесном контакте с эпителиальными

клетками, образуя нейроэпителиальные узлы (Veres et al., 2007; Weichselbaum et

al., 2005). Именно нервные волокна ответственны за формирование

гиперчувствительности дыхательных путей, приводящей к бронхоспазмам

(Nassenstein et al., 2006). При этом наиболее эффективными средствами борьбы с

бронхоспазмами при острых приступах астмы являются агонисты β-

адренорецепторов (Barnes, Pride, 1983). Вместе с эпителиальными клетками

нервные волокна участвуют в процессе перестроения дыхательных путей в

процессе хронического астматического воспаления (Grainge et al., 2011). Кроме

того, в подэпителиальном пространстве бронхов были обнаружены кластеры,

сформированные дендритными клетками, нервными окончаниями и

активированными Т-клетками (Veres et al., 2009). Это наблюдение позволяет

предположить, по аналогии с фолликулами ассоциированной с кишечником

лимфоидной ткани (Brandtzaeg et al., 2001), существование центров активации Т-

клеток на периферии, вне лимфатических узлов.

2.1.1.6. Макрофаги

Астма является заболеванием, развивающимся на бронхиальном и

альвеолярном уровне (Kosciuch et al., 2013; Tashkin, 2002; Virchow, 2009). В

просвете альвеол вдыхаемый аллерген распознается в первую очередь

альвеолярными макрофагами. Эти клетки являются одними из наиболее

значимых фагоцитов, представленных в дыхательных путях нижнего

респираторного тракта. Большое число исследований показывает, что

альвеолярные макрофаги пациентов астматиков демонстрируют измененный

фенотип по сравнению с альвеолярными макрофагами здоровых людей. В

частности, при астме наблюдается повышение экспрессии альвеолярными

13

макрофагами CD80/86, CD1a, ICAM-1, LFA-1 и CD23 и понижение экспрессии

CD40 (Careau et al., 2006; Peters-Golden, 2004; Tang et al., 2001). Также при астме

усиливается продукция альвеолярными макрофагами IL-1, IL-6, TNF-α и IL-10 и

снижается продукция IL-12 (John et al., 1998; Magnan et al., 1998; Peters-Golden,

2004). При совместном культивировании CD4+ клеток с альвеолярными

макрофагами астматиков, но не здоровых доноров, наблюдалась секреция IL-5

(Tang et al., 1999). Приведенные выше данные свидетельствуют о потенциальной

способности альвеолярных макрофагов активировать Th2-опосредованный

иммунный ответ. Однако наиболее распространено мнение о том, что за

активацию про-аллергического ответа в большей степени ответственны

макрофаги, расположенные в тканях, нежели альвеолярные макрофаги.

Макрофаги, находящиеся в паренхимальной ткани дыхательных путей, не

только участвуют в захвате, процессинге и представлении антител, но и

способны синтезировать пирогенные вещества, в частности металлопротеиназы,

принимающие участие в ремоделировании дыхательных путей в процессе

хронического воспаления (Ferrari-Lacraz et al., 2001).

2.1.1.7. Т-лимфоциты в аллергическом воспалении

Основным компонентом, без которого невозможно аллергическое воспаление

дыхательных путей, считают активацию Th2 клеток. (Afshar et al., 2008;

Murdoch, Lloyd, 2010). На настоящий момент описано более 20 субпопуляций

Т-клеток, многие из которых тем или иным образом вовлечены в

воспалительный процесс при астме (Jutel, Akdis, 2011; Ozdemir et al., 2010).

Большинство Т-лимфоцитов развивается в тимусе из CD4-CD8- клеток, которые

являются предшественниками не только для CD4+, и CD8+ лимфоцитов, но и для

NKT и γδ-T клеток (Afshar et al., 2008). Классически CD4+ T-лимфоциты делят на

Th1, продуцирующие IFN-gamma, и Th2, секретирующие IL-4, IL-5 and IL-13.

Сравнительно недавно была описана еще одна субпопуляция T-лимфоцитов –

Th17. Эти клетки характеризуются повышенной продукцией IL-17. Среди этих

14

Th17 были выделены со-продуценты IL-17 и IFN-γ, так называемые, Th17/Th1 и

со-продуценты IL-17A и характерных для Th2 цитокинов, таких как IL-4, IL-5,

IL-9 и IL-13, так называемые Th17/Th2. Было показано, что Th17/Th2 способны

in vitro стимулировать переключение B-клеток на синтез IgE (Cosmi et al., 2011).

Современные исследователи полагают, что увеличение активности Th17/Th2 или

Th9 (отвечающих на стимуляцию IL-9) в совокупности со снижением активности

регуляторных Tregs (продуцирующих IL-10 и TGF-β) является дополнительным

механизмом развития аллергической астмы, однако конечным этапом данного

пути также является активация Th2 (Holtzman, 2012; Lloyd, Saglani, 2013). Tregs

были охарактеризованы немногим раньше, чем Th17. Разные исследовательские

группы выделяют различные субпопуляции Tregs. В большинстве случаев они

характеризуются экспрессией транскрипционного фактора Foxp3, экспрессия

которого на периферии не стабильна. Таким образом, в условиях воспаления,

Tregs могут терять экпрессию Foxp3 и дифференцироваться в эффекторные

Т-лимфоциты, причем фенотип эффекторов и способность продуцировать IFN-γ

или Th2-характерные цитокины зависит от природы воспаления (Fontenot et al.,

2003). Помимо перечисленных субпопуляций также сравнительно недавно были

охарактеризованы Th22, продуценты IL-22 и фолликулярные Т-хелперы. В мире

существует несколько групп, проводящих исследования, направленные на

выяснение роли этих субпопуляций в патогенезе астмы, однако, определенный

ответ пока не получен. Одной из последних была охарактеризована

субпопуляция врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые наряду с Th2

способны продуцировать IL-5 и -13 (Bernink et al., 2013). Было показано, что

второй тип ILC является источником Th2-типа цитокинов на начальной стадии

аллергического воспаления дыхательных путей (Mjosberg, Spits, 2012).

2.1.1.8. В-лимфоциты в аллергическом воспалении

В тканях легких и бронхиальных смывов, или лаважей, В-клетки составляют

от 5 до 10 % от общего количества лейкоцитов (Dustin, 2002). Основная роль

15

B-лимфоцитов в развитие аллергических заболеваний сводится к синтезу и

секреции IgE (Hamelmann et al., 1997). Инфильтрация В-клеток в дыхательные

пути и переключение на синтез IgE невозможны без помощи ICOS+ Th2 и

продуцируемых Th2 цитокинов (Beier et al., 2004). Именно это обстоятельство

привело к тому, что клетки, изначально считавшиеся ключевыми в механизмах

развития аллергической бронхиальной астмы вследствие их способности

секретировать IgE, стали рассматривать лишь в контексте клинических

проявлений. Действительно, было показано, что отсутствие В-клеток и, как

следствие, IgE не оказывает влияния на приток эозинофилов в дыхательные пути

(Hamelmann et al., 1997). В то же время, отсутствие связывания IgE с FcεRI на

поверхности эозинофилов приводит к отмене бронхиальной гиперреактивности

(Hamelmann et al., 1997), что свидетельствует в пользу суждения о том, что роль

В-клеток в астме ограничивается продукцией IgE. Несмотря на это, многие

ученые считают, роль В-клеток в развитии аллергического воспаления в

дыхательных путях не однозначна. В последние годы, была охарактеризована

субпопуляция В-клеток – гиперпродуцентов IL-10, которым, по аналогии с

Т-регуляторными клетками, приписывают регуляторные свойства (Stanic et al.,

2014). Было показано, что секреция IgG4, ассоциированного с прекращением

синтеза IgE и подавлением аллергического воспаления, характерна именно для

регуляторных В-лимфоцитов (van de Veen et al., 2013). Кроме того, Sorrentino R

et al (Sorrentino et al., 2014) показали, что деплеция В-клеток приводит к

усилению воспалительного процесса.

2.1.1.9. Нейтрофилы и астма

В отличие от эозинофилов нейтрофилы не рассматривают как клетки

характерные для аллергического воспаления дыхательных путей. Основным

источником нейтрофилов является костный мозг (Rankin, 2010; Summers et al.,

2010). В случае проникновения в организм экзогенных патогенов нейтрофилы

способны в течение короткого времени мигрировать на периферию в очаг

16

воспаления (Kohler et al., 2011). Эта способность обуславливает представления о

нейтрофилах как о клетках острой фазы воспаления, в том числе и острого

воспаления при астме (Nakagome et al., 2012). После инфильтрации дыхательных

путей нейтрофилы остаются в тканях и удаляются другими фагоцитами после

апоптоза, некроза или нетоза (Ciepiela et al., 2015). В последние годы появляется

все больше работ, посвященных регуляторной роли нейтрофилов в развитии

патологического воспаления (Ciepiela et al., 2015). Известно, что в острой фазе

бронхиальной астмы наблюдается повышенный уровень нейтрофилов в

дыхательных путях, тогда как вне острой фазы число нейтрофилов в легких

больных астмой близко к контрольным значениям (Ciepiela et al., 2015). Также

была показана повышенная экспрессия рецептора IgE FcɛRI на поверхности

нейтрофилов пациентов, страдающих от астмы, и секреция этими клетками IL-8

в ответ на стимуляцию IgE (Gounni et al., 2001). Позднее, однако, было показано,

что экспрессия этого рецептора нейтрофилами зависит от Th-2-ассоциированных

цитокинов (Alphonse et al., 2008), т.е. патологическая роль нейтрофилов

опосредуется развитием аллергического воспаления, а не наоборот.

Основной функцией нейтрофилов в качестве первой линии иммунной

защиты является дегрануляция и синтез активных форм кислорода (АФК). При

этом именно гиперпродукция АФК все чаще называется в числе основных

факторов, опосредующих тяжесть приступов астмы при предъявлении аллергена

(Ciepiela et al., 2015). Показано, что у пациентов с астмой стимуляция

нейтрофилов антигеном вызывает усиленный ответ, и «окислительный взрыв»

развивается быстрее и имеет большую амплитуду, чем в нейтрофилах здоровых

людей (Di Stefano et al., 2010; Monteseirin et al., 2002). Авторы полагают, что

чрезмерная продукция АФК в дыхательных путях может способствовать

усилению астмы и ремоделированию стенок бронхов у больных астмой. Также

для нейтрофилов больных астмой было показано снижение способности к

фагоцитозу, индуцированному взаимодействием с патогеном и

иммуноглобулинами или компонентами комплемента (da Silva-Martins et al.,

2013).

17

Важной недавно обнаруженной особенностью нейтрофилов является

способность к образованию внеклеточных нитеобразных структур, состоящих из

нуклеиновых кислот, гистонов и нейтрофил-эластазы, названных NET

(neutrophils extracellular traps, внеклеточные ловушки нейтрофилов) (Brinkmann

et al., 2004).

Следует отметить, что патологическая активация нейтрофилов может

приводить к развитию так называемой нейтрофильной астмы – патологии

дыхательных путей, характеризующейся сходными клиническими проявлениями

без повышения уровня эозинофилов в легких (Douwes et al., 2002).

2.1.2. Гуморальный иммунный ответ при астме

Множество медиаторов вовлечено в процесс аллергического воспаления

дыхательных путей, среди них биоактивные производные арахидоновой кислоты

(эйкозаноиды), цитокины, хемокины, гистамин, нейропептиды и компоненты

комплемента (Idzko et al., 2007; Lambrecht, 2003). Основными функциями

гуморальных иммунных факторов являются регуляция клеточного трафика,

активация клеток путем взаимодействия с соответствующими рецепторами на

поверхности последних и осуществление межклеточного бесконтактного

сигналинга.

2.1.2.1. Гистамин

Гистамин является одним из важнейших воспалительных медиаторов,

участвующих в патогенезе бронхиальной астмы. Он содержится в гранулах

тучных клеток и базофилов и выделяется при дегрануляции, вызванной

активацией (например, через высокоаффинные рецепторы к IgE FcɛR1) (Wenzel

et al., 1988). Гистамин является мощным бронхоконстриктором, а также

увеличивает проницаемость сосудов и выделение слизи, приводя к отекам,

бронхоспазмам и образованию слизистых пробок (Howarth et al., 1987). На

данный момент известно 4 типа рецепторов к гистамину: Н1, Н2, Н3 и Н4,

18

первые три из которых опосредуют гидролиз фосфоинозитида, активацию и

подавление активности аденилатциклазы соответственно. При этом вызываемая

гистамином бронхоконстрикция опосредуется его взаимодействием с H1

рецептором (Maconochie et al., 1979), а вазодилатация, увеличение

проницаемости сосудов и секреции слизи –взаимодействием с Н2 рецептором

(Lambrecht, 2003). Также была показано способность гистамина активировать

эозинофилы, вероятно, через Н4 рецептор (Raible et al., 1994). Антагонисты Н1

рецепторов много лет широко применяются в терапии аллергических

заболеваний, а также для немедленной бронходилатации при астматических

приступах (Popa, 1977).

2.1.2.2. Эйкозаноиды

Эйкозаноиды, включающие в себя простагландины, тромбоксаны,

лейкотриены и ряд других веществ, представляют собой продукты распада

арахидоновой кислоты, входящей в состав клеточных мембран. Также они могут

быть образованы и из других полиеновых кислот. Это химически и

метаболически нестабильные высокоактивные регуляторы клеточных функций,

участвующие в ауто- и паракринной регуляции. (Северин, 2003; Смирнов, 2008).

Простагландины являются наиболее многочисленным семейством среди

эйкозаноидов, насчитывая десять подгрупп (A-J). Среди биологических

эффектов простагландинов стимуляция сокращений матки, миокарда, бронхов,

снижение тонуса сосудов, агрегации тромбоцитов и желудочной секреции,

стимуляция воспалительных процессов (Смирнов, 2008). Простагландины

принимают активное участие в патогенезе астмы. Так, PGD2 потенциирует

воспаление дыхательных путей (Honda, Kabashima, 2015), в то время как для

PGE2 и синтетических агонистов EP2 рецептора показано ингибирование

активации тучных клеток в легких мышей с индуцированной астмой,

приводившие к снижению гиперчувствительности к клещу домашней пыли

(Torres et al., 2015).

19

Тромбоксаны подразделяются на две подгруппы – А и В, и во многих

случаях являются физиологическими антагонистами простагландинов. Так, они

стимулируют вазоконстрикцию и тромбообразование (Смирнов, 2008).

Лейкотриены составляют группу нециклических триеновых эйкозаноидов.

Физиологические эффекты лейкотриенов также разнообразны и включают

стимуляцию дыхания и сокращений кишечника и иммуномодулирующую

активность (Смирнов, 2008). LTB4 широко известен как хемоаттрактант для

большинства лейкоцитов, а цистеин-содержащие лейкотриены, являясь

бронхоконстрикторами, участвуют в ремоделировании дыхательных путей при

развитии астмы (Liu, Yokomizo, 2015), а также способны вызывать эозинофилию

тканей (Honda, Kabashima, 2015).

2.1.2.3. Нейропептиды

Нейропептиды также играют важную роль в патогенезе астмы. Так,

несколько лет назад было установлено, что в период приступов бронхиальной

астмы у детей увеличивалось содержание субстанции Р - основного медиатора

нехолинергических нервов, вызывающего нейрогенное воспаление, и

одновременно снижался уровень вазоактивного интестинального пептида -

медиатора неадренергических нервов, обладающего бронхолитическим

эффектом (Лев, 2000).

2.1.2.4. Цитокины

В острой фазе аллергического воспаления дыхательных путей, как и при

любом другом воспалении, наблюдается секреция IL-8, как полагают, клетками

эпителия или альвеолярными макрофагами, что влечет за собой

кратковременный приток нейтрофилов (Bhakta, Woodruff, 2011; Lommatzsch et

al., 2006; Lutfi et al., 2012). Однако, при регулярно повторяющемся воздействии

аллергена на респираторный тракт, наблюдается снижение уровня

рекрутированных нейтрофилов и развитие Th2-опосредованного ответа (Bafadhel

20

et al., 2011; Holtzman, 2012). Переключение на Th2-опосредованный ответ

зависит от многих факторов, в том числе от транскрипционного фактора NF-

HEV – цитокина IL-33, рецепторы к которому экспрессированы на

активированных Т-лимфоцитах (Lefrancais, Cayrol, 2013; Liew, 2012; Lloyd,

2010). Дифференцировка CD4+-клеток в Th2-эффекторы сопровождается

регулируемой на транскрипционном уровне экспрессией IL-4, IL-5, IL-13 и

подавлением экспрессии цитокинов, ассоциированных с Th1-опосредованным

ответом (Renz et al., 2011). IL-4 и IL-13 активируют эндотелий и способствуют

повышенной экспрессии VCAM-1, который задерживает циркулирующие

эозинофилы (Nakagome, Nagata, 2011). IL-5 стимулирует приток эозинофилов в

просвет дыхательных путей и дегрануляцию (Holtzman, 2012). Помимо

вышеперечисленных, к Th2-опосредованным цитокинам относятся IL-9, IL-25,

IL-31, и IL-33 (Akdis et al., 2011).

Основными продуцентами IL-9 являются Th2. В гораздо меньшей степени

продукция IL-9 была описана для тучных клеток и эозинофилов, причем

секреция этого цитокина клетками астматиков была выше, чем в контрольной

группе (Liu J. et al., 2014). IL-9 ингибирует продукцию цитокинов Th1

(Blankenhaus et al., 2014; Renz et al., 2011), а также способствует продукции IgE

B-клетками, вызывает секрецию хемокинов и слизи клетками бронхиального

эпителия. Кроме того, было показано, что IL-9 важен для пролиферации тучных

клеток (Hu et al., 2007).

IL-25 также считают про-аллергическим цитокином. Показано, что именно

IL-25 ответственен за увеличение числа эозинофилов и CD4+ T-клеток в легких

после стимуляции аллергеном, к которому была вызвана

сенсибилизация (Byers, 2014).

IL-31 экспрессируют активированные CD4+ T-клетки, преимущественно Th2.

В небольшом количестве экспрессия IL-31 была замечена для CD8+ T-клеток.

Исследования при помощи мышиной модели аллергического воспаления

дыхательных путей показали увеличение экпрессии IL-31 mRNA в легких после

провокации антигеном (Baumann et al., 2012).

21

Вместе с открытием множества субпопуляций Т-клеток, присутствующих в

здоровом организме в минорных количествах, но прогрессирующих и

оказывающих разнообразные эффекты при воспалительных процессах,

появилось и множество новых цитокинов тем или иным образом

ассоциированных с астмой. Так TGFβ, IL-1β, IL-23 и IL-6 ассоциированы с

развитием Th17, которые выявлены в при острой и хронической астме и в свою

очередь продуцируют IL-17A (Korn et al., 2009); IL-22 продуцируют Th22 в

острой фазе и при осложненной тяжелой астме (Souwer et al., 2010). Кроме того,

было продемонстрирована роль IL-9/IL-9R в острой фазе овальбумин-

индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей,

сопровождающегося IgE-опосредованной анафилаксией (Osterfeld et al., 2010). С

активацией T-регуляторных клеток, пролиферация которых необходима для

подавления аллергического воспаления, ассоциируют экспрессию IL-35 (Collison

et al., 2007).

В последнее время, особый интерес вызывает влияние так называемых

цитокинов врожденной иммунной системы на развитие аллергического

воспаления дыхательных путей. IL-1α и IL-1β – представители семейства IL-1

цитокинов, в которое также входят IL-18, IL-33 и некоторые другие цитокины. С

использованием OVA-индуцированной модели аллергического воспаления

дыхательных путей было показано, что введение рекомбинантного IL-1α на

стадии сенсибилизации приводит к ослаблению основных симптомов астмы. В

модели слабо выраженного аллергического воспаления дыхательных путей,

вызываемого без использования адъюванта, IL1R1-/- нокаутные мыши не

проявляли признаков астмы в отличие от контрольных животных. Кроме того,

было показано, что аутокринный выброс IL-1α клетками эпителия бронхов в

ответ на ингаляцию экстракта клеща домашней пыли сопровождался продукцией

TSLP, GM-CSF и IL-33 и был необходим для стимуляции Th2. Более того,

именно IL-1α, но не IL-1β, был необходим для активации Th2 иммунного

ответа (Schuijs et al., 2013).

22

2.1.2.5. Хемокины

Хемокины и хемокиновые рецепторы регулируют передвижение лейкоцитов

к месту воспаления. При аллергическом воспалении дыхательных путей

наиболее охарактеризованы следующие хемокины: эотаксины 1,2 (CCL11, 24),

RANTES (CCL5), хемотактические моноцитарные белки (MCP-1 – CCL2, MCP-2

– CCL8, MCP-3 – CCL13 и др.) хемокины моноцитарных предшественников

(MDC – CCL22) и тимические и регулирующие активацию хемокины (TARC –

CCL17) (Lloyd, Brown, 2006).

К хемокинам также относят IL-8 (CXCL8), роль которого в астме описана в

предыдущем разделе (Bhakta, Woodruff, 2011; Lommatzsch et al., 2006;

Lutfi et al., 2012).

Эотаксины, RANTES и относящиеся к MCP хемокины вызывают приток

эозинофилов, нейтрофилов, в некоторых случаях макрофагов и дендритных

клеток. MDC и TARC отвечают за специфическое привлечение Th2 (Ansel et al.,

1999; Dustin, 2002; Lloyd, Brown, 2006).

Помимо IL-8, IL-16 также относят к интерлейкинам со свойствами

хемокинов, то есть, обладающим хемотактической активностью. IL-16 был

открыт как специфический аттрактант для Т-лимфоцитов (Center, Cruikshank,

1982). Было показано, что он воздействует на клетки, экспрессирующие CD4,

непосредственно взаимодействуя с этим рецептором. IL-16 ингибирует

пролиферацию T-клеток, способствует развитию Th1-опосредованного ответа, и

блокирует Th2-опосредованное воспаление путем активации продукции TNF-α,

IL-1β, и IL-15 и, соответственно, блокируя синтез IL-4 и IL-5 (Akdis et al., 2011).

Также к хемокиновым цитокинам относят IL-17. IL-17 оказывает

хемотактическое воздействие на нейтрофилы, однако, до сих пор не выяснено,

является ли это воздействие непосредственным или же IL-17 стимулирует

продукцию других хемокинов, которые в свою очередь отвечают за приток

гранулоцитов (Akdis et al., 2011).

23

2.1.2.6. Компоненты комплемента

Компоненты комплемента анафилатоксины C3a и C5a являются

провоспалительными факторами, отвечающими, как и хемокины, за привлечение

клеток в очаг воспаления (Gressner et al., 2007). Также C3a и C5a принимают

участие в развитии аллергического воспаления при астме, в частности

ответственны за образование отека и обуславливают бронхоспазмы. Механизм

действия компонентов комплемента долгое время оставался не изучен. Как

оказалось впоследствии, к развитию Th2-опосредованной сенсибилизации и

воспаления приводит связывание рецептора к C5a (C5aR) на ранних стадиях,

однако если блокировать C5aR на эффекторной стадии аллергического

воспаления или при устоявшемся заболевании астмой, то проявляется ярко-

выраженный супрессорный эффект (Kohl et al., 2006; Lambrecht, 2006).

2.1.2.7. Иммуноглобулины

Основным ассоциированным с аллергией и астмой типом иммуноглобулинов

является IgE. Повышенный уровень общего и специфического IgE выявляют в

сыворотке периферической крови пациентов-астматиков, однако далеко не

всегда астма ассоциирована с повышением продукции IgE (Hamelmann et al.,

1999; Matricardi et al., 2009). Кросс-связывание аллергена и двух молекул IgE, в

свою очередь связанных с FcεR на поверхности базофилов, эозинофилов и

тучных клеток, приводит к дегрануляции и выбросу большого количества про-

воспалительных медиаторов, в том числе гистамина во внеклеточное

пространство (Knol, 2006; MacGlashan, 2012). Подобное взаимодействие

приводит не только к развитию и обострению воспаления, но и к

анафилактическому шоку (Khan, Kemp, 2011). При этом, большое значение

имеет аффинность аллерген-специфического IgE (Xiong et al., 2012). В

некоторых случаях выявляют высокий титр IgE, специфичных к собственным

белкам организма.

24

2.2. Белки теплового шока

Белки теплового шока (Hsp, от heat shock proteins) составляют одну из

разнообразных молекулярных систем, направленных на защиту клетки от

различных цитотоксических факторов.

Свое название эти белки получили из-за того, что впервые были описаны как

белки, устойчивые к нагреванию и накапливающиеся в клетках плодовой мушки

Drozophila melanogaster при тепловом воздействии (Ritossa, 1962). Позднее было

установлено, что экспрессия белков теплового шока является реакцией на целый

спектр неблагоприятных факторов, таких как увеличение количества ионов

тяжелых металлов, УФ-облучение; патологические факторы, такие как вирусные

или бактериальные инфекции, опухолевая трансформация и аутоиммунные

заболевания, а также такие физиологические факторы как низкий уровень

глюкозы в межклеточной жидкости, гипоксия, ишемия, эндогенные факторы

роста, гормоны и дифференцировка клеток (Asea A. et al., 2002). Белки теплового

шока обнаружены во всех исследованных организмах и клетках, что позволяет

относить их к наиболее консервативной и универсальной системе стресс-

индуцируемого клеточного ответа. Большинство представителей семейств БТШ

представлены в клетках и в нормальных условиях.

Эволюционными предшественниками белков теплового шока

млекопитающих являются прокариотические шаперонные белки, участвующие в

процессах внутриклеточного фолдинга белков и ренатурации белковых молекул,

подвергшихся стрессорным воздействиям, а также препятствующие

образованию белковых агрегатов. В эукариотических организмах эти белки

также выполняют шаперонные функции и способны связывать

новосинтезированные или поврежденные гидрофобные участки пептидов и

восстанавливать их структуры. Также БТШ участвуют в элиминации

неправильно свернутых или денатурированных белков. Также было показано

влияние на уровень БТШ70 химических агентов, модулирующих такие

физиологические процессы как дифференцировка, пролиферация и апоптоз (Lee

et al., 2015; Liu D.J. et al., 2014; Zeng et al., 2015).

25

2.2.1. Семейства белков теплового шока

Белки млекопитающих, относящиеся к суперсемейству БТШ, были

подразделены на несколько семейств в соответствии с их молекулярными

массами, каждому из которых соответствует определенное семейство генов.

Выделяют следующие семейства БТШ:

высокомолекулярные БТШ100 (100 кДа)

БТШ90 (90 кДа)

БТШ70 (70 кДа)

БТШ60 (60 кДа)

БТШ40 (40 кДа)

малые БТШ27 (27 кДа) и БТШ10 (10 кДа).

Каждое семейство включает один или несколько белков (Bettencourt et al.,

2008; Joly et al., 2010; Kostenko, Moens, 2009; Shemetov et al., 2008; Zavialov et al.,

1998). Поскольку белки каждого семейства БТШ являются продуктами

родственных генов, внутри каждой группы прослеживается высокая степень

гомологии между белками.

2.2.1.1. БТШ90 и БТШ100

Белки из семейства БТШ100 помимо шаперонной активности обладают

способностью инициировать протеолиз некоторых белков и участвуют в

развитии термотолерантности. Описано их важное значение для транспорта ряда

белков (Schirmer et al., 1996).

Известно, что семейство белков БТШ90 участвует в восстановлении

поврежденных белков, эти белки активно образуют сложные комплексы с

другими шаперонами и в составе комплексов участвуют в каскадах передачи

сигналов от ряда стероидных рецепторов и протеинкиназ. В частности, для

работы более чем сотни белков необходимо образование гетерокомплекса

белков из семейств БТШ90 и БТШ70 (Pratt, Toft, 2003). Такой гетерокомплекс,

26

например, участвует в сборке глюкокортикоидного рецептора (Kanelakis et al.,

2002). Белки БТШ90 играют роль в защите эмбриональных клеток от

неблагоприятных факторов, в том числе важна роль белков этого семейства в

миогенезе. В литературе описан механизм, с помощью которого внеклеточные

БТШ90 способствуют повышению инвазивности опухоли, в связи с чем эти

белки активно исследуются в качестве мишеней в противоопухолевой терапии

(Song et al., 2010).

2.2.1.2. БТШ60

Белки БТШ60 известны своими шаперонными свойствами по отношению к

митохондриальным белкам. В связи с этим их экспрессия особенно сильно

активируется при окислительном стрессе. Несмотря на то, что в основном

БТШ60 локализованы в митохондриях, эти белки обнаружены и на клеточной

поверхности, и в сыворотке. Показана корреляционная зависимость между

уровнем циркулирующих сывороточных БТШ60 у человека и рядом

патологических состояний. Например, поверхностная экспрессия БТШ60 влияет

на активацию развития аутоиммунного ответа при ревматоидном артрите, за

счет мимикрии между БТШ60 хозяина и бактерии (Kaufmann, 1990).

2.2.1.3. БТШ40

БТШ40 (Hdj1) является кошаперонной молекулой без пептидсвязывающей

активности. Она обладает АТФ-азной активностью и за счет этого участвует в

формировании комплекса БТШ70-субстрат (Angelidis et al., 1999).

2.2.1.4. БТШ10 и БТШ27

Семейство БТШ27 относится к малым белкам теплового шока. Белки этого

семейства играют важную роль в стабилизации актиновых филаментов и их

27

реорганизации при стрессе. Изучается участие БТШ27 в защите клеток от

окислительного стресса и регуляции апоптоза (Concannon et al., 2003).

БТШ10 является кошапероном для БТШ60 и необходим для работы

последних. Функция БТШ10 заключается в регулировании субстрат

связывающей и АТФ-связывающей активности БТШ60.

2.2.2. Семейство БТШ70

Одним из наиболее изученных семейств БТШ является семейство белков

теплового шока с массой 70 кДа – БТШ70 (HspA). У человека, согласно

номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC), известно о 15

членах этого семейства с молекулярной массой 66-78 кДа, кодируемых разными

генами. Основными (по уровню экспрессии и степени изученности) стресс-

индуцируемыми продуктами генов семейства БТШ 70 являются белки HspA1A и

HspA1B, отличающиеся друг от друга на две аминокислоты и, вероятно,

взаимозаменяемые, а также HspA6 – преобладающий белок при тепловом шоке.

В литературе чаще всего эти белки обозначаются как БТШ70 или Hsp70 (Hsp72)

и имеют молекулярную массу около 72 кДа. К конститутивно экспрессируемым

белкам относят HspA8 (Hsc70), имеющий молекулярную массу 73 кДа, а также

органеллоспецифические белковые изоформы.

Индукция транскрипции генов БТШ70 происходит за счет связывания

специфических факторов (так называемых факторов теплового шока, HSF), в

первую очередь HSF1, с регулятоарными транскрипционными элементами HSE

(heat shock elements) в составе промоторного участка гена (Pirkkala et al., 2001). А

отсутствие интронов в составе генов БТШ70 позволяет избежать ошибок при

сплайсинге, вероятность которых увеличивается в условиях

стресса (Gunther, Walter, 1994).

28

2.2.2.1. Структура БТШ70

В структуре БТШ70 выделяют три основных домена – нуклеотид-

связывающий консервативный NH2-домен, располагающийся в N-концевой

части молекулы и обладающий АТФ-азной активностью (около 450 а. о.),

субстрат-связывающий домен (около 200 а. о.) на С-конце, включающий в себя

участок массой 18 кДа из двукратно повторяющихся четырех антипараллельных

нитей и четырех петель между ними, и концевой спиральный участок размером

10 кДа, непосредственно контактирующие с субстратом; эти домены соединены

между собой коротким линкерным доменом, который включает сайт узнавания

протеолитическими ферментами и участвует в регуляции АТФ-зависимой

диссоциации комплекса БТШ70 и субстратного белка (рис. 1) (Мельников,

Ротанова, 2010; Genevaux et al., 2007; Mayer, Bukau, 2005).

Рис. 1. Пространственная структура БТШ70 (Qi et al., 2013)

До связывания с АТФ (а) БТШ70 в виде мономера или димера находится в «закрытой»

конформации. При этом его АТФ-связывающий домен (1), содержащий молекулу АДФ,

удален от субстрат-связывающего, а участки субстрат-связывающего домена 3 и 4

сближены и связывание нового субстрата невозможно. При взаимодействии белка в АТФ

происходит изменение его конформации (б), приводящее к сближению АТФ-

связывающего и субстрат-связывающего доменов и «открыванию» субстрат-

связывающего домена. При этом участки 3 и 4 расходятся, образуя карман для связывания

субстрата. Взаимодействие с субстратом приводит к гидролизу АТФ до АДФ. При этом

белок снова принимает «закрытую» конформацию (а), содержащую прочно связанный

полипептид внутри закрытого кармана. Для высвобождения субстрата вновь потребуется

связывание БТШ70 с АТФ. 1 – нуклеотид-связывающий домен, 2 – линкерный участок, 3 и

4 – участки субстрат-связывающего домена.

а б

29

Субстрат-связывающий домен БТШ70 узнает короткие аминокислотные

последовательности, которые составлены из кластеров гидрофобных

аминокислотных остатков, фланкированных основными остатками. Такие

мотивы встречаются 1 раз на 36 аминокислот в большинстве

белков (Wickner, Maurizi, 1999).

АТФ-связывающий центр БТШ70 сформирован лизином, пролином,

тирозином, фенилаланином, аргинином и глутамином (Andersson et al., 2004;

Kityk et al., 2012; Schlecht et al., 2011; Vogel et al., 2006).

Активная молекула БТШ70 в клетке находится в комплексе с кофакторами

(кошаперонами). Кроме своего основного кошаперона, молекулы БТШ40,

БТШ70 может также быть связан с белками Bag-l, Hdj-1, Hsc70-interacting protein

(Hip), Hsc70-Hsp90-organizing protein (Hop) и др. (Freeman, Morimoto, 1996;

Hohfeld, 1998). Показано, что кошаперон Hip-1 стабилизирует АДФ-связанное

состояние БТШ70, которое характеризуется высокой аффинностью к белковым

субстратам. Кошаперон Hdj-1 и нуклеотид-обменный фактор GrpE активируют

АТФазное состояние БТШ70, что приводит к быстрой диссоциации этого белка с

субстратом. Кроме того, связь этого домена с антиапоптическим белком BAG-1 с

одной стороны, ингибирует восстанавливающую активность БТШ70 в системе

in vitro, а с другой – активирует создание антиапоптического комплекса

BAG-l/Bc-2 (Hohfeld et al., 1995; Palleros et al., 1991; Szabo et al., 1994; Takayama

et al., 1997).

2.2.2.2. Внутриклеточные функции БТШ70

Митохондриальный БТШ70 обеспечивает как транспорт через внутреннюю

мембрану митохондрий, так и фолдинг импортированных белков в матриксе,

функционируя в составе двух разных комплексов. АДФ-связанная конфигурация

мБТШ70 приводит к формированию комплекса на внутренней мембране

митохондрий, состоящего из мБТШ70, якорного белка Tim44 и нуклеотид-

30

обменным фактором GrpE и функционирующего как комплекс импорта. АТФ-

связанная конфигурация приводит к формированию комплекса в матриксе,

состоящего из мБТШ70, Mdj-1 (гомолог DnaJ) и GrpE u функционирующего как

комплекс сборки (Horst et al., 1997).

Jaattela et al. показали, что клетки, экспрессирующие повышенный уровень

БТШ70 менее подвержены TNF-индуцируемой гибели, что по-видимому связано

с подавлением активации фосфолипазы А2 (Jaattela, 1993). Позднее было

показано антиапоптотическое действие БТШ70 в модели апоптоза, вызванного

тепловым шоком, опосредованное подавлением стресс-индуцируемого JNK-

киназного каскада (Mosser et al., 1997). В клеточной линии с повышенной

экспрессией БТШ70 этот белок в условиях теплового стресса не влияет на

активацию SARK1/JNK киназного каскада, но предотвращает апоптоз,

индуцированный церамидами, блокируя процессинг CDE-3-связанной протеазы,

каспазы-3 (Mosser et al., 1997).

Роль БТШ70 и БТШ90 в регуляции сигнальных каскадов также опосредуется

через взаимодействие с другими регуляторными белками и шаперонами. Как

показано выше, БТШ70 осуществляет свое влияние на сигнальные пути, по-

видимому, через взаимодействие с BAG-1 и Bcl-2. Bcl-2 обнаружен в

гетерокомплексах с разными компонентами сигнальных каскадов, в частности, с

серин-треонин Raf-1 киназой и ГТФазными белками R-Ras и H-Ras (Reed, 1997).

Последние являются непосредственными активаторами ERK киназных каскадов

через Ras/Raf взаимодействие и играют ключевую роль в клеточном росте и

дифференцировке (Vojtek, Hollenberg, 1995).

2.2.2.3. Внеклеточный пул БТШ70

В последние годы в литературе появилась большая серия работ,

демонстрирующих присутствие в сыворотке периферической крови человека и

лабораторных животных циркулирующего пула внеклеточной формы БТШ70

(Сапожников и др., 2012; Johnson, Fleshner, 2006; Pockley et al., 2003).

31

Внеклеточный и связанный с мембраной белки БТШ70 обладают свойствами

иммуномодуляторов (Pockley et al., 2003; Zhu et al., 2003), в том числе

осуществляя связь между врожденным и адаптивным иммунным ответом (Binder

et al., 2004; Joly et al., 2010). При этом во многих работах упоминается, что

концентрация циркулирующего БТШ70 достигает значений, при которых он

способен оказывать иммуномодулирующее влияние в экспериментах in vitro

(Njemini et al., 2003; Pockley et al., 2007).

2.2.2.4. Природа и механизмы секреции внеклеточных БТШ70

В клетках организма экспрессируются как конститутивная, так и

индуцируемая форма БТШ70 (Bettencourt et al., 2008). И та и другая форма были

обнаружены в биологических жидкостях и внеклеточных средах (Евдонин,

Медведева, 2009; Сапожников и др., 2012).

Большинство представителей семейства БТШ70 синтезируются в цитозоле и

не имеют в своей структуре сигнальной последовательности, позволяющей

белкам быть транспортированными через мембрану, в соответствии с

классическим путем (De Maio, 2011). Долгое время предполагали, что на

поверхность и во внеклеточное пространство БТШ70 попадают в результате

повреждения или в процессе гибели клетки (Basu et al., 2000; Daniels et al., 2004).

В тоже время была показана поверхностная экспрессия БТШ70 на живых,

преимущественно опухолевых, клетках (Multhoff, 2007). Дальнейшие

исследования выявили целый комплекс различных механизмов,

задействованных в активной транспортировке белков БТШ70 на поверхность

клеток. Активация того или иного пути зависит как от природы БТШ70, так и от

условий, стимулирующих выброс БТШ70 во внеклеточное пространство

(Зяблицин и др., 2012; De Maio, 2011; Mambula et al., 2007). Одним из первых

был предложен лизосомально-эндосомальный путь, при котором БТШ70

попадает в лизосомы благодаря способности связывать АТФ, который, в свою

очередь, связывается белками транспортно-подобной системы

32

АТФ-связывающей кассеты (ATPbinding cassette, ABC) (Mambula et al., 2007).

Основываясь на наличие пептид-связывающего домена, обуславливающего

связывание БТШ70 с так называемой «клиентской» белковой цепью, было

сделано предположение о транспорте БТШ70 посредством связывания с

молекулой, содержащей сигнальную последовательность (Joly et al., 2010).

Также было показано, что БТШ70 способен выходить во внеклеточное

пространство в составе секреторных гранул (Evdonin et al., 2006). Кроме того,

был предложен механизм встраивания БТШ70 в мембрану в составе везикул

различной природы, в частности экзосом (De Maio, 2011; Prado et al., 2008).

2.2.2.5. БТШ70 как «сигнал опасности»

Белки, относящиеся к внеклеточному пулу БТШ70, являются индикаторами

стрессовых состояний. Повышение уровня внеклеточных БТШ70 служит так

называемым «сигналом опасности» для клеток организма, в частности, клеток

иммунной системы, и предупреждает распространение повреждения (Elsner et

al., 2010; Wallin et al., 2002; Willart, Lambrecht, 2009). Механизм распознавания

клетками внеклеточного БТШ70 до сих пор не изучен. Рецепторов, способных

специфически распознавать белки семейства БТШ70, до сих пор не обнаружено.

Несмотря на это, предполагают, что существует некая «SOS» система (Система

Обзора Стресса, Stress Observation System), которая осуществляет распознавание

внеклеточного БТШ70 и является формой взаимодействия клеток при стрессе

(De Maio, 2011; Wheeler et al., 2009).

2.2.2.6. Белки и пептиды, способные связываться с БТШ70

Функциональная активность шаперонов БТШ70 обуславливает их

способность распознавать поврежденные белки или белки с искаженной

вторичной структурой, экспонирующие характерные гидрофобные поверхности,

с которыми и связывается пептид-связывающий домен БТШ70 (Joly et al., 2010).

33

В 2013 г. было показано, что цинк-L-карнозин способен связываться с

N-концевым доменом БТШ70, приводя к подавлению шаперонной и АТФазной

активности этого белка (Haga et al., 2013). Была также продемонстрирована

способность БТШ70 взаимодействовать с растительным гормоном, абсцизовой

кислотой, причем аффинность шаперона к этому гормону зависит от наличия

кошаперона и снижается в несколько раз в его присутствии (Kharenko et al.,

2013).

2.2.2.7. Рецепторы БТШ70

Рецепторы, связывающие и/или интернализующие БТШ70 и другие

шаперонные белки, для которых показана возможность циркуляции в кровяном

русле, по-прежнему остаются темой для активных дискуссий (Binder et al., 2004).

В настоящее время в качестве наиболее вероятных рецепторов БТШ70 на

антиген-презентирующих клетках (АПК) можно назвать CD91 (Basu et al., 2001;

Wan et al., 2004), LOX-1 (Delneste et al., 2002), CD-40 (Becker et al., 2002; Millar et

al., 2003) и, вероятно, CD14 (Asea et al., 2000) и TLR2 и TLR4

(Vabulas et al., 2002). По всей видимости, это не все способы взаимодействия

БТШ70 с АПК. Так, Lipsker et al. было показано, что циркулирующий БТШ70

интернализуется CD14-, TLR4- дендритными клетками путём рецептор-

опосредованного эндоцитоза (Lipsker et al., 2002).

Помимо воздействия БТШ70 на АПК, существуют также свидетельства его

связывания с рецепторами не антиген-презентирующих, а также не иммунных

клеток. Так, показано взаимодействие этого шаперона с поверхностными

рецепторами эндотелиальных и эпителиальных клеток (Theriault et al., 2005), а

также с рецепторами на поверхности NK-клеток (Multhoff, 2002). При этом было

показано, что рецепторы NK-клеток узнают не циркулирующую, а

экспрессированную на клеточной поверхности форму белка (Multhoff, 2002),

характерную для опухолевых клеток.

34

С помощью аффинной хроматографии и иммунопреципитации было

показано взаимодействие БТШ70 с цитоплазматическим доменом скэвенджер-

рецептора макрофагов (MSR), тримерного мембранного белка, связывающего

липопротеины низкой плотности и вовлеченного в развитие атеросклероза

(Nakamura et al., 2002).

2.2.3. БТШ70 и иммунитет

В настоящее время появляется все больше литературных данных,

позволяющих рассматривать внеклеточные БТШ70 в качестве важного

компонента регуляции как врожденного, так и адаптивного

иммунитета (Tamura et al., 2012).

2.2.3.1. Иммуно-супрессорные свойства БТШ70

Как уже упоминалось, БТШ70 являются индикаторами, но не индукторами

стресса (De Maio, 2011; Joly et al., 2010). Повышенная экспрессия этих белков в

неблагоприятных для организма ситуациях осуществляется с целью защиты, а не

повреждения организма. Детально охарактеризована способность белка БТШ70

останавливать рост опухолей и препятствовать развитию аутоиммунных и

инфекционных заболеваний (Stocki, Dickinson, 2012; Vinokurov et al., 2012;

Zonneveld-Huijssoon et al., 2013). Механизмы, приводящие к

БТШ70-опосредованному подавлению неблагоприятных процессов, не

достаточно изучены.

2.2.4. БТШ70 в аллергии и астме

Внеклеточный БТШ70 не рассматривается как диагностический маркер при

астме, однако было показано, что системное и локальное повышение уровня

внеклеточного БТШ70 коррелирует со степенью тяжести астматического

воспаления (Hou et al., 2011). В процессе аллергического воспаления и при астме

белки семейства БТШ70 могут проявлять как про-, так и

35

противовоспалительную активность (Kacimi, Yenari, 2015; Polla et al., 1998; Yang

et al., 2005).

2.2.5. БТШ70 при воспалении дыхательных путей

Прямого противовоспалительного эффекта БТШ70 при аллергическом

воспалении дыхательных путей до настоящего времени продемонстрировано не

было. Однако было показано, что БТШ70 оказывает протективное воздействие

при развитии фиброзов легких различной этиологии (Fujibayashi et al., 2009;

Tanaka et al., 2010). Повышенная экспрессия БТШ70 была зарегистрирована при

исследовании механизмов супрессорного воздействия нестероидных препаратов

на тучные клетки, играющие важную роль в аллергических заболеваниях (Mortaz

et al., 2009). И, наконец, повышенное содержание БТШ70 было обнаружено в

составе экзосом, выделенных из БАЛ мышей, у которых была выработана

толерантность к аллергену (Prado et al., 2008). Более того, было показано, что

превентивная интраназальная иммунизация такими экзосомами мышей

препятствовала развитию аллергического воспаления дыхательных путей,

вызванного сенсибилизацией и провокацией аллергеном из пыльцы оливкового

дерева (Prado et al., 2008). Механизм протективного эффекта БТШ70 при

воспалительных процессах, в том числе аллергических и воспалениях

дыхательных путей, до сих не изучен, однако, ведутся активные исследования

супрессирующего воздействия БТШ70 на различные типы клеток иммунной

системы.

2.2.6. БТШ70 в регуляции активности нейтрофилов

В отличие от эозинофилов, нейтрофилы не являются специфическими

клетками, отличающими аллергическое воспаление дыхательных путей от

воспалительных процессов иной природы. Как и в случае ингаляции экзогенных

патогенов грибной или бактериальной природы, после вдыхания аллергена

сенсибилизированными животными или пациентами с аллергией инфильтрация

36

нейтрофилов в дыхательные пути происходит в течение 2-6 часов (Bhakta,

Woodruff, 2011; Lommatzsch et al., 2006; Lutfi et al., 2012). Приток нейтрофилов

носит кратковременный характер и в отсутствии повторного вдыхания аллергена

количество нейтрофилов в респираторном тракте снижается до базового уровня

(Page et al., 2008). Предполагают, что аттрактантом для нейтрофилов при астме

служат аллерген-специфические антитела или эндотоксин, примеси которого

присутствуют в растворе аллергена (Delayre-Orthez et al., 2004; Peters et al., 2010;

Taube et al., 2003). Вопрос о том, играют ли нейтрофилы принципиальную роль в

развитии аллергического заболевания дыхательных путей, или являются

ассоциированным фактором остается не выясненным. Было показано, что

БТШ70 in vitro способен стимулировать хемотаксис нейтрофилов (Hinchado et

al., 2012). Более того, одной из характеристик БТШ70 как «сигнала опасности»

является способность активировать нейтрофилы путем воздействия на TLR4

(Wheeler et al., 2009). Однако, более поздние публикации ставят под сомнение

способность БТШ70 взаимодействовать с TLR, объясняя полученные ранее

результаты влиянием липополисахарида (LPS), примеси которого содержались в

исследуемых препаратах БТШ70 (Marincek et al., 2008; Tsan, Gao, 2009). В то же

время, детальное исследование влияния на активацию различными

бактериальными антигенами нейтрофилов периферической крови человека

выявили ярко выраженный ингибиторный характер воздействия экзогенного

БТШ70 (Antonova et al., 2012; Yurinskaya et al., 2010; Yurinskaya et al., 2009).

2.3. Активные формы кислорода

К активным формам кислорода (АФК) относят разнообразные продукты

неполного восстановления кислорода. Активные формы кислорода (АФК),

продуцируемые активированными нейтрофилами, играют важную роль в первой

линии защиты организма от болезнетворных микроорганизмов. В то же время

хорошо известно, что повышенная концентрация внеклеточных АФК в очагах

воспаления оказывает повреждающее действие не только на патогенные

37

микроорганизмы, но и на клетки-продуценты кислородных радикалов, и на

другие клетки и ткани организма.

Помимо противомикробной активности АФК также выполняют в клетки

важные физиологические функции, такие как регуляция клеточного цикла,

запуск и развитие апоптоза, а также выступают в качестве вторичных

посредников при проведении сигнала (Brown, Griendling, 2015). Было показано,

что увеличение концентрации АФК может приводить к активации

транскрипционного фактора NF-κВ, и индукции синтеза ряда белков, в том

числе участвующих в развитии иммунного и воспалительного ответа (Morgan,

Liu, 2011).

Продукция как внутри-, так и внеклеточных АФК нейтрофилами находится

под контролем разнообразных рецептор-опосредованных сигнальных путей.

Основным источникoм АФК служит реакция одноэлектронного восстановления

молекулярного кислорода с образованием супероксид анион-радикала O2•. В

нейтрофилах O2• образуется преимущественно NADPH-оксидазой

цитоплазматической мембраны и мембран фагосом, а также в небольшой

степени дыхательной цепью внутренней мембраны митохондрий и системой

цитохрома Р-450. При этом большая часть O2• превращается в перекись

водорода, которая также токсична в больших концентрациях (Babior et al., 1973):

2O2•+ 2O2

• + 2H+ O2 + H2O2

Основной цитотоксический эффект O2• и H2O2 связан с их участием в

образовании более агрессивных АФК, таких как гипохлорит HOCl, озон О3,

гидроксил радикал OH• и др.

Гипохлорит, образующийся из перекиси водорода под действием

миелопероксидазы, обладает наиболее выраженным антибактериальным

эффектом (Arnhold, 2004).

В нефагоцитирующих клетках АФК образуются в основном в качестве

побочного продукта при работе дыхательной цепи митохондрий. В процессе

переноса электронов по дыхательной цепи около 1-2% электронов участвуют в

38

продукции O2•. При этом нарушения в работе системы электронного транспорта,

такие как нарушение синтеза или функций белков-переносчиков, усиливают

продукцию O2• (Boveris, 1984).

В нейтрофилах основным продуцентом АФК является мембраносвязанный

мультимолекулярный ферментный комплекс

NADPH-оксидаза (Gougerot-Pocidalo et al., 2002).

2.4. NADPH-оксидаза

NADPH-оксидаза — ассоциированный с плазматической мембраной

мультикомпонентный ферментный комплекс, относящийся к группе

флавинсодержащих ферментов. Ее основной функцией является перенос

электрона через мембрану с восстановленного NADPH на молекулярный

кислород с образованием супероксид-анион радикала, который, в свою очередь,

является источником для образования большого числа токсичных активных

форм кислорода, таких как оксиды галогенов, свободные радикалы и синглетный

кислород.

В настоящее время к семейству NADPH-оксидаз относят 7 гомологичных

ферментов: Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 and Duox2 (Touyz et al., 2011).

Наиболее изучена NADPH-оксидаза фагоцитирующих клеток (Nox2), в которых

она выполняет функцию защиты от патогенов, продуцируя активные формы

кислорода во внеклеточную среду в реакции «окислительного взрыва». Однако,

избыточная концентрация АФК в очагах воспаления приводит не только к

гибели чужеродных микроорганизмов, но и повреждению окружающих тканей.

Активный фермент заякорен на мембране клеточных органелл или

цитоплазматической мембране. В неактивном состоянии компоненты фермента

не взаимодействуют и на мембране находятся лишь две субъединицы NADPH-

оксидазы p22phox (phox как аббревиатура от phagocyte oxidase, оксидаза

фагоцитов) и gp91phox, а также низкомолекулярный G-белок Rap1A, а другие

три субъединицы p67phox, p47phox, p40phox, образующие цитозольный

39

комплекс, и низкомолекулярные G-белки Rac2, и Rho-GDI в виде гетородимера

находятся в цитоплазме (Bayraktutan et al., 2000; Lapouge et al., 2002).

При активации фагоцита одним из многочисленных рецептор-

опосредованных или нерецепторных стимулов происходит усиленное

фосфорилирование субъединицы p47phox, приводящее к миграции всего

комплекса к мембране и его взаимодействию с цитохромом b558 (рис. 2). Rac2

связывает GTP и мигрирует к мембране вместе с цитозольным комплексом

(Diebold, Bokoch, 2001; El-Benna et al., 2009). Таким образом собирается

активный фермент. Считается, что транспорт электронов осуществляется путем

последовательного переноса по простетическим группам флавина и, затем, гема

(Cross, Segal, 2004).

2.4.1. Свойства и функции компонентов NADPH-оксидазы

Структура NADPH-оксидазного комплекса и пути его активации схематично

изображены на рис. 2.

Мембранные молекулы p22phox (α-субъединица, или легкая цепь, продукт

гена CYBA) и gp91phox (β-субъединица, или тяжелая цепь, продукт гена CYBB),

связывая FAD и два неидентичных гема образуют гетеродимерный

флавогемопротеин цитохром b558 (по длине волны поглощения цитохрома)

(Taylor et al., 1993), являющийся основным компонентом NADPH-оксидазы.

Этот компонент формирует канал для потока электронов от окисленного NADP+

из цитозоля на другую сторону мембраны (наружную сторону клеточной

мембраны или внутреннюю сторону мембраны фагосомы) (Cross, Segal, 2004).

С использованием цитохимического окрашивания Kobayashi и соавторами

было показано, что в активированных форболом нейтрофилах продукция

супероксиданиона первоначально происходит в небольших цитоплазматических

везикулах, содержащих алкалин-фосфатазу. Эти везикулы затем формируют

более крупные везикулы, которые сливаются с плазматический мембраной

(Kobayashi et al., 1998).

40

p40phox, p47phox, и p67phox – мультидоменные белки, содержащие домены

белок-белкового взаимодействия SH3. p40phox и p47phox содержат также по

одному PX домену. Показано, что PX домены могут связывать

фосфатидилинозитолы и, по всей видимости, являются модулями,

направляющими к мембране (Cheever et al., 2001; Kanai et al., 2001). Помимо

этого, большинство PX доменов содержат аминокислотный мотив, узнаваемый

SH3 доменами. В том числе было показано, что изолированный PX домен

p47phox связывается со вторым SH3 доменом p47phox с Kd~50µМ (Hiroaki et al.,

2001). p47phox является центральной фигурой процесса активации, т.к. он

способен связываться с цитоплазматическим регионом мембранного белка

p22phox. p67phox находится в цитозоле в комплексе с p47phox. Оказавшись на

мембране, куда он транслоцируется вместе с p47phox, имеющим специфический

адресный домен, p67phox взаимодействует с Rac (Diebold, Bokoch, 2001; Han et

al., 1998).

Субъединица р40phox была охарактеризована при выделении в комплексе с

р67phox. Она состоит из 339 а.о. и имеет очень высокую гомологию с р47phox, с

той разницей, что она слабо фосфорилируется во время активации (Kanai et al.,

2001). Функциональная роль белка p40phox в экспериментах in vitro в полной

мере не раскрыта: описаны как стимулирующие, так и ингибирующие NADPH

оксидазу эффекты, оказываемые этим белком (Matute et al., 2005). Субъединица

р40phox способствует удержанию р67phox в мембране (Groemping, Rittinger,

2005). Таким образом цитозольные субъединицы связываются с мембраной и

способствуют направленному потоку электронов к мембране.

В удержании на мембране, полной сборке и активации фермента NADPH-

оксидазы участвуют GTP-связывающие белки Rac2 и Rho. Они относятся к

суперсемейству Ras (Kreck et al., 1996). Известно, что в покоящихся

нейтрофилах GDP-Rac2 находится в комплексе с Rho-GDI (от GDP-Dissociation

Inhibitor). Этот комплекс обладает ингибирующим действием на NADPH-

оксидазу. При активации NADPH-оксидазы происходит диссоциация комплекса

с ингибитором, и при участии фактора обмена GEF (Guanine-Nucleotide Exchange

41

Factors - GEF) Rac2 переходит в связанную форму с GТP (Abo et al., 1994;

Takeya, Sumimoto, 2003). Этот белок транслоцируется в мембрану независимо от

р67phox и р47phox (Diebold, Bokoch, 2001). На мембране GTP-Rac2 в процессе

фосфорилирования связывается с р67phox, регулируя окисление NADPH до

NADP+ (Bokoch, Knaus, 1994).

Rap1A является еще одним представителем G-белков, который

взаимодействует с цитохромом b558. Помимо этого, он является субстратом для

протеинкиназы А, обладающей ингибирующей активностью по отношению к

NADPH-оксидазе (Bokoch et al., 1991).

Рис. 2. Схема сборки и активации NADPH-оксидазы.

На рисунке схематично приведена последовательность событий при проведении

сигнала от рецепторов к fMLP и к Fc-концу антител и при воздействии РМА и Ca2+-

ионофоров. Во всех случаях конечной реакцией является фосфорилирование

субъединицы NADPH-оксидазы p47phox протеинкиназой С, приводящее к

автоматической сборке комплекса.

42

2.4.2. Ингибиторы NADPH-оксидазы

Так как для работы NADPH-оксидазы необходимы сульфгидрильные группы,

некоторые блокаторы –SH групп могут ингибировать ее активность. К таким

ингибиторам относится альдегид 4-гидроксиноненнал с I50 = 19µM

(Siems et al., 1997). 4-гидроксиноненнал является физиологически важным

ингибитором, т.к. это основной продукт перекисного окисления липидов,

который неизбежно присутствует в тканях, испытывающих окислительный

стресс.

Оксид азота (NO) также способен ингибировать NADPH-оксидазу,

препятствуя объединению ее субъединиц, необходимому для сборки активного

фермента (Fujii et al., 1997). Нитрозотиолы (RSNO) также ингибируют

активацию NADPH-оксидазы, препятствуя транслокации к мембране

цитозольных субъединиц p47phox and p67phox (Ding et al., 1996).

Также активность NADPH-оксидазы может быть подавлена

неспецифическими ингибиторами флавин-содержащих ферментов, такими как

дифенилиод (DPI) (O'Donnell et al., 1993).

2.4.3. NADPH-оксидаза и цитоскелет

Было показано, что стимуляция оксидазы в детергент-активируемой

бесклеточной системе усиливается под действием актина G

(Morimatsu et al., 1997). Berton et al. показали, что активация нейтрофилов,

адгезированных на поверхности, фактором некроза опухоли, которой не

происходит в клеточной суспензии, зависит от миграции тирозинкиназы p58fgr

из семейства Src из цитозоля к цитоскелету. При этом нейтрофилы с нокаутом

генов p58fgr и другой тирозинкиназы из того же семейства p59/61hck не

способны продуцировать О2- при взаимодействии с поверхностью, покрытой

коллагеном или фибронектином, демонстрируя при этом нормальную

способность к продукции кислородного радикала в ответ на стимуляцию

43

иммунными комплексами или ФМА (Lowell et al., 1996; Yan, Berton, 1996; Yan et

al., 1995).

2.4.4. Взаимодействие БТШ70 и NADPH-оксидазы

В литературе описано взаимодействие БТШ70 с мембранной NADPH-

оксидазой, приводящее к снижению продукции активных форм кислорода. Так,

было показано, что повышение уровня БТШ70 в дендритных клетках линии XS-

106 приводит к снижению продукции ими активных форм кислорода (Je et al.,

2013). Chen et al. сообщают об участии БТШ70 в деградации оксидаз NOX-2 и

NOX-5 путем убиквитинилирования, что также приводит к снижению продукции

АФК (Chen et al., 2012). Далее, Gil Lorenzo et al. было показано повышение

уровня экспрессии и активности NOX-4 при деплеции БТШ72, а также

колокализация и взаимодействие мембранного БТШ70 и активного комплекса

NOX-4/p22phox (Gil Lorenzo et al., 2013).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Буферные растворы

PBS: 2mM KH2PO4, 10 мM Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2.7 мM KCl; pH 7.4

гемолизирующий буфер: 0.83% NH4Cl, 0.004% EDTA, 0.084% NaHCO3

ЭДТА-бикарбонатный буфер: 4.4 мг/мл ЭДТА, титровали NaHCO3 до pH 7.4

буфер для образцов: 0.125 М Tris-Cl (Ferak, Германия), 4% додецилсульфат

натрия (MERCK, Германия), 0.025% β-меркаптоэтанол (Sigma, США) и

0.02% бромфеноловый синий (Sigma, США); pH 6.8

буфер для хранения: 20 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH=7.4

буфер D: 20мМ Tris, 20 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 15 мМ β-меркаптоэтанол

лизирующий буфер: Буфер D с 0.1% Triton X100, 1 мМ PMSF

буфер B: 50 мМ Na2HPO4 и 300 мМ NaCl; pH 8

44

буфер Bl: 50 мМ Na2HPO4 и 300 мМ NaCl, 10µМ PMSF,

2 мг/мл лизоцима; pH=8

буфер С: 50 мМ Na2HPO4 и 300 мМ NaCl; pH 6

буфер Е: 50 мМ Na2HPO4 и 300 мМ NaCl; pH 4.5

TGB: 25 мМ Tris, 250 мМ глицин, 0.1% SDS

буфер для переноса: 0.2 М Tris, 0.2М глицин, 0.2% этиловый спирт

3.2. Животные и клеточные модели

3.2.1. Животные

В настоящей работе были использованы мыши линии BALB/c, полученные

инбредным скрещиванием в питомнике Российской Академии Медицинских

Наук (пос. Андреевка, Московская область, Россия). Мышей содержали при

температуре 22°C и 12-и часовом световом цикле, пищу и воду животные

получали ad libitum. В экспериментах использовали самок в возрасте 10-12

недель, весом 18-20 г, протоколы экспериментов были одобрены комиссией по

контролю за содержанием и использованием животных, созданной при ИБХ

РАН. Все исследования проводились в соответствии с этическими принципами и

нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом

(ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным.

Эвтаназия мышей проводилась путем пассивной ингаляции летальной дозы

изофлюрана (2-bromo-2-chloro-1,1,1-trifluoroethane, Sigma-Aldrich, США).

3.2.2. Индукция воспаления дыхательных путей с помощью

овальбумина

Мышей сенсибилизировали стандартным методом (Idzko et al., 2007) – путем

внутрибрюшинного введения белка овальбумина, OVA (Grade VI, Sigma-Aldrich,

США), в концентрации 10 µг/мышь/инъекцию, адсорбированного на носителе

Imject Alum (Thermo scientific, США) с разницей в неделю (день 0 и 7 на

45

рис. 3). После этого, на день 19, 20 и 21 мыши получали интрафарингеально

ингаляции 0.1% раствора OVA в PBS (Хеликон, Россия), в количестве

50 µл/мышь/инъекцию. Контрольные животные получали тот же объем PBS. Для

определения эффектов БТШ70 целевой белок вводили мышам

интрафарингеально в количестве 1 µг/мышь на 22 день (через сутки после

последней ингаляции аллергена). Контрольные мыши получали PBS. Эвтаназию

животных и забор биоматериала проводили на 22, 23 и 24 день (т.е. через 24 ч,

48 ч и 72 ч после последней ингаляции аллергена). Схема эксперимента

приведена на (рис. 3).

Рис. 3. Схема эксперимента.

Стрелки сверху указывают время предъявления аллергена (количество дней от

начала эксперимента), стрелки внизу – время эвтаназии животных в часах после

последней ингаляции аллергена.

3.2.3. Определение общего количества и популяционного состава

клеток бронхоальвеолярного лаважа (бронхоальвеолярного смыва)

После эвтаназии, в трахею мыши вводили канюлю, с помощью которой

лёгкие промывали PBS дважды по 0.8 мл. Полученный БАЛ помещали в

эппендорф и центрифугировали 5 минут. Супернатант отбирали, замораживали и

хранили при -20 °C. Клетки, находящиеся в осадке, разводили PBS до 1 мл.

Подсчет общего количества клеток проводили с помощью камеры Горяева

(Минимед, Россия). Для получения монослоя использовали концентрацию

22 23 24 7 0

дней после первой

инъекции адъюванта

24 48 72 часов после последней

ингаляции аллергена

19 21 20

БТШ70

ингаляции

OVA 1%

(или PBS)

интраперитонеально

OVA/Alum

10µg/мышь

эвтаназия

животных

46

клеток 0.5 млн/мл и оптимальный объем образца 200 µл/стекло. Клетки

осаждали при помощи цитоцентрифуги (Shendon Cytospin II, Великобритания) в

течение 5 минут при 500 об/мин. Препараты окрашивали с помощью набора

«Диахим-Диффквик» (Диахим, Россия). В состав набора входят красители (в

растворе), предназначенные для быстрого дифференцированного окрашивания

биопрепаратов.

3.2.4. Определение уровня цитокинов в бронхоальвеолярных лаважах

Продукцию цитокинов оценивали методом твердофазного ИФА. Для

определения IL-4 и IL-5 использовали наборы ELISA MAX Standard Sets

(Biolegend, США), для определения IL-1β, IL-6 и IL-13 использовали ELISA

Development Kit (PeproTech, США). В лунки 96-луночного планшета для ИФА

(Linbro, Великобритания) вносили по 100 µл раствора первых антител в PBS в

концентрации 0.5 µг/мл и инкубировали в течение ночи в соответствии с

инструкциями производителей. Затем планшеты отмывали буфером на основе

PBS, содержащим 0.05% Tween-20 (Fer-A-Synth, Германия) (T-PBS). Здесь и

далее отмывки проводили трижды. Далее в лунки вносили блокирующий буфер

(1% BSA-PBS): 1% раствор BSA (Serva, Германия) в PBS. Через 1 час планшет

отмывали T-PBS, затем вносили разведенные в BSA-PBS бронхоальвеолярные

лаважи иммунных мышей и стандарты. Планшеты инкубировали два часа при

комнатной температуре, затем отмывали T-PBS. Далее проводили двухчасовую

инкубацию со вторыми антителами в концентрации 0.5 µг/мл. После отмывки

инкубировали 30 минут со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой

хрена. Проводили отмывку T-PBS, как описано ранее. Окрашивание

производили 2-х компонентным раствором субстрата («НВО Иммунотех»,

Россия). Реакцию останавливали добавлением 50 µл/лунку 10% серной кислоты.

Конечный результат оценивали по разности поглощения при 690 нм и 450 нм.

Поглощение измеряли, используя прибор Multiskan FC (Thermo Scientific,

Германия). Ставили контроль на неспецифическое связывание реагентов и

47

неспецифическую реакцию субстрата. Далее проводили обсчет и построение

графиков по полученным результатам.

3.2.5. Определение уровня иммуноглобулинов

Продукцию антиген-специфических антител оценивали методом

твердофазного ИФА. В лунки 96-луночного планшета для ИФА (Linbro,

Великобритания) вносили по 100 µл раствора овальбумина в фосфатном буфере

в концентрации 5 µг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем

планшеты отмывали T-PBS как описано выше. Далее в лунки вносили

блокирующий буфер (1% BSA-PBS). Через 30 минут планшет отмывали T-PBS,

затем вносили разведенные в BSA-PBS сыворотки иммунных мышей. Планшеты

инкубировали час при комнатной температуре, затем отмывали T-PBS. Далее

проводили часовую инкубацию в присутствии специфического конъюгата – anti

mouse IgG HRP (Phara-Mingen, США), разведенного в BSA-PBS 1:1000.

Проводили отмывку T-PBS, как описано ранее. Окрашивание производили 2-х

компонентным раствором субстрата («НВО Иммунотех», Россия). Реакцию

останавливали добавлением 50 µл/лунку 10% серной кислоты. Конечный

результат оценивали по разности поглощения при 690 нм и 450 нм. Поглощение

измеряли, используя прибор Multiskan FC (Thermo Scientific, Германия). Ставили

контроль на неспецифическое связывание реагентов и неспецифическую

реакцию субстрата. Далее проводили обсчет и построение графиков по

полученным результатам.

3.2.6. Выделение клеток и приготовление клеточных суспензий

Клетки костного мозга мыши выделяли путем их вымывания из бедренных и

большеберцовых костей охлажденным фосфатным буфером (PBS). После

гомогенизации полученного материала пипетированием примесь эритроцитов

удаляли путем гемолиза с помощью гемолизирующего буфера (0.83% NH4Cl;

0.004% EDTA; 0.084% NaHCO3) с последующими отмывками фосфатным

48

буфером. Нейтрофилы из суспензии клеток костного мозга мыши выделяли

методом отрицательной магнитной селекции с использованием коммерческого

набора Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Германия) на магнитных

колонках LS Coloumns + MidiMACS Separator (Miltenyi Biotec, Германия)

согласно рекомендациям производителя. Чистоту популяции выделенных клеток

оценивали с помощью детекции специфических маркеров нейтрофилов мыши

Ly-6G (Gr-1) и CD11b (антитела Ly6G-FITC и CD11b-PE, eBioscience, США)

методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton

Dickinson, США).

Ряд экспериментов проводили с использованием клеточных образцов из

части популяции клеток КМ, оставшейся после выделения нейтрофилов и

содержащей фагоцитирующие клетки других типов, в частности моноцитарного

ряда.

Для выделения человеческих нейтрофилов периферическую кровь здоровых

доноров собирали закрытым способом в стерильные гепаринсодержащие

пробирки (Vacutube, Италия). Фракцию полиморфоядерных лейкоцитов,

содержащую преимущественно нейтрофилы, выделяли из цельной крови (не

позднее 2 ч после забора крови) с помощью коммерческого разделяющего

раствора Polymorohprep (AXIS-SHIELD, Норвегия), следуя рекомендациям

производителя. После выделения клетки отмывали от разделяющей среды

двукратным центрифугированием в растворе Хэнкса (ПанЭко, Россия). Чистоту

популяции выделенных клеток оценивали с помощью детекции специфических

маркеров нейтрофилов человека CD66b (антитела CD66b-FITC, BioLegend,

США) методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton

Dickinson, США).

3.2.7. Регистрация уровня внеклеточной РНК

Определение внеклеточной концентрации нуклеотидов проводили на

планшетном флуориметре GLOMAX Multudetection System (Promega, США) при

49

помощи флуоресцентного нуклеотид-связывающего красителя Sytox-Green (Life

Technologies, США). Для определения эффекта БТШ70 данный белок добавляли

к образцам в концентрации 10 µг/мл. В контрольные образцы добавляли

референтный белок БСА, схожий с БТШ70 по физико-химическим

характеристикам, в той же дозе.

3.2.8. Регистрация активных форм кислорода

Измерение общего и внеклеточного уровня АФК проводили соответственно

методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции (Lundqvist,

Dahlgren, 1996) с использованием планшетного люминометра GLOMAX

Multudetection System (Promega, США). Перед измерениями подготовленные

клеточные суспензии переводили в раствор Хэнкса, содержащий 10-4 М

люминола или изолюминола. Для анализа в лунки белого плоскодонного 96-

луночного планшета (SPL Life Science, Корея) вносили по 2х105 клеток в объеме

200 µл. БТШ70 (Invitrogen, США) и БСА (Sigma, США) добавляли в лунки до

конечной концентрации 0.1–5 µг/мл за 30 мин до индукции «окислительного

взрыва». Регистрацию внутриклеточного уровня АФК проводили методом

люминол-зависимой хемилюминесценции в присутствии во внеклеточном

пространстве скэвенджеров АФК каталазы (Sigma, США) и

супероксиддисмутазы (Sigma, США) в концентрациях 2000 U/мл и 100 U/мл

соответственно (Nosal et al., 2011). Наряду с этим, для оценки уровня

внутриклеточного содержания АФК использовали метод проточной

цитофлуориметрии с применением 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA)

(Sigma, США) – флуоресцентного зонда кислородных радикалов, проникающего

в клетки, в концентрации 10 µМ (Testa et al., 2011).

Для внесения в клеточные культуры использовали раствор рекомбинантного

БТШ70 в PBS. В качестве контроля в этих опытах использовали такие же дозы

раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США) в PBS. В серии

экспериментов, направленных на оценку эффектов возможной контаминации

50

рекомбинантного белка бактериальным эндотоксином (ЛПС) использовали

коммерческие препараты липополисахарида стенок бактерий

Escherichia coli (Sigma, США).

3.2.9. Индукция «окислительного взрыва»

Для активации клеток, приводящей к лавинообразной продукции АФК

(«окислительный взрыв»), были использованы хемотактический пептид N-

формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) (Sigma, США) (Panaro, Mitolo,

1999) в концентрации 1–20 µМ, форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) (Sigma,

США) в концентрации 8–2000 µМ (Castagna et al., 1982), кальциевый ионофор

А23187 (Serva, Германия) в концентрации 10 µМ (Pressman, 1976). Для оценци

влияния БТШ70 на «окислительный взрыв» использовали те же дозы белка, что

и для спонтанной продукции АФК.

3.2.10. Ингибиторы продукции АФК

Для направленного подавления интенсивности продукции АФК ферментным

комплексом NADPH-оксидазы использовали ингибитор p47phox-субъединицы

этого комплекса – апоцинин (Calbiochem, Германия) (Touyz, 2008) в

концентрации 15 µМ и ингибитор флавинсодержащих ферментов

дифенилениодоний – DPI (Sigma, США) (O'Donnell et al., 1993) в концентрации

1.5 µМ. Ингибиторы вносили в образцы клеток за 15 мин до добавления белков.

3.3. Выделение белка БТШ70 из внутренних органов мышей

Для получения аутологичного БТШ70 для инрафарингеального введения

мышам использовали БТШ70, получаемый из гомогената внутренних органов

сингенных мышей с последующей аффинной хроматографией на АТФ-агарозе.

51

3.3.1. Получение гомогенатов печени и почек мышей

Печень и почки мышей гомогенизировали при помощи лабораторных

инструментов и процеживали через сито 100 мкм (SPL Life Sciences, Корея).

Гомогенат растворяли в лизирующем буфере и измельчали вначале механически

с помощью гомогенатора Ultra-Turrax (IKA, Германия), затем ультразвуком с

использованием ультразвукового диспергатора УЗДН-А (УКРРОСПРИБОР,

Украина). Степень разрушения контролировали визуально с помощью

микроскопа Axiovert 40 (Zeiss, Германия). Гомогенат центрифугировали 30 мин

при 3200 об/мин с использованием центрифуги SORVALL (Thermo Scientific,

США); полученный супернатант центрифугировали 45 мин при 10000g с

использованием центрифуги J-21 (Beckmann, США) и фильтровали через фильтр

0.22 мкм (Millipore, Германия).

3.3.2. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии на

АТФ-агарозе

АТФ-агарозу (Sigma, США) выдерживали в 10х объеме буфера D 3 часа.

Затем колонку с АТФ-агарозой последовательно промывали 1М раствором NaCl,

5мМ раствором АДФ в буфере D и буфером D.

Гомогенат внутренних органов мышей разводили лизирующим буфером и

двукратно пропускали белковый раствор через колонку. Для более эффективного

связывания колонку с белковым раствором инкубировали в течение 20−40 минут

при комнатной температуре, после чего собирали фракцию не связавшегося

материала. Далее колонку последовательно промывали лизирующим буфером (2

объема колонки), Буфером D (4 объема) и 0.5 М NaCl в Tris-буфере (2 объема).

Избыток соли удаляли 1 объемом Буфера D, после чего, производили элюцию

белка 3 мМ АТФ в Буфере D (2-5 объемов колонки). При необходимости элюат

концентрировали при помощи лиофильной сушки SpeedVac

Concentrator (SAVANT, США).

52

3.3.3. Диализ в бикарбонатном буфере

Для удаления избытка АТФ очищенный белок, полученный высокоаффинной

хроматографией, диализовали против ЭДТА-бикарбонатного буфера (4.4 мг

ЭДТА на 1 л дистиллированной воды; далее титровали NaHCO3 до pH 7.4).

Раствор БТШ70 помещали в диализный мешок (Spektra/Por Membranes,

Germany) с диаметром пор 3 кДа. Диализ проводили в течение ночи при

температуре +4 ºС. Полученный белок хранили в аликвотах при -20 ºС.

3.3.4. Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии на

Ni-агарозе

В экспериментах на клеточных моделях использовали препараты

рекомбинантного индуцируемого БТШ70 человека, очищенные от LPS.

Эти белки продуцировались штаммом Escherichia coli Mach,

трансформированным векторной плазмидой pHis parallel 2.

После 12-часовой IPTG-индуцированной продукции белка, бактерии

осаждали при 5000g 20 минут. Осадок ресуспендировали в буфере Bl из расчета

5 мл на 1 г осадка. После инкубации с лизоцим-содержащим буфером Bl в

течение 30 мин, клетки разбивали на соникаторе QSonica S-4000 (Qsonica,

США). Полученный осветленный лизат центрифугировали при 16000g.

Супернатант наносили на уравновешенную буфером В Ni-NТА-колонку

(QIAGEN, Нидерланды). Затем колонку промывали 10 объемами буфера С для

удаления слабо связывающихся белков. БТШ70 элюировали буфером Е.

3.3.5. Очистка БТШ70 от контаминации бактериальных

липополисахаридов

После выделения и хроматографической очистки на Ni-агарозной колонке

препараты БТШ70 подвергались стадии элиминации примеси бактериального

липополисахарида на колонках с полимиксином (Thermo Fisher Scientific, США)

согласно рекомендациям производителя.

53

3.3.6. Определение концентрации белка

Концентрацию белка определяли при помощи Bio-Rad Protein Assay (Bio-

Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Калибровочную

кривую строили с использованием BSA, имеющего молекулярную массу 66.5

кДа, т.е. близкую к белку БТШ70, концентрацию которого необходимо было

установить.

3.3.7. Электрофорез в ПААГ

С целью оценки чистоты полученного из внутренних органов мышей белка

БТШ70, проводили электрофорез в ПААГ. Растворенные образцы смешивали с

буфером для образцов в соотношении 1:1, затем кипятили в течение пяти минут.

Для определения молекулярной массы исследуемого белка в качестве

контроля используют смесь белковых маркеров (Хеликон, Россия).

Для проведения электрофореза использовали рамку MV-1 для вертикального

электрофореза (Хеликон, Россия). Разделение проводили в 5%

концентрирующем геле (5% АА/бисАА (30% акриламид/0.8% бисакриламид),

130 мМ Tris-Cl pH=6,8, 0.1% SDS, 0.1% APS, 0.1% TEMED) и 10% разделяющем

геле (10% АА/бисАА, 375 мМ Tris-Cl pH=8.8, 0.1% SDS, 0.1% APS, 0.08%

TEMED) в трис-глициновом буфере (TGB).

Визуализацию проводили при помощи окрашивания PageBlue Protein Staining

Solution (Thermo scientific, США).

3.3.8. Вестерн-блот анализ

Для подтверждения того, что выделенный белок является БТШ70, проводили

иммуноблоттинг с использованием специфических к БТШ70 антител

BRM22 (Sigma, США).

54

Часть геля после электрофореза опускали в буфер для переноса на 10 минут

при покачивании на шейкере SHAKER S3.02. (ELMI, Латвия). Перенос белков с

геля на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher und Schuler, Германия)

осуществляли полусухим методом на установке Trans-blot СОi-Dry Transfer cell

(Bio-Rad, Великобритания) в течение 30 минут при напряжении не более 15 В.

Силу тока подбирали согласно формуле: I = 5.5 mA/см2 х S, где S – площадь

мембраны.

Далее нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в Tris-буфере в течение

часа при +4 ºС с анти-БТШ70 антителами (BRM22, титр: 1:500). В качестве

вторых антител использовались антитела против IgG мыши, конъюгированные с

пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания, титр 1:5000). Инкубацию со

вторыми антителами проводили в течение часа при +4 ºС. После каждой

инкубации мембрану отмывали Tris-буфером, в течение 30 минут.

Визуализацию проводили путем добавления субстрата тетраметилен

бензидина, TMB (Promega, США).

3.3.9. Определение содержания примеси LPS

Содержание примесей LPS в растворах используемых в работе белков

оценивали с помощью стандартного LAL-теста c использованием коммерческого

набора E-TOXATE (Sigma, США) в соответствии с рекомендациями

производителя.

3.4. Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с помощью пакета функций для

статистической обработки программы Prism и программы Statistics. На графиках

представлены средние значения и стандартная ошибка. Данные подвергались

анализу с помощью критерия t-тест Стьюдента. Различие значений при p<0.05

рассматривалось как достоверное.

55

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Особенности получения и очистки белка БТШ70

Гомогенность препаратов БТШ70, полученного из печени и почек мышей и

очищенного методом аффинной хроматографии на АТФ-агарозе (рис. 4 а), а

также рекомбинантного БТШ70, очищенного методом аффинной хроматографии

на Ni-агарозе (рис. 4 б), была определена с использованием метода

денатурирующего электрофореза в 10% полиакриламидном геле.

Рис. 4. Идентификация и характеристика выделенного из органов мыши (а, б)

и рекомбинантного (в, г) БТШ70.

а – электрофорез белка, выделенного из органов мыши,

б – вестерн-блот анализ БТШ70. Окрашивание коммерческими моноклональными

антителами Brm22,

в – электрофорез рекомбинантного белка,

г – вестерн-блот анализ рекомбинантного индуцируемого БТШ70. Окрашивание

коммерческими моноклональными антителами Brm22.

Молекулярные массы используемых маркерных белков приведены слева от

фотографий.

Вестерн-блот анализ с использованием специфических поликлональных

антител к БТШ70 BRM22 (Sigma, США) подтвердил тот факт, что выделенный

белок действительно является БТШ70 (рис. 4 б, г). При этом, как видно из рис.

а б в г

56

4 б, пул аутологичного мышиного БТШ70 содержит как коститутивный, так и

индуцируемый БТШ70, тогда как рекомбинантный БТШ70 представлен на рис.

4 г одной полосой, соответвующей только индуцируемой форме белка.

Вследствие особенностей используемого метода выделения БТШ70 с

помощью аффинной хроматографии на АТФ-агарозе, полученный белок может

содержать примесь АТФ, как в свободном виде, так и связанного с БТШ70.

Указанная контаминация препаратов выделенного белка снижает способность

БТШ70 взаимодействовать с эндогенной внеклеточной формой АТФ. Кроме

того, содержащий примесь АТФ БТШ70 может вызвать усиление

воспалительного ответа. В связи с этим, проводилось удаление АТФ из раствора

выделяемого белка с помощью диализа против буфера для хранения. Диализ

проводили в несколько этапов (по 12 ч.), после каждого раствор белка был

проанализирован на наличие АТФ. Было показано, что двух этапов диализа по

12 ч. достаточно, для полной очистки БТШ70 от примеси АТФ.

Другим фактором, потенциально способным искажать эффект белкового

препарата, в частности при получении рекомбинантного белка, являются

пирогенные примеси LPS. В нашем случае БТШ70, выделенный из печени и

почек мышей, как и рекомбинантный БТШ70 после очистки полимиксином,

содержал менее 20 U LPS на 1 мг белка, что соответствует незначительному

содержанию (LPSlo) (Gao, Tsan, 2003).

4.2. Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического

воспаления дыхательных путей

Для того, чтобы оценить участие нейтрофилов в процессе развития

аллергической бронхиальной астмы, а также влияние на этот процесс БТШ70,

мы использовали мышиную модель овальбумин-индуцированного

аллергического воспаления дыхательных путей. С целью выбора оптимального

временного интервала для введения БТШ70, а также для оценки эффектов,

оказываемых БТШ70, в данной работе было проведено сравнение характерных

57

показателей аллергического воспаления дыхательных путей на 24 часа (острая

фаза) и на 48 часов (эффекторная фаза) после последней ингаляции аллергена.

4.3. Общее количество и популяционный состав клеток

бронхоальвеолярных лаважей

Анализ бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ) показал, что общее количество

клеток значительно возрастает как в острой, так и в эффекторной фазе

аллергического воспаления дыхательных путей по сравнению с БАЛ

контрольных и интактных животных. Определение состава БАЛ выявило

повышенное количество макрофагов, эозинофилов и нейтрофилов как в острой,

так и в эффекторной фазе воспаления, однако, количество нейтрофилов в острой

фазе было значительно выше, чем в эффекторной (рис. 5).

общее кол-во клеток макрофаги нейтрофилы лимфоциты эозинофилы0.0

0.5

1.0

1.5

**

***

*** *** ***

**

***

******

OVA/PBS-острая

OVA/OVA-острая

OVA/PBS-эффекторная

OVA/OVA-эффекторная

NM

кл

етки

, м

лн

/мл

Рис. 5. Общее и дифференциальное количество клеток бронхоальвеолярного

лаважа мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных

путей в острой (OVA/PBS-острая и OVA/OVA-острая) и эффекторной (OVA/PBS-

эффекторная и OVA/OVA-эффекторная) фазе.

Результаты представлены в виде средних значений ± m (стандартная ошибка

среднего) по данным 3 экспериментов по 3-5 мышей в группе. При сравнении

показателей мышей с индуцированной астмой (OVA/OVA) с соответствующей

контрольной группой (OVA/PBS) статистическая значимость обозначена следующим

образом: ** – p≤0.01 обозначено; *** – p≤0.001.

58

Таким образом, было показано, что массовый приток нейтрофилов в легкие

характерен для острой фазы аллергического воспаления дыхательных путей.

4.4. Изменение уровня цитокинов в дыхательных путях

С целью оценки изменения гуморального ответа в острой и эффекторной

фазе воспаления было проведено измерение проаллергических цитокинов –

IL-4, IL-5, IL-13, общего провоспалительного IL-1β, а также ассоциированного

с активацией Th17 IL-6. Полученные данные свидетельствовали о том, что

секреция проаллергических цитокинов возрастала как в острой, так и в

эффекторной фазе аллергического воспаления дыхательных путей (рис. 6 а).

При этом, уровень IL-4 был выше в эффекторной фазе, а уровень IL-13 в острой

фазе воспаления (рис. 6 а). Уровень IL-5 был повышен как в острой, так и в

эффекторной фазе (рис. 6 а). Повышенный уровень маркеров острой фазы IL-1β

(рис. 6 б) и IL-6 (рис. 6 в) наблюдался через 24 ч после последней ингаляции

аллергена и был значительно снижен через 48 часов. Это подтверждает

адекватность определения данных временных точек как острой и эффекторной

фаз воспаления соответственно.

59

IL-4 IL-5 IL-130

5

10

15

20

***

**

*

*

OVA/PBS-острая

OVA/OVA-острая

OVA/PBS-эффекторная

OVA/OVA-эффекторная

NMко

нц

ен

тр

ац

ия

ци

то

ки

на,

пкг/

мл

0

100

200

300

400

ND

*

**IL-1

, п

кг/

мл

/ml

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00*

IL-6

, п

кг/

мл

Рис. 6. Секреция цитокинов клетками респираторного тракта мышей с

индуцированным воспалением дыхательных путей.

Изменение уровня проаллергических цитокинов IL-4, IL-5, IL-13 (А),

провоспалительного IL-1β (Б) и IL-6 (В) в БАЛ мышей на различных стадиях

аллергического воспаления дыхательных путей. Результаты представлены в виде

средних значений ± m по данным 3 экспериментов; n=5. Достоверное различие уровня

цитокина БАЛ мышей с индуцированной астмой (OVA/OVA) по сравнению с

соответствующей контрольной группой (OVA/PBS), * – p<0.05; ** – p≤0.01.

4.5. Продукция аллерген-специфических антител

Для дальнейшей оценки гуморального иммунного ответа в различных фазах

воспаления было проведено определение аллерген-специфических

иммуноглобулинов в сыворотке периферической крови и БАЛ мышей с

индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей. Уровень IgE

в сыворотке периферической крови был достоверно выше у OVA/OVA мышей,

как в острой, так и в эффекторной фазе воспаления, по сравнению с

*

*

а

б в

60

контрольными мышами, получавшими интрафарингеальные ингаляции

фосфатного буфера, вместо аллергена, и не проявляющими признаков

воспаления дыхательных путей (рис. 7 а, правая панель). При этом, увеличение

времени после последней ингаляции приводило к увеличению уровня IgE,

который в эффекторной фазе был выше, чем в острой (рис. 7 а, правая панель).

Интраперитонеальных инъекций аллергена было достаточно для того, чтобы

вызвать продукцию OVA-специфического IgG1, количество которого было

сопоставимо в OVA/OVA и OVA/PBS мышах (рис. 7 а, левая панель). При этом в

эффекторной фазе, наблюдалось достоверное увеличение концентрации IgG1 по

сравнению с концентрацией в БАЛ мышей с острой фазой воспаления (рис. 7 а,

левая панель). Измерения IgG1 в БАЛ также не выявили различий между

OVA/OVA и OVA/PBS группами, а также между OVA/OVA группами в строй и

эффекторной фазе (рис. 7 б, левая панель). Поскольку характерным

иммуноглобулином для мукозальных барьеров в организме млекопитающих

является IgA, было также проведено измерение аллерген-специфического IgA в

БАЛ. Как и предполагалось, уровень IgA был выше в случае

интрафарингеальной ингаляции аллергена по сравнению с контрольными

мышами (рис. 7 б, правая панель). При этом не было выявлено достоверных

различий в количестве IgA в БАЛ мышей с острой и эффекторной фазой

аллергического воспаления (рис. 7 б, правая панель).

61

0.0

0.5

1.0

ns

ns

**

*

*

**

IgG1 IgE

OD

450

0.0

0.5

1.0

nsns

***

*

OVA/PBS-острая

OVA/OVA-острая

OVA/PBS-эффекторная

OVA/OVA-эффекторная

NM

ns

ns

IgG1 IgA

OD

450

Рис. 7. Продукция аллерген-специфических антител при аллергическом

воспалении дыхательных путей.

Уровень секреции OVA-специфических IgG1 и IgE в сыворотке периферической

крови (а), а также OVA-специфических IgG1 и IgA в БАЛ (б) мышей с острой

(OVA/OVA-острая) и хронической (OVA/OVA-эффекторная) фазой аллергического

воспаления дыхательных путей был сопоставлен с уровнями продукции

соответствующих иммуноглобулинов у мышей контрольных групп (OVA/PBS).

Разведение сыворотки 1:10000 для определения IgG1 и 1:10 для определения IgE, БАЛ

1:1. Результаты представлены в виде средних значений ± m по данным 2

экспериментов: 3 и 5 мышей в группе. При сравнении показателей мышей с

индуцированной астмой (OVA/OVA) с соответствующей контрольной группой

(OVA/PBS) статистическое значение p≤0.05 обозначено *; p≤0.001 обозначено ***; ns –

отсутствие достоверного различия.

Таким образом, было показано, что внутрибрюшинной сенсибилизации

мышей аллергеном достаточно для формирования аллерген-специфического

IgG1, в то время как IgE и IgA формируется лишь после дополнительной

экспозиции аллергена. Кроме того, уровень аллерген-специфического IgE

возрастал в эффекторной фазе аллергического воспаления дыхательных путей по

сравнению с острой фазой.

а б

62

4.6. Снижение уровня секреции проаллергических цитокинов под

действием БТШ70

Поскольку усиление аллергического воспаления, в том числе в дыхательных

путях, обусловлено воздействием Th2-ассоциированных цитокинов, в частности

IL-4 и IL-13 на эпителиальные клетки и IL-5 непосредственно на эозинофилы,

далее была проведена оценка изменения про-аллергических цитокинов под

действием БТШ70. Было показано, что у мышей, получавших ингаляцию

БТШ70, достоверно снижались уровни IL-4, IL-5 и IL-13 на 48 часов после

ингаляции аллергена по сравнению с мышами, не получавшими протективной

ингаляции БТШ70 (рис. 8).

Рис. 8. Изменение секреции проаллергических цитокинов у мышей с

воспалением дыхательных путей после ингаляции БТШ70.

Уровень IL-4, IL-5 и IL-13 в бронхоальвеолярных смывах мышей с

индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в острой фазе

(OVA/OVA-острая, 24ч после последней ингаляции аллергена), мышей, получавших

интрафарингеально БТШ70 (OVA/OVA+БТШ70), не получавших протективной

ингаляции (OVA/OVA-эффекторная, 48ч после последней ингаляции аллергена) и

преиммунных мышей (NM). Результаты представлены в виде средних значений ± m по

данным 3 экспериментов: 5 мышей в группе. Достоверное снижение уровня

проаллергических цитокинов под действием БТШ70 с p≤0.001 обозначали **.

0

10

20

30

**

**

**

IL-4 IL-5 IL-13

ко

нц

ен

тра

ци

я

ци

токи

на

, п

г/м

л

63

Таким образом, экзогенное введение аутологичного БТШ70 мышам с

индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей снижало

секрецию проаллергических цитокинов.

4.7. Влияние БТШ70 на системную и локальную продукцию

аллерген-специфических иммуноглобулинов

Для оценки влияния БТШ70 на продукцию антител были выбраны

сывороточные IgG1 и IgE, а также IgA БАЛ, так как для этих иммуноглобулинов

было выявлено повышение уровня секреции в эффекторной фазе по сравнению с

острой фазой воспаления либо по сравнению с контрольными

иммунизированными мышами (рис. 7). Ингаляция БТШ70 в острой фазе

воспаления останавливала прогрессию уровней аллерген-специфических IgG1

и IgE в сыворотке периферической крови и IgA в надосадочной жидкости БАЛ

мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных

путей (рис. 9).

64

Рис. 9. Изменение продукции аллерген-специфических антител под действием

БТШ70 у мышей с аллергическим воспалением дыхательных путей.

Уровень IgG и IgE в сыворотке периферической крови и уровень IgA в БАЛ мышей

с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в острой фазе

аллергического воспаления дыхательных путей (OVA/OVA-острая) и мышей с

эффекторной фазой, получавших интрафарингеально БТШ70 (OVA/OVA+БТШ70) и не

получавших протективной ингаляции (OVA/OVA-эффекторная), а также преиммунных

мышей (NM). Разведение сыворотки 1:10000 для определения IgG1 и 1:10 для

определения IgE, БАЛ 1:1. Результаты представлены в виде средних значений ± m по

данным 3 экспериментов: 5 мышей в группе. Достоверное снижение параметров под

действием БТШ70 p<0.05 обозначали *.

4.8. Подавление роста общего количества и изменение

популяционного состава клеток БАЛ мышей с аллергическим воспалением

дыхательных путей после введения БТШ70

Оценка изменения клеточного состава БАЛ показала, что

интрафарингеальное введение аутологичного БТШ70 через 24 часа после

последней ингаляции аллергена ограничивало общий приток клеток в легкие

(рис. 10 а) через 48 ч после последней ингаляции аллергена. При этом у мышей,

получавших ингаляцию БТШ70, процент эозинофилов в легких был значительно

ниже по сравнению с OVA/OVA мышами или мышами, получавшими вместо

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

OVA/OVA-эффекторная

OVA/OVA+БТШ70

NM

*

*

*

OVA/OVA-острая

IgG1 IgA IgE

OD450

65

БТШ70 ингаляцию PBS (рис. 10 б). При этом было замечено, что в группе

мышей, получавших БТШ70, процент нейтрофилов в БАЛ на 48 часов после

последней ингаляции аллергена оставался более высоким, чем в контрольных

группах (рис. 10 б).

Рис. 10. Эффект ингаляции БТШ70 в острой фазе аллергического воспаления

дыхательных путей на развитие воспалительного процесса.

Общее количество клеток (а) и процент макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов и

эозинофилов (б) в БАЛ мышей с индуцированным воспалением дыхательных путей в

острой фазе (OVA/OVA-острая) и мышей с эффекторной фазой (OVA/OVA-

эффекторная), получавших в острой фазе интрафарингеально БТШ70

(OVA/OVA+БТШ70) или PBS (OVA/OVA+PBS) через 24 ч, 48 ч и 72 ч после последней

ингаляции аллергена. Результаты представлены в виде средних значений ± m по данным

3 экспериментов: 5 мышей в группе. Достоверные отличия от показателей мышей с

острой (а) и эффекторной (б) фазой аллергического воспаления дыхательных путей (24 ч

и 48 ч соответственно) обозначали: p<0.05: *; p≤0.01: **; p≤0.001: ***.

24 48 72 NM0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

**

** **

nsns

*

время после последнейингаляции OVA

кл

етк

и, м

лн

/мл

а

б

66

Таким образом, увеличение концентрации внеклеточного БТШ70 в острой

фазе аллергического воспаления дыхательных путей стабилизирует клеточный

ответ и смещает популяционный баланс в дыхательных путях от эозинофилов к

нейтрофилам.

Хорошо известно, что БТШ70 как представитель семейства белков-

шаперонов обладает способностью препятствовать денатурации белков и гибели

клеток. Мы предполагаем, что указанные протективные функции могут

обусловливать противовоспалительную активность БТШ70. Как видно из рис.

10 б, при ингаляции БТШ70 в острой фазе аллергического воспаления не

наблюдалось резкого снижения уровня нейтрофилов в БАЛ мышей. Таким

образом, предполагаемый нами механизм подавления аллергического

воспаления путем локального увеличения концентрации внеклеточного БТШ70

вероятнее всего связан с протективным воздействием этого белка на

нейтрофилы.

Введение БТШ70 через 24 часа после ингаляции аллергена способствовало

сохранению количества нейтрофилов в БАЛ в эффекторной фазе на уровне

достоверно более высоком, чем у мышей, не подвергавшихся воздействию

БТШ70 (рис. 10 б).

4.9. Оценка влияния БТШ70 на количество нейтрофилов в костном

мозге мышей с индуцированным аллергическим воспалением

Как было описано ранее, процент нейтрофилов среди клеток костного мозга

был снижен у мышей с аллергическим воспалением дыхательных путей (как в

острой, так и в эффекторной фазе) по сравнению с мышами без астмы. При этом

локальное введение БТШ70 не изменяло процентное содержание и количество

этих клеток в костном мозге (рис. 11).

67

Рис. 11. Влияние БТШ70 на процентное содержание нейтрофилов в КМ

мышей в эффекторной фазе аллергического воспаления дыхательных путей

Приведены данные о доле нейтрофилов среди клеток костного мозга мышей в

различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей в процентах от

общего числа клеток.

OVA/PBS – сенсибилизированные мыши без аллергического воспаления

дыхательных путей, OVA/OVA-острая – мыши с OVA-индуцированным

аллергическим воспалением дыхательных путей в острой фазе, OVA/OVA+БТШ70 –

мыши с OVA-индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в

эффекторной фазе, ранее получившие ингаляцию БТШ70, OVA/OVA-эффекторная –

мыши с OVA-индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в

эффекторной фазе, не получившие ингаляции БТШ70, 4 – интактные мыши.

Приведены средние значения ± m. n=4, достоверность p<0.05 обозначена *, p≤0.001

обозначена ***.

Таким образом, зарегистрированное ранее смещение популяционного

баланса клеток БАЛ под действием БТШ70, по-видимому, происходит не за счет

рекрутмента новых нейтрофилов из костного мозга.

4.10. Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре

активированных нейтрофилов

При помощи флуоресцентного окрашивания внеклеточной РНК было

показано, что, начиная с дозы 20 нМ, РМА вызывает достоверное увеличение

24 48 NM0

25

50

75

100 ******

кле

тки

, %

24 48 NM0

25

50

75

100 ******

кле

тки

, %

68

уровня внеклеточной РНК в культуре нейтрофилов через 3 ч после добавления

этого активирующего агента (рис 12).

Рис 12. РМА-индуцированное повышение уровня внеклеточной РНК в

культуре нейтрофилов.

Приведена кинетика изменения уровня флуоресценции при окраске внеклеточной

РНК флуоресцентным нуклеотид-связывающим красителем. На оси ординат приведен

уровень флуоресценции в относительных единицах, на оси абсцисс – время инкубации

с РМА. Приведены репрезентативные данные одного из четырех независимых

экспериментов. Приведены средние значения ± m.

При исследовании влияния БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре

РМА-активированных нейтрофилов было показано, что инкубация клеток в

присутствии 10 µг/мл БТШ70 приводила к достоверному подавлению РМА-

индуцированного роста концентрации внеклеточной РНК через 3 и 4 ч после

добавления.

0 1 2 3 4 50

5

10

15

20

25

30

20мкM

2мкM

0,2мкM

0,02мкM

0

время, ч

I Flx

10

-3, о

тн

. ед

.

69

Рис. 13. Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре РМА-

активированных нейтрофилов мыши.

Уровень внеклеточной РНК при окраске флуоресцентным нуклеотид-связывающим

красителем через 3 (а) и 4 (б) часа после добавления к клеткам 2 µМ РМА приведен в

относительных единицах. Приведены репрезентативные данные одного из четырех

независимых экспериментов. Приведены средние значения ± m; n = 4; приведены

усредненные данные четырех независимых экспериментов; * – p<0.05.

Таким образом, присутствие БТШ70 в культуре нейтрофилов отменяет

повышение уровня внеклеточной РНК, вызванное добавлением РМА.

4.11. Оптимизация клеточной модели для исследования

антиоксидантной активности БТШ70

Анализ антиоксидантной активности экзогенного внеклеточного БТШ70

проводили на клеточной суспензии клеток костного мозга (КМ) мыши,

обогащенной нейтрофилами посредством отрицательной магнитной селекции.

Содержание нейтрофилов в обогащенной суспензии, полученной методом

негативной магнитной селекции, составляло не менее 98%, что было

продемонстрировано дифференцированным окрашиванием нейтрофилов

моноклональными антителами, связывающими специфические поверхностные

маркеры нейтрофилов мыши Gr1 (Ly6G) и CD11b (рис. 14).

а б

70

Рис. 14. Оценка гомогенности обогащенной популяции нейтрофилов методом

проточной цитофлуориметрии.

На рисунках слева (а, б, в) приведены данные для клеток КМ, справа (г, д, е) – для

обогащенной культуры нейтрофилов, полученной отрицательной магнитной

селекцией. Красным отмечены мертвые клетки, окрашенные Sytox Red. CD11b и Gr1

(Ly6G) – специфические поверхностные маркеры нейтрофилов мыши.

71

На первом этапе была оптимизирована модель «окислительного взрыва»

нейтрофилов, для чего был произведен подбор активаторов и определена их

оптимальная рабочая концентрация.

Методом люминол-зависимой хемилюминесценции была

продемонстрирована дозозависимая индукция «окислительного взрыва» в

образцах нейтрофилов мыши под действием PMA (рис. 15), Са2+ ионофора

А23187 (рис. 16) и fMLP (рис. 17). В результате для дальнейшей работы были

выбраны оптимальные концентрации активирующих агентов (8 нМ для РМА и

10µМ для А23187 и fMLP), увеличивающие продукцию АФК не менее чем в

10 раз.

Рис. 15. РМА-индуцированная продукция АФК в ККМ мыши.

Клетки костного мозга мыши в количестве 200 тыс. кл. в лунках 96-луночного

планшета стимулировали различными концентрациями РМА. Для дальнейших

исследований была выбрана концентрация РМА 8 нМ как минимальная, вызывающая

увеличение уровня АФК не менее чем в 10 раз. 1 – Контрольные образцы. 2 –

Индукция клеточного ответа 8 нМ РМА. 3 – Индукция клеточного ответа 32 нМ РМА.

4 – Индукция клеточного ответа 160 нМ РМА. Приведены значения уровня

хемилюминисценции, нормированные по базовому уровню.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 20 40 60 80 100

Отн

оси

тел

ьн

ый

уровен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

Время, мин

1

2

3

4

PMA

72

Рис. 16. Ионофор-индуцированная продукция АФК в ККМ мыши.

Клетки костного мозга мыши в количестве 2*105 кл. в лунках 96-луночного

планшета стимулировали различными концентрациями Са2+ ионофора А23187. Для

дальнейших исследований была выбрана концентрация ионофора 10 µМ, вызывающая

увеличение уровня АФК не менее чем в 10 раз. 1 – Контрольные образцы. 2 –

Индукция клеточного ответа 2 µМ А23187. 3 - Индукция клеточного ответа 5 µМ

А23187. 4 – Индукция клеточного ответа 10 µМ А23187. Приведены значения уровня

хемилюминисценции, нормированные по базовому уровню.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 10 20 30 40

Отн

оси

тельн

ый

уровен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

Время, мин

1

2

3

4

А23187

73

Рис. 17. fMLP-индуцированная продукция АФК в образцах нейтрофилов КМ

мыши.

Нейтрофилы КМ мыши в количестве 2х105 на лунку 96-луночного планшета

стимулировали fMLP в концентрации 5 (2), 10 (3), 20 µМ (4). Для дальнейших

исследований была выбрана концентрация – наименьшая концентрация fMLP,

вызывающая увеличение уровня АФК в этой модели более, чем в 10 раз - 10 µМ. 1 –

контрольные образцы.

Приведены значения уровня хемилюминисценции, нормированные по базовому

уровню.

Далее был исследован вклад внеклеточных АФК в общую кинетику

индуцированного «окислительного взрыва». Для этого была использована

специальная химически модифицированная форма люминола – изолюминол,

который не способен проникать через клеточные мембраны. Регистрацию

внутриклеточных АФК проводили с помощью люминол-зависимой

хемилюминесценции в присутствии скэвенджеров кислородных радикалов –

супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT). Проверка такой системы

показала, что наличие в среде скэвенджеров практически полностью подавляет

изолюминол-зависимую хемилюминесценцию, так же, как и ингибитор

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 20

Отн

оси

тельн

ый

уро

вен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

Время, мин

1

2

3

4

fMLP

74

мембранной NADPH-оксидазы апоцинин, что позволяет рассматривать NADPH-

оксидазу в качестве основного источника внеклеточных АФК в нейтрофилах.

При стимуляции нейтрофилов человека fMLP и использовании метода

люминол-зависимой хемилюминесценции, отражающей уровень общего пула

АФК, обычно регистрируется два пика (рис. 18 а), тогда как в нейтрофилах

мыши данным методом регистрировали только один пик. При этом при

использовании непроникающего в клетки изолюминола регистрируется только

первый пик, соответствующий, очевидно, уровню только внеклеточных АФК

(рис. 18 а). Таким образом, второй пик люминол-зависимой

хемилюминесценции, по-видимому, отражает внутриклеточный уровень АФК.

Это подтверждается также экспериментами по измерению люминол-зависимой

хемилюминесценции в присутствии в среде скэвенджеров кислородных

радикалов CAT и SOD, в которых наблюдается только второй пик

хемилюминесценции (рис. 18 а).

Исследование эффектов экзогенного БТШ70 на уровень внутриклеточных

АФК в присутствии скэведжеров осложняется тем, что эффект собственно

БТШ70 может быть искажен присутствием в среде других белков. Исходя из

этого кинетика продукции внутриклеточных АФК может быть рассчитана путем

вычитания значений кривой, полученной с использованием изолюминола из

значений кривой люминол-зависимой хемилюминесценции. Однако,

чувствительность изолюминола в наших экспериментах ниже, чем люминола. С

учетом этого вычисление теоретической кривой показателя внутриклеточного

уровня АФК проводили по формуле:

RLU𝑖𝑛 = RLU𝑙𝑢𝑚 − (RLU𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑚 ×MAX𝑙𝑢𝑚

MAX𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑚),

где RLUin – показатель внутриклеточного уровня АФК, RLUlum – показатель

люминол-зависимой хемилюминесценции, RLUisolum – показатель изолюминол-

зависимой хемилюминесценции, MAXlum – амплитуда первого пика при

75

измерении методом люминол-зависимой хемилюминесценции, MAXisolum –

амплитуда «окислительного взрыва» при измерении методом изолюминол-

зависимой хемилюминесценции.

Коэффициент нормирования MAX𝑙𝑢𝑚

MAX𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑚 , вычисленный экспериментально (по

результатам четырех экспериментов), составил 2.6±0.05. Экспериментальные

данные подтвердили, построенная таким способом теоретическая кривая

практически полностью повторяет кривую, полученную при регистрации

«окислительного взрыва» в присутствии скэвенджеров методом люминол-

зависимой хемилюминесценции (рис. 18 б). При этом при применении такого

коэффициента нормирования измерение внутриклеточного уровня АФК

возможно и в клетках, демонстрирующих только один пик при регистрации

люминол-зависимой хемилюминесценции – например, в нейтрофилах мыши.

76

Рис. 18. «Окислительный взрыв» в нейтрофилах периферической крови

человека.

Приведена регистрируемая методом люминол-зависимой и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции реакция нейтрофилов человека (2х105 клеток на лунку 96-

луночного планшета) на добавление 10 µМ fMLP. Уровень хемилюминесценции

приведен в RLU (относительные единицы люминесценции).

а – реальные значения хемилюминесценции, полученные при регистрации fMLP-

индуцированной продукции АФК. 1 – изолюминол-зависимая хемилюминесценция в

присутствии CAT и SOD, 2 – люминол-зависимая хемилюминесценция в присутствии

CAT и SOD, 3 – изолюминол-зависимая хемилюминесценция без скэвенджеров, 4 –

люминол-зависимая хемилюминесценция без скэвенджеров.

б – Сравнение реальных значений хемилюминесценции внутриклеточных АФК, со

значениями, рассчитанными теоретически на основании соотношения значений

люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции клеток. 1 – кривая,

построенная по точкам данных, полученным в результате вычислений, 2 – люминол-

зависимая хемилюминесценция в присутствии CAT и SOD, 3 – изолюминол-зависимая

хемилюминесценция без скэвенджеров, умноженная на коэффициент

нормирования 2.6, 4 – люминол-зависимая хемилюминесценция без скэвенджеров.

На следующем этапе было проведено тестирование чувствительности

используемой модели к процессам, связанным со стресс-индуцируемой

активацией БТШ70. Для этого был использован классический индуктор синтеза

БТШ70 – тепловой шок. Было продемонстрировано, что инкубация нейтрофилов

мыши даже в условиях кратковременного теплового шока (43ºС 10 мин, с

последующим восстановлением при 37ºС 1 ч) приводит к значительному, по

0

40000

80000

120000

160000

0 1000 2000

Отн

оси

тельн

ый

уровен

ь

хем

илю

ми

ни

сцен

ци

и

Время, сек

1

2

3

4

fMLP

0

40000

80000

120000

160000

0 500 1000 1500 2000Время, сек

1

2

3

4

fMLPа б

77

сравнению с контрольными образцами, снижению уровня продукции АФК,

индуцируемых внесением в культуру клеток используемой дозы fMLP (рис. 19).

Рис. 19. fMLP-индуцированная продукция АФК в нейтрофилах КМ мыши

после 10-минутного теплового шока при 43ºС на водяной бане с последующим

восстановлением при 37º С в течение 1 ч.

Нейтрофилы костного мозга мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-

луночного планшета стимулировали 10 µМ fMLP. 1 – контрольные образцы, 2 –

клетки, подвергавшиеся тепловой обработке.

По оси ординат отложен относительный уровень хемилюминесценции,

представляющий собой отношение регистрируемого уровня хемилюминесценции к

среднему уровню хемилюминесценции интактных клеток.

Таким образом, воздействие, инициирующее синтез и активацию БТШ70, приводит

также к снижению способности нейтрофилов к «окислительному взрыву», что

косвенно указывает на взаимосвязь БТШ70 и АФК.

4.12. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на

продукцию АФК in vitro

Прединкубанция клеток КМ с экзогенным БТШ70 оказывала дозозависимое

ингибирующее действие этого протеина на продукцию АФК. Так, полученные

результаты показали, что добавление к образцам нейтрофилов КМ мыши

78

экзогенных БТШ70 в концентрации 1 µг/мл и выше значительно снижает fMLP-

индуцированный «окислительный взрыв» (рис. 20 в, г), а снижение фонового

уровня продукции АФК при добавлении БТШ70 наблюдается, начиная с дозы

этого протеина 0.5 µг/мл (рис. 20 а, б). Данная динамика сохраняется при

регистрации с использованием как люминол-зависимой (Рис. 20 а, в), так и

изолюминол-зависимой (Рис. 20 б, г) хемилюминесценции.

Достоверный ингибирующий эффект БТШ70 на индуцированный

«окислительный взрыв» проявлялся также при активации ионофором

А23187 (рис. 21) и РМА (рис. 22).

79

Рис. 20. Влияние БТШ70 на продукцию АФК покоящимися и

активированными fMLP нейтрофилами КМ мыши.

Нейтрофилы мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного

планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 0.1 (2), 0.5 (3), 1 (4), 2.5 (5), 5 µг/мл

(6). Оценку влияния БТШ70 на фоновую продукцию АФК (а–б) проводили путем

сравнения нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5

мин после добавления БТШ70. Оценку влияния БТШ70 на «окислительный взрыв»,

вызванный 10 µМ fMLP (в–г) проводили путем сравнения нормированных по базовому

уровню (до активации) максимальных значений хемилюминесценции. 1 – контрольные

образцы. Приведены средние значения ± m; 4 мыши в группе; * – p<0.05, ** – p≤0.01,

*** – p≤0.001. Оценку влияния БТШ70 на общую фоновую продукцию АФК (а) и на

общую fMLP-индуцированную продукцию АФК (в) проводили методом люминол-

зависимой хемилюминесценции. Оценку влияния БТШ70 на внеклеточную фоновую

продукцию АФК (б) и на внеклеточную fMLP-индуцированную продукцию АФК (г)

проводили методом изолюминол-зависимой хемилюминесценции.

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6

Отн

оси

тельн

ый

уровен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

*** ***

*

(в)

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6

***

*

(г)

*** *** ***

80

Рис. 21. Влияние БТШ70 на А23187-индуцированный «окислительный взрыв»

в нейтрофилах КМ мыши.

Нейтрофилы мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного

планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 2.5µг/мл. Оценку влияния БТШ70 на

А23187-индуцированный «окислительный взрыв» проводили путем сравнения

нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений

люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 – контрольные образцы, 2 – референтный

белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние значения ± m; n = 4; приведены

усредненные данные четырех независимых экспериментов; * – p<0.05.

0

4

8

12

16

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

*

81

Рис. 22. Влияние БТШ70 на РМА-индуцированный «окислительный взрыв» в

нейтрофилах КМ мыши.

Нейтрофилы мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного

планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 2.5µг/мл. Оценку влияния БТШ70 на

РМА-индуцированный «окислительный взрыв» проводили путем сравнения

нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений

люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 – контрольные образцы, 2 – референтный

белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние значения ± m; n = 4; приведены

усредненные данные четырех независимых экспериментов; * – p<0.05.

Наряду с этим, ингибирование спонтанной и индуцированной продукции

АФК под действием БТШ70 было зарегистрировано в экспериментах с

нейтрофилами переферической крови человека и с клетками фракции костного

мозга мыши, не содержащей нейтрофилы (рис. 23–рис. 26).

0

4

8

12

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

*

82

Рис. 23. Влияние БТШ70 на спонтанную общую (а) и внеклеточную (б)

продукцию АФК клетками костного мозга мыши, не содержащими нейтрофилов.

Клетки костного мозга мыши, не содержащие нейтрофилов, в количестве 2х105 на

лунку плоскодонного 96-луночного планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации

2.5 µг/мл. Оценку влияния БТШ70 на общую (а) и внеклеточную (б) спонтанную

продукцию АФК проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню (до

воздействия) значений люминол-зависимой и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции соответственно. 1 – контрольные образцы, 2 – референтный

белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние значения ± m; приведены усредненные

данные трех независимых экспериментов; *** – p<0.001.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

ни

сцен

ци

и

***

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

***

а б

83

Рис. 24. Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК

клетками фракции костного мозга мыши, не содержащей нейтрофилов.

Клетки фракции костного мозга мыши, не содержащей нейтрофилов, в количестве

2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного планшета инкубировали с БТШ70 в

концентрации 2.5 µг/мл. Оценку влияния БТШ70 на fMLP-индуцированный

«окислительный взрыв» проводили путем сравнения нормированных по базовому

уровню (до активации) максимальных значений люминол-зависимой (а) и

изолюминол-зависимой (б) хемилюминесценции. 1 – контрольные образцы, 2 –

референтный белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние значения ± m; приведены

усредненные данные четырех независимых экспериментов; * – p<0.05.

0

1

2

3

4

5

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

ни

сцен

ци

и

*

0

1

2

3

4

1 2 3

*

а б

84

Рис. 25. Влияние БТШ70 на спонтанную общую (а) и внеклеточную (б) продукцию

АФК клетками нейтрофилами человека.

Нейтрофилы человека в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного

планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 2.5 µг/мл. Оценку влияния БТШ70

на общую (а) и внеклеточную (б) спонтанную продукцию АФК проводили путем

сравнения нормированных по базовому уровню (до воздействия) значений люминол-

зависимой и изолюминол-зависимой хемилюминесценции соответственно. 1 –

контрольные образцы, 2 – референтный белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние

значения ± m; приведены усредненные данные трех независимых

экспериментов; достоверные различия с p<0.01 обозначены **.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

**

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

**

а б

85

Рис. 26. Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК

нейтрофилами периферической крови человека.

Нейтрофилы человека в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного

планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 2.5 µг/мл. Оценку влияния БТШ70

на fMLP-индуцированный «окислительный взрыв» проводили путем сравнения

нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений

люминол-зависимой (а) и изолюминол-зависимой (б) хемилюминесценции. 1 –

контрольные образцы, 2 – референтный белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние

значения ± m; приведены усредненные данные четырех независимых экспериментов;

достоверные различия с p<0.01 обозначены **.

Описанный выше подход к детекции АФК с помощью люминол- и

изолюминол-зависимой хемилюминесценции позволил осуществить раздельную

оценку влияния экзогенного БТШ70 на продукцию АФК в окружающую среду и

на уровень генерации кислородных радикалов во внутриклеточном

пространстве.

При этом было показано, что при нормировке по вышеописанному способу

результаты, полученные методами люминол- и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции, практически не различаются, что свидетельствует о

незначительном вкладе внутриклеточных АФК в регистрируемый в данной

модели «окислительный взрыв». Это подтверждают и результаты

цитометрического анализа внутриклеточного содержания АФК с

0

4

8

12

16

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

ни

сцен

ци

и

**

0

4

8

12

16

1 2 3

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

ни

сцен

ци

и

**

а б

86

использованием проникающего в клетки флуоресцентного зонда кислородных

радикалов DCF-DA (2’,7’-дихлорфруоресцеин диацетата) (рис. 27).

Рис. 27. Изменение внутриклеточного уровня АФК при активации нейтрофилов

мыши fMLP.

Нейтрофилы мыши в концентрации 1 млн/мл в присутствии 10 µМ DCF-DA

активировали 10 µМ fMLP. Флуоресценцию DCF-DA регистрировали в канале FL-1.

Следующая часть исследования была направлена на анализ модулирующего

действия БТШ70 на активность NADPH-оксидазы. Для этого было

протестировано действие экзогенного БТШ70 на клетки КМ в присутствии

ингибиторов NADPH-оксидазы апоцинина и дифенилиодония (DPI).

Полученные результаты практически не различались для моделей с

использованием культуры клеток КМ мыши без нейтрофилов и фракций

нейтрофилов, изолированных методом магнитной сепарации из суспензии

клеток КМ мыши или из популяции лейкоцитов периферической крови

человека. Поэтому ниже приведены данные, зарегистрированные только в

______

---------

интактные клетки

FMLP

87

опытах с нейтрофилами КМ мыши. Кинетика изменения фонового и

индуцированного уровня АФК под действием этих агентов и БТШ70 приведена

на рис. 28. В экспериментах использовали метод люминол- и изолюминол-

зависимой хемилюминесценции.

Рис. 28. Влияние БТШ70 на фоновую (а) и fMLP-индуцированную (б)

продукцию АФК в образцах нейтрофилов КМ мыши.

Приведена регистрируемая методом люминол-зависимой хемилюминесценции

реакция нейтрофилов КМ мыши (2х105 на лунку 96-луночного планшета) на

добавление 2.5 µг/мл БСА (2), 2.5 µг/мл БТШ70 (3), 1.5 µМ DPI (4), 15 µМ апоцинина

(5). 1 – Контрольные образцы. Уровень хемилюминесценции приведен в RLU

(относительные единицы люминесценции).

Как и ожидалось, апоцинин – специфический ингибитор сборки мембранного

комплекса NADPH-оксидазы, взаимодействующий с субъединицей p47phox

указанного фермента (Touyz, 2008), в дозе 15 µМ практически полностью

подавлял продукцию АФК в используемых моделях. Внесение fMLP в

клеточные культуры в присутствии этого ингибитора не приводило к типичной

лавинообразной продукции АФК, поэтому при практически нулевой амплитуде

«окислительного взрыва» (по сравнению с фоновыми значениями уровня АФК)

эффект БТШ70, очевидно, не мог быть зарегистрирован (рис. 29 а, б). Однако

присутствие апоцинина в дозе 10 µМ, не вызывающей абсолютного подавления

продукции АФК, в образцах клеток не отменяло ингибирующий эффект БТШ70

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60

Ур

овен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

Время, мин

1

2

3

4

5

а

0

10000

20000

30000

0 20 40

Время, мин

1

2

3

4

5

б

88

на фоновую продукцию АФК в данной модели (рис. 30 а, б). Это указывает на

то, что антиоксидантный эффект БТШ70 достигается, вероятнее всего, не за счет

его взаимодействия с субъединицей NADPH-оксидазы p47phox,

обеспечивающей транслокацию цитозольных субъединиц NADPH-оксидазы к

плазматической мембране. В пользу этого утверждения также говорит тот факт,

что ингибирующий эффект БТШ70 проявляется практически сразу после его

добавления (рис. 28), тогда как для интернализации этого белка требуется не

менее 15 мин (Сапожников и др., 2011). Возможно, что обусловленное БТШ70

снижение активности NADPH-оксидазы связано с взаимодействием этого

протеина с другими субъединицами данного ферментного комплекса или с

рецепторами клеточной поверхности нейтрофилов.

Далее был проведен анализ эффектов БТШ70 в присутствии в клеточной

культуре DPI – неспецифического ингибитора флавинсодержащих ферментов, в

том числе и NADРН-оксидазы, а именно – ее трансмембранной субъединицы

gp91phox, представленной на клеточной поверхности, т.е. доступной для

прямого взаимодействия с внеклеточным пулом БТШ70. DPI в избыточной

концентрации (1.5 µМ) существенно, но не полностью, подавлял в наших

моделях уровень фоновой продукции АФК и амплитуду «окислительного

взрыва» в образцах клеток КМ мыши без нейтрофилов и фракции нейтрофилов

КМ, а также в образцах нейтрофилов, выделенных из периферической крови

человека. Полученные результаты продемонстрировали, что, как и в

экспериментах с апоцинином, внесение экзогенного БТШ70 в культуры клеток,

инкубируемых в присутствии DPI, приводило к снижению общего и

внеклеточного фонового уровня продукции АФК (рис. 30 в, г), а также к

достоверному снижению амплитуды fMLP-индуцированного «окислительного

взрыва» (рис. 29 в, г).

89

Рис. 29. Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК

нейтрофилами мыши в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы.

Оценку влияния БТШ70 на «окислительный взрыв» в присутствии 15 µМ

специфичного ингибитора NADPH-оксидазы – апоцинина (а, б) и 1.5 µМ

неспецифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения

нормированных по показателям котрольных активированных клеток значений

амплитуды «окислительного взрыва».

Оценка общего (а, в) и внеклеточного (б, г) уровня продукции активных форм

кислорода проводилась методом люминол- и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции соответственно. 1 – контрольные клетки, инкубированные с

ингибиторами NOX, 2 – 2.5 µг/мл референтного белка БСА, 3 – 2.5 µг/мл БТШ70.

Приведены средние значения ± m; n=4; * – p<0.05.

0

0.5

1

1.5О

тно

сите

льны

й у

рове

нь

хем

ил

юм

инесц

енц

ии

(а)

0

0.5

1

1.5(б)

0

0.5

1

1.5

1 2 3

Отн

осите

льны

й у

рове

нь

хе

мил

юм

ине

сц

енц

ии

*

(в)

0

0.5

1

1.5

1 2 3

*

(г)

90

Рис. 30. Влияние БТШ70 на фоновую продукцию АФК нейтрофилами мыши в

присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы.

Оценку влияния БТШ70 на фоновую продукцию АФК в присутствии 10 µМ

специфичного ингибитора NADPH-оксидазы – апоцинина (а, б) и 1.5 µМ

неспецифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения

нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5 мин после

добавления БТШ70. Оценка общего (а, в) и внеклеточного (б, г) уровня продукции

активных форм кислорода проводилась методом люминол- и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции соответственно. 1 – контрольные клетки, инкубированные с

ингибиторами NOX, 2 – 2.5 µг/мл референтного белка БСА, 3 – 2.5 µг/мл БТШ70.

Приведены средние значения ± m; n=4; ** – p<0.01, *** – p<0.001.

Важно отметить, что в отношении иммуномодулирующего действия

экзогенных рекомбинантных БТШ70 до сих пор не прекращается дискуссия об

обусловленности многих зарегистрированных эффектов контаминацией

используемых препаратов белка липополисахаридами бактериального

происхождения. В наших исследованиях использовались препараты

человеческого рекомбинантного БТШ70, очищенного от LPS с помощью

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Отн

осите

льны

й у

рове

нь

хе

мил

юм

ине

сц

енц

ии

***

(а)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

**

(б)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

Отн

осите

льны

й у

рове

нь

хе

мил

юм

ине

сц

енц

ии

***

(в)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3

***

(г)

91

полимиксина. Однако, этот метод не гарантирует полного отсутствия примеси

эндотоксинов. Поэтому, несмотря на ожидаемую разнонаправленность действия

эндотоксина и БТШ70 на продукцию АФК фагоцитирующими клетками, мы

провели отдельную серию экспериментов, посвященных анализу эффектов ЛПС

в наших моделях. В результате данной серии экспериментов было

продемонстрировано, что бактериальные ЛПС в низких концентрациях не

влияют на фоновый уровень АФК в нейтрофилах КМ мыши, а эндотоксины в

высоких концентрациях вызывают повышение этого уровня (рис. 31).

Следовательно, возможная контаминация используемого в наших экспериментах

БТШ70 липополисахаридом не может быть причиной ингибирующих эффектов

этих протеинов, обнаруженных в наших моделях.

Это подтверждается также отсутствием достоверного ингибирующего

эффекта у препаратов белка, загрязненных эндотоксином, в отличие от

очищенного БТШ70 (рис. 31). Зарегистрированное отсутствие существенной

реакции клеток КМ на ЛПС в низких концентрациях говорит также о

принципиальном преимуществе использования модели тестирования влияния

внеклеточных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитирующими клетками в

сравнении с многими другими моделями, применяемыми для анализа

иммуномодулирующих эффектов БТШ70, в которых препараты белка и примесь

эндотоксина обладают однонаправленной иммуностимулирующей активностью,

что не позволяет провести корректную оценку действия БТШ70.

92

Рис. 31. Влияние ЛПС бактериального происхождения на фоновую продукцию

АФК в образцах нейтрофилов КМ мыши.

Влияние оценивали путем сравнения нормированных по базовому уровню

значений хемилюминесценции через 5 мин после добавления – 2.5 µг/мл очищенного

БТШ70 (2), 2.5 µг/мл неочищенного БТШ70 (3) или ЛПС в концентрациях: 0.05 (4), 0.5

(5), 5 µг/мл (6). 1 – интактные клетки. Приведены средние значения ± m; n=3;

достоверные различия с p<0.05 обозначены *.

4.13. Изменение продукции активных форм кислорода клетками

костного мозга мышей на различных стадиях аллергического воспаления

дыхательных путей

Как было показано ранее, при использовании модели аллергического

воспаления дыхательных путей, временный приток нейтрофилов в дыхательные

пути наблюдается в острой фазе воспаления, тогда как наступление эффекторной

фазы, напротив, характеризуется снижением количества нейтрофилов в

дыхательных путях и супрессией нейтрофил-опосредованного иммунного ответа

относительно острой фазы. Так как костный мозг является основным

источником привлекаемых на периферию нейтрофилов, потенциал нейтрофил-

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 2 3 4 5 6

Отн

оси

тельн

ый

ур

овен

ь

хем

илю

ми

несц

енц

ии

*

93

опосредованного ответа должен коррелировать с активностью нейтрофилов

костного мозга.

В данном был также проанализирован уровень продукции активных форм

кислорода (АФК) нейтрофилами костного мозга мышей с острой и эффекторной

фазой аллергического воспаления дыхательных путей (рис. 33–рис. 33).

Спонтанная продукция АФК нейтрофилами коррелировала с долей

нейтрофилов в КМ и была заметно снижена у мышей с индуцированным

аллергическим воспалением дыхательных путей. Индуцированная продукция

АФК нейтрофилами, выделенными в острой фазе аллергического воспаления,

значительно возрастала по сравнению с нейтрофилами нормальных и

сенсибилизированных мышей (рис. 33 а). В тоже время, выделенные из

костного мозга мышей на стадии эффекторной фазы аллергического

воспаления нейтрофилы демонстрировали снижение индуцированной

продукции АФК (рис. 33 б).

1 2 30

50

100

150

200 ***

Ур

ов

ен

ь ф

луо

ресц

ен

ци

и,

отн

. ед

.

1 2 30

100

200

300 **

Ур

ов

ен

ь ф

луо

ресц

ен

ци

и,

отн

. ед

.

Рис. 32. Продукция АФК покоящимися нейтрофилами КМ мышей с

аллергическим воспалением дыхательных путей.

Оценку уровня спонтанной продукции АФК в нейтрофилах КМ мышей с острой (а)

и эффекторной (б) фазой воспаления дыхательных путей проводили путем сравнения

нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений

люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 – нейтрофилы интактных мышей, 2 –

нейтрофилы сенсибилизированных мышей, получавших ингаляции PBS, 3 –

нейтрофилы мышей с OVA-индуцированной астмой. Приведены средние значения ±

m; n = 4; * – p<0.05.

а б

94

Рис. 33. А23187-индуцированная продукция АФК нейтрофилами КМ мышей с

аллергическим воспалением дыхательных путей.

Оценку амплитуды А23187-индуцированного «окислительного взрыва» в

нейтрофилах КМ мышей с острой (а) и эффекторной (б) фазой воспаления

дыхательных путей проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню

(до активации) максимальных значений люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 –

нейтрофилы интактных мышей, 2 – нейтрофилы сенсибилизированных мышей,

получавших ингаляции PBS, 3 – нейтрофилы мышей с OVA-индуцированной астмой.

Приведены средние значения ± m; n = 4; * – p<0.05.

Локальное введение БТШ70 мышам с OVA-индуцированным аллергическим

воспалением дыхательных путей приводило к восстановлению способности

нейтрофилов костного мозга к «окислительному взрыву» через 48 ч после

последней ингаляции аллергена (в эффекторной фазе воспаления) до значений,

сравнимых с показателями интактных мышей (рис. 34).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 2 3

Отн

оси

тельн

ая

амп

ли

туд

а О

В

**

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 2 3

*

а б

95

Рис. 34. Влияние локально введенного БТШ70 на индуцированную продукцию

АФК клетками костного мозга мышей в эффекторной фазе воспаления

дыхательных путей.

Приведены данные амплитуды РМА-индуцированного «окислительного взрыва»,

регистрируемого методом люминол-зависимой хемилюминесценции, нормированной

по базовому уровню (до активации). В эксперименте использовали нейтрофилы,

выделенные из костного мозга мышей с овальбумин-индуцированной астмой в

эффекторной фазе воспаления (1), сенсибилизированных мышей, получавших

ингаляции PBS (2), мышей с овальбумин-индуцированной астмой в эффекторной фазе

воспаления, получивших ингаляцию БТШ70 через 24 ч после последней ингаляции

аллергена (3) и интактных мышей (4). Приведены средние

значения ± m; n=4; достоверные различия с p<0.01 обозначены **.

Таким образом, был показан достоверный модулирующий эффект БТШ70 на

продукцию АФК нейтрофилами. При этом локальные и системные эффекты

БТШ70, по-видимому, имеют разную направленность. Так, было показано, что

добавление БТШ70 непосредственно к культуре нейтрофилов вызывает

немедленное снижение способности этих клеток к генерации АФК, в то время

как интрафарингеальное введение БТШ70 мышам с индуцированной астмой

восстанавливает способность нейтрофилов костного мозга к «окислительному

взрыву», сниженную в контрольной группе (не получившей протективной

инъекции БТШ70) в эффекторной фазе аллергического воспаления.

0

0.5

1

1.5

1 2 3 4

Отн

оси

тельн

ая

амп

ли

туд

аО

В

**

96

5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Способность БТШ70 к подавлению продукции АФК фагоцитами на данный

момент была показана несколькими авторами (Пономарёв и др., 2005; Юринская

и др., 2009; Chen et al., 2012), однако, механизмы зарегистрированных эффектов

до сих пор нуждаются в выяснении.

В данной работе было показано, что присутствие избыточного количества

специфического ингибитора NADPH-оксидазы апоцинина практически

полностью отменяет fMLP-индуцированный клеточный ответ при регистрации

как методом люминол-зависимой, так и изолюминол-зависимой

хемилюминесценции. Это говорит от том, что «окислительный взрыв»

нейтрофилов мыши, по-видимому, происходит только за счет выработки АФК

NADPH-оксидазой. В связи с этим, антиоксидантный эффект, проявляемый

БТШ70 в условиях активации клеток, очевидно, связан с действием этого белка

на NADPH-оксидазу.

При анализе полученных в работе результатов измерения фоновой

продукции АФК в клеточных суспензиях, обращает на себя внимание факт

практически полного совпадения уровня БТШ70-опосредованного снижения

хемилюминесценции, зарегистрированного в опытах с использованием

люминола и изолюминола (Рис. 20 б). Это указывает на незначительный вклад

внутриклеточной составляющей измеряемого уровня люминесценции

(детектируемой с помощью проникающего в клетки люминола) в наблюдаемые

эффекты БТШ70 и на то, что преобладающим источником фоновых АФК в

нейтрофилах мыши является NADPH-оксидаза, находящаяся на плазматической

мембране, синтезирующая внеклеточные АФК и регулирующаяся БТШ70.

Подтверждением этого предположения служат данные проведенного

цитометрического анализа внутриклеточного содержания АФК с

использованием проникающего в клетки флуоресцентного зонда кислородных

радикалов DCF-DA (2’,7’-дихлорфруоресцеин диацетата). В этих экспериментах

не было зарегистрировано достоверного влияния БТШ70 уровень

97

внутриклеточных АФК в образцах клеток, использованных в наших

моделях (Рис. 27).

Эффект БТШ70 наблюдается уже через минуту после внесения белка, что

указывает на прямое взаимодействие внеклеточного БТШ70 с белками

клеточной поверхности (с рецепторами или собственно с цитохромом b558,

представленным на клеточной поверхности), т.к. показано, что для

интернализации БТШ70 клетками иммунной системы требуется не менее 15

минут (Сапожников и др., 2011). Существуют данные о возможности

взаимодействия БТШ70 с G-белок ассоциированными рецепторами (GPCR) (Lim

et al., 2013). Однако, его способность вызывать проведение сигнала от этих

рецепторов не была показана. В пользу того факта, что эффект БТШ70 не

опосредуется простым связыванием c GPCR, предотвращающим проведение

сигнала fMLP, говорит продемонстрированная в данной работе способность

БТШ70 снижать PMA- и Ca2+ионофор-индуцированную продукцию АФК. При

этом конечным эффектором рецептор-опосредованной регуляции работы

NADPH-оксидазы является цитозольная субъединица p47phox (El-Benna et al.,

2009). Однако, присутствие неизбыточного количества специфического

ингибитора p47phox апоцинина не отменяло антиоксидантный эффект БТШ70 в

наших экспериментах (рис. 29 а, рис. 30 а), что свидетельствует о наличии

других мишеней для БТШ70.

Только две субъединицы мультиферментного комплекса NADPH-оксидазы

являются трансмембранными белками и представлены на клеточной

поверхности – gp91phox и p22phox, образующие гетеродимер цитохром b558.

При этом в присутствии избыточной дозы DPI антиоксидантная активность

БТШ70 сохраняется. Это свидетельствует в пользу предположения, что эффект

этого протеина не связан с его непосредственным взаимодействием с

субъединицей gp91phox NADPH-оксидазы.

Исходя из вышесказанного, мы предполагаем, что продемонстрированное в

наших экспериментах ингибирующее действие экзогенного БТШ70 на уровень

продукции АФК связано с его непосредственным взаимодействием с

98

цитохромом b558, однако не может быть опосредовано взаимодействием с его

тяжелой цепью gp91phox. Наиболее вероятной мишенью внеклеточного БТШ70,

по нашим представлениям, является субъединица p22phox, представленная на

поверхности плазматической мембраны и потому доступная для прямого

взаимодействия с экзогенными регуляторами. Это предположение

подкрепляется тем фактом, что эффект экзогенно добавленного БТШ70 на

фоновую продукцию АФК проявляется одинаково как на нейтрофилах, так и на

других клетках, т.е. его действие, по-видимому, затрагивает участки NADPH-

оксидазы, общие для нескольких ферментов этого семейства. В то же время из

известных на данный момент субъединиц только гомологи gp91phox и p22phox

являются общими элементами для большинства ферментов семейства NOX. Тем

не менее, приведенные результаты все же не исключают возможности рецептор-

опосредованного действия БТШ70.

Влияние БТШ70 на процессы клеточной гибели в нейтрофилах было

продемонстрированно в экспериментах с измерением уровня внеклеточной РНК,

возрастающего при стимуляции клеток неспецифическим активатором РМА.

Присутствие в культуре нейтрофилов БТШ70 отменяло РМА-индуцированный

рост уровня внеклеточной РНК, что говорит о снижении под действием БТШ70

неапоптотической гибели нейтрофилов, характерной для гиперактивации этих

клеток (Tintinger et al., 2001). Зарегистрированный эффект является важным

проявлением противовоспалительного действия БТШ70, т.к. в отличие от

апоптоза нейтрофилов, сопутствующего завршению воспалительного процесса

(El Kebir, Filep, 2013; Leitch et al., 2011), гибель нейтрофилов путем некроза и

нетоза, сопровождающаяся ростом концентрации внеклеточной РНК, приводит к

усилению воспалительного процесса (Kruger et al., 2015).

В данном исследовании было продемонстрировано ингибирующее действие

БТШ70 на процессы неапоптотической гибели нейтрофилов. При этом было

показано, что повышенное содержание нейтрофилов в БАЛ мышей, получавших

БТШ70, не связано с изменением уровня нейтрофилов в костном мозге, который

остается постоянным. Сопоставление этих данных позволяет предположить, что

99

именно увеличение времени жизни нейтрофилов БАЛ, а не миграция новых

нейтрофилов из костного мозга, опосредует БТШ70-зависимое повышение

уровня нейтрофилов в БАЛ мышей с индуцированным аллергическим

воспалением дыхательных путей через 48 часов после последней ингаляции

OVA относительно таких же мышей, получавших PBS. Это предположение

также косвенно подтверждается тем фактом, что БТШ70 вызывает снижение

концентрации в БАЛ IL-4 и IL-5, являющихся важными факторами,

обеспечивающими рекрутмент и инфильтрацию в ткани не только эозинофилов,

но и нейтрофилов (Linch et al., 2012; Ratthe et al., 2009).

Острая фаза аллергического воспаления характеризуется рекрутментом

нейтрофилов из костного мозга в дыхательные пути (Mizgerd, 2002). Этот

процесс опосредуется циркуляцией в крови гуморальных факторов, выделяемых

при ингаляции аллергена клетками дыхательных путей различной этиологии и

обеспечивающих активацию процесса выхода нейтрофилов из костного мозга и

привлечение нейтрофилов в легкие (Mizgerd, 2002). Получая активирующие

сигналы нейтрофилы костного мозга находятся, как следует из наших

экспериментов, в более возбудимом физиологическом состоянии. Это

проявляется в том числе в достоверно более высокой амплитуде

«окислительного взрыва», регистрируемого в случае нейтрофилов КМ мышей с

аллергическим воспалением дыхательных путей, по сравнению с

сенсибилизированными мышами (рис. 33 а). Полученные данные коррелируют с

литературными данными об увеличении возбудимости нейтрофилов при астме

(Di Stefano et al., 2010; Monteseirin et al., 2002).

Эффекторная фаза характеризуется практически полным исчезновением

нейтрофилов в дыхательных путях, связанным с их гибелью путем апоптоза,

некроза или нетоза (Gunzer, 2014). При этом в наших экспериментах амплитуда

ответа нейтрофилов костного мозга на активатор снижена по сравнению с

нейтрофилами интактных мышей или сенсибилизированных мышей (рис. 33 б).

Такое изменение физиологического состояния нейтрофилов КМ, по-видимому,

связано с изменением набора циркулирующих в крови гуморальных регуляторов

100

и молекулярных паттернов опасности DAMP, выделяемых поврежденными

клетками дыхательных путей и иммунными клетками. Несмотря на то, что

подобная регуляция направлена на снижение активности нейтрофилов для

уменьшения повреждения собственных тканей в очаге воспаления, системное

снижение противомикробной активности нейтрофилов – клеток первой линии

защиты, – способствует ослаблению иммунной защиты организма. Вероятно,

продемонстрированный в наших экспериментах феномен может являться одним

из определяющих факторов сезонных инфекций, часто проявляющихся у

больных астмой, в особенности у детей (Ciepiela et al., 2015).

Помимо увеличения количества (приблизительно в 2 раза) и процентного

содержания нейтрофилов в БАЛ мышей с аллергическим воспалением

дыхательных путей, БТШ70 оказывает достоверный эффект на инфильтрацию

дыхательных путей эозинофилами. Так, концентрация эозинофилов в БАЛ

мышей с OVA-индуцированной астмой через 48 часов после последней

ингаляции аллергена снижена более чем 2 раза в группе, получавшей БТШ70

относительно контрольных мышей или мышей, получавших PBS.

Мы полагаем, что протективное действие БТШ70 на нейтрофилы, вследствие

которого более половины нейтрофилов, инфильтрующих дыхательные пути

через 24 часа после последней ингаляции OVA, остаются в легких на 48 часов,

является одним из важных факторов, препятствующих росту числа эозинофилов

в БАЛ (у мышей, не получивших БТШ70, уровень эозинофилов возрастает в

2 раза).

Важными факторами регулирования количества эозинофилов безусловно

являются провоспалительные цитокины IL-4, IL-5 и IL-13, концентрация

которых также значительно снижается у мышей с аллергическим воспалением

дыхательных путей, получивших БТШ70, по сравнению с контрольными

группами, не получавшими белок.

Известно, что недостаток нейтрофилов в ранний период развития

кандидозной инфекции приводит к усилению сигналлинга IL-4 и развитию

проаллергических Th-2 вместо характерного Th1-ответа (Romani et al., 1997).

101

Также было показано, что селективное удаление нейтрофилов отменяет

дифференцировку CD8+ Т-хелперных клеток (Тh-1), ответственных за развитие

первого типа иммунного ответа (Tanaka et al., 2010).

Исходя их полученных данных, мы полагаем, что введенный через 24 ч после

последней ингаляции аллергена (в острой фазе воспаления) БТШ70 снижает

смертность нейтрофилов посредством ограничения продукции этими

клетками АФК.

В то же время пролонгированное присутствие нейтрофилов в легких, по-

видимому, приводит к подавлению синтеза IL-4 и инфильтрации в дыхательные

пути эозинофилов. Это прерывает положительную обратную связь в развитии

аллергического воспаления дыхательных путей, где приток эозинофилов

приводит к синтезу большего числа провоспалительных цитокинов,

вызывающих рекрутмент и активацию новых эозинофилов. Таким образом,

приток эозинофилов и синтез проаллергических цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13

супрессируется под действием БТШ70. При последующей элиминации

нейтрофилов через 72 ч после последней ингаляции аллергена количество

эозинофилов, как было показано в работе, по-прежнему не увеличивается, т.к.

концентрация активирующих факторов недостаточна для их рекрутмента.

Обобщяя все вышесказанное, можно заключить, что физиологическое

значение подобной «перенастройки» иммунной системы под действием БТШ70

требует дальнейшего изучения, однако уменьшение эозинофилии дыхательных

путей бесспорно является благоприятным диагностическим признаком.

102

6. ВЫВОДЫ

1. С целью анализа иммуномодулирующих эффектов внеклеточного пула

БТШ70 охарактеризована динамика развития аллергического воспаления

дыхательных путей в мышиной модели овальбумин-индуцированной астмы.

2. Установлено, что интрафарингеальная ингаляция БТШ70 в острой фазе

воспаления ограничивает приток эозинофилов в дыхательные пути в

эффекторной фазе, препятствует повышению уровней специфических IgA в

лаважной жидкости и IgG1 и IgE в сыворотке периферической крови, а также

снижает уровень проаллергических цитокинов – IL-4, IL-5 и IL-13 в

бронхоальвеолярных смывах.

3. Продемонстрирована способность БТШ70 подавлять как спонтанную,

так и индуцированную продукцию активных форм кислорода в модели

«окислительного взрыва» фагоцитов.

4. Зарегистрированный антиоксидантный эффект БТШ70, по-видимому,

может быть опосредован молекулярным взаимодействием этого протеина с

p22phox субъединицей комплекса NADPH-оксидазы.

5. Ингибирующее действие БТШ70 на развитие аллергического воспаления

в использованной модели сопровождается нормализацией продукции АФК

нейтрофилами костного мозга и повышением жизнеспособности этих клеток в

дыхательных путях, препятствующим росту числа эозинофилов в БАЛ.

103

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПК – антиген-представляющая клетка

АТФ – аденозинтрифосфат

АФК – активные формы кислорода

БАЛ – бронхоальвеолярный лаваж (бронхоальвеолярный смыв)

БСА – бычий сывороточный альбумин

БТШ – белок теплового шока

БТШ70 – белок теплового шока 70 кДа

ИФА – иммуноферментный анализ

ККМ – клетки костного мозга

КМ – костный мозг

НПВС – нестероидные противовоспалительные средства

ПААГ – полиакриламидный гель

РНК – рибонуклеиновая кислота

Тх1(2) – Т-хелперы первого (второго) типа

ФНО – фактор некроза опухоли

BSA – бычий сывороточный альбумин

CAT – каталаза

CD – кластеры дифференциировки

DAMP – молекулярные паттерны, ассоциированные с опасностью

DCF-DA – 2’,7’-дихлорфлуоресцеин диацетат

DPI – дифенилиодоний

GPCR – G-Protein Coupled Receptor, рецепторы, сопряженные с G-белками

Hip – Hsc70-interacting protein

fMLP (fMLF) – N-формил метионил лейцил фенилаланин

IgG; IgE; IgA; IgM – иммуноглобулины классов G; E; A; M

IL – интерлейкин

ILC – innate lymphoid cells – лимфоидные клетки врожденной иммунной системы

LPS – липополисахарид

104

m – стандартная ошибка (ошибка среднего)

MBP – Main Basic Protein, содержащийся в гранулах эозинофилов, является

специфичным для данного типа клеток

MCP – monocyte chemotactic protein

MDC – monocyte-derived chemokine

NM – интактная (преиммунная) мышь

NOX – NADPH-оксидаза

OVА – овальбумин

PBS – фосфатный буфер

PMA – фолбол 12-миристат 13-ацетат

RANTES – regulated on activation, normal T cell expressed, and secreted, хемокин

SDS – sodium dodecyl sulfate, денатурирующий агент

SOD – супероксид дисмутаза

TARC – thymus an activation-regulated chemokine

Тh1(2) – Т-хелперы первого (второго) типа

TLR – Toll-like receptors, рецепторы, подобные Toll рецептору

мушки Drozophila fruity fly

TMB – тетра метилен бензидин

Tris – трис(гидроксиметил)аминометан

TSLP – тимусный стромальный лимфопоэтин

105

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Евдонин, А.Л., Медведева, Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его

функции // Цитология. – 2009. – Т. 2 – С. 130-137.

2. Зяблицин, А.В., Алекперов, Э.А., Бойко, А.А., Клинкова, А.В., Троянова, Н.И.,

Сапожников, А.М. Анализ механизмов неклассического пути секреции БТШ70 в

популяциях лимфоидных клеток // Иммунология. – 2012. – Т. 33 (1). – С. 49-50.

3. Лев, Н.С. Нейропептиды и другие нейрогуморальные регуляторы в патогенезе

бронхиальной астмы у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии.

– 2000. – Т. 2 – С. 4.

4. Мельников, Э.Э., Ротанова, Т.В. Молекулярные шапероны // Биоорганическая

Химия. – 2010. – Т. 36 (1). – С. 5-14.

5. Пономарёв, А.Д., Семенков, В.Ф., Сапожников, А.М. Влияние белков

теплового шока на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами

человека // Иммунология. – 2005. – Т. 26 – С. 4.

6. Сапожников, А.М., Зяблицин, А.В., Алекперов, Э.А., Бойко, А.А., Клинкова,

А.В., Луцан, Н.И. Эффекты внеклеточного пула белков теплового шока в

популяциях лимфоидных клеток // Иммунология. – 2011. – Т. 5 – С. 5.

7. Сапожников, А.М., Зяблицин, А.В., Алекперов, Э.А., Бойко, А.А., Шустова,

О.А., Луцан, Н.И. Формирование внеклеточного пула БТШ70 в популяциях

лимфоидных клеток // Иммунология. – 2012. – Т. 33 (1). – С. 20-23.

8. Северин, Е.С. Биохимия: Учебник для вузов. – Москва: ГЭОТАР-Медиа,

2003. – 417 С.

9. Смирнов, А.Н. Элементы эндокринной регуляции. – Москва: ГЭОТАР-Медиа,

2008. – 351 С.

10. Юринская, М.М., Винокуров, М.Г., Зацепина, О.Г., Гарбуз, Д.Г., Гужова,

И.В., Рожкова, Е.А., Сусликов, А.В., Карпов, В.Л., Евгеньев, М.Б. Экзогенные

белки теплового шока БТШ70 подавляют эндотоксин-индуцированную

активацию нейтрофилов человека // ДАН. – 2009. – Т. 426 – С. 4.

11. Abo, A., Webb, M.R., Grogan, A., Segal, A.W. Activation of NADPH oxidase

involves the dissociation of p21rac from its inhibitory GDP/GTP exchange protein

106

(rhoGDI) followed by its translocation to the plasma membrane // Biochem J. – 1994.

– V. 298 Pt 3 – P. 585-591.

12. Afshar, R., Medoff, B.D., Luster, A.D. Allergic asthma: a tale of many T cells //

Clin Exp Allergy. – 2008. – V. 38 (12). – P. 1847-1857.

13. Akdis, M., Burgler, S., Crameri, R., Eiwegger, T., Fujita, H., Gomez, E., Klunker,

S., Meyer, N., O'Mahony, L., Palomares, O., Rhyner, C., Ouaked, N., Schaffartzik, A.,

Van De Veen, W., Zeller, S., Zimmermann, M., Akdis, C.A. Interleukins, from 1 to

37, and interferon-gamma: receptors, functions, and roles in diseases // J Allergy Clin

Immunol. – 2011. – V. 127 (3). – P. 701-721.

14. Alphonse, M.P., Saffar, A.S., Shan, L., HayGlass, K.T., Simons, F.E., Gounni,

A.S. Regulation of the high affinity IgE receptor (Fc epsilonRI) in human neutrophils:

role of seasonal allergen exposure and Th-2 cytokines // PLoS One. – 2008. –

V. 3 (4). – P. e1921.

15. Andersson, A., Rasool, O., Schmidt, M., Kodzius, R., Fluckiger, S., Zargari, A.,

Crameri, R., Scheynius, A. Cloning, expression and characterization of two new IgE-

binding proteins from the yeast Malassezia sympodialis with sequence similarities to

heat shock proteins and manganese superoxide dismutase // Eur J Biochem. – 2004. –

V. 271 (10). – P. 1885-1894.

16. Angelidis, C.E., Lazaridis, I., Pagoulatos, G.N. Aggregation of hsp70 and hsc70 in

vivo is distinct and temperature-dependent and their chaperone function is directly

related to non-aggregated forms // Eur J Biochem. – 1999. – V. 259 (1-2). – P. 505-

512.

17. Ansel, K.M., McHeyzer-Williams, L.J., Ngo, V.N., McHeyzer-Williams, M.G.,

Cyster, J.G. In vivo-activated CD4 T cells upregulate CXC chemokine receptor 5 and

reprogram their response to lymphoid chemokines // J Exp Med. – 1999. –

V. 190 (8). – P. 1123-1134.

18. Antczak, A., Montuschi, P., Kharitonov, S., Gorski, P., Barnes, P.J. Increased

exhaled cysteinyl-leukotrienes and 8-isoprostane in aspirin-induced asthma //

Am J Respir Crit Care Med. – 2002. – V. 166 (3). – P. 301-306.

19. Antonova, O.Y., Yurinskaya, M.M., Evgen'ev, M.B., Suslikov, A.V., Vinokurov,

M.G. Exogenous heat shock protein HSP70 protects human blood phagocytes at the

action of different chemotypes of lipopolysaccharide // Dokl Biol Sci. – 2012. –

V. 447 – P. 392-395.

20. Arnhold, J. Properties, functions, and secretion of human myeloperoxidase //

Biochemistry (Mosc). – 2004. – V. 69 (1). – P. 4-9.

107

21. Asea, A., Kraeft, S.K., Kurt-Jones, E.A., Stevenson, M.A., Chen, L.B., Finberg,

R.W., Koo, G.C., Calderwood, S.K. HSP70 stimulates cytokine production through a

CD14-dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine //

Nat Med. – 2000. – V. 6 (4). – P. 435-442.

22. Babior, B.M., Kipnes, R.S., Curnutte, J.T. Biological defense mechanisms. The

production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // J Clin Invest.

– 1973. – V. 52 (3). – P. 741-744.

23. Bafadhel, M., McCormick, M., Saha, S., McKenna, S., Shelley, M., Hargadon, B.,

Mistry, V., Reid, C., Parker, D., Dodson, P., Jenkins, M., Lloyd, A., Rugman, P.,

Newbold, P., Brightling, C.E. Profiling of sputum inflammatory mediators in asthma

and chronic obstructive pulmonary disease // Respiration. – 2011. – V. 83 (1). – P.

36-44.

24. Baiz, N., Annesi-Maesano, I. Is the asthma epidemic still ascending? // Clin Chest

Med. – 2012. – V. 33 (3). – P. 419-429.

25. Barnes, P.J., Pride, N.B. Dose-response curves to inhaled beta-adrenoceptor

agonists in normal and asthmatic subjects // Br J Clin Pharmacol. – 1983. – V. 15 (6).

– P. 677-682.

26. Basu, S., Binder, R.J., Ramalingam, T., Srivastava, P.K. CD91 is a common

receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin // Immunity. –

2001. – V. 14 (3). – P. 303-313.

27. Basu, S., Binder, R.J., Suto, R., Anderson, K.M., Srivastava, P.K. Necrotic but not

apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation

signal to dendritic cells and activate the NF-kappa B pathway // Int Immunol. – 2000.

– V. 12 (11). – P. 1539-1546.

28. Baumann, R., Rabaszowski, M., Stenin, I., Gaertner-Akerboom, M.,

Scheckenbach, K., Wiltfang, J., Schipper, J., Wagenmann, M. The release of IL-31 and

IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms // Clin Transl

Allergy. – 2012. – V. 2 (1). – P. 13.

29. Bayraktutan, U., Blayney, L., Shah, A.M. Molecular characterization and

localization of the NAD(P)H oxidase components gp91-phox and p22-phox in

endothelial cells // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2000. – V. 20 (8). – P. 1903-

1911.

30. Becker, T., Hartl, F.U., Wieland, F. CD40, an extracellular receptor for binding and

uptake of Hsp70-peptide complexes // J Cell Biol. – 2002. – V. 158 (7). – P. 1277-

1285.

108

31. Beier, K.C., Hutloff, A., Lohning, M., Kallinich, T., Kroczek, R.A., Hamelmann,

E. Inducible costimulator-positive T cells are required for allergen-induced local B-cell

infiltration and antigen-specific IgE production in lung tissue // J Allergy Clin

Immunol. – 2004. – V. 114 (4). – P. 775-782.

32. Bernink, J., Mjosberg, J., Spits, H. Th1- and Th2-like subsets of innate lymphoid

cells // Immunol Rev. – 2013. – V. 252 (1). – P. 133-138.

33. Bettencourt, B.R., Hogan, C.C., Nimali, M., Drohan, B.W. Inducible and

constitutive heat shock gene expression responds to modification of Hsp70 copy

number in Drosophila melanogaster but does not compensate for loss of

thermotolerance in Hsp70 null flies // BMC Biol. – 2008. – V. 6 – P. 5.

34. Bhakta, N.R., Woodruff, P.G. Human asthma phenotypes: from the clinic, to

cytokines, and back again // Immunol Rev. – 2011. – V. 242 (1). – P. 220-232.

35. Binder, R.J., Vatner, R., Srivastava, P. The heat-shock protein receptors: some

answers and more questions // Tissue Antigens. – 2004. – V. 64 (4). – P. 442-451.

36. Binia, A., Kabesch, M. Respiratory medicine - genetic base for allergy and asthma

// Swiss Med Wkly. – 2012. – V. 142 – P. 13612.

37. Bjerg, A., Winberg, A., Berthold, M., Mattsson, L., Borres, M.P., Ronmark, E. A

population-based study of animal component sensitization, asthma and rhinitis in

schoolchildren // Pediatr Allergy Immunol. – 2015. – ePub.

38. Blander, J.M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for

presentation by dendritic cells // Nature. – 2006. – V. 440 (7085). – P. 808-812.

39. Blankenhaus, B., Reitz, M., Brenz, Y., Eschbach, M.L., Hartmann, W., Haben, I.,

Sparwasser, T., Huehn, J., Kuhl, A., Feyerabend, T.B., Rodewald, H.R., Breloer, M.

Foxp3(+) regulatory T cells delay expulsion of intestinal nematodes by suppression of

IL-9-driven mast cell activation in BALB/c but not in C57BL/6 mice // PLoS Pathog. –

2014. – V. 10 (2). – P. e1003913.

40. Bokoch, G.M., Knaus, U.G. Ras-related GTP-binding proteins and leukocyte signal

transduction // Curr Opin Hematol. – 1994. – V. 1 (1). – P. 53-60.

41. Bokoch, G.M., Quilliam, L.A., Bohl, B.P., Jesaitis, A.J., Quinn, M.T. Inhibition of

Rap1A binding to cytochrome b558 of NADPH oxidase by phosphorylation of Rap1A

// Science. – 1991. – V. 254 (5039). – P. 1794-1796.

109

42. Boveris, A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen

peroxide in mitochondria // Methods Enzymol. – 1984. – V. 105 – P. 429-435.

43. Bradding, P., Roberts, J.A., Britten, K.M., Montefort, S., Djukanovic, R., Mueller,

R., Heusser, C.H., Howarth, P.H., Holgate, S.T. Interleukin-4, -5, and -6 and tumor

necrosis factor-alpha in normal and asthmatic airways: evidence for the human mast

cell as a source of these cytokines // Am J Respir Cell Mol Biol. – 1994. – V. 10 (5). –

P. 471-480.

44. Brandtzaeg, P., Baekkevold, E.S., Morton, H.C. From B to A the mucosal way //

Nat Immunol. – 2001. – V. 2 (12). – P. 1093-1094.

45. Brinkmann, V., Reichard, U., Goosmann, C., Fauler, B., Uhlemann, Y., Weiss,

D.S., Weinrauch, Y., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria //

Science. – 2004. – V. 303 (5663). – P. 1532-1535.

46. Brown, D.I., Griendling, K.K. Regulation of signal transduction by reactive oxygen

species in the cardiovascular system // Circ Res. – 2015. – V. 116 (3). – P. 531-549.

47. Byers, D.E. Defining the roles of IL-33, thymic stromal lymphopoietin, and IL-25

in human asthma // Am J Respir Crit Care Med. – 2014. – V. 190 (7). – P. 715-716.

48. Calhoun, W.J., Sedgwick, J., Busse, W.W. The role of eosinophils in the

pathophysiology of asthma // Ann N Y Acad Sci. – 1991. – V. 629 – P. 62-72.

49. Careau, E., Proulx, L.I., Pouliot, P., Spahr, A., Turmel, V., Bissonnette, E.Y.

Antigen sensitization modulates alveolar macrophage functions in an asthma model //

Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2006. – V. 290 (5). – P. L871-879.

50. Castagna, M., Takai, Y., Kaibuchi, K., Sano, K., Kikkawa, U., Nishizuka, Y.

Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by

tumor-promoting phorbol esters // J Biol Chem. – 1982. – V. 257 (13). – P. 7847-7851.

51. Center, D.M., Cruikshank, W. Modulation of lymphocyte migration by human

lymphokines. I. Identification and characterization of chemoattractant activity for

lymphocytes from mitogen-stimulated mononuclear cells // J Immunol. – 1982. –

V. 128 (6). – P. 2563-2568.

52. Cheever, M.L., Sato, T.K., de Beer, T., Kutateladze, T.G., Emr, S.D., Overduin, M.

Phox domain interaction with PtdIns(3)P targets the Vam7 t-SNARE to vacuole

membranes // Nat Cell Biol. – 2001. – V. 3 (7). – P. 613-618.

110

53. Chen, F., Yu, Y., Qian, J., Wang, Y., Cheng, B., Dimitropoulou, C., Patel, V.,

Chadli, A., Rudic, R.D., Stepp, D.W., Catravas, J.D., Fulton, D.J. Opposing actions of

heat shock protein 90 and 70 regulate nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

oxidase stability and reactive oxygen species production // Arterioscler Thromb Vasc

Biol. – 2012. – V. 32 (12). – P. 2989-2999.

54. Ciepiela, O., Ostafin, M., Demkow, U. Neutrophils in asthma-A review // Respir

Physiol Neurobiol. – 2015. – V. 209 – P. 13-16.

55. Collison, L.W., Workman, C.J., Kuo, T.T., Boyd, K., Wang, Y., Vignali, K.M.,

Cross, R., Sehy, D., Blumberg, R.S., Vignali, D.A. The inhibitory cytokine IL-35

contributes to regulatory T-cell function // Nature. – 2007. – V. 450 (7169). – P.

566-569.

56. Concannon, C.G., Gorman, A.M., Samali, A. On the role of Hsp27 in regulating

apoptosis // Apoptosis. – 2003. – V. 8 (1). – P. 61-70.

57. Cosmi, L., Liotta, F., Maggi, E., Romagnani, S., Annunziato, F. Th17 cells: new

players in asthma pathogenesis // Allergy. – 2011. – V. 66 (8). – P. 989-998.

58. Crameri, R. Immunoglobulin E-binding autoantigens: biochemical characterization

and clinical relevance // Clin Exp Allergy. – 2012. – V. 42 (3). – P. 343-351.

59. Cross, A.R., Segal, A.W. The NADPH oxidase of professional phagocytes--

prototype of the NOX electron transport chain systems // Biochim Biophys Acta. –

2004. – V. 1657 (1). – P. 1-22.

60. Custovic, A., Simpson, A. The role of inhalant allergens in allergic airways disease

// J Investig Allergol Clin Immunol. – 2012. – V. 22 (6). – P. 393-401.

61. D'Amato, G., Cecchi, L., Bonini, S., Nunes, C., Annesi-Maesano, I., Behrendt, H.,

Liccardi, G., Popov, T., van Cauwenberge, P. Allergenic pollen and pollen allergy in

Europe // Allergy. – 2007. – V. 62 (9). – P. 976-990.

62. da Silva-Martins, C.L., Couto, S.C., Muniz-Junqueira, M.I. Inhaled corticosteroid

treatment for 6 months was not sufficient to normalize phagocytosis in asthmatic

children // Clin Transl Allergy. – 2013. – V. 3 (1). – P. 28.

63. Daniels, G.A., Sanchez-Perez, L., Diaz, R.M., Kottke, T., Thompson, J., Lai, M.,

Gough, M., Karim, M., Bushell, A., Chong, H., Melcher, A., Harrington, K., Vile,

R.G. A simple method to cure established tumors by inflammatory killing of normal

cells // Nat Biotechnol. – 2004. – V. 22 (9). – P. 1125-1132.

111

64. Dapul-Hidalgo, G., Bielory, L. Climate change and allergic diseases // Ann Allergy

Asthma Immunol. – 2012. – V. 109 (3). – P. 166-172.

65. De Maio, A. Extracellular heat shock proteins, cellular export vesicles, and the

Stress Observation System: a form of communication during injury, infection, and cell

damage. It is never known how far a controversial finding will go! Dedicated to

Ferruccio Ritossa // Cell Stress Chaperones. – 2011. – V. 16 (3). – P. 235-249.

66. Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of

endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse // Clin Exp Allergy. –

2004. – V. 34 (11). – P. 1789-1795.

67. Delneste, Y., Magistrelli, G., Gauchat, J., Haeuw, J., Aubry, J., Nakamura, K.,

Kawakami-Honda, N., Goetsch, L., Sawamura, T., Bonnefoy, J., Jeannin, P.

Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation //

Immunity. – 2002. – V. 17 (3). – P. 353-362.

68. Di Stefano, A., Gnemmi, I., Vicari, C., Balbi, B. Oxidant-antioxidant balance in

asthma and the potential of antioxidant therapies // Monaldi Arch Chest Dis. – 2010. –

V. 73 (3). – P. 96-98.

69. Diebold, B.A., Bokoch, G.M. Molecular basis for Rac2 regulation of phagocyte

NADPH oxidase // Nat Immunol. – 2001. – V. 2 (3). – P. 211-215.

70. Ding, J., Knaus, U.G., Lian, J.P., Bokoch, G.M., Badwey, J.A. The renaturable 69-

and 63-kDa protein kinases that undergo rapid activation in chemoattractant-stimulated

guinea pig neutrophils are p21-activated kinases // J Biol Chem. – 1996. – V. 271

(40). – P. 24869-24873.

71. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma:

importance and possible mechanisms // Thorax. – 2002. – V. 57 (7). – P. 643-648.

72. Dustin, M.L. Membrane domains and the immunological synapse: keeping T cells

resting and ready // J Clin Invest. – 2002. – V. 109 (2). – P. 155-160.

73. El-Benna, J., Dang, P.M., Gougerot-Pocidalo, M.A., Marie, J.C., Braut-Boucher, F.

p47phox, the phagocyte NADPH oxidase/NOX2 organizer: structure, phosphorylation

and implication in diseases // Exp Mol Med. – 2009. – V. 41 (4). – P. 217-225.

74. El Kebir, D., Filep, J.G. Targeting neutrophil apoptosis for enhancing the

resolution of inflammation // Cells. – 2013. – V. 2 (2). – P. 330-348.

112

75. Elsner, L., Flugge, P.F., Lozano, J., Muppala, V., Eiz-Vesper, B., Demiroglu, S.Y.,

Malzahn, D., Herrmann, T., Brunner, E., Bickeboller, H., Multhoff, G., Walter, L.,

Dressel, R. The endogenous danger signals HSP70 and MICA cooperate in the

activation of cytotoxic effector functions of NK cells // J Cell Mol Med. – 2010. –

V. 14 (4). – P. 992-1002.

76. Evdonin, A.L., Martynova, M.G., Bystrova, O.A., Guzhova, I.V., Margulis, B.A.,

Medvedeva, N.D. The release of Hsp70 from A431 carcinoma cells is mediated by

secretory-like granules // Eur J Cell Biol. – 2006. – V. 85 (6). – P. 443-455.

77. Ferrari-Lacraz, S., Nicod, L.P., Chicheportiche, R., Welgus, H.G., Dayer, J.M.

Human lung tissue macrophages, but not alveolar macrophages, express matrix

metalloproteinases after direct contact with activated T lymphocytes // Am J Respir

Cell Mol Biol. – 2001. – V. 24 (4). – P. 442-451.

78. Fontenot, J.D., Gavin, M.A., Rudensky, A.Y. Foxp3 programs the development

and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Nat Immunol. – 2003. – V. 4 (4). –

P. 330-336.

79. Freeman, B.C., Morimoto, R.I. The human cytosolic molecular chaperones hsp90,

hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and

protein refolding // EMBO J. – 1996. – V. 15 (12). – P. 2969-2979.

80. Fujibayashi, T., Hashimoto, N., Jijiwa, M., Hasegawa, Y., Kojima, T., Ishiguro, N.

Protective effect of geranylgeranylacetone, an inducer of heat shock protein 70, against

drug-induced lung injury/fibrosis in an animal model // BMC Pulm Med. – 2009. –

V. 9 – P. 45.

81. Fujihara, S.M., Nadler, S.G. Intranuclear targeted delivery of functional NF-

kappaB by 70 kDa heat shock protein // EMBO J. – 1999. – V. 18 (2). – P. 411-419.

82. Fujii, H., Ichimori, K., Hoshiai, K., Nakazawa, H. Nitric oxide inactivates NADPH

oxidase in pig neutrophils by inhibiting its assembling process // J Biol Chem. – 1997.

– V. 272 (52). – P. 32773-32778.

83. Fukushima, C., Matsuse, H., Fukahori, S., Tsuchida, T., Kawano, T., Senjyu, H.,

Kohno, S. Aspergillus fumigatus synergistically enhances mite-induced allergic airway

inflammation // Med Sci Monit. – 2010. – V. 16 (7). – P. 197-202.

84. Gaffin, J.M., Phipatanakul, W. The role of indoor allergens in the development of

asthma // Curr Opin Allergy Clin Immunol. – 2009. – V. 9 (2). – P. 128-135.

113

85. Ganter, M.T., Ware, L.B., Howard, M., Roux, J., Gartland, B., Matthay, M.A.,

Fleshner, M., Pittet, J.F. Extracellular heat shock protein 72 is a marker of the stress

protein response in acute lung injury // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2006. –

V. 291 (3). – P. L354-361.

86. Gao, B., Tsan, M.F. Endotoxin contamination in recombinant human heat shock

protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor

alpha release by murine macrophages // J Biol Chem. – 2003. – V. 278 (1). – P.

174-179.

87. Genevaux, P., Georgopoulos, C., Kelley, W.L. The Hsp70 chaperone machines of

Escherichia coli: a paradigm for the repartition of chaperone functions // Mol

Microbiol. – 2007. – V. 66 (4). – P. 840-857.

88. Gil Lorenzo, A.F., Bocanegra, V., Benardon, M.E., Cacciamani, V., Valles, P.G.

Hsp70 regulation on Nox4/p22phox and cytoskeletal integrity as an effect of losartan

in vascular smooth muscle cells // Cell Stress Chaperones. – 2013. – V. 19 (1). –

P. 115-124.

89. Godfrey, R.W., Severs, N.J., Jeffery, P.K. A comparison between the epithelial

tight junction morphology of human extrapulmonary bronchi and rat trachea // Eur

Respir J. – 1994. – V. 7 (8). – P. 1409-1415.

90. Gougerot-Pocidalo, M.A., el Benna, J., Elbim, C., Chollet-Martin, S., Dang, M.C.

[Regulation of human neutrophil oxidative burst by pro- and anti-inflammatory

cytokines] // J Soc Biol. – 2002. – V. 196 (1). – P. 37-46.

91. Gounni, A.S., Lamkhioued, B., Koussih, L., Ra, C., Renzi, P.M., Hamid, Q.

Human neutrophils express the high-affinity receptor for immunoglobulin E (Fc

epsilon RI): role in asthma // FASEB J. – 2001. – V. 15 (6). – P. 940-949.

92. Grainge, C.L., Lau, L.C., Ward, J.A., Dulay, V., Lahiff, G., Wilson, S., Holgate, S.,

Davies, D.E., Howarth, P.H. Effect of bronchoconstriction on airway remodeling in

asthma // N Engl J Med. – 2011. – V. 364 (21). – P. 2006-2015.

93. Gressner, O., Meier, U., Hillebrandt, S., Wasmuth, H.E., Kohl, J., Sauerbruch, T.,

Lammert, F. Gc-globulin concentrations and C5 haplotype-tagging polymorphisms

contribute to variations in serum activity of complement factor C5 // Clin Biochem. –

2007. – V. 40 (11). – P. 771-775.

94. Groemping, Y., Rittinger, K. Activation and assembly of the NADPH oxidase: a

structural perspective // Biochem J. – 2005. – V. 386 (Pt 3). – P. 401-416.

114

95. Gunther, E., Walter, L. Genetic aspects of the hsp70 multigene family in

vertebrates // Experientia. – 1994. – V. 50 (11-12). – P. 987-1001.

96. Gunzer, M. Traps and hyper inflammation - new ways that neutrophils promote or

hinder survival // Br J Haematol. – 2014. – V. 164 (2). – P. 189-199.

97. Haga, A., Okamoto, T., Yamada, S., Kubota, T., Sanpei, A., Takahashi, S.,

Nakayama, M., Nagai, M., Otaka, M., Miyazaki, T., Nunomura, W., Grave, E., Itoh,

H. Zinc-L-carnosine binds to molecular chaperone HSP70 and inhibits the chaperone

activity of the protein // J Biochem. – 2013. – V. 154 (3). – P. 249-256.

98. Hamelmann, E., Oshiba, A., Schwarze, J., Bradley, K., Loader, J., Larsen, G.L.,

Gelfand, E.W. Allergen-specific IgE and IL-5 are essential for the development of

airway hyperresponsiveness // Am J Respir Cell Mol Biol. – 1997. – V. 16 (6). –

P. 674-682.

99. Hamelmann, E., Tadeda, K., Oshiba, A., Gelfand, E.W. Role of IgE in the

development of allergic airway inflammation and airway hyperresponsiveness--a

murine model // Allergy. – 1999. – V. 54 (4). – P. 297-305.

100. Hammad, H., Chieppa, M., Perros, F., Willart, M.A., Germain, R.N., Lambrecht,

B.N. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of

airway structural cells // Nat Med. – 2009. – V. 15 (4). – P. 410-416.

101. Han, C.H., Freeman, J.L., Lee, T., Motalebi, S.A., Lambeth, J.D. Regulation of

the neutrophil respiratory burst oxidase. Identification of an activation domain in

p67(phox) // J Biol Chem. – 1998. – V. 273 (27). – P. 16663-16668.

102. Hinchado, M.D., Giraldo, E., Ortega, E. Adrenoreceptors are involved in the

stimulation of neutrophils by exercise-induced circulating concentrations of Hsp72:

cAMP as a potential "intracellular danger signal" // J Cell Physiol. – 2012. – V.

227 (2). – P. 604-608.

103. Hiroaki, H., Ago, T., Ito, T., Sumimoto, H., Kohda, D. Solution structure of the

PX domain, a target of the SH3 domain // Nat Struct Biol. – 2001. – V. 8 (6). – P. 526-

530.

104. Hohfeld, J. Regulation of the heat shock conjugate Hsc70 in the mammalian cell:

the characterization of the anti-apoptotic protein BAG-1 provides novel insights // Biol

Chem. – 1998. – V. 379 (3). – P. 269-274.

105. Hohfeld, J., Minami, Y., Hartl, F.U. Hip, a novel cochaperone involved in the

eukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle // Cell. – 1995. – V. 83 (4). – P. 589-598.

115

106. Holt, P.G., Stumbles, P.A. Regulation of immunologic homeostasis in peripheral

tissues by dendritic cells: the respiratory tract as a paradigm // J Allergy Clin

Immunol. – 2000. – V. 105 (3). – P. 421-429.

107. Holtzman, M.J. Asthma as a chronic disease of the innate and adaptive immune

systems responding to viruses and allergens // J Clin Invest. – 2012. – V. 122 (8). –

P. 2741-2748.

108. Honda, T., Kabashima, K. Prostanoids in allergy // Allergol Int. – 2015. –

V. 64 (1). – P. 11-16.

109. Horst, M., Oppliger, W., Rospert, S., Schonfeld, H.J., Schatz, G., Azem, A.

Sequential action of two hsp70 complexes during protein import into mitochondria //

EMBO J. – 1997. – V. 16 (8). – P. 1842-1849.

110. Hou, C., Zhao, H., Li, W., Liang, Z., Zhang, D., Liu, L., Tong, W., Cai, S.X.,

Zou, F. Increased heat shock protein 70 levels in induced sputum and plasma correlate

with severity of asthma patients // Cell Stress Chaperones. – 2011. – V. 16 (6). – P.

663-671.

111. Howarth, P.H., Durham, S.R., Kay, A.B., Holgate, S.T. The relationship between

mast cell-mediator release and bronchial reactivity in allergic asthma // J Allergy Clin

Immunol. – 1987. – V. 80 (5). – P. 703-711.

112. Hu, Z.Q., Zhao, W.H., Shimamura, T. Regulation of mast cell development by

inflammatory factors // Curr Med Chem. – 2007. – V. 14 (28). – P. 3044-3050.

113. Idzko, M., Hammad, H., van Nimwegen, M., Kool, M., Willart, M.A., Muskens,

F., Hoogsteden, H.C., Luttmann, W., Ferrari, D., Di Virgilio, F., Virchow, J.C., Jr.,

Lambrecht, B.N. Extracellular ATP triggers and maintains asthmatic airway

inflammation by activating dendritic cells // Nat Med. – 2007. – V. 13 (8). – P. 913-

919.

114. Jaattela, M. Overexpression of major heat shock protein hsp70 inhibits tumor

necrosis factor-induced activation of phospholipase A2 // J Immunol. – 1993. –

V. 151 (8). – P. 4286-4294.

115. Je, J.H., Kim, D.Y., Roh, H.J., Pak, C., Kim, D.H., Byamba, D., Jee, H., Kim,

T.G., Park, J.M., Lee, S.K., Lee, M.G. The antioxidative effect of heat shock protein70

in dendritic cells // Scand J Immunol. – 2013. – V. 78 (3). – P. 238-247.

116. Jenei, Z.M., Szeplaki, G., Merkely, B., Karadi, I., Zima, E., Prohaszka, Z.

Persistently elevated extracellular HSP70 (HSPA1A) level as an independent

116

prognostic marker in post-cardiac-arrest patients // Cell Stress Chaperones. – 2013. –

V. 18 (4). – P. 447-454.

117. John, M., Lim, S., Seybold, J., Jose, P., Robichaud, A., O'Connor, B., Barnes,

P.J., Chung, K.F. Inhaled corticosteroids increase interleukin-10 but reduce

macrophage inflammatory protein-1alpha, granulocyte-macrophage colony-stimulating

factor, and interferon-gamma release from alveolar macrophages in asthma // Am J

Respir Crit Care Med. – 1998. – V. 157 (1). – P. 256-262.

118. Johnson, J.D., Fleshner, M. Releasing signals, secretory pathways, and immune

function of endogenous extracellular heat shock protein 72 // J Leukoc Biol. – 2006. –

V. 79 (3). – P. 425-434.

119. Joly, A.L., Wettstein, G., Mignot, G., Ghiringhelli, F., Garrido, C. Dual role of

heat shock proteins as regulators of apoptosis and innate immunity // J Innate Immun.

– 2010. – V. 2 (3). – P. 238-247.

120. Jutel, M., Akdis, C.A. T-cell subset regulation in atopy // Curr Allergy Asthma

Rep. – 2011. – V. 11 (2). – P. 139-145.

121. Kacimi, R., Yenari, M.A. Pharmacologic heat shock protein 70 induction confers

cytoprotection against inflammation in gliovascular cells // Glia. – 2015. – V. 63 (7). –

P. 1200-1212.

122. Kanai, F., Liu, H., Field, S.J., Akbary, H., Matsuo, T., Brown, G.E., Cantley,

L.C., Yaffe, M.B. The PX domains of p47phox and p40phox bind to lipid products of

PI(3)K // Nat Cell Biol. – 2001. – V. 3 (7). – P. 675-678.

123. Kanelakis, K.C., Shewach, D.S., Pratt, W.B. Nucleotide binding states of hsp70

and hsp90 during sequential steps in the process of glucocorticoid receptor.hsp90

heterocomplex assembly // J Biol Chem. – 2002. – V. 277 (37). – P. 33698-33703.

124. Kaufmann, S.H. Heat-shock proteins: a link between rheumatoid arthritis and

infection? // Curr Opin Rheumatol. – 1990. – V. 2 (3). – P. 430-435.

125. Khan, B.Q., Kemp, S.F. Pathophysiology of anaphylaxis // Curr Opin Allergy

Clin Immunol. – 2011. – V. 11 (4). – P. 319-325.

126. Kharenko, O.A., Polichuk, D., Nelson, K.M., Abrams, S.R., Loewen, M.C.

Identification and characterization of interactions between abscisic acid and human

heat shock protein 70 family members // J Biochem. – 2013. – V. 154 (4). – P. 383-

391.

117

127. Kityk, R., Kopp, J., Sinning, I., Mayer, M.P. Structure and dynamics of the ATP-

bound open conformation of Hsp70 chaperones // Mol Cell. – 2012. – V. 48 (6). –

P. 863-874.

128. Knol, E.F. Requirements for effective IgE cross-linking on mast cells and

basophils // Mol Nutr Food Res. – 2006. – V. 50 (7). – P. 620-624.

129. Knutsen, A.P., Bush, R.K., Demain, J.G., Denning, D.W., Dixit, A., Fairs, A.,

Greenberger, P.A., Kariuki, B., Kita, H., Kurup, V.P., Moss, R.B., Niven, R.M.,

Pashley, C.H., Slavin, R.G., Vijay, H.M., Wardlaw, A.J. Fungi and allergic lower

respiratory tract diseases // J Allergy Clin Immunol. – 2012. – V. 129 (2). – P. 280-

291.

130. Kobayashi, T., Robinson, J.M., Seguchi, H. Identification of intracellular sites of

superoxide production in stimulated neutrophils // J Cell Sci. – 1998. – V. 111 (Pt 1) –

P. 81-91.

131. Kohl, J., Baelder, R., Lewkowich, I.P., Pandey, M.K., Hawlisch, H., Wang, L.,

Best, J., Herman, N.S., Sproles, A.A., Zwirner, J., Whitsett, J.A., Gerard, C., Sfyroera,

G., Lambris, J.D., Wills-Karp, M. A regulatory role for the C5a anaphylatoxin in type

2 immunity in asthma // J Clin Invest. – 2006. – V. 116 (3). – P. 783-796.

132. Kohler, A., De Filippo, K., Hasenberg, M., van den Brandt, C., Nye, E., Hosking,

M.P., Lane, T.E., Mann, L., Ransohoff, R.M., Hauser, A.E., Winter, O., Schraven, B.,

Geiger, H., Hogg, N., Gunzer, M. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers

neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands

// Blood. – 2011. – V. 117 (16). – P. 4349-4357.

133. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V.K. IL-17 and Th17 Cells // Annu

Rev Immunol. – 2009. – V. 27 – P. 485-517.

134. Kosciuch, J., Krenke, R., Gorska, K., Zukowska, M., Maskey-Warzechowska, M.,

Chazan, R. Airway dimensions in asthma and COPD in high resolution computed

tomography: can we see the difference? // Respir Care. – 2013. – V. 58 (8). –

P. 1335-1342.

135. Kostenko, S., Moens, U. Heat shock protein 27 phosphorylation: kinases,

phosphatases, functions and pathology // Cell Mol Life Sci. – 2009. – V. 66 (20). –

P. 3289-3307.

136. Kreck, M.L., Freeman, J.L., Abo, A., Lambeth, J.D. Membrane association of Rac

is required for high activity of the respiratory burst oxidase // Biochemistry. – 1996. –

V. 35 (49). – P. 15683-15692.

118

137. Kruger, P., Saffarzadeh, M., Weber, A.N., Rieber, N., Radsak, M., von Bernuth,

H., Benarafa, C., Roos, D., Skokowa, J., Hartl, D. Neutrophils: Between Host Defence,

Immune Modulation, and Tissue Injury // PLoS Pathog. – 2015. – V. 11 (3). –

P. e1004651.

138. Lambrecht, B.N. The Immunological Basis of Asthma. – New York: Marcel

Dekker, Inc. , 2003. – 800 P.

139. Lambrecht, B.N. Dendritic cells and the regulation of the allergic immune

response // Allergy. – 2005. – V. 60 (3). – P. 271-282.

140. Lambrecht, B.N. An unexpected role for the anaphylatoxin C5a receptor in

allergic sensitization // J Clin Invest. – 2006. – V. 116 (3). – P. 628-632.

141. Lapouge, K., Smith, S.J., Groemping, Y., Rittinger, K. Architecture of the p40-

p47-p67phox complex in the resting state of the NADPH oxidase. A central role for

p67phox // J Biol Chem. – 2002. – V. 277 (12). – P. 10121-10128.

142. Lee, S.H., Lee, E.J., Min, K.H., Hur, G.Y., Lee, S.H., Lee, S.Y., Kim, J.H., Shin,

C., Shim, J.J., In, K.H., Kang, K.H., Lee, S.Y. Quercetin Enhances Chemosensitivity

to Gemcitabine in Lung Cancer Cells by Inhibiting Heat Shock Protein 70 Expression

// Clin Lung Cancer. – 2015. – ePub.

143. Lefrancais, E., Cayrol, C. Mechanisms of IL-33 processing and secretion:

differences and similarities between IL-1 family members // Eur Cytokine Netw. –

2013. – V. 23 (4). – P. 120-127.

144. Leitch, A.E., Lucas, C.D., Rossi, A.G. Editorial: Neutrophil apoptosis: hot on the

TRAIL of inflammatory resolution // J Leukoc Biol. – 2011. – V. 90 (5). – P. 841-843.

145. Liew, F.Y. IL-33: a Janus cytokine // Ann Rheum Dis. – 2012. – V. 71 Suppl 2 –

P. i101-104.

146. Lim, W.K., Kanelakis, K.C., Neubig, R.R. Regulation of G protein signaling by

the 70kDa heat shock protein // Cell Signal. – 2013. – V. 25 (2). – P. 389-396.

147. Linch, S.N., Danielson, E.T., Kelly, A.M., Tamakawa, R.A., Lee, J.J., Gold, J.A.

Interleukin 5 is protective during sepsis in an eosinophil-independent manner // Am J

Respir Crit Care Med. – 2012. – V. 186 (3). – P. 246-254.

148. Lipsker, D., Ziylan, U., Spehner, D., Proamer, F., Bausinger, H., Jeannin, P.,

Salamero, J., Bohbot, A., Cazenave, J.P., Drillien, R., Delneste, Y., Hanau, D., de la

Salle, H. Heat shock proteins 70 and 60 share common receptors which are expressed

119

on human monocyte-derived but not epidermal dendritic cells // Eur J Immunol. –

2002. – V. 32 (2). – P. 322-332.

149. Liu, D.J., Hammer, D., Komlos, D., Chen, K.Y., Firestein, B.L., Liu, A.Y. SIRT1

knockdown promotes neural differentiation and attenuates the heat shock response //

J Cell Physiol. – 2014. – V. 229 (9). – P. 1224-1235.

150. Liu, J., Harberts, E., Tammaro, A., Girardi, N., Filler, R.B., Fishelevich, R.,

Temann, A., Licona-Limon, P., Girardi, M., Flavell, R.A., Gaspari, A.A. IL-9

regulates allergen-specific Th1 responses in allergic contact dermatitis // J Invest

Dermatol. – 2014. – V. 134 (7). – P. 1903-1911.

151. Liu, M., Yokomizo, T. The role of leukotrienes in allergic diseases // Allergol

Int. – 2015. – V. 64 (1). – P. 17-26.

152. Lloyd, C.M. IL-33 family members and asthma - bridging innate and adaptive

immune responses // Curr Opin Immunol. – 2010. – V. 22 (6). – P. 800-806.

153. Lloyd, C.M., Brown, Z. Chemokine receptors : therapeutic potential in asthma //

Treat Respir Med. – 2006. – V. 5 (3). – P. 159-166.

154. Lloyd, C.M., Saglani, S. T cells in asthma: Influences of genetics, environment,

and T-cell plasticity // J Allergy Clin Immunol. – 2013. – V. 131 (5). – P. 1267-1274.

155. Lloyd, C.M., Saglani, S. Epithelial cytokines and pulmonary allergic

inflammation // Curr Opin Immunol. – 2015. – V. 34 – P. 52-58.

156. Lommatzsch, M., Julius, P., Kuepper, M., Garn, H., Bratke, K., Irmscher, S.,

Luttmann, W., Renz, H., Braun, A., Virchow, J.C. The course of allergen-induced

leukocyte infiltration in human and experimental asthma // J Allergy Clin Immunol. –

2006. – V. 118 (1). – P. 91-97.

157. Lowell, C.A., Fumagalli, L., Berton, G. Deficiency of Src family kinases

p59/61hck and p58c-fgr results in defective adhesion-dependent neutrophil functions //

J Cell Biol. – 1996. – V. 133 (4). – P. 895-910.

158. Lundqvist, H., Dahlgren, C. Isoluminol-enhanced chemiluminescence: a sensitive

method to study the release of superoxide anion from human neutrophils // Free Radic

Biol Med. – 1996. – V. 20 (6). – P. 785-792.

159. Lutfi, R., Lewkowich, I.P., Zhou, P., Ledford, J.R., Page, K. The role of protease-

activated receptor-2 on pulmonary neutrophils in the innate immune response to

cockroach allergen // J Inflamm (Lond). – 2012. – V. 9 (1). – P. 32.

120

160. Macfarlane, A.J., Kon, O.M., Smith, S.J., Zeibecoglou, K., Khan, L.N., Barata,

L.T., McEuen, A.R., Buckley, M.G., Walls, A.F., Meng, Q., Humbert, M., Barnes,

N.C., Robinson, D.S., Ying, S., Kay, A.B. Basophils, eosinophils, and mast cells in

atopic and nonatopic asthma and in late-phase allergic reactions in the lung and skin //

J Allergy Clin Immunol. – 2000. – V. 105 (1 Pt 1). – P. 99-107.

161. MacGlashan, D.W., Jr. IgE-dependent signaling as a therapeutic target for

allergies // Trends Pharmacol Sci. – 2012. – V. 33 (9). – P. 502-509.

162. Maconochie, J.G., Woodings, E.P., Richards, D.A. Effects of H1- and H2-

receptor blocking agents on histamine-induced bronchoconstriction in non-asthmatic

subjects // Br J Clin Pharmacol. – 1979. – V. 7 (3). – P. 231-236.

163. Magnan, A., van Pee, D., Bongrand, P., Vervloet, D. Alveolar macrophage

interleukin (IL)-10 and IL-12 production in atopic asthma // Allergy. – 1998. – V. 53

(11). – P. 1092-1095.

164. Mambula, S.S., Stevenson, M.A., Ogawa, K., Calderwood, S.K. Mechanisms for

Hsp70 secretion: crossing membranes without a leader // Methods. – 2007. – V. 43

(3). – P. 168-175.

165. Marincek, B.C., Kuhnle, M.C., Srokowski, C., Schild, H., Hammerling, G.,

Momburg, F. Heat shock protein-antigen fusions lose their enhanced

immunostimulatory capacity after endotoxin depletion // Mol Immunol. – 2008. –

V. 46 (1). – P. 181-191.

166. Matricardi, P.M., Bockelbrink, A., Gruber, C., Keil, T., Hamelmann, E., Wahn,

U., Lau, S. Longitudinal trends of total and allergen-specific IgE throughout childhood

// Allergy. – 2009. – V. 64 (7). – P. 1093-1098.

167. Matute, J.D., Arias, A.A., Dinauer, M.C., Patino, P.J. p40phox: the last NADPH

oxidase subunit // Blood Cells Mol Dis. – 2005. – V. 35 (2). – P. 291-302.

168. Mayer, M.P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular

mechanism // Cell Mol Life Sci. – 2005. – V. 62 (6). – P. 670-684.

169. Millar, D.G., Garza, K.M., Odermatt, B., Elford, A.R., Ono, N., Li, Z., Ohashi,

P.S. Hsp70 promotes antigen-presenting cell function and converts T-cell tolerance to

autoimmunity in vivo // Nat Med. – 2003. – V. 9 (12). – P. 1469-1476.

170. Mizgerd, J.P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by

bacteria in the lungs // Semin Immunol. – 2002. – V. 14 (2). – P. 123-132.

121

171. Mjosberg, J., Spits, H. Type 2 innate lymphoid cells-new members of the "type 2

franchise" that mediate allergic airway inflammation // Eur J Immunol. – 2012. –

V. 42 (5). – P. 1093-1096.

172. Monteseirin, J., Camacho, M.J., Bonilla, I., De la Calle, A., Guardia, P., Conde,

J., Sobrino, F. Respiratory burst in neutrophils from asthmatic patients // J Asthma. –

2002. – V. 39 (7). – P. 619-624.

173. Morgan, M.J., Liu, Z.G. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-kappaB

signaling // Cell Res. – 2011. – V. 21 (1). – P. 103-115.

174. Morimatsu, T., Kawagoshi, A., Yoshida, K., Tamura, M. Actin enhances the

activation of human neutrophil NADPH oxidase in a cell-free system // Biochem

Biophys Res Commun. – 1997. – V. 230 (1). – P. 206-210.

175. Mortaz, E., Engels, F., Nijkamp, F.P., Redegeld, F.A. New insights on the

possible role of mast cells in aspirin-induced asthma // Curr Mol Pharmacol. – 2009. –

V. 2 (2). – P. 182-189.

176. Mosser, D.D., Caron, A.W., Bourget, L., Denis-Larose, C., Massie, B. Role of the

human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis // Mol

Cell Biol. – 1997. – V. 17 (9). – P. 5317-5327.

177. Multhoff, G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70 // Int J

Hyperthermia. – 2002. – V. 18 (6). – P. 576-585.

178. Multhoff, G. Heat shock protein 70 (Hsp70): membrane location, export and

immunological relevance // Methods. – 2007. – V. 43 (3). – P. 229-237.

179. Murdoch, J.R., Lloyd, C.M. Chronic inflammation and asthma // Mutat Res. –

2010. – V. 690 (1-2). – P. 24-39.

180. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe

asthma // Int Arch Allergy Immunol. – 2012. – V. 158 Suppl 1 – P. 96-102.

181. Nakagome, K., Nagata, M. Pathogenesis of airway inflammation in bronchial

asthma // Auris Nasus Larynx. – 2011. – V. 38 (5). – P. 555-563.

182. Nakamura, T., Hinagata, J., Tanaka, T., Imanishi, T., Wada, Y., Kodama, T., Doi,

T. HSP90, HSP70, and GAPDH directly interact with the cytoplasmic domain of

macrophage scavenger receptors // Biochem Biophys Res Commun. – 2002. –

V. 290 (2). – P. 858-864.

122

183. Nassenstein, C., Schulte-Herbruggen, O., Renz, H., Braun, A. Nerve growth

factor: the central hub in the development of allergic asthma? // Eur J Pharmacol. –

2006. – V. 533 (1-3). – P. 195-206.

184. Njemini, R., Lambert, M., Demanet, C., Mets, T. Elevated serum heat-shock

protein 70 levels in patients with acute infection: use of an optimized enzyme-linked

immunosorbent assay // Scand J Immunol. – 2003. – V. 58 (6). – P. 664-669.

185. Nosal, R., Perecko, T., Jancinova, V., Drabikova, K., Harmatha, J., Svitekova, K.

Naturally appearing N-feruloylserotonin isomers suppress oxidative burst of human

neutrophils at the protein kinase C level // Pharmacol Rep. – 2011. – V. 63 (3). –

P. 790-798.

186. O'Donnell, B.V., Tew, D.G., Jones, O.T., England, P.J. Studies on the inhibitory

mechanism of iodonium compounds with special reference to neutrophil NADPH

oxidase // Biochem J. – 1993. – V. 290 ( Pt 1) – P. 41-49.

187. Ogawa, K., Seta, R., Shimizu, T., Shinkai, S., Calderwood, S.K., Nakazato, K.,

Takahashi, K. Plasma adenosine triphosphate and heat shock protein 72 concentrations

after aerobic and eccentric exercise // Exerc Immunol Rev. – 2011. – V. 17 – P.

136-149.

188. Osterfeld, H., Ahrens, R., Strait, R., Finkelman, F.D., Renauld, J.C., Hogan, S.P.

Differential roles for the IL-9/IL-9 receptor alpha-chain pathway in systemic and oral

antigen-induced anaphylaxis // J Allergy Clin Immunol. – 2010. – V. 125 (2). – P.

469-476.

189. Ozdemir, C., Akdis, M., Akdis, C.A. T-cell response to allergens // Chem

Immunol Allergy. – 2010. – V. 95 – P. 22-44.

190. Page, K., Lierl, K.M., Hughes, V.S., Zhou, P., Ledford, J.R., Wills-Karp, M.

TLR2-mediated activation of neutrophils in response to German cockroach frass //

J Immunol. – 2008. – V. 180 (9). – P. 6317-6324.

191. Palleros, D.R., Welch, W.J., Fink, A.L. Interaction of hsp70 with unfolded

proteins: effects of temperature and nucleotides on the kinetics of binding // Proc Natl

Acad Sci U S A. – 1991. – V. 88 (13). – P. 5719-5723.

192. Panaro, M.A., Mitolo, V. Cellular responses to FMLP challenging: a mini-review

// Immunopharmacol Immunotoxicol. – 1999. – V. 21 (3). – P. 397-419.

193. Peters-Golden, M. The alveolar macrophage: the forgotten cell in asthma // Am J

Respir Cell Mol Biol. – 2004. – V. 31 (1). – P. 3-7.

123

194. Peters, M., Dudziak, K., Stiehm, M., Bufe, A. T-cell polarization depends on

concentration of the danger signal used to activate dendritic cells // Immunol Cell

Biol. – 2010. – V. 88 (5). – P. 537-544.

195. Pirkkala, L., Nykanen, P., Sistonen, L. Roles of the heat shock transcription

factors in regulation of the heat shock response and beyond // FASEB J. – 2001. – V.

15 (7). – P. 1118-1131.

196. Pittet, J.F., Lee, H., Morabito, D., Howard, M.B., Welch, W.J., Mackersie, R.C.

Serum levels of Hsp 72 measured early after trauma correlate with survival //

J Trauma. – 2002. – V. 52 (4). – P. 611-617.

197. Pockley, A.G., De Faire, U., Kiessling, R., Lemne, C., Thulin, T., Frostegard, J.

Circulating heat shock protein and heat shock protein antibody levels in established

hypertension // J Hypertens. – 2002. – V. 20 (9). – P. 1815-1820.

198. Pockley, A.G., Fairburn, B., Mirza, S., Slack, L.K., Hopkinson, K., Muthana, M.

A non-receptor-mediated mechanism for internalization of molecular chaperones //

Methods. – 2007. – V. 43 (3). – P. 238-244.

199. Pockley, A.G., Georgiades, A., Thulin, T., de Faire, U., Frostegard, J. Serum heat

shock protein 70 levels predict the development of atherosclerosis in subjects with

established hypertension // Hypertension. – 2003. – V. 42 (3). – P. 235-238.

200. Pockley, A.G., Shepherd, J., Corton, J.M. Detection of heat shock protein 70

(Hsp70) and anti-Hsp70 antibodies in the serum of normal individuals // Immunol

Invest. – 1998. – V. 27 (6). – P. 367-377.

201. Polla, B.S., Bachelet, M., Dall'ava, J., Vignola, A.M. Heat shock proteins in

inflammation and asthma: Dr Jekyll or Mr Hyde? // Clin Exp Allergy. – 1998. –

V. 28 (5). – P. 527-529.

202. Popa, V.T. Bronchodilating activity of an H1 blocker, chlorpheniramine // J

Allergy Clin Immunol. – 1977. – V. 59 (1). – P. 54-63.

203. Prado, N., Marazuela, E.G., Segura, E., Fernandez-Garcia, H., Villalba, M.,

Thery, C., Rodriguez, R., Batanero, E. Exosomes from bronchoalveolar fluid of

tolerized mice prevent allergic reaction // J Immunol. – 2008. – V. 181 (2). – P. 1519-

1525.

204. Pratt, W.B., Toft, D.O. Regulation of signaling protein function and trafficking by

the hsp90/hsp70-based chaperone machinery // Exp Biol Med (Maywood). – 2003. –

V. 228 (2). – P. 111-133.

124

205. Pressman, B.C. Biological applications of ionophores // Annu Rev Biochem. –

1976. – V. 45 – P. 501-530.

206. Qi, R., Sarbeng, E.B., Liu, Q., Le, K.Q., Xu, X., Xu, H., Yang, J., Wong, J.L.,

Vorvis, C., Hendrickson, W.A., Zhou, L., Liu, Q. Allosteric opening of the

polypeptide-binding site when an Hsp70 binds ATP // Nat Struct Mol Biol. – 2013. –

V. 20 (7). – P. 900-907.

207. Raible, D.G., Lenahan, T., Fayvilevich, Y., Kosinski, R., Schulman, E.S.

Pharmacologic characterization of a novel histamine receptor on human eosinophils //

Am J Respir Crit Care Med. – 1994. – V. 149 (6). – P. 1506-1511.

208. Rankin, S.M. The bone marrow: a site of neutrophil clearance // J Leukoc Biol. –

2010. – V. 88 (2). – P. 241-251.

209. Ratthe, C., Ennaciri, J., Garces Goncalves, D.M., Chiasson, S., Girard, D.

Interleukin (IL)-4 induces leukocyte infiltration in vivo by an indirect mechanism //

Mediators Inflamm. – 2009. – V. 2009 – P. 193970.

210. Reed, J.C. Bcl-2 family proteins: regulators of apoptosis and chemoresistance in

hematologic malignancies // Semin Hematol. – 1997. – V. 34 (4 Suppl 5). – P. 9-19.

211. Renz, H., von Mutius, E., Brandtzaeg, P., Cookson, W.O., Autenrieth, I.B.,

Haller, D. Gene-environment interactions in chronic inflammatory disease // Nat

Immunol. – 2011. – V. 12 (4). – P. 273-277.

212. Reynolds, S.D., Malkinson, A.M. Clara cell: progenitor for the bronchiolar

epithelium // Int J Biochem Cell Biol. – 2010. – V. 42 (1). – P. 1-4.

213. Ritossa, F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosofila //

Experientia. – 1962. – V. 18 – P. 3.

214. Romani, L., Mencacci, A., Cenci, E., Del Sero, G., Bistoni, F., Puccetti, P. An

immunoregulatory role for neutrophils in CD4+ T helper subset selection in mice with

candidiasis // J Immunol. – 1997. – V. 158 (5). – P. 2356-2362.

215. Rothenberg, M.E., Hogan, S.P. The eosinophil // Annu Rev Immunol. – 2006. –

V. 24 – P. 147-174.

216. Samter, M., Beers, R.F., Jr. Intolerance to aspirin. Clinical studies and

consideration of its pathogenesis // Ann Intern Med. – 1968. – V. 68 (5). – P. 975-983.

125

217. Sapozhnikov, A.M., Gusarova, G.A., Ponomarev, E.D., Telford, W.G.

Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis //

Cell Prolif. – 2002. – V. 35 (4). – P. 193-206.

218. Schirmer, E.C., Glover, J.R., Singer, M.A., Lindquist, S. HSP100/Clp proteins: a

common mechanism explains diverse functions // Trends Biochem Sci. – 1996. –

V. 21 (8). – P. 289-296.

219. Schlecht, R., Erbse, A.H., Bukau, B., Mayer, M.P. Mechanics of Hsp70

chaperones enables differential interaction with client proteins // Nat Struct Mol Biol.

– 2011. – V. 18 (3). – P. 345-351.

220. Schleimer, R.P., Kato, A., Kern, R., Kuperman, D., Avila, P.C. Epithelium: at the

interface of innate and adaptive immune responses // J Allergy Clin Immunol. – 2007.

– V. 120 (6). – P. 1279-1284.

221. Schuijs, M.J., Willart, M.A., Hammad, H., Lambrecht, B.N. Cytokine targets in

airway inflammation // Curr Opin Pharmacol. – 2013. – V. 13 (3). – P. 351-361.

222. Shemetov, A.A., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. Structure, properties, and functions

of the human small heat-shock protein HSP22 (HspB8, H11, E2IG1): a critical review

// J Neurosci Res. – 2008. – V. 86 (2). – P. 264-269.

223. Siems, W.G., Capuozzo, E., Verginelli, D., Salerno, C., Crifo, C., Grune, T.

Inhibition of NADPH oxidase-mediated superoxide radical formation in PMA-

stimulated human neutrophils by 4-hydroxynonenal--binding to -SH and -NH2 groups

// Free Radic Res. – 1997. – V. 27 (4). – P. 353-358.

224. Song, X., Wang, X., Zhuo, W., Shi, H., Feng, D., Sun, Y., Liang, Y., Fu, Y.,

Zhou, D., Luo, Y. The regulatory mechanism of extracellular Hsp90{alpha} on matrix

metalloproteinase-2 processing and tumor angiogenesis // J Biol Chem. – 2010. –

V. 285 (51). – P. 40039-40049.

225. Sorrentino, R., Bertolino, A., Terlizzi, M., Iacono, V.M., Maiolino, P., Cirino, G.,

Roviezzo, F., Pinto, A. B Cell Depletion Increases Sphingosine-1-phosphate-

dependent Airway Inflammation in Mice // Am J Respir Cell Mol Biol. – 2014. – V.

52 (5). – P. 571-583.

226. Souwer, Y., Szegedi, K., Kapsenberg, M.L., de Jong, E.C. IL-17 and IL-22 in

atopic allergic disease // Curr Opin Immunol. – 2010. – V. 22 (6). – P. 821-826.

126

227. Stanic, B., van de Veen, W., Wirz, O.F., Ruckert, B., Morita, H., Sollner, S.,

Akdis, C.A., Akdis, M. IL-10-overexpressing B cells regulate innate and adaptive

immune responses // J Allergy Clin Immunol. – 2014. – V. 135 (3). – P. 771-780.

228. Stocki, P., Dickinson, A.M. The immunosuppressive activity of heat shock

protein 70 // Autoimmune Dis. – 2012. – V. 2012 – P. 617213.

229. Summers, C., Rankin, S.M., Condliffe, A.M., Singh, N., Peters, A.M., Chilvers,

E.R. Neutrophil kinetics in health and disease // Trends Immunol. – 2010. – V. 31 (8).

– P. 318-324.

230. Szabo, A., Langer, T., Schroder, H., Flanagan, J., Bukau, B., Hartl, F.U. The ATP

hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK,

DnaJ, and GrpE // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1994. – V. 91 (22). – P. 10345-10349.

231. Szczeklik, A., Nizankowska, E. Clinical features and diagnosis of aspirin induced

asthma // Thorax. – 2000. – V. 55 Suppl 2 – P. S42-44.

232. Takayama, S., Bimston, D.N., Matsuzawa, S., Freeman, B.C., Aime-Sempe, C.,

Xie, Z., Morimoto, R.I., Reed, J.C. BAG-1 modulates the chaperone activity of

Hsp70/Hsc70 // EMBO J. – 1997. – V. 16 (16). – P. 4887-4896.

233. Takeya, R., Sumimoto, H. Molecular mechanism for activation of superoxide-

producing NADPH oxidases // Mol Cells. – 2003. – V. 16 (3). – P. 271-277.

234. Tamura, Y., Torigoe, T., Kutomi, G., Hirata, K., Sato, N. New paradigm for

intrinsic function of heat shock proteins as endogenous ligands in inflammation and

innate immunity // Curr Mol Med. – 2012. – V. 12 (9). – P. 1198-1206.

235. Tanaka, K., Tanaka, Y., Namba, T., Azuma, A., Mizushima, T. Heat shock

protein 70 protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice // Biochem

Pharmacol. – 2010. – V. 80 (6). – P. 920-931.

236. Tang, C., Rolland, J.M., Ward, C., Li, X., Bish, R., Thien, F., Walters, E.H.

Modulatory effects of alveolar macrophages on CD4+ T-cell IL-5 responses correlate

with IL-1beta, IL-6, and IL-12 production // Eur Respir J. – 1999. – V. 14 (1). –

P. 106-112.

237. Tang, C., Ward, C., Reid, D., Bish, R., O'Byrne P, M., Walters, E.H. Normally

suppressing CD40 coregulatory signals delivered by airway macrophages to TH2

lymphocytes are defective in patients with atopic asthma // J Allergy Clin Immunol. –

2001. – V. 107 (5). – P. 863-870.

127

238. Tashkin, D.P. The role of small airway inflammation in asthma // Allergy Asthma

Proc. – 2002. – V. 23 (4). – P. 233-242.

239. Taube, C., Dakhama, A., Rha, Y.H., Takeda, K., Joetham, A., Park, J.W.,

Balhorn, A., Takai, T., Poch, K.R., Nick, J.A., Gelfand, E.W. Transient neutrophil

infiltration after allergen challenge is dependent on specific antibodies and Fc gamma

III receptors // J Immunol. – 2003. – V. 170 (8). – P. 4301-4309.

240. Taylor, W.R., Jones, D.T., Segal, A.W. A structural model for the nucleotide

binding domains of the flavocytochrome b-245 beta-chain // Protein Sci. – 1993. – V.

2 (10). – P. 1675-1685.

241. Testa, M.P., Alvarado, O., Wournell, A., Lee, J., Guilford, F.T., Henriksen, S.H.,

Phillips, T.R. Screening assay for oxidative stress in a feline astrocyte cell line, G355-

5 // J Vis Exp. – 2011. – V. (53). – P. e2841.

242. Theriault, J.R., Mambula, S.S., Sawamura, T., Stevenson, M.A., Calderwood,

S.K. Extracellular HSP70 binding to surface receptors present on antigen presenting

cells and endothelial/epithelial cells // FEBS Lett. – 2005. – V. 579 (9). – P. 1951-

1960.

243. Tintinger, G.R., Theron, A.J., Steel, H.C., Anderson, R. Accelerated calcium

influx and hyperactivation of neutrophils in chronic granulomatous disease // Clin Exp

Immunol. – 2001. – V. 123 (2). – P. 254-263.

244. Torres, R., Serra-Pages, M., Plaza, J., Herrerias, A., Costa-Farre, C., Marco, A.,

Jimenez, M., Maurer, M., Picado, C., de Mora, F. Activation of the Prostaglandin E2

receptor EP2 prevents house dust mite-induced airway hyperresponsiveness and

inflammation by restraining mast cells activity // Clin Exp Allergy. – 2015. – ePub.

245. Touyz, R.M. Apocynin, NADPH oxidase, and vascular cells: a complex matter //

Hypertension. – 2008. – V. 51 (2). – P. 172-174.

246. Touyz, R.M., Briones, A.M., Sedeek, M., Burger, D., Montezano, A.C. NOX

isoforms and reactive oxygen species in vascular health // Mol Interv. – 2011. –

V. 11 (1). – P. 27-35.

247. Tsan, M.F., Gao, B. Heat shock proteins and immune system // J Leukoc Biol. –

2009. – V. 85 (6). – P. 905-910.

248. Turner, H., Kinet, J.P. Signalling through the high-affinity IgE receptor

Fc epsilonRI // Nature. – 1999. – V. 402 (6760 Suppl). – P. B24-30.

128

249. Vabulas, R.M., Ahmad-Nejad, P., Ghose, S., Kirschning, C.J., Issels, R.D.,

Wagner, H. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin-1 receptor signal

pathway // J Biol Chem. – 2002. – V. 277 (17). – P. 15107-15112.

250. van de Veen, W., Stanic, B., Yaman, G., Wawrzyniak, M., Sollner, S., Akdis,

D.G., Ruckert, B., Akdis, C.A., Akdis, M. IgG4 production is confined to human IL-

10-producing regulatory B cells that suppress antigen-specific immune responses //

J Allergy Clin Immunol. – 2013. – V. 131 (4). – P. 1204-1212.

251. Veres, T.Z., Rochlitzer, S., Shevchenko, M., Fuchs, B., Prenzler, F., Nassenstein,

C., Fischer, A., Welker, L., Holz, O., Muller, M., Krug, N., Braun, A. Spatial

interactions between dendritic cells and sensory nerves in allergic airway inflammation

// Am J Respir Cell Mol Biol. – 2007. – V. 37 (5). – P. 553-561.

252. Veres, T.Z., Shevchenko, M., Krasteva, G., Spies, E., Prenzler, F., Rochlitzer, S.,

Tschernig, T., Krug, N., Kummer, W., Braun, A. Dendritic cell-nerve clusters are sites

of T cell proliferation in allergic airway inflammation // Am J Pathol. – 2009. –

V. 174 (3). – P. 808-817.

253. Veres, T.Z., Voedisch, S., Spies, E., Valtonen, J., Prenzler, F., Braun, A.

Aeroallergen challenge promotes dendritic cell proliferation in the airways //

J Immunol. – 2013. – V. 190 (3). – P. 897-903.

254. Vinokurov, M., Ostrov, V., Yurinskaya, M., Garbuz, D., Murashev, A., Antonova,

O., Evgen'ev, M. Recombinant human Hsp70 protects against lipoteichoic acid-

induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels // Cell Stress

Chaperones. – 2012. – V. 17 (1). – P. 89-101.

255. Virchow, J.C. Asthma - a small airway disease: concepts and evidence //

Pneumologie. – 2009. – V. 63 Suppl 2 – P. S96-101.

256. Vogel, M., Bukau, B., Mayer, M.P. Allosteric regulation of Hsp70 chaperones by

a proline switch // Mol Cell. – 2006. – V. 21 (3). – P. 359-367.

257. Vojtek, A.B., Hollenberg, S.M. Ras-Raf interaction: two-hybrid analysis //

Methods Enzymol. – 1995. – V. 255 – P. 331-342.

258. Wallin, R.P., Lundqvist, A., More, S.H., von Bonin, A., Kiessling, R., Ljunggren,

H.G. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system // Trends

Immunol. – 2002. – V. 23 (3). – P. 130-135.

129

259. Wan, T., Zhou, X., Chen, G., An, H., Chen, T., Zhang, W., Liu, S., Jiang, Y.,

Yang, F., Wu, Y., Cao, X. Novel heat shock protein Hsp70L1 activates dendritic cells

and acts as a Th1 polarizing adjuvant // Blood. – 2004. – V. 103 (5). – P. 1747-1754.

260. Weichselbaum, M., Sparrow, M.P., Hamilton, E.J., Thompson, P.J., Knight, D.A.

A confocal microscopic study of solitary pulmonary neuroendocrine cells in human

airway epithelium // Respir Res. – 2005. – V. 6 – P. 115.

261. Wenzel, S.E., Fowler, A.A., 3rd, Schwartz, L.B. Activation of pulmonary mast

cells by bronchoalveolar allergen challenge. In vivo release of histamine and tryptase

in atopic subjects with and without asthma // Am Rev Respir Dis. – 1988. – V. 137 (5).

– P. 1002-1008.

262. Wheeler, D.S., Chase, M.A., Senft, A.P., Poynter, S.E., Wong, H.R., Page, K.

Extracellular Hsp72, an endogenous DAMP, is released by virally infected airway

epithelial cells and activates neutrophils via Toll-like receptor (TLR)-4 // Respir Res. –

2009. – V. 10 – P. 31.

263. Wickner, S., Maurizi, M.R. Here's the hook: similar substrate binding sites in the

chaperone domains of Clp and Lon // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. – V. 96

(15). – P. 8318-8320.

264. Willart, M.A., Lambrecht, B.N. The danger within: endogenous danger signals,

atopy and asthma // Clin Exp Allergy. – 2009. – V. 39 (1). – P. 12-19.

265. Xiong, H., Curotto de Lafaille, M.A., Lafaille, J.J. What is unique about the IgE

response? // Adv Immunol. – 2012. – V. 116 – P. 113-141.

266. Yan, S.R., Berton, G. Regulation of Src family tyrosine kinase activities in

adherent human neutrophils. Evidence that reactive oxygen intermediates produced by

adherent neutrophils increase the activity of the p58c-fgr and p53/56lyn tyrosine

kinases // J Biol Chem. – 1996. – V. 271 (38). – P. 23464-23471.

267. Yan, S.R., Fumagalli, L., Dusi, S., Berton, G. Tumor necrosis factor triggers

redistribution to a Triton X-100-insoluble, cytoskeletal fraction of beta 2 integrins,

NADPH oxidase components, tyrosine phosphorylated proteins, and the protein

tyrosine kinase p58fgr in human neutrophils adherent to fibrinogen // J Leukoc Biol. –

1995. – V. 58 (5). – P. 595-606.

268. Yang, I.V., Schwartz, D.A. Epigenetic mechanisms and the development of

asthma // J Allergy Clin Immunol. – 2012. – V. 130 (6). – P. 1243-1255.

130

269. Yang, M., Wu, T., Cheng, L., Wang, F., Wei, Q., Tanguay, R.M. Plasma

antibodies against heat shock protein 70 correlate with the incidence and severity of

asthma in a Chinese population // Respir Res. – 2005. – V. 6 – P. 18.

270. Yurinskaya, M.M., Evgen'ev, M.B., Antonova, O.Y., Vinokurov, M.G.

Exogenous heat shock protein HSP70 suppresses bacterial pathogen-induced

activation of human neutrophils // Dokl Biochem Biophys. – 2010. – V. 435 – P. 316-

319.

271. Yurinskaya, M.M., Vinokurov, M.G., Zatsepina, O.G., Garbuz, D.G., Guzhova,

I.V., Rozhkova, E.A., Suslikov, A.V., Karpov, V.L., Evgen'ev, M.B. Exogenous heat

shock proteins (HSP70) significantly inhibit endotoxin-induced activation of human

neutrophils // Dokl Biol Sci. – 2009. – V. 426 – P. 298-301.

272. Zavialov, A.V., Gaestel, M., Korpela, T., Zav'yalov, V.P. Thiol/disulfide

exchange between small heat shock protein 25 and glutathione // Biochim Biophys

Acta. – 1998. – V. 1388 (1). – P. 123-132.

273. Zeng, Y., Cao, R., Zhang, T., Li, S., Zhong, W. Design and synthesis of

piperidine derivatives as novel human heat shock protein 70 inhibitors for the

treatment of drug-resistant tumors // Eur J Med Chem. – 2015. – V. 97 – P. 19-31.

274. Zhu, J., Quyyumi, A.A., Wu, H., Csako, G., Rott, D., Zalles-Ganley, A.,

Ogunmakinwa, J., Halcox, J., Epstein, S.E. Increased serum levels of heat shock

protein 70 are associated with low risk of coronary artery disease // Arterioscler

Thromb Vasc Biol. – 2003. – V. 23 (6). – P. 1055-1059.

275. Zonneveld-Huijssoon, E., Albani, S., Prakken, B.J., van Wijk, F. Heat shock

protein bystander antigens for peptide immunotherapy in autoimmune disease // Clin

Exp Immunol. – 2013. – V. 171 (1). – P. 20-29.