Jowlal of Chomatography. 111 (1975) 105-l 15 0 Elscvicr Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

CHROM. 8358

GASCHROMATOGRAPHIE ACYLIERTER a-HYDROXYPHOSPHON- SAUREESTER

SPURENANALYSE ALIPHATISCHER CARBONSAUREN MLT DEM PHOS- PHORDETEKTOR

PAUL SCHULZ und RADU V?LCEANU

Ccvrtrrtl de Clrimic Timiqoara, TinriSoara ( RlmuWcrr)

(Eingcgangen am 11. Miirz 1975)

SUMMARY

Gas chromatography qf’ acyfated a-lgy~frosy-phosphortale esters. Trace arlalysis qf ali- pltatic carbosylic acids with the thermionic detector

By a new analytic procedure, traces of carboxylic acids are converted into phosphorus-containing derivatives, using their esterification with a-hydroxy-phos- phonic acid esters. The derivatisation occurs under mild conditions in the presence of dicyclohexyl carbodiimide, resulting in compounds with good elution properties. By a multi-valve switching system, the reagent excess is vented before entering the main analytical column. Using the alkaline flame ionization detector, carboxylic acids can be detected according to this technique in the low picogram range.

EINLEITUNG

Die Entwicklung elementspezifischer Detektoren fur die Gaschromatographie hat die selektive Erfassung extrem kleiner Substanzmengen etmtiglicht. Die Bedeu- tung, die diese Detektoren (z.B. der Alkaliflammenionisationsdetektor (AFID), der Elektronenanlagerungsdetektor (ECD) und der flammenphotometrische Detektor (FPD)) in der Erfassung von Pestizidriickstanden erlangt haben, ist bekannt.

Die ausserordentlich hohe Empfindlichkeit des AFID gegeniiber phosphor- haltigen gaschromatographischen Fraktionen legt die Maglichkeit nahe, verschiedene Stoffklassen iiber eine vorangehende Phosphor-Derivatisierung im Bereich kleinster Konzentrationen nachzuweisen.

Es sind daher phosphorhaltige Reagenzien erforderlich, die sich mit Alkoholen, Aminen, Carbonsauren usw. rasch und quantitativ ohne Nebenreaktionen umsetzen und Derivate mit giinstigen gaschromatographischen Eigenschaften ergeben. Der Umstand, dass viele Reaktionen in der organischen Phosphorchemie mit geringen Aus- beuten verlaufen bzw. thermisch unbesttindige Produkte ergeben, erschwert diese Aufgabe.

106 I’. SCHULZ, R. VPLCEANU

Nach einem von uns beschriebenen Verfahren werden Alkollolspuren mit den synthetisch leicht zugtinglichen 2-Chlor-1,3,2-dioxaphospholanen und den 2-Chlor- 1,3,2-dioxaphosphorinanen in gaschromatographisch gut erfassbare Derivate umge- setzt’.

Die Umwandlung von Oestron in den entsprechenden Dimethylphosphinsiiure- ester mittels Dimethylamino-dimethylphosphin zum gaschromatographischen Nach- weis von Oestronspuren wurde von Vogt et al. beschriebenz.

Nach Heenan und McCallum3 werden Phenole mit Phosphorigstiure-diester- chloriden derivatisiert. Die anfallenden phosphorhaltigen Spezies werden anschlies- send mit dem FPD erfasst.

Die guten gaschromatographischen Eigenschaften acylierter O,O’-Dialkyl-a- hydroxyphosphonstiureester (AHPE) (II) veranlassten eine Untersuchung der Ver- esterung gestittigter geradkettiger Fettstiuren mit a-Hydroxyphosphonstiureestern. (HPE) (I). Uber die Ergebnisse dieser Untersuchungen sol1 nun berichtet werden.

RIO \Ppo OH

RIO \PPO

R 0’ 2 ‘C’ R o/

2

\C/“\C/Rs

IX’ ‘R /\ II

(1) 3

4 R3 R4 0

w

lnfolge des ungiinstigen Elutionsverhaltens (Schweifbildung, Zersetzungen, usw.) erfordern Carbonsauren oft spezielle gaschromatographische Trennverfah- renJ*5. Freie Carbonstiuren werden an SpezialfGllungen getrennt?“. Zahlreiche Autoren haben Derivatbildungsverfahren beschrieben. Die dabei entstehenden Ab- kiimmlinge haben bessere Elutionseigenschaften (z.B. die Methylester8-10) bzw. niedrigere Nachweisgrenzen, (z.B. die Benzylester11*12 und die Triclllortiithylester13).

Aufgrund unserer Problemstellung mussten bei der Aufbereitung biologischer Proben anfallende freie Fettstiuren in nahezu quantitativer Reaktion in die ent- sprechenden AH PE umgewandelt werden. Veresterungsverfahren unter energischen Bedingungen schieden infolge mtiglicher Nebenreaktionen im Phosphonstiureesterrest von vornherein aus.

Die unter milden Bedingungen ablaufende Veresterung von Carbonstiuren mit Al koholen in Gegenwart von Dicyclohexyl-carbodiimid ( DCC)‘4-‘” ist von Felder et a/.” in der Gaschromatographie eingesetzt worden. Im Falle primtirer und sekun- dtirer Alkohole hat sich dieses Verfahren als vorteilhaft erwiesen, Ein Reaktions- mechanismus wurde von Smith et 01. vorgesclllagen18.

Auch im Falle primtirer und sekundtirer HPE ist eine rasche und vollstiindige Veresterung freier FettsSiuren unter DCC-Zusatz miiglich.

EXPERIMENTELLES

Folgende SGulen kamen zum Einsatz: (A) 1 m x 5 mm rostl’reier Stahl, 15%

CC ACYLIERTER u-HYDROXYPHOSPHONS~UREESTER 107

Apiezon L auf Chromosorb W (silanisiert). 60-80 mesh; (B) 1 m x 5 mm rostfreier Stahl, 10% Carbowax 20M auf Chromosorb W (silanisiert). 60-80 mesh; (C) 1 m x 5 mm rostfreier Stahl, 5 % Neopentylglykolsuccinat (NPGS) auf Chromosorb W (si- lanisiert), 60-80 mesh; (D) 0.5 m x 5 mm rostfreier Stahl, 7.5 “/, OV-7 auf Gas Chrom Q, 80-100 mesh; (E) 1 m x 5 mm rostfreier Stahl, 7.5 % OV-7 auf Gas-Chrom Q. 80-100 mesh. Alle Stiulenftillungen wurden im Vakuum-Rotationsverdampfer herge-

stellt. Der eingesetzte Gaschromatograph war ein Fractovap 2400 V von Carlo Erba

(Mailand, ltalien). Die verwendeten Detektoren waren: Der Flammenionisations- detektor (FID) und der “parallel flame thermionic detector “(PFTD) von Carlo Erba, ein kombinierter FID-AFlD. TrSigergas war in nllen Ffillen reiner Stickstoff. Das pneumatisch gesteuerte Membranventil Bimatic war ebenfalls von Carlo Erba.

Reagentieu Benz01 (iiber Natrium getrocknet), Pyridin und die FettsSiurestandurde (Essig-

stiure, PropionsHure, ButtersSiure, Valerianstiure, Capronstiure, t)nanthstiure und Caprylstiure) waren analysenrein. Dicyclohexyl-carbodiimid (,DCC> “zur Synthese” (Merck, Darmstadt, B.R.D.) wurde keiner weiteren Reinigung unterworfen.

Die HPE wurden nach bekannten Verfahren, durch Kondensation von Dialkyl- phosphiten (Dimethyl-, Ditithyl- und MethylSithylphosphit) mit Carbonylverbindun- gen (Formaldehyd, Acetaldehyd, Aceton und Methyltithyllceton) dargestellt19J0. Die HPE mit tertitirer Hydroxylgruppe wurden durch mehrfaches Umliisen aus Benzol. die prim&en und sekundtiren durch fraktionierte Vakuumdestillation gereinigt. Durch Umesterungen der Hydroxylgruppe der HPE im Destillierkolben bilden sich Poly- esterstrukturen, und der Destillationsriickstand erstarrt als glasartige Masse.Die Ausbeuten an reinen prim&en und sekundtiren HPE betragen daher nur etwa 30-

50%.

Optirniertes Derivotisienmgsve~fnllrerl Zur Derivatisierung win-den die folgenden Reagenzien verwendet. Reagens I :

TABELLE I

RETENTIONSINDIZES DER rr-HYDROXYPHOSPHONS#UREESTER (I)

Fltissigphase: Apiczon L (Sliulc A); Tcmpcratur: 140”. MC == Methyl: Et = Ethyl. .._..

RI

Me Et Et MC Et Et MC Et Et MC Et Et

_ _ R2

MC MO Et MC MO Et Me MC Et MC MC

B t

-.RA

H H H MC Me MC MC MC MC Et Et Et

R4

H I-l H H H H MC MC MC MC MC MC

I I52 I200 1097 1142 I I83 IO24 1076 II29 1146 II79 1225

108

TABELLE II

P. SCHULZ, R. VYLCEANU

RETENTlONSlNDlZES DER MIT cc-liYDROXYPHOSPH0NATEN VERESTERTEN ALI- PHATISCHEN CARBONSAUREN

Sliulcn A, B und C. Me = Methyl: Et = Athyl.

0 RA II I

R ,O-P-C-0-Acyl

RdH 2

Carhorrsarrm

tic Et Et Me Et Et MC Et Et Me Et Et Me Et Et Me Et Et Me Et Et MC Et Et Me Et Et MC Et Et Me Et Et Me Et Et MC Et El Me Et Et

Propions!iurc

Butterstiurc

Capronsiiure

C)nanths!iure

Caprylsiiure

RI

.._. -- __._. - ___-.__

MC H Me H Et H MC Me MC Me Et Me MC H MC H Et H MC Me MC Me Et Me MC H MC H Et H Me MC Me MC Et Me MC 1-l Me H Et H Me MC MC MC Et Me Me H MC H Et H MC MC MC MC Et Me MC 1-i Me H Et H MC Me MC MC Et MC MC H MC H Et H MC MC MC MC Et MC

.-.. _... _ ._ .__. _ Reterrtiorl.sitrtfizes ^._ .._... _ ___..__. Apiczorl L (It;(Y) Carbowaax 20M NPGS ( IG3O)

( Ison) ---.- --.-... . ..___. . . . -- ..^._... _._^-. ..^.._...--._..._ -..- ..__. __________.___ 1103 1153 1200 1100 1148 1195 1195 1243 1291 1190 1238 1285 1281 1327 1374 1277 I323 1364 1377 1412 1460 1367 1410 1455 1463 1500 1557 1456 1499 1545 1556 1592 1642 1544 1584 1630 1647 1686 1732 1632 1673 1714

_ .__--.-

1680 1982 1695 2000 1713 2018 1624 1916 1645 1935 1670 1955 1730 2023 1747 2046 1768 2065 I675 1960 1698 1985 1721 2002 1793 2090 1815 2113 1838 2134 1745 2025 1768 2048 1790 2063 1877 2166 1896 2185 1920 2207 1830 2102 1851 2126 1872 2148 1968 2246 1986 2265 2014 2295 1915 2185 1940 2208 1965 2226 ._. - __ - -

- -

-

GC ACYLIERTER u-WYDROXYPHOSPWONS~UREESTER 109

reiner HPE (I; R, = Rz = CH3, R3 = R4 = H). Reagcns 2: 25.0 g DCC und 12.5 g Pyridin werden in einen loo-ml Messkolben eingetragen und trockenes Benzol bis 100 ml nachgeftillt; unter Schiitteln wird das DCC geliist.

In ein l-ml SchliffriShrchen werden zuerst 100,~l BenzolliSsung mit FettsSiure- spuren eindosiert, darauf 150 ,wl Reagens 2 und 50 ,ul Reagens 1. Die Reaktionsmasse wird kriiftig durchgeschtittelt. Nach einsttindigem Lagern bei 50” ist die Reaktion praktisch beendet, und die L&sung kann nach Abkiihlung auf Zimmertemperatur in- jiziert werden.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die gaschromatographische Erfassung der AHPE im Spurenbereich, in Gegen- wart tiberschtissiger HPE setzt einen gentigenden Elutionsabstand der Spurenkom- ponenten vom Reagenstiberschusspeak voraus. Ein Vergleich dcr entsprechenden Retentionsindizes (Tabellen I und II) zeigt, dass die mit Essigsaure und Propionsnure acylierten HPE den sich in diesem Falle in der Praxis als notwcndig erwcisenden Elutionsabstand von mindestens 150 Retentionsindexeinheiten unterschreiten. Die Derivate der Buttersaure kiinnen hingegen im allgemeinen schon gut erfasst werden. Die h6heren Homologen eignen sich in steigendem Masse ftir eine genaue spuren- analytische Erfassungl

Die synthetisierten HPE lassen sich an allen eingesetzten Saulen nur unter teil- weiser Zersetzung eluieren. Eine Bestimmung von Retentionsindizes an Saule A war

1300

2200

Z/O0

2000

1900

INPGS

IAPIEZON

Fig. 1. Zusammenhang zwischen den Rctcntionsindizes dcr AHPE an Apiezon L (Siiulc A, IGO”) und NPGS (Sliulc C. 163”). -, Rs z H: --.---, RJ z.zz Cl-I,; 0, R, = R2 = CHJ; 0, R, -== CHa und R2 = C2Hs; A, ,R, 3 Rz = C2Ha,

110 I’. SCHULZ, R. Vi’LCEANU

nur nach vorangehender lnaktivierung mit Hexamethyl-disilazan miiglich (Tabelle I). Im Gegensatz dazu verftigen die AHPE (Tabelle 11) iiber gute Elutionseigenschaften. Fig. 1 zeigt die Retentionszusammenhtinge der dargestellten sechs homologen Ester- reihen an zwei FlLissigphasen verschiedener Polaritiit (‘Stiulen A und C).

Zur Optimierung des Deri~&&ierungsverfahrens war eine Wall1 des als Deri- vatisierungsreagens vorteilhaftesten HPE erforderlich. Unsymmetrische HPE (Ta- belle I, Methyl-iithylderivate) schieden a priori infolge der Schwierigkeit, sie in reinem Zustand, d.h. frei van symmetrischen Estern darzustellen, aus. Die Dimethyl- und die Diiithylester (I) eignen sich hingegen gleich gut. Hiihere symmetrisclle Ester sind wegen stark erhiihter Retention nur bedingt zu cmpfehlen. Fiir unsere weiteren Unter- suchungen haben wir die Dimethylester eingesetzt (I; R1 =I Rz = CHJ).

fO0

80

20 60 80 ?UO

Fig. 2, Veresterung primiirer und sekundhx HPE mit Buttcrsiiurc bci SO”. I ml 0.5% ButtcrsBurc- lijsung in Benzol wird mit 1.5 ml Rcagcns 2 und 0.5 ml rcinem HPE umgcsetzt. O-0, RI - R2 = H: O--O, RI I= H und Rz I- Cl&.

Fig. 2 zeigt die Veresterung des primtiren H PE (Dimethylester) im Vergleich zum sekundiiren. Die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt vom primiiren zum sekundilren HPE weitgehend ab. Tertiiire HPE werden unter den von uns gewiihlten Bedingungen praktisch nicht verestert. Als Derivatisierungsreagens I haben wir daller weiterhin nur den Dimethylester mit primiirer Hydroxylgruppe (I; R1 = Rz = CH3. RJ = R., = H) verwendet.

Die Beschleunigung der Verestcrungen in Gegenwart von DCC durch Pyridin ist bekannt”. In unserem Falle war die optimale H6he des Pyridinzusatzes zu bestim- men. Fig. 3 zeigt den Reaktionsablauf ohne Pyridin, bzw. unter dem Einfluss steigen- der Pyridinmengen. Die langsame Veresterung ohne Pyridinkatalysator wird schon durch geringe Zusiitze Pyridin auffallend beschleunigt. Wesentliche Erhiihungen der Katalysatotmenge fiihren ZLI Iceiner verhtiltnismBssigen Verkiirzung der Reaktions- dauer. Ein Pyridinzusatz von 12.5 g zu Reagens 2 elwies sich als kinetisch nocll vor- teilhaft.

GC ACYLIERTER rt-HYDROXYPI-IOSPWONSkiUREESTER 111

20 40 60 80 0

Fig. 3. Dcr Einfluss dcs Pyridinzusatzcs auf die Dcrivatisicrung von Buttcrstiurc bci 50” untcr Stan- dardbcdingungcn mit I: R, F-= Rz =z= CHJ. RJ =-= R., ;:. H. Rcagens 2 cnthlilt ausscr DCC: O-0, kcin Pyridin: 0 -0. 5.0 g Pyridin pro 100 ml : A--& 12.5 g Pyridin pro 100 ml; Cl--n, 25.0 g Pyridin pro 100ml.

Den Temperatureinfluss auf die Derivatisierungsgeschwindigkeit veranschau- licht Fig. 4. Sol1 die Umsetzung in weniger als einer Stunde crfolgen, ist fiir die Llnter- suchte Carbons&urereihe eine Reaktionstemperatur von 50” erforderlich.

Fiir die kinetischen Untersucllungen warden in einem thermostatisierten 5-ml Mantelgefsss mit Magnetriihrung 1 ml CarbonsZurestandard (0.5 ‘x, Buttersiiure in

20 40 60 80

Fig. 4. Einfluss dcr Tcmpcratur auf die Dcrivatisicrung von Buttcrsiiurc mit I: RI = Rz = CHJ, RJ .= RJ :L= I-I. Dcrivatisicrungstcmpcratur: A-& 50”.

untcr Standardbcdingungcn O-0, 25”; (j-0. 37.5”:

I’. SCHULZ, R. VPLCEANU

10 40 60 80 100

Fig. 5. Einlluss dcs Alkylrestcs auf die Dcrivatisierung dcr linearcn aliphatischcn Carbonsiiurcn bci SO”. untcr Standardbcclingungcn mit 1; R, = R2 = Cl-Is, Rz = Rq == H. 0-O. Buttcrsiiure; O-0, Capronstiurc: A-& CaprylsUurc.

Benzol) mit 1.5 ml Rcagens 2 und 0.5 ml Reagens 1 umgcsetzt. Das intensiv geriihrtc Reaktionsgemisch wurde in Zeitabsttinden von 5-10 Min gaschromatographisch analysiert. unter Einsatz des FlDs und an Stiule A.

Die vergleichende Veresterung von Butter-, Capron- und Caprylsiiure unter Standardbedingungen (Fig. 5) zeigt eine relativ geringe Abnahme der Reaktionsge- schwindigkcit mit wachsendem Alkylrest. lnnerhalb einer Derivatisierungsdauer von 60 Min ist bei 50” such die CaprylsSiure vollst5indig verestert.

Fig. G zeigt die Erfassung einiger Carbonsiiuren der untersuchten Reihe. Die durchschnittliche Menge pro lnjektion betrug 2 ng. Der Nullinienverlauf nach dem Reagensiiberschusspeak gestattet noch eine befriedigende quantitative Auswertung.

I40

2 .3 4 5 6 7 8 9 P

Fig. G. Erfassung dcr Carbonsiiurcspurcn als AHPE. Die Dcrivatisicrung erfolgtc nach dcm Stan- dardvcrfahrcn bei 50” mit I; Rx - Rz = CHJ. Rj - R., -- H. Die injizierten Dcrivatmcngcn ent- sprcchen ca. 1 ng Buttersiiurc (I), Valcriansiiurc (2), Capronstiurc (3) bzw. Caprylsiiure (4). Tcmpcra- turprogrammicrre Trcnnung an Siiulc E. Triigcrgas: Stickstoff, 85 ml/min. Detektor: KCI-PFTD, Wasserstbff 65 ml/min, Luft 440 ml/min. Temperaturvcrlauf cingczcichnct: Injektion und Dctcktion bei 200”.

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I T

Fig. 7. Nullinicnvcrlauf bci der Erfassung von CarbonsHurcspuren ats AHPE, Die injizicrtcn Dcrivat- mcngcn cntsprcchcn cn. IO pg Buttcrsiiurc (l), Valcriansiiurc (2) bzw. Capronsiiurc (3). Siiulc E. 170”: lnjcktion und Dctcktion bei 200”; Triigcrgas und Dctcktor wit Fig. 6.

Im Picogrammbereich (Fig. 7) ist wegen der steil abfallenden .Nullinie eine genaue Erfassung nicht mehr gcw!ihrleistet. Urn die Kontamination des AFlD mit phosphor- haltigen Komponenten zu vermeiden, muss der Reagensiiberschuss noch vor dem Eintritt in die Trennstiule weitestgcbend abgebaut werden. Eine selektive Absorption des HPE in einer mit Borsiiure impr2gnierten VorsMe gelang nur unvollkommen und fi,i!lrte zu keiner wesentlichen Vcrbesserung des Nullinienverlnufs.

* Durch Vorschnltung einer z.B. diJnnschichtchromat.ographischen Trennstufe zur Abtrennung des Reagensiiberschusses ist ein stabiler, stijrungsfreier Betrieb des AFID gewtihrleistet”. Unsere Untersuchungen haben gezeigt. dnss eine prelimin5ire weitestgehende Ausschaltung des HPE-tiberschusses auf gaschromatogrnpl~iscl~em

INJEUTOR t

. . .

Fig. 8. Schcmatischc Darstcllung dcr Zweisiiulcnanordnllng zur Abtrennung dcs Elutionsvorlaufs. Ct. Vorsiiulc: Cz. Hauptsiiule: RI und Rz. Nacielvcntile. Zur Vcrmcidung von Druckschwanlcungcn bcim Umschaltcn dcr Anordnung werflen RI und Rz so cingestellt, dass ihrc pncumatischen Wider- stiinde genau dcnen VOII C, bzw. Cz entsprechen,

I’. SCHULZ, R. ViLCEANU

3 4

Fig. 9. Erfassung von Carbonsiiurcspurcn als AHPE untcr Einsatz dcr Zwcisiiulcnanordnung. Die injizicrtcn Dcrivatmcngcn cntsprechcn cu. 10 pg Buttcrsiiiurc (I ). Valcriansiiurc (2), bzw. Capronstturc (3). Vorsliulc: Siiulc D: Hauptsiiulc: Sliulc E. Temperatur: 180”; lnjektion und Detektion bci 200”. Triigergns: Stickstoff, 85 ml/mine Dctcktor wit Fig. G. Die Umschaltung crfolgte SO see nach der Injcktion.

Wege, mitt& eines pneumatisch gesteuerten Zweisiiulensystcms mijglich ist. Im Ver- gleich zur diinnschichtchromatographischen Mcthode ist dieses Verfahren einfacher und mit keinen Substanzverlusten verbunden.

Das von uns eingesetzte Zweistiulensystem ermiiglicht eine prelimidire Tren- nung des Derivatisicrungsgemisches an einer Vorstiule (Fig. 8). Der Elutionsvorlauf, dh. der LiSsungsmittelpeak und der HPE-Peak treten unmittelbar nach der VorsUule aus, wtihrend durch die Hauptstiule reines TrBgergas flies& Durch Umschaltung des Membranventils wird der gewiinschte Retentionsbereich der VorsCiule selektiv der Hauptstiule zugeftihrt. Die darin enthaltencn Spurenderivate werden anschliessend mit dem AFID erfasst. Belastungen des AFID durch grosse L&ungsmittelvolumina bzw. durch HPE-tiberschiisse entfallen. und der Nullinienverlauf gestattet analytische Bestimmungen im Picogrammbereich.

Fig. 9 zeigt ein mit der Zweis~iulenanordnung crhaltenes Chromatogramm. Die injizierten Derivatmengen entsprechen durchschnittlich 10 pg Butter-, Valerian-, bzw. Capronstiure.

ZUSAMMENFASSUNG

Acylierte n-Hydroxyphosphonstiurcester stellen eine Substanzklasse dar, die sich infolge guter gaschrornatographischer Elutionseigenschaften zum spurenanalyti- schen Nachweis mit dem Alkaliflammenionisationsdetektor (AFID) eignet. Es wird ein kinetisch optimiertes Verfahren vorgeschlagen, ;iliphatische Carbonsiiuren mit diesen Reagenzien zu derivatisieren. Durch den Einsatz einer pneumatisch gcsteuerten Zwci- stiulenanordnung gelingt die Abtrennung des Reagensiiberschusses und somit ein stabiler, stijrungsfreier Betrieb des AFID.

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