Gasna kromatografija (GC)

Osnove metodeRazvija se koncem etrdesetih i poetkom pedesetih godina XX vijeka.Tekua mobilna faza se zamjenjuje gasom, to znai da uzorak mora biti u gasnoj fazi (vrsti i tekui uzorci se prije analize moraju ispariti).Ova injenica predstavlja i najvee ogranienje metode kojom se veoma teko analiziraju termolabilne, polarne i nehlapive supstance.Sama separaciona metoda je veoma efikasna, za neke spojeve je osjetljivost reda pikograma i moe se automatizirati.

Vrste GCStacionarna faza moe biti vrsta, pa se govori o gasno-vrstoj ili adsorptivnoj kromatografiji (GSC).Stacionarna faza moe biti tekua, fiziki nanesena na vrsti nosa ili kovalentno vezana za nosa, pa se govori o gasno-tenoj ili podionoj kromatografiji (GLC).

Komponente ureajaGasni kromatograf se sastoji od:Sistema za kontrolu mobilne faze (gasa nosaa).Sistema za unoenje uzoraka.Kolone koja je smjetena u termostatiranom prostoru (penici).Detektorskog sistemaSistema za registraciju i obradu signala s detektora

Mobilna faza i sistem za kontrolu mobilne fazeKao mobilna faza se koriste inertni gasovi (helij, vodik i nitrogen).Gasovi se nalaze u elinim bocama ili se dobivaju na licu mjesta u generatorima.Gasovi moraju biti isti bez primjesa kisika, vodene pare ili tragova ugljikovodika.Priroda gasa nosaa nema vei utjecaj na podioni koeficijent K, jer gas ne stupa u interakciju sa stacionarnom fazom.Viskoznost i brzina protoka mobilne faze imaju znaajan utjecaj na efikasnost separacije.

Hidrogen je gas nosa prvog izbora. Iz sigurnosnih razloga, moe se zamijeniti helijem.Nitrogen se najvie koristi zbog niske cijene i prihvatljive efikasnosti.Postoje detektori koji zahtijevaju odreene vrste gasa nosaa: za detektor toplotne vodljivosti najpogodniji je helij, za elektron-apsorbirajui detektor najpogodnija je smjesa 5% metana u argonu.S promjenom temperature mijenja se i brzina protoka. Instrumenti mogu raditi uz konstantan ulazni pritisak (tada se mijenja protok tokom analize) ili konstantan protok gasa nosaa (tada se elektronski regulira pritisak na ulazu u kolonu).

Sistem za unoenje uzorkaNajee se koriste tekui uzorci (rastvori) koji se unose mikropricom.Tipini volumeni injiciranja su 0,5-10 ml, ovisno o vrsti kolone.Gasoviti uzorci se unose posebnim sistemom ventila.Specijalni naini unoenja uzoraka koji kombiniraju i ekstrakciju:Head-space tehnikaSolid-phase micoextraction

Vrste pricaMikrolitarska prica koja mjeri u tijelu.Mikrolitarska prica koja mjeri u igli.Automatski ureaji za injiciranje (autosampleri).

InjektoriUloga injektora je da ispari komponente uzorka, da ih pomijea sa mobilnom fazom (gasom) i da ih dovede do kolone.Vrsta injektora ovisi o vrsti kolone koja se koristi i brzini protoka mobilne faze kroz kolonu, te o vrsti analize.Za punjene kolone i kapilarne kolone promjera 0,53 mm se koriste injektori sa direktnim isparavanjem.

Injektor sa direktnim isparavanjemKoristi se ako je protok gasa nosaa 10 ml/min i vei.Sastoji se od grijane metalne cijevi u kojoj je staklena cijev.Mikrolitarskom pricom se kroz gumenu ploicu (septum) vri injiciranje uzorka.Drugi kraj injektora je takoer zagrijan i povezan s kolonom.

Split/splitless injektorKoristi se za kapilarne kolone kod kojih je protok mobilne faze oko 1 ml/min.U split modu injektor ima ulogu da pocijepa injiciranu zapreminu uzorka i samo manji dio unese u kolonu.Odnos cijepanja se izraunava na osnovu protoka gasa nosaa kroz ventil 2 i protoka kroz kolonu: Odnos cijepanja = (protok kroz ventil 2 + protok kroz kolonu)/protok kroz kolonu.Ventil 1 ima ulogu da isti septum i imasasvim mali protok, do 1 ml/min.

Splitless tehnika injiciranjaKoristi se isti injektor, ali bez cijepanja uzorka.Na ovaj nain se injiciraju veoma razblaeni uzorci.Manje zapremine uzoraka se sporo injiciraju u injektor, dok su ventili 1 i 2 zatvoreni, obino 30-60 sekundi.Komponente uzorka se isparavaju i koncentriraju na poetku kolone koja je na nioj temperaturi od injektora.Nakon 60 sekundi ventili se otvaraju, viak otapala izbaci iz injektora i istovremeno se pokrene temperaturni program. Ova tehnika injiciranja dovodi do jake diskriminacije supstanci razliite isparljivosti i moe biti uzrok greke u kvantitativnoj analizi metodom eksternog standarda.

Hladno injiciranje na kolonuUzorak se specijalnom mikropricom unosi direktno u kapilarnu kolonu koja je ohlaena na 40 oC.Igla ovakve price ima promjer 0,15 mm a tehnika zahtjeva puno vjebe.Koristi se za injiciranje termolabilnih spojeva ili spojeva veoma visoke take kljuanja.Danas se provodi primjenom autosamplera.

Temperaturno programirani injektorSutinski je slian split/splitless injektoru, jedino se moe programirano zagrijavati na temperaturu od 20-300 oC u intervalu od nekoliko desetaka sekundi (omoguava temperaturni gradijent).Omoguava injiciranje veih volumena uzorka, ime se poboljava osjetljivost.Omoguava uklanjanje supstanci niske take kljuanja (otapala).Moe raditi u tri razliita naina.

Split hladno injiciranjeUzorak se unosi u hladan injektor i ventili se odmah otvaraju, a injektor se poinje zagrijavati.Poto uzorak nije odmah isparen, komponente uzorka ulaze u kolonu redoslijedom ovisnim o njihovoj taki kljuanja.Splitless hladno injiciranjeKoristi se za analizu tragova.Za vrijeme injiciranja ventil je zatvoren, a onda se injektor zagrijava i unosi komponente uzorka na kolonu koja je hladna.

Injiciranje uz eliminaciju otapalaUzorak se unosi u hladan injektor, nakon ega se ventili otvaraju.Protok kroz ventile je jako velik (1000 ml/ min) kako bi se iz injektora uklonilo otapalo.Nakon toga se injektor zagrije kako bi se manje volatilne komponente prebacile u kolonu. Za to vrijeme su ventili zatvoreni (splitless mod).Na ovaj nain se moe injicirati do 50 ml uzorka jednokratno, odnosno do 500 ml u nekoliko uzastopnih injiciranja prije pokretanja analize.

Statika headspace ekstrakcija

Utjecaj matriksa je presudan na efikasnost i preciznost ekstrakcijeZa kvalitativnu analizu uzorak se stavi u boicu i analizira bez prethodne pripreme.Za kvantitativnu analizu vrsti uzorak se usitni ili otopi/suspendira.Bolji rezultati se postiu rastvaranjem

Optimalizacija headspace ekstrakcijeNa osjetljivost analize utjeu podioni koeficijent K i odnos faza b.Na podioni koeficijent presudno utjee temperatura.Na efikasnost ekstrakcije supstance sa visokim podionim koeficijentom vei je utjecaj temperature nego odnosa faza.Ako se supstanca loe otapa u matriksu, presudan je odnos faza.

Utjecaj temperature na efikasnost ekstrakcijeEtanol Metil,etil ketonToluenn-heksanTetrakloro etilen

Utjecaj topivosti u matriksu1. cikloheksan; 2. 1,4-dioksan I 1 ml uzorka boici od 22,3 ml; II 5 ml uzorka u istoj boici; III dodatak 2 g NaCl u boicu sa 5 ml uzorka

Termostatirani prostor kolone (penica)Penica se moe termostatirati na temperaturu do 400 oC, uz tanost od 0,1 oC.Instalacijom kriogenog sistema sa tekuim nitrogenom ili ugljen dioksidom, penica se moe kontrolirano hladiti do -40 oC.Programirano dranje penice na odreenoj temperaturi i gradijentno zagrijavanje zove se temperaturni program.Temperaturni program omoguava efikasno odvajanje komponenti smjese koje se znaajno razlikuju po hlapivosti, molekulskoj masi ili polarnosti.

KolonePostoje dva osnovna tipa:Punjene koloneKapilarne kolone

Punjene koloneTo su staklene ili eline cijevi duine 1-3 m, promjera 1/8 ili ina (3,18 ili 6,35 mm).Tipian protok gasa nosaa kroz ove kolone je 10-40 ml/min.Mogu biti punjene inertnim nosaem koji je impregniran tekuom stacionarnom fazom ili na koji je tekua stacionarna faza kovalentno vezana (GLC).Mogu biti punjene vrstom stacionarnom fazom koja ima ulogu adsorbensa (GSC).

estice punila u GLC su obino sferne promjera oko 0,2 mm ili 80-100 mesh (veliina se izraava u mesh-ima: broj otvora po kvadratnom inu). vrsti sorbens je obino diatomejska zemlja izaprana kiselinama, bazama ili silinizirana kako bi se smanjio broj polarnih mjesta na povrini estice.Komercijalne oznake su Chromosorb W, Chromosorb W-HP, Chromosorb W-AW, Chromosorb G, Chromosorb P....Spherosil je sintetski inertni nosa kojeg ine estice silicij oksida.Koliina tekue faze kojom se moe impregnirati nosa je 3-20%.

Kapilarne koloneIzraene su od staljenog silicij oksida koji nastaje sagorijevanjem SiCl4 u atmosferi bogatoj kisikom.Unutranji promjer kolone moe biti 100-530 mm, a duina 12-100 m.Unutranjost kolone je prevuena poliamidom koji joj daje elastinost.a) Punjena kolona 1/8; b) kapilarna kolona 0,53 mm; c) kapilarna kolona 0,25 mm

Stacionarna faza moe biti kovalentno vezana za unutranji zid kolone (wall coated open tubular WCOT) ili na unutranji zid moe biti nanesen sloj sorbensa (porous layer open tubular PLOT).Kapilarne kolone promjera 0,53 mm se jo zovu Widebore, Megabore ili Maxcrobore kolone.Predstavljaju prijelaz izmeu punjenih i kapilarnih kolona, imaju duinu 5-50 mm i tipian protok mobilne faze 5 ml/m.Ove kolone mogu primiti vee volumene uzorka to poveava osjetljivost analize i imaju puno veu efikasnost od punjenih kolona.

Vrste stacionarne fazeDanas se koriste dva osnovna tipa faza:PolisiloksaniPolietilen glikoliSvaka faza ima minimalnu i maksmalnu preporuenu rednu temperaturuPostoje faze specijalno dizajnirane za pojedine klase spojeva

Faze tipa polisiloksanaZovu se jo silikonska ulja ili silikonske gume.Sastoje se od dva ugljikovodikova lanca vezana za jedan silicij.Danas postoji oko 20 razliitih vrsta lanaca (metil, fenil, cijanopropil, trifluoropropil..)Imaju veliku stabilnost i irok temperaturni opseg.Skvalan je referentna faza jer se jedino za njega zna potpuno taan sastav (C30H62). Skvalan je faza dobivena iz skvalena, prirodnog terpenoida.

Polietilen glikoliTo su polarni polimeri poznati pod nazivom Carbowax, molekulske mase od 1500 do 20000 (Carbowax 20M).Temperaturni opseg im je manji nego kod polisiloksana (40-240/260 oC).

vrste stacionarne fazeIzvedene su iz razliitih sorbensa: silika gela, aluminij oksida, molekulskih sita, sintetskih polimera, poroznog stakla, grafita, ai...Komercijalni preparati su Chromosorb 100-800, Porapak...Koriste se kao PLOT kolone a namijenjeni su odvajanju anorganskih gasova i malih lakohlapivih molekula.

Odnos fazaDa bi se predvidjelo ili usporedilo ponaanje kapilarnih kolona, esto je potrebno izraunati odnos faza (stacionarne i mobilne faze):b = VM/VSAko je dc unutranji promjer kolone, a df debljina filma stacionarne faze, onda je:b = VM/VS = dc/4df Ako su komponente uzorka volatilne, treba birati kolone sa malim odnosom faza i obrnuto.

Detektori Detektori mogu biti univerzalni i selektivniMogu biti destruktivni i nedestruktivniMogu davati samo informaciju o vremenu zadravanja i povrini ispod signala, ili mogu davati strukturne informacije o molekuli.

Detektor toplotne vodljivosti (TCD)To je univerzalni, nedestruktivni detektor koji se poeo koristiti meu prvima.Osjetljivost mu je umjerena (do 400 pg/ml) uz linearnost od 6 redova veliine.Rad mu se zasniva na mjerenju toplotne vodljivosti smjese gasova u ovisnosti o njenom sastavu.

Plamenojonizacijski detektor (FID)Univerzalan je za organske supstance i najee se koristi u GC.Eluat sa kolone ulazi u mali plamenik u kojem gori smjesa H2 i zraka.Sagorijevanjem organske supstance daju jone koji proizvode veoma slabu struju (10-12A) izmeu elektroda detektora.Povrina ispod signala je proporcionalna broju C atoma u jedinici vremena (dm/dt).Osjetljivost je 2-3 pg/s a linearni dinamiki opseg 108.

Nitrogen fosfor detektor (NPD)Zove se jo i termojonski detektor. Slian je FID-u, samo je plamen manjeg intenziteta.U plamenu spojevi sa N i P specifino daju anione.Iznad plamenika je mala keramika perlica koja sadri rubidij sulfat i zagrijana je na 800 oC.Pri ovim uvjetima se emitiraju elektroni koje selektivno hvataju joni nastali sagorijevanjem molekula sa N i P.Osjetljivost detektora je 0,1-0,4 pg/s a linearnost 5 redova veliine.

Elektron apsorbirajui detektor (ECD)Ovo je detektor izbora za analizu tragova spojeva sa halogenima i nitro grupom.Ima izvor b zraenja (63Ni) koji jonizira gas nosa.Jonizirani nosa prolazi izmeu elektroda i odrava ravnotenu struju I0.Kada se u detektoru nae molekula sa afinitetom prema elektronima, ona hvata elektrone i tada nastaju manje pokretni joni od jona N2, te intenzitet struje I0 opada.Izmjereni intenzitet struje opada eksponencijalnoI=I0e-kc.

Fotojonizacijski detektor (PID)Detektor je selektivan za ugljikovodike i spojeve sa S i P.Jonizacija molekula iz uzorka se provodi UV zraenjem pri emu energija fotona moe biti od 8,4 eV do 11,8 eV.Energija fotona se odreuje izborom filtera (LiF 11,8 eV; MgF2 9,6-10 eV; safir 8,4 eV).Elektrone koje UV zraenje izbije iz molekule pokupi anoda, a nastale anione katoda.

Plamenofotometrijski detektor (FPD)Ovo je selektivni detektor za spojeve sa S i P koji se koristi kemiluminiscentnom reakcijom u plamenu.Za spojeve sa sumporom svjetlost emitira S2 na 394 nm, a za fosfor HPO nastaje dublet na 510 i 526 nm.

Indeksi zadravanjaSlue za identifikaciju supstanci u sloenim smjesama kad na raspolaganju nisu standardi.Slue za usporeivanje i klasifikaciju stacionarnih faza.

Kovats indeksPri izotermalnom radu logaritam reduciranog vremena zadravanja n-alkana je proporcionalan broju C atoma u njihovoj molekuli.log tR(n) = an+b

Kovats indeks se definira kao broj C atoma u hipotetskoj molekuli n-alkana koji ima isto reducirano vrijeme zadravanja kao i ishodna supstanca, pomnoen sa 100.Taj broj C atoma nipoto nije cijeli broj i dobiva se raunski, ekstrapolacijom vremena zadravanja n-alkana koji eluiraju prije i poslije ispitivane supstance.

McReynoldsova konstanta ili McReynoldsov brojSlui za karakterizaciju polarnosti stacionarne faze.Predstavlja zbir razlika Kovats indeksa pet standardnih supstanci na ispitivanoj fazi i standardnoj stacionarnoj fazi (skvalanu).Standardne supstance predstavljaju klase pojedinih organskih spojeva: benzen, i-butanol; 2-pentanon, nitropropan i piridin.

to je McReynoldsov broj vei, faza je polarnija.

***********************************************************