gen mutasyonu ve dna onarimikisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/moleküler biyoloji/6-gen... ·...

GEN MUTASYONU ve DNA ONARIMI

1

1. Gen mutasyonlarının sınıflandırılması1. Mutasyonun nasıl oluştuğuna göre2. Mutasyonun yerine göre3. Moleküler değişimin tipine göre4. Fenotipteki etkisine göre

2. Kendiliğinden oluşan mutasyonlar sebepleri3. Tetiklenmiş mutasyonların sebepleri4. Mutasyon tanısı5. Mutasyonların araştırmalarda kullanımı6. DNA onarımı

Konular

1. Mutasyonların sınıflandırılması

3

• Mutasyon, DNA dizisindeki değişiklik olaraktanımlanabilir.

• Mutasyon:

• Tek bir baz çifti değişiminden,

• Bir silinme ya da

• Bir veya daha fazla baz çiftinineklenmesinden oluşabilir.

4

• Mutasyonlar fenotipte değişikliğe yol açabilir ya da açmayabilir.

• Organizmanın karakteristiklerini değiştirme derecesi, mutasyonun nerde olduğuna ve mutasyonun geni ne denli

değiştirdiğinin derecesine bağlıdır.

• Mutasyonlar somatik hücrelerde ya da eşey hücrelerinde

olabilir.

• Eşey hücrelerinde olanlar kalıtılır ve bu sebeple,

genetik çeşitlilik ve evrimin de temelini oluşturur.

1. Mutasyonların sınıflandırılması

1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar

5

• Mutasyonlar, kendiliğinden ya da tetiklenmiş olarak

sınıflandırılabilir

1) Kendiliğinden mutasyon genlerin nükleotid dizilerindeki

rastgele değişikliktir.

• Bu duruma herhangi bir dış etken sebep olmaz

• Hücre içi biyolojik ve kimyasal tepkimeler sonucu oluşur

• Genellikle DNA eşlenmesi (replikasyonu) sırasında oluşan hatalardır.

• Mutasyon hızı: Bir nesilde veya gamet oluşumunda bir

mutasyonun oluşma olasılığı

• Kendiliğinden oluşan mutasyonlarda mutasyon hızı için 3

genelleme:

1. Tüm canllarda mutasyon hızı oldukça yavaştır

2. Türler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir

3. Aynı organizmada genler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir

• Organizmalar arasındaki değişkenlik, onların hata okuma ve

onarım sistemlerinin göreceli etkinliklerinden dolayı oluşabilir.


Farklı organizmalar ve bunların farklı genlerinde mutasyon hızları

Hız

Hızlar faj için bir gen eşlenmesiE.coli için bir hücre bölünmesiDiğer canlılar için bir nesilde gamet oluşumu olarak verilmiştir1X10-8 = 100 milyon eşlenmede 1 mutasyon

8

2) Tetiklenmiş mutasyon, herhangi bir dış faktörün etkisi sonucu oluşan mutasyonlardır.

• Doğal ya da yapay ajanlar sonucu oluşabilir.

• Ör: UV ışınlar, kimyasallar

• Mutasyonların yapay olarak tetiklendiklerine dair örnekler:

• Hermann J. Muller, X ışınlarının Drosophila’damutasyona yol açtığını rapor etmiştir.

• Lewis J. Stadler, X ışınlarının arpa üzerinde aynı etkiyi yaptığını belirlemiştir.


9

Luria-Delbrück düzensiz değişim testi

• Mutasyonlar rastgele mi oluşur yoksa çevresel etkenler

sonucu uyum amacıyla mı oluşur?

• Salvador Luria ve Max Delbrück, mutasyonların rastgele

olarak oluştuğuna dair ilk doğrudan kanıtı sundular.

• deneylerini E. coli / T1 sistemi ile gerçekleştirdiler.

• T1 bakteriyofajı E. coli hücrelerin enfekte eden ve onları parçalayan bir bakteri virüsüdür.


10

• E. coli’nin bir büyük bir de çok sayıda küçük sıvı kültürünü

oluşturdular.

• Büyük kaptaki hücreler yüksek yoğunluğa ulaşana

kadar büyütüldü

• Küçük tüplerde 20 milyon hücre olduğunda bunları T1

bakteriyofajı içeren petri kabına ektiler.

• Büyük kaptaki bakteriler de 20 milyonluk hücreler

halinde aynı şekilde ekildi.


11

• Bakteriyofaj varlığında büyüyebilen bakteriler

bu faja dirençli bakteriler olacaktı

• Büyüyen koloniler sayıldı

• Mutasyonların rastgele olup olmadığı iki

hipotez altında test edildi


12

Hipotez 1 – Canlının uyumunu artıran mutasyon ise:

• Her petri kutusunda sabit sayıda bakteri ve faj bulunur.

• Eğer mutasyonlar ortamda faj bulunduğu için oluşuyorsa

her bakterinin direnç oluşturma olasılığı sabit bir değer

olmalıdır

• Dolayısıyla dirençli bakteri sayısında, petri kabından petri

kabına ve deneyden deneye çok az oynama olur.


13

Hipotez 2 – Rastgele mutasyon ise:

• Eğer mutasyonlar fajın varlığından bağımsız, rastgele olarak meydana geliyorsa bakterinin büyümesi sırasında herhangi bir

anda oluşmuş olabilirler

• Mutasyonlar büyümenin geç döneminde oluştuklarında, çok daha az sayıda dirençli hücre üreyecektir.

• Mutasyonlar büyümenin erken döneminde oluştuysa çok

sayıda dirençli koloni üreyecektir

• Bu durumda kaptan kaba ve deneyden deneye koloni sayıları

değişkenlik gösterecektir.


• Deney sonucunda 2. hipotezi doğrular şekilde kaplardaki

koloni sayıları arasında büyük farklar görülmüştür.

• Tüpten tüpe farklı zamanlarda rastgele mutasyon oluştuğunu

gösterir

• Büyük kapta büyütülen bakteriler kontrol grubunu

oluşturmuştur.

• Bu kaptaki hücreler sürekli karıştırılmış ve bakterilerin eşit

dağılması sağlanmıştır

• Dolayısıyla aynı kaptan alınarak farklı petri kaplarında faj

üzerinde büyütülen bakterilerin birbirine benzer özellikleri

göstermesi beklenir

T1’e dirneçli baktreilerin sayısıÖrnek no. Aynı kültür (Kontrol) Farklı kültürler

OrtalamaDeğişim

1.2 Mutasyonun yerine göre

17

• Mutasyonlar oluştukları hücre tipi ya da kromozom bölgelerine göre sınıflandırılabilirler.

• Somatik mutasyonlar; eşey hücreleri dışında herhangi bir hücrede olabilirler.

• Eşey hücre mutasyonları, gametlerde oluşur.

• Otozomal mutasyonlar, otozom kromozomlar

üzerinde yer alan genlerde oluşur.

• X veya Y’ye bağlı mutasyonlar

18

Somatik hücrelerdeki mutasyonlar gelecek nesillere

aktarılamaz.

• Diploid bir organizmanın somatik bir hücresinde bir

otozomal çekinik mutasyon oluştuğunda bu mutasyonlaryabanıl allel tarafından maskelenir!!!

• Ancak baskın olursa veya X’e bağlı olarak erkekte oluşursa tespit

edilebilir

• Bu tip mutasyonlar da gelişim evresinde oluşursa daha fazla fark

edilebilir

• Erişkin bireylerde oluştuğunda tek bir hücredeki baskın mutasyon

diğer binlerce normal hücre tarafından yine maskelenecektir!!!


19

Eşey hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar

daha önemlidir çünkü yavrulara aktarılırlar

• Üstelik gametlerden köken alan bu

mutasyonlar yavru bireyin tüm hücrelerinde

görülecektir ve etkisi daha belirgin olacaktır


1.3 Moleküler değişiklik tipine göre

20

• Nokta mutasyon

• Yanlış anlamlı (missense) mutasyon

• Anlamsız (nonsense) mutasyon

• Sessiz (silent) mutasyon

• Silinme veya eklenme

Mutasyon yokSessiz Anlamsız Yanlış anlamlı

Koruyan Korumayan

Nokta mutasyonlar

DNA düzeyi

mRNAdüzeyi

Protein düzeyi

BazikPolar

22

Bir DNA molekülünde bir baz çiftinin diğer bir baz çiftine dönüşümünokta mutasyonu olarak adlandırılır.

1) yanlış anlamlı mutasyon: Bir genin protein kodlayan kısmındakibir kodondaki bir nükleotidde nokta mutasyonu yeni bir

aminoasit oluşumuna yol açabilir

ÖR: Akondroplazi (cücelik): %80 FGFR2 geni 380 Glisin – Arjinin dönüşümü

2) anlamsız (nonsense) mutasyon: kodon, bir durdurucu kodona

dönüşür ve protein sentezinin sonlanmasını sağlar

ÖR: Marfan sendromu: Fibrillin geni tirozin – Dur kodonu dönüşümü

3) Sessiz mutasyon: Nokta mutasyonu bir kodonu değiştirir fakat

proteinin o pozisyonda bir aminoasit değişikliğine yol açmazsa sessiz

mutasyon oluşur.


23

• Gen içinde herhangi bir noktaya bir ya da

daha fazla nükleotitin girmesine eklenme,

çıkmasına ise silinme adı verilir.

• Tek bir harfin kaybedilmesi veya eklenmesi

sonraki tüm üç harfli kodonların değişmesine sebep olur buna çerçeve kayması mutasyonu

denir.


1.4 Fenotipik etkilerine göre

25

İşlev kaybı (loss of function) mutasyonu

İşlev kazancı (gain of function) mutasyonu

• Morfolojik bir özelliği etkileyen mutasyonlar

• Besinsel veya biyokimyasal etki gösteren mutasyonlar

• Davranış mutasyonları

• Öldürücü (letal) mutasyonlar

• Koşullu mutasyonlar

• Nötral mutasyonlar

1.4.1 İşlev kaybı/kazancı mutasyonları

26

• İşlev kaybı (loss-of-function) mutasyonu gen ürününün işleviniyok eden mutasyondur.

• yokluk (null) ya da nakavt(knockout) olarak bilinir.

• İşlev kaybı mutasyonlarının baskın ya da çekinik olmasıolasıdır.

• ÖR: Orak hücre anemisi

• İşlev kazancı (gain-of-function) mutasyonu yeni bir işlev kazanmasına yol açar.

• Bu mutasyonların çoğu baskındır

• ÖR: Huntington hastalığı.

Sessiz mutasyon

İşlev kaybı mutasyonuİşlevsiz protein kodlar

İşlev kazancı mutasyonuYeni bir işlevi olan protein kodlar

2. Kendiliğinden oluşan

mutasyonların sebepleri

28

1 DNA eşlenmesi hataları

• DNA polimerazlar eşlenme hatalarının çoğunu yapılarında

bulunan 3’-5’ yönünde çalışan ekzonükleazlarını kullanarak

düzeltebilmelerine karşın,

• Yanlış girmiş nükleotitler replikasyondan sonra kalabilirler.

• Bu hatalar ağırlıklı olarak nokta mutasyonlarına yol açar.

29

Nokta mutasyonlarına ek olarak, DNA replikasyonu küçük

eklenme ve silinmelere neden olabilir.

• Eşlenme sırasında kayma sebebiyle olur :

• DNA kalıbının bir zincirinin ilmik oluşturup ayrıldığı zamanveya

• DNA polimerazın kayıp yeniden başlangıç noktasına döndüğü zaman

oluşur.

• Replikasyon kayması DNA’nın herhangi bir bölgesinde olabilir.

• Fakat tekrarlayan dizilere sahip bölgelerinde ve mutasyona

daha açık olan sıcak noktalarda daha fazla görülür.

2.1. DNA eşlenme hataları

30

• Çift sarmal DNA’daki azotlu bazlardan birinin kaybolması

durumudur.

• Genellikle pürinlerde meydana gelir (adenin veya

guanin).

• Bu durum, DNA’nın bir zincirinde apürinik (AP) bölge

oluşumuna yol açar.

• Bu tip hasarların binlercesi memeli hücrelerinde bir günde oluşur

• AP bölgesi onarılmazsa DNA eşlenmesi sırasında o pozisyonda

kalıp rolü oynayacak hiçbir baz bulunmayacaktır.

• Sonuçta DNA polimeraz, bu bölgedeki nükleotitleri rastgele

yerleştirebilir.

2.2 Depürinasyon

2.3 Deaminasyon

31

• Adenin ve sitozindeki bir amino grubunun keto grubuna

dönüşmesidir.

• Sonuçta sitozin urasile ve adenin hipozantine dönüşür.

• Eşlenme sırasında her iki molekülün de baz eşleşme

özellikleri değişmiş olur.

• Deaminasyon kendiliğinden ya da nitröz asit (HNO2) gibi

kimyasal mutajenlerle muamele sonucu oluşabilir.

2.4 Oksidatif hasar

32

• Hücrelerde, normal oksijenli solunum sırasında reaktif

oksijen türleri (serbest radikaller) oluşur.

• Bu radikaller (süperoksitler, hidroksil radikalleri, hidrojen

peroksit vb.), DNA’nın yapısal bütünlüğü için tehdit

oluştururlar.

• Bu maddeler, yüksek enerjili radyasyon sonucunda da

oluşabilir.

• DNA’daki bazlar üzerinde 100’den fazla farklı tip kimyasal

modifikasyon oluşturabilirler.

2.5 Transpozonlar

33

• Yer değiştirebilen genetik elementlerdir.

• Kendiliğinden oluşan mutasyonlara neden

olurlar.

3. Tetiklenmiş mutasyonlar radyasyonveya kimyasallardan kaynaklanır

34

Yaşadığımız çevrede bol miktarda mutajen bulunmaktadır.

Doğal mutajenler;

Mantar toksinleri

Kozmik ışınlar

UV ışınları vb’dir.

Yapay mutajenler ise;

Endüstriyel kirleticiler,

Tıbbi X ışınları

Sigara dumanındaki kimyasallar vb’dir.

3.1 Baz analogları

• Nükleik asit biyosentezi sırasında

pürin ya da pirimidinlerin yerine

geçebilen mutajenik kimyasallardır.

• 5 bromourasil (5-BU), urasilin bir

türevidir.

• 5-BU timin yerine DNA’ya

girebilir.

• Diğer bir baz analoğu da adenin

yerine geçen 2- aminopurin’dir (2-

AP).

• 2-AP timin ile eşleşmeye

yatkındır. 35

3.2 Alkilleyici ajanlar

• I. Dünya Savaşı’nda keşfedilen kükürt içeren hardal gazı alkilleyici bir ajandır.

• Nükleotitlerdeki amino veya keto gruplarına CH3

veya CH3CH2 gibi bir alkil grubu ekler.

• Bu yolla oluşan 6-etil guanin, adeninin baz

analoğu gibi davranır ve timinle eşleşir.

36

3.3 UV ışınları

• Dünyadaki tüm enerji, çeşitli dalga boylarında bir seri elektromanyetik bileşenden oluşur.

• Kısa dalga boylu ışınlar yüksek enerji taşıdıklarından organik moleküllere zarar verirler.

37

3.3 UV ışınları

• UV radyasyonu, yanyana duran iki timin bazı üzerinde pirimidin dimerleri oluşturur.

• T-T dimerlerinin yanı sıra, daha az sayıda da olsa C-C ve T-Cdimerleri meydana gelebilir.

• Dimerler DNA yapısını bozar ve normal eşlenmeyidurdurur.

38

3.4 İyonize radyasyon

39

• X ışınları, gama ışınları ve kozmik ışınlar dokuların derinliklerine kadar girerler.

• Yolları boyunca karşılaştıkları moleküllerin iyonlaşmasınaneden olurlar.

• X ışınları hücreye girdiğinde karşılaştığı moleküllerin atomlarından elektron atılır.

• Böylece kararlı moleküller ve atomlar, serbest radikallere ve

reaktif iyonlara dönüşür.

3.3 İyonize radyasyon

40

• Bu reaksiyonlar DNA’yı etkileyerek nokta

mutasyonlar oluşturabilir.

• Fosfodiester bağlarını kırarak kromozom

bütünlüğünü bozar.

• Buna bağlı olarak silinmeler, yer değiştirmeler

ve kromozomal parçalanmalar oluşabilir.

4. Mutasyonların tanısı

41

• Mutasyon süreçlerini çalışabilmek için öncelikle mutasyonları tanılamak gerekmektedir.

• Bilim insanları genlerin işlevlerini anlamak için

mutasyonları incelerler

• Fakat doğada mutasyonlar nadir

görüldüğünden kendileri kimyasallarla

mutasyon oluştururlar ve bundan sonra oluşan

değişimleri normal organizmayla karşılaştırırlar

4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı

42

• Mutasyonların tanısı haploid organizmalarda daha

kolaydır.

• Mutant hücreleri mutant olmayanlardan ayırmak içinseçilim (seleksiyon) yapılır.

ÖR: Neurospora ekmek üzerinde büyüyen pembe bir küftür.

• Normalde diploiddir ama vejetatif evrede haploid olduğu

için mutasyonlar daha kolay tanımlanabilir.

• Yabanıl tip, minimal kültür ortamında (glikoz, birkaç organik

asit, tuzlar, amonyum nitrat, biotin) üreyebilir.

• Besinsel mutantlar ise bu ortamda üreyemezler.

43

• Bu mutantlar ancak; aminoasitler, vitaminler ve nükleik asit

türevlerince desteklenmiş tam besi ortamında üreyebilirler.

• Mutant tip, her biri tek bir bileşik ilave edilmiş minimal

ortamlarda üremeye bırakılırsa, eksik olan bileşik tespit edilir.

• Bu yolla mutasyonlar tanımlanabilir.

4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı

4.2 İnsanlarda tanı

• İnsanlar uygun deneysel organizmalar değillerdir.

• İnsanlarda mutasyona dayalı bir bozukluğun tespiti için

öncelikle soyağacı (pedigri) analizi yapılır.

• Mutasyonun kalıtımla geçtiği belirlenebiliyorsa;

• Mutant allelin baskın veya çekinik olup olmadığı veya

• X’e bağlı ya da otozomal olup olmadığı belirlenebilir.

44

4.2 Diğer teknikler

45

• Enzim aktivitesi analizi

• Jelde protein hareketliliği

• Protein ve DNA’nın doğrudan analizi

• Genomik

5. DNA onarım sistemleri

46

• Hata okuma (proofreading) ve yanlış eşleşme (mismatch) onarımı,

• Replikasyon sonrası (post-replication) onarım ve SOS

onarım sistemleri,

• Fotoreaktivasyon onarımı (bakterilerde UV hasarının geri

dönüşümü),

• Baz ve nükleotit kesip çıkarma onarımı (eksizyon),

• Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı

5.1 Hata okuma ve yanlışeşleşme onarımı

47

• Bakteri DNA polimeraz yaklaşık

olarak her 100.000 yerleştirmede bir hata yapar

• Enzim her basamakta hata okuması

yaparak hataların % 99’unu yakalar.

• Hatalı bazları tespit eder, kesip çıkararak

doğrusu ile yer değiştirir.

• Hata okuma sırasında kalan hataları gidermek için yanlış eşleşme (mismatch)

onarımı devreye girer.

• Bu sistemde de yanlış eşleşmeler tanınır,

nükleotitler kesilip çıkarılarak yenileriyle yer

değiştirilir.

5.1.2 Yanlış eşleşme onarım sistemindeproblem !

48

• Onarım sistemi, hangi zincirin doğru hangisinin yanlış olduğunu nasıl tespit edecektir?

• Zincir seçimi işlevinin, zincir üzerindeki DNA metilasyonuna

dayandığı tahmin edilmektedir.

• Yeni sentezlenmiş zincir geçici bir süre metillenmiş olarak kalır.

• Onarım enzimi bu zincire bağlanarak yanlış eşlemiş bazları

değiştirir.

• Bakterilerde bu işlem olağanüstü etkilidir, hata sıklığı bin misli azaltılır (hataların % 99.99’u)

5.2 SOS onarım sistemi

49

• E. coli’de bulunan farklı bir hasar onarım sistemidir.

• Bu tip onarım, DNA hasarına karşı son çare olduğundan SOS onarımı olarak bilinmektedir.

• Yanlış eşleşmelerin ve boşlukların bulunduğu kısımlara

rastgele ve olasılıkla yanlış nükleotitler yerleştirilir.

• Bu nedenle SOS onarımı mutajeniktir.

• Bununla beraber, hücreye, aksi halde onu öldürecek olan

DNA hasarıyla yaşama şansı verir.

5.3 Baz ve nükleotit kesip çıkarmaonarımı

50

• Tüm prokaryot ve ökaryotlarda bulunan onarım sistemleridir.

• Bozuk bölge veya hata tanınır ve enzimatik olarak bir nükleaz

tarafından kesilip çıkarılır.

• Bu işlem sırasında hatanın bulunduğu bölgedeki komşu birkaçnükleotit de birlikte kesilip çıkarılır.

• Kesilen zincirde oluşan boşluk, sağlam zincir kalıp olarak kullanılarak doldurulur.

• Bu işlem genellikle DNA polimeraz I tarafından

gerçekleştirilir.

• DNA ligaz ise en son 3’-OH ucunda kalan çentiği yapıştırır ve boşluğu kapatır.

5.4 Xeroderma pigmentosum

52

• Bireylerde ağır deri anomalilerine yol açan nadir çekinik bir bozukluktur.

• Bu bireylerde nükleotit kesip çıkarma mekanizması

çalışmamaktadır.

• Güneş ışığında bulunan UV radyasyonuna maruz kaldıklarındabaşlangıçta çillenme ve deri yaralanmaları görülür.

• Daha sonra deri kanserine kadar giden değişik reaksiyonlar

ortaya çıkar.

• Hasta ve normal bireylerden elde edilen fibroblastkültürlerinde UV ile uyarılmış lezyonları onarma yeteneği

araştırılmıştır.

• Hasta bireylerde birden fazla mutant genin olduğu tespit

edilmiştir.

5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı

54

• Buraya kadar olan kısımda DNA’nın sadece bir

zincirindeki hasarla ilgilenen onarım yollarını tartıştık.

• Ancak iyonize radyasyona maruz kalma sonucunda

DNA’nın her iki zincirinde de kırıklar meydana gelebilir.

• Bu durumda DNA çift zincir kırık onarımı (DÇK) aktive edilir.

• Bu süreç aynı zamanda homolog rekombinasyon onarımı

olarak da adlandırılır.

5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı

55

• Hasarlı DNA, hasarsız homoloğu ile rekombinasyon yapar

ve yer değiştir.

• Bu işlem için çift zincir kırığını tanıyan bir enzime ihtiyaç vardır.

• Çıkarılan hasarlı çift zincir bölgesi, hasar görmemiş kardeş• kromatit ile etkileşir.

• Bu süreç sonucunda DNA polimeraz, hasarsız DNA dizilerini

kullanarak hasarlı DNA’nın her iki zincirini de yeniden

düzenler.

• Süreç genellikle replikasyondan sonraki S/G2 fazı

sonlarında gerçekleşir.

gen mutasyonu ve dna onarimikisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/moleküler biyoloji/6-gen... ·...

Documents