generación y caracterización de células pluripotentes ... · tipos celulares que conforman las...
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Tesis de Grado
Generación y caracterización deGeneración y caracterización decélulas pluripotentes inducidascélulas pluripotentes inducidas
equinasequinas
Campetella, Carla Agustina
2017
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Campetella, Carla Agustina. (2017). Generación y caracterización de células pluripotentesinducidas equinas. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001604_Campetella
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Campetella, Carla Agustina. "Generación y caracterización de células pluripotentes inducidasequinas". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001604_Campetella
UNIVERSIDADDEBUENOSAIRES
FacultaddeCienciasExactasyNaturales CarreradeCienciasBiológicas
TesisdeLicenciatura
‘GeneraciónyCaracterizacióndeCélulasPluripotentesInducidasEquinas’
Alumna:CarlaAgustinaCampetellaDirectora:Dra.CarolinaBlüguermannDirectorAsistente:Dr.AdriánÁngelMuttoLugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Biotecnológicas(IIB),UniversidadNacionaldeSanMartín(UNSAM)
Noviembre,2017
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‘GeneraciónyCaracterizacióndeCélulasPluripotentesInducidasEquinas’
Las célulasmadre representan unmodelo experimental único para numerosas áreas de investigación en
veterinaria,biologíaymedicinadebidoasucapacidaddeautorrenovaciónyasunaturalezapluripotente.En
losúltimosañoselcampodelascélulasmadrepluripotentesseviorevolucionadoporunanuevaformade
obtencióndecélulasmuysimilaresalascélulasmadreembrionarias(CME),lascélulasmadrepluripotentes
inducidas(CPI).Estascélulassonobtenidasapartirdelareprogramacióndecélulassomáticasadultas.Las
CPIpresentanexpresióngénicayproteicamuysimilaresa lasdeCMEyevitan losproblemaspresentados
porlasCME,dadoquesucostodeobtenciónesmenor,puedenserexpandidasengrancantidadinvitroy
diferenciadasadistintostiposcelulares,yaseanprogenitoresocélulasterminalmentediferenciadas.Debido
aesto,lasCPIresultanparticularmenteprometedorasenelcampodelamedicinaregenerativa.
Los caballos tienengranvalor comoanimales tantodeportivos comode compañía. En la saludequina las
lesionesarticularesymusculo-esqueléticasson lasmás frecuentes,y lasopcionesterapéuticasdisponibles
actualmente sólo logran proporcionar una solución a corto plazo. En este marco, las aplicaciones
terapéuticasdelascélulasmadreproporcionaríanunaalternativaparaalcanzarterapiasregenerativasque
permitanlacompletarestauracióndeltejidoadulto.ElestudiodeCPIequinasesuncampoemergenteque
actualmentesólocuentacon6trabajosaescalamundial.Sibienentodosloscasosseestudiólacapacidad
depluripotenciay laexpresióngénicayproteicadecada línea, lascaracterísticasdescriptasdifierenentre
líneas,porloquenoexisteunconsensoentrelaslíneasCPIexistentes.
ElobjetivodelpresentetrabajodeTesisfueestablecer,caracterizaryvalidarunalíneadeCPIequinassegún
loscriteriosactualesdepluripotencia.LasCPIfueroninducidasapartirdefibroblastosequinosembrionarios
quefuerontransfectadosconunplásmidoconteniendolassecuenciascodificantesparalosgenesOct4,Sox2,
Klf4 y C-Myc utilizando un vector lentiviral. Se seleccionó un clonCPI para analizar su cariotipo, perfil de
expresión génico y proteico, actividad de fosfatasa alcalina y capacidad de diferenciación in vitro. Los
resultados obtenidos indican que las células obtenidas presentan características asociadas a las células
pluripotentes.
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ÍNDICE
Introducción…………………………………………………………………………………………………………………………4
CélulasMadre…………………………………………………………………………………………………………..5
Reprogramación…………………………………………………………………………………………………….…8
CélulasMadreenAnimalesDomésticos………….……………………………………………….………10
CélulasMadreenEquinos………………………………………………………………………………….……11
HipótesisyObjetivos…………………………………………………………………………………………….…12
Resultados………………………………………………………………………………………………………………………….13
Reprogramación…………………………………………………………………………………………………..…14
Validación…………………………………….…………………………….…………………………………………..16
Discusión…………………………………………………………………………………………………………………………….24
MaterialesyMétodos…………………………………………………………………………………………………………30
Bibliografía………………………………………………………………………………………………………………………….39
Agradecimientos………………………………………………………………………………………………………………….43
4
INTRODUCCIÓN
5
I.Célulasmadre
ConradWaddingtonasemejóeldesarrolloembrionarionormalaunapelotarodandocolinaabajo,desdeun
estadoinicialpluripotentehastaunodemuchosposiblesestadosdiferenciadosfinales(1).Elhechoqueun
embrión temprano deba contener células con la capacidad de generar y diferenciarse a todos los tipos
celularesadultos,yque los linajes individualespierdenpotencialidadgradualmenteamedidaqueavanzan
en su camino de diferenciación, ha sido el dogma establecido pormucho tiempo (2). De esta forma, se
entiende por ‘célula madre’ aquella célula que al dividirse genera una copia de sí misma y una célula
diferenciada. Según cuántos linajes celulares pueda generar una célulamadre, se define su potencia. Las
células‘Totipotentes’soncapacesdegenerartodoslostiposcelularespresentesenelembriónyeladulto,
célulasgerminalesyestructurasextraembrionarias.Lascélulas‘Pluripotentes’puedendarorigenatodoslos
tiposcelularesdelembriónyeladultoycélulasgerminales,peronosoncapacesdeoriginarlasestructuras
extraembrionariasnecesariasparael correctodesarrollodeun individuo.Colinaabajoen la topografíade
Waddington, se encuentran las células ‘Multipotentes’, que pueden generar los distintos tipos celulares
dentrodeunmismotejido,yporúltimo,lascélulas‘Unipotentes’quesólopuedenoriginaruntipocelular.
Unavezqueunacélulaseencuentracompletamentediferenciada, sólopuededividirseunaspocasveces,
generandocélulashijasigualesasímismas,ysudiferenciaciónaotrotipocelularnoesposible(3).
Eldesarrolloembrionariocomienzaconlaunióndelasgametasmasculinayfemenina,eventodenominado
fecundación, resultando en la formación del cigoto. Luego de la fecundación comienza el clivaje, que
comprende una serie de rápidas divisionesmitóticas en que el cigoto se divide en célulasmás pequeñas
denominadasblastómeros.Al finalizarelclivajequedaestablecidoelblastocisto,estadioenquesucede la
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primer diferenciación estableciéndose dos tipos celulares: elmacizo interno celular (MCI) y el trofoblasto
(Figura2)(4).
En los estadios pre-implantatorios, el embrión está compuesto por células capaces de generar todos los
tiposcelularesdelorganismoadulto.Estaampliacapacidaddedesarrolloesconocidacomo‘Pluripotencia
Naïve’ (5).Pocoantesdequeocurra la implantación,elMCIsesegregaenundiscoembrionariobilaminar
compuestopordoscapasepiteliales,elepiblasto(dorsal)yelhipoblasto(ventral).Luegodelaimplantación,
lascélulasdelepiblastomuestranunpotencialmásrestringido,denominado‘Primed’(delinglés‘preparar’)
(5).Durantelagastrulaciónseformalabandaprimitivaatravésdelacualmigrancélulasdelepiblastohacia
el interiordelembrión,medianteunprocesodenominado ‘TransiciónEpitelioMesenquimal’ (TEM).Como
consecuenciadeesteprocesosurgentrescapasembrionariascompletamentecomprometidas,endodermo,
mesodermo y ectodermo, que junto con el trofoblasto generaran todos los tejidos embrionarios y
extraembrionarios.
LaderivacióndeCélulasMadreEmbrionariasenmurinos(6,7)yluegoenhumanos(8),permitióestablecer
un tipo celular con capacidad de autorrenovación casi ilimitada y de naturaleza pluripotente, capaz de
diferenciarse y generar derivados de las tres capas embrionarias in vitro (8,9). Debido a esto, las CME se
convirtieron en unmodelo novedosopara el estudio del desarrollo embrionario y una herramienta tanto
para análisis de drogas como para posibles terapias regenerativas. La derivación de CME implica el
aislamiento del MCI de un blastocisto, que es luego cultivado in vitro en condiciones específicas. La
pluripotenciadelaslíneascelularesasígeneradasdependerádelmomentoeneldesarrolloembrionarioen
queseaíslalascélulasdelMCI.Enratonesporejemplo,esposiblederivarlíneasCMEtantoenestadiospre
comopost-implantatorios(10-14).ActualmenteseconsideraquelasverdaderasCMEmurinassonobtenidas
de laderivacióndeestadiospre-implantatorios, las cualesexhibenpluripotencia ‘Naïve’in vitro. Las líneas
obtenidas a partir de estadiospost-implantatoriosmuestranpluripotencia ‘Primed’ y son conocidas como
célulasEpiSC,queaunquesoncapacesdegenerarderivadosdelastrescapasnosoncapacesdecontribuira
laformacióndequimerasinvivocomolasCMENaïve(5).
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Las CME constituyen una herramienta única para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que
definenlaespecificacióntisularduranteeldesarrolloembrionario.Esposibleestudiarnumerososaspectos
de la embriogénesis mediante el modelo de cuerpos embrioides (CE). Los CE consisten en agregados
celulares tridimensionales formadosapartirdecoloniasdeCME,ysoncapacesdediferenciarsea las tres
capas germinales a través de un conjunto secuencial de eventos que imitan parcialmente la gastrulación.
Durantelosúltimos20añoslasCMEhandemostradoserungranmodelo invitroquelograrecapitularde
manerafielloseventosqueocurrendurantelaembriogénesis.
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II.Reprogramación
En 1962 John Gurdon transfirió el núcleo de células del epitelio intestinal de rana a oocitos enucleados,
obteniendo renacuajos normales (15). Esto no solo hirió el modelo reinante que consideraba la
diferenciación como un hecho terminal e irreversible, sino que consistió en el primer ejemplo de
reprogramacióncelulardecélulassomáticas.Utilizandoestemétodo,conocidocomo‘TransferenciaNuclear
deCélulasSomáticas’(SCNTporsussiglaseninglés),hasidoposibleclonardistintasespeciesdemamíferos
(porejemploovinos (16), bovinos (17), caprinos (18),porcinos (19))poniendoenevidenciaque las células
somáticasdemamíferostambiénpuedenserreprogramadas.
Losexperimentosmencionadosdemostraronqueenelcitoplasmadelosoocitosexistenfactorescapacesde
reprogramarcélulasterminalmentediferenciadas.Enelaño2006,KazutoshiTakahashiyShinyaYamanaka
lograron identificar factores de transcripción capaces de reprogramar células somáticas en un método
sencillodereprogramacióndirectaquenorequiereembrionesnioocitos(20).Ensutrabajoseleccionaron
24 genes candidatos que codifican para factores inductores de pluripotencia en células somáticas. Estos
factoresfuerontransfectadosenfibroblastosembrionariosmurinos(MEF)utilizandounsistemaretroviral.
Encontraronquesibienningúnfactoreracapazdegenerarcélulaspluripotentesporsísolo,lacombinación
decuatrodeelloserasuficiente.MediantelainduccióndelaexpresiónexógenadeOct3/4(Octamer-binding
transcription factor 3/4), Klf4 (Kruppel-like factor 4), Sox2 (Sex determining Region Y-box 2) y C-Myc (set
‘OSKM’), lograron generar células madre pluripotentes inducidas (CPI). Luego de la reprogramación, las
células recuperan la capacidad para auto-renovarse y la pluripotencia, pudiendo así dar lugar a todos los
tiposcelularesdeunorganismoadulto(20).Lascélulasreprogramadassonsimilaresenmúltiplesaspectosa
lasCME,incluyendolamorfología,latasadeproliferación,laexpresióndeantígenosdesuperficie,elestado
epigenéticoylaactividaddelaenzimatelomerasa.Además,lasCPIpuedendiferenciarseacadaunodelos
tiposcelularesqueconformanlastrescapasgerminales(21).Deestaforma,losautoreslograrondemostrar
queesposibleinducirelestadopluripotenteencélulassomáticasygeneraruntipocelularmuysimilaralas
CME,aunquenoidéntico(20,21).
Considerandoelcampodelaterapiaregenerativa,resultadifícilpensarenlaaplicaciónagranescaladeCME.
Suobtenciónesmuydificultosa, limitandopor lotantosudisponibilidad.Lautilizacióndeestascélulasen
terapias regenerativas seve limitadadebidoaproblemasdehistocompatibilidadcomosucedehoyendía
con los trasplantes de órganos, sinmencionar los problemas éticos que representa la obtención de estas
célulasennumerosospaísesenelmundo.Dadoquelareprogramacióndecélulassomáticasnoinvolucrala
destrucción de embriones y que sólo se requiere de células adultas diferenciadas (como por ejemplo
fibroblastos, queratinocitos, células de médula ósea o células del epitelio de la mucosa gástrica), esta
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tecnología ha revolucionado el campo de estudio. Las CPI presentan expresión génica, proteica y
modificaciones epigenéticasmuy similares a las CME.Estas características las equiparan a las CME, y por
endesonvistascomosustitutosaccesibles(22).
La reprogramación de células es el resultado de la remodelación de la expresión transcripcional y
epigenéticadeunacélulasomáticahaciaunestadotipo-CME.EstoincluyelareactivacióndelcromosomaX
encélulasfemeninas,lademetilaciónderegionespromotorasdegenesencargadosdeinducirymantenerel
estadopluripotente(porejemploOct4yNanog),yelrestablecimientoanivelgenómicodelatrimetilación
delaslisinas4y27delahistona3(H3K4me3yH3K27me3),marcasepigenéticascaracterísticasderegiones
transcripcionalmenteinactivas.Esentoncesunprocesogradualquepuededemorarvariosdíasosemanas,y
que depende de una cascada de activación de genes de autorrenovación y pluripotencia e inhibición del
compromiso a un linaje determinado. En ratón, por ejemplo, se observó que este proceso requiere
mantener los factoresde reprogramaciónexógenos activospor aproximadamentediezdías,momentoen
que el genoma se encuentra preparado para la conversión a un estado pluripotente. Esto incluye la
reactivacióndegenesendógenosdepluripotencia(Oct4,Sox2,Nanog,etc).Cuandoestoocurre, lasCPIse
tornan independientes de los factores exógenos usados en la reprogramación para mantener el estado
pluripotente(23).
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III.CélulasMadreenAnimalesDomésticos
Con la introducciónde la tecnologíade reprogramacióndirecta, se logróestablecer líneasCPIendistintas
especiesdomésticas(bovinos,equinos,porcinos,caprinos,ovinos)generalmentepartiendodefibroblastos
fetalesyutilizandovectoresviralesparalaintroduccióndelosfactoresnecesariosparalareprogramación.
Estemétodo,entonces,permitióladerivacióndecélulaspluripotentesenespeciesenqueladerivaciónde
CME aún no ha sido posible. Actualmente se cuenta con gran cantidad y variedad de líneas CPI en estas
especies,conpropiedadesdeproliferaciónydiferenciaciónvariables,pocasde lascualescumplencon los
requisitosdeCMEverdaderas(24).
DadoquelasCPIsonmuysimilaresalasCME,representanunafuentepotencialmenteilimitadadecélulas
pluripotentes individuo-específicas que podrían ser usadas en terapias de reemplazo celular con células
autólogas, modelado de enfermedades, screening de drogas e investigación en temas relacionados a la
biologíadeldesarrollo.Actualmenteexisten45trabajospublicadosdescribiendogeneracióndelíneasCPIen
animalesdegranja(17enporcinos,8enbovinos,6enequinos,6encaprinos,4enovinos,4enconejos),
utilizandodistintosmétodosdetransfecciónysetsdefactoresdetranscripción.Estosestudiosdemuestran
que es posible reprogramar células de animales domésticos empleando factores de transcripción ya sean
especie-específico,humanos,murinosounacombinacióndeellos.En lamayoríade loscasoselsetOSKM
fue suficiente para inducir la reprogramación, en algunos casos utilizado en combinación con otros
elementosparaaumentarlaeficienciaylaestabilidaddelaslíneasCPI.
En lamayoría de los casos las células reprogramadas son fibroblastos y se empleamétodos integrativos,
basadosenretro-olentivirusoentransposonespiggyback.LacaracterizacióndelapluripotenciadelasCPI
obtenidas es generalmente determinada por la expresión de marcadores específicos de pluripotencia,
capacidaddediferenciacióninvitroyformacióndeteratomasenratonesinmunodeficientes.
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IV.CélulasMadreenEquinos
Loscaballospresentanunenormevalorcomoanimalesdeportivosydecompañía.Lasaludequinaesunade
lasprincipalespreocupacionespara la industria,yaqueelcostopor lesionesyenfermedadesenanimales
deportivosseestimaen6,5milmillonesdedólaresporañoanivelmundial(25).Las lesionesarticularesy
musculo-esqueléticassonlasmásfrecuentesysóloentreel25y50%delosanimaleslesionadoslogravolver
acompetir(26).Lasopcionesterapéuticasdisponiblesactualmentesólologranproporcionarunasolucióna
cortoplazoyestánasociadasaunaelevadatasaderecurrenciadelesiones(27).Porlotanto,lanecesidad
dedesarrollarnuevasterapiasparaeltratamientodelesionesmúsculoesqueléticasencaballosesevidente.
En este marco, las aplicaciones terapéuticas de las células madre proporcionarían una alternativa para
alcanzarterapiasregenerativasquepermitanlacompletarestauracióndeltejidoadulto.
Encomparaciónaotrasespecies,elcampodelasCMEequinasseencuentraactualmentepocoestudiado.
En 2002 Saito et al lograron aislar la primer línea de células equinas tipo-CME a partir de embriones
criopreservados (28). Más recientemente, en 2006 y 2007 dos grupos establecieron líneas tipo-CME
partiendo delMCI (29, 30). En ambos casos las células mostraron la morfología característica de CME y
fueroncapacesdegenerarderivadosdelastrescapasgerminales.Apesardeestonogeneraronteratomas
alserinyectadosenratonesinmunodeficientes,ynosehaverificadosucontribuciónaquimeras.Debidoa
diferencias en los métodos de marcación, falta de controles y la calidad de las imágenes, aún quedan
preguntaspor responder yno seha logradoun consenso sobrequé caracterizaunaverdadera líneaCME
equina (31). Esta incertidumbre, junto a la dificultad intrínseca de la derivación de CME y los costos
asociados a la recuperaciónde los embrionesnecesarios, limita el usodeCMEen terapias regenerativas.
Másaún,suaplicaciónenestasterapiasseveimpedidaporproblemasdehistocompatibilidad.
En este contexto, el desarrollo de CPI equinas resulta particularmente atractivo. Las CPI eluden los
problemaspresentadosporlasCME,dadoquesucostodeobtenciónesmenor,puedenserexpandidasen
gran cantidad in vitro y diferenciadas a distintos tipos celulares, ya sean progenitores o células
terminalmente diferenciadas. El estudio de CPI equinas es un campo emergente que actualmente sólo
cuentacon6trabajosaescalamundial.En2011NagyetalderivaronlaprimerlíneaCPIequinaapartirde
fibroblastos equinos fetales utilizando el setOKSMy unmétodode transfecciónbasado en transposones
(32). Seguidamente, en 2013 Bretonet al y en 2014 Whitworth et al generaron CPI equinas a partir de
fibroblastosadultosconelsetOSKMymétodosdetransfecciónvirales(retroy lentiviralrespectivamente)
(33,34).Sibienentodosloscasosseestudiólacapacidaddepluripotenciaylaexpresióngénicayproteica
decadalínea,lascaracterísticasdescriptasdifierenentrelíneas,porloquenoexisteunconsensoentrelas
líneas CPI existentes. Más aún, debido a la ausencia de verdaderas líneas CME equinas resulta muy
dificultosoestablecermarcadoresconfiablesquepermitanlacorrectavalidacióndelaslíneasCPIobtenidas.
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CabedestacarquenoexisteenArgentinaningunalíneaequinadeCPI.Porlotantoconsideramosqueesde
sumaimportanciaeldesarrollodenuevastecnologíasquenospermitanexplotarlasventajasdelamedicina
veterinariaregenerativaennuestropaís.
V. HipótesisyObjetivosTeniendoencuentalopreviamenteexpuesto,seevidencialanecesidaddedesarrollarfuentescelularesque
permitanelavancedenuevosenfoquesterapéuticosbasadosentecnologíasdemedicinaregenerativa.Por
lo tanto,elobjetivoprincipaldeeste trabajode tesis fueestableceruna líneaCPIequina, caracterizarlay
validarla.
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RESULTADOS
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Reprogramación
Paragenerar lasCPIsecomenzópor laproducciónde laspartículas lentivirales.Paraelloseutilizócélulas
HEK293T,lascualesfuerontransfectadasconelplásmidoSTEMCCA(portadordelaregióncodificantedelos
genes humanos OCT4-Klf4-SOX2-cMyc) y los plásmidos empaquetadores PSPAX2 y VSVG utilizando el
reactivodetransfecciónFUGENE.Elvirusfuerecolectadoalas48y72hsposttransfecciónyutilizadofresco
sobrelosfibroblastosequinos.Luegodetresdíaslosfibroblastosinfectadosfueronpasadossobreunacapa
nutriciadefibroblastosmurinosembrionariosinactivadosmitóticamenteporirradiacióngamma(MEFi)yse
comenzó a utilizar el medio KO-DMEM 20% KSR, específico para CPI, con el fin de generar una presión
selectivasobreaquellascélulasquehabíansido transfectadasexitosamente.Durante losprimerosdíasde
cultivoenestascondiciones,lascélulasaúnconservabanlamorfologíacaracterísticadelosfibroblastos,sin
embargosecomenzóaobservaralgunoscambiosmorfológicosprincipalmenteeneltamañodelosnúcleos
(Figura3A).Elsurgimientodelascoloniasseobservóapartirdeldía8post-infección.Lascoloniasdecélulas
pluripotentessecaracterizanporcrecercomounconjuntodecélulascompactasdenúcleosdegrantamaño,
por lo que presentan una relación núcleo/citoplasma elevada, y con bordes definidos (Figura 3B).
Aproximadamente al día 12 post-infección se seleccionó las colonias según sumorfología (Figura 3C). Las
coloniasseleccionadasfueronaisladasmecánicamenteycultivadasindividualmenteenpocillosdeunaplaca
de24pocillosconelfindecultivarcadaclonporseparado.Delos105fibroblastosquefueronplaqueados
paraserinfectadosselogróaislarenpromediodiezcolonias,porloquelaeficienciaestimadadelatécnica
fuedel0,01%.Esimportanteremarcarquemuchasdeestascoloniasnoprogresan,esdecirquenologran
sermantenidasencultivo luegodevariospasajesyaseaporquepierdensumorfología, sucrecimientose
vuelveinestable(dejandecrecerocrecendescontroladamente)omueren.Porlotantopodemosdecirque
este valor refleja la eficiencia de reprogramación parcial. La eficiencia total de esta técnica se estima en
0,001%(20).
Lascoloniasdecélulaspluripotentesnormalmentepresentanunatasadediferenciaciónbasalquesueleser
bajayestarpresenteenlosbordesdelascolonias.LasCPIsuelensermásinestablesdurantelosprimeros
pasajes(Figura3D)(35).Enmuchoscasoslamorfologíadelascoloniascambiadrásticamente,perdiendolas
característicasdecoloniaCPI.Enalgunoscasoslascoloniasperdieronsusbordesdefinidos(Figura3E)y/ose
observó que parte de la colonia se desprende (Figura 3F), lo cual reflejaría que en estos casos la
reprogramación ocurrió de forma incompleta. Estos clones fueron descartados y sólo se utilizó para la
validaciónaquellosclonesquemantuvieransumorfologíaa lo largode lospasajesencultivo.Tambiénse
tuvo en cuenta que la tasa de crecimiento fuera acorde a la que presentan las células pluripotentes (las
célulasnormalmentedebenserpasadascada5-7días).
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Duranteeldesarrollodeeste trabajo se realizóquinceensayosde reprogramación,de los cuales se logró
aislarnoventaclones,muchosdeloscualesnoprosperaron.Generalmenteel75%delascoloniasaisladasen
cada ensayo perdió su morfología 15 días post-infección. Para realizar los ensayos de validación, se
seleccionóunclon,denominadoA5,quemantuvolamorfologíaytasadecrecimientoadecuadadurantelos
sucesivospasajes.EsteclonfuedenominadoA5.
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Validación
I) EnsayodeactividaddeFosfatasaAlcalina
Lascélulasmadreindiferenciadassecaracterizanporexhibirunaactividadelevadadefosfatasaalcalina,que
disminuyemarcadamente amedida que se diferencian. Se comparó la actividad de fosfatasa alcalina de
coloniasdelclonA5enpasaje8ydecélulasdeunclon(denominadoclon2)queperdiólascaracterísticas
morfológicas de CPI (Figura 4). Al analizar la actividad de fosfatasa alcalina de las colonias del clon 2, se
observóunamarcamuytenueconcentradaenpartedelascolonias.EnelcasodelascoloniasdelclonA5,la
tincióngeneróunacoloraciónmásintensaconunadistribuciónmáshomogéneaenlascolonias.Estosugiere
quelascélulasdelclonA5presentanmayoractividaddefosfatasaalcalina.
II) Expresióndemarcadoresdepluripotencia
SeestudiólaexpresióndemarcadoresdepluripotenciaOct4ySox2enlasCPIgeneradas(Figura5).Debidoa
queelplásmidoutilizadoparainducirlareprogramaciónincluyeestosgenes,sediseñóprimersdemanera
talque fueseposibledistinguirentreelARNmprovenientede laexpresióndelplásmido(“ARNviral”)yel
endógeno.ComosepuedeobservarenlaFigura5A,lascélulasdelclonA5enpasajecuatrohansilenciadola
expresióndeOct4viralyhanencendidolaexpresióndeOct4equino.Sinembargo,nohansilenciadoSox2
viralytampocoexpresanaúnlaversiónequina.Enpasajeonce,semantieneelpatrónobservadoparaOct4
yademásseobservalaexpresióndeSox2equino,peroaúnnohansilenciadoSox2viral.Comocontrolesde
la técnica se verificó la expresión de estosmarcadores en los fibroblastos utilizados para reprogramar y
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embriones equinos, en estadio de blastocisto temprano. Se observó que los fibroblastos no expresan
ningunodeestosmarcadores yque losembrionesexpresanOct4peronoSox2, loquepodríadeberseal
estadio embrionario empleado. A su vez, al analizar la expresión de fibroblastos infectados, se observó
expresión de Oct4 endógeno lo que sugiere que su activación sería un evento temprano en la
reprogramación.
Los componentes del medio de cultivo CPI varían según la especie cultivada. La citoquina LIF (Leukemia
InhibitoryFactor)esunacitoquinadelafamiliadelaInterleuquina-6involucradaenlavíadeseñalizaciónde
JAK/STAT3, relacionada al mantenimiento de la pluripotencia y la proliferación (36). Esta citoquina es
suficienteynecesariaparamantenerelestadopluripotenteenCPImurinas,peronoenCPIhumanas.Enel
casodeanimalesdomésticos,lamayoríadelosprotocolosempleanLIFensumediodecultivo,porloquese
quisoestudiarelefectodeestacitoquinaenCPIequinas.Paraello,lascélulasdelclonA5fuerongeneradas
ycultivadasenpresenciadeLIF,yalrealizareltercerpasajesedividióelcultivoparacultivarlascélulasen
presenciayausenciadeLIF.LuegodedospasajesenausenciadeLIFseobservóquelascélulasperdieronsu
morfología, muerte celular y que las células se desprendían de la placa. Al analizar la expresión de los
marcadoresOct4ySox2(Figura5B)seobservaexpresióndeSox2viralenpresenciayausenciadeLIF,pero
lascélulasenausenciadeLIFtienenmenorexpresióndeOct4equino.
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Adicionalmente, se analizó el perfil de expresión demarcadores de pluripotencia de siete clones que no
progresaron,esdecirqueperdieronsuscaracterísticasmorfológicasdecélulasCPI(Figura6).Enestecasose
observa que el perfil difiere en granmedida respecto a lo observadopara el clonA5. A diferencia de las
células del clon A5, todos estos clones ya han silenciado Oct4 y Sox2 exógenos en el segundo pasaje, y
algunos(clones1,3,6,8y9)expresanSox2equino.Aexcepcióndelclon7,todoslosclonesexpresanOct4
endógeno,comoseobservóparaelclonA5.Deestaforma,seobservaqueestossieteclonespresentanun
perfildeexpresióndistintoaldelascélulasdelclonA5.Considerandoqueningunodeestosclonesprogresó,
esposiblequenosehayansucedidoloseventosnecesariosenelordencorrectoparaunareprogramación
exitosa,resultandoenunareprogramaciónincompleta.
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Con el fin de evaluar la expresión de proteínas características de las células pluripotentes se realizó un
ensayodeinmunofluorescenciaenlascélulasCPIgeneradas.Comosemencionópreviamente,estascélulas
crecensobreunacapanutriciadefibroblastosmurinos,loscualesalsercélulasterminalmentediferenciadas
noexpresanestosmarcadoresy,porlotanto,actúancomocontrolnegativodentrodelamismamuestra.
ComoseobservaenlaFigura7A,lascélulasdelclonA5expresanlosmarcadoresOct4,Sox2yNanog.Enel
casodeOct4ydeSox2seobservaquelamarcadelanticuerpocorrespondienteseencuentraúnicamenteen
lascélulasdelascolonias,mientrasquelascélulasmurinasestánmarcadassóloporlatincióndesuADNpor
DAPI.ConsiderandoqueseutilizólosgenesdeOct4ySox2parainducirlareprogramación(enamboscasos
lahomologíadesecuenciaequina/humanaessuperioral90%),losresultadosdelasPCRdemarcadoresde
pluripotenciayqueenesteensayoseutilizócélulasenpasaje8,noesposibleidentificarsilaexpresiónde
Sox2identificadacorrespondeala inducidaexógenamente.EnelcasodeNanog,seobservaclaramentela
marca concentrada en la colonia, pero también se observa unas células MEFi positivas. Sin embargo,
tambiénseobservacélulasMEFiquesonpositivasparaDAPIynegativasparaNanog,locualindicaquese
tratadeunamarcainespecífica,debidaprobablementealaconcentraciónutilizadadeanticuerpoprimario.
Porotrolado,serealizóunamarcacióndeOCT4enembrionesequinosenestadiodeblastocistotemprano
comocontrolpositivo(Figura7B-C).
Enconjuntoestosresultados indicanque lascélulasdelclonA5expresan losmarcadoresdepluripotencia
Oct4,Sox2yNanog,yquehansilenciadolaexpresióndelostransgenescuyaactividadfuereemplazadapor
laexpresiónendógena.
20
21
III) Diferenciacióninvitro
Comosemencionoenlaintroducción,unadelascaracterísticasdelascélulaspluripotenteseslacapacidad
deoriginarderivadosdelastrescapasembrionarias.ParaevaluarestacapacidadsesometiólasCPIdelclon
A5aunprotocolodediferenciación invitroenpresenciadesuerofetalbovinocomoagentediferenciante.
Para ello las colonias fueron cultivadas por 5 días en suspensión, tiempo en el cual adquieren una
conformaciónesféricadenominada‘CuerpoEmbrioide’(CE)debidoasusemejanzaalosprimerosestadios
del desarrollo embrionario (Figura 8A). Los CE son luego adheridos en placas pre-tratadas con gelatina y
cultivadospordossemanasmás.Comosemuestraen laFigura8B,adía6seobservaelCEadheridoa la
placa, caracterizado por células compactas, del cual se originan células demorfología muy distinta a las
coloniasdecélulasindiferenciadas.Eneldía9nosedistinguefácilmenteelCEyseobservagrancrecimiento
de las células (Figura 8C).Durante la segunda semanade cultivo se puededistinguir células con distintas
morfologías,característicasdediversostiposcelulares,principalmentecélulasconmorfologíamesenquimal
(Figura8D-F).
22
Conelfindeanalizarlacapacidaddegenerarderivadosdelastrescapasgerminales,seestudióelperfilde
expresión del cultivo de CE al término de veinte días, a excepción de T/Brachyury. Dado que este es un
marcador demesodermo temprano, presentamáxima expresión entre los días cuatro y cinco de cultivo
coincidenteconlaespecificacióndelmesodermo,porloqueseevaluósuexpresiónalquintodíadeiniciada
ladiferenciación.ComoseobservaenlaFigura9,seobservóexpresióndeSox17,marcadordeendodermo
(37) y T/Brachyury e Islet-1, marcadores de mesodermo (38,39). Sin embargo, no se pudo observar
expresiónde losmarcadoresdeectodermoNestina (40)yPax6 (41)peseahaberobservadoenel cultivo
célulasconmorfologíatipo-neural.Apesardeesto,losresultadosobtenidosindicanquelascélulasdelclon
A5poseencapacidaddediferenciarseygenerardistintostiposcelulares.
23
IV) Cariotipo
OtrocriteriodevalidacióndeCPIgeneralmenteempleadoeselanálisisdesucariotipo.Enestosensayosse
evalúa la aparicióndeposibles rearreglos cromosómicos causadospor la inducciónde la reprogramación.
ParaanalizarelcariotipodelosfibroblastosutilizadosenlareprogramaciónydelascélulasdelclonA5,se
contóconlacolaboracióndelLaboratoriodeBiotecnologíadel‘InstitutodeInvestigaciónsobreProducción
AgropecuariaAmbienteySalud’delaFacultaddeCienciasAgrariasdelaUniversidaddeLomasdeZamora.
Alanalizarelcariotipodelosfibroblastosfetalesempleadoselmismorevelóquesóloel28%delascélulas
presentaba64cromosomas,elnúmerocromosómicocaracterísticodeequinos(Figura10A).De lascélulas
restantes,el64%presentóunnúmerocromosómicoinferioryel8%presentóunnúmeromayor.Asuvez,se
analizóelcariotipodecélulasequinaspertenecientesaunahembraenpiecomocontroldelmétodo.Eneste
casoelcariotiporesultónormal(Figura10B).SibienseintentóanalizarelcariotipodelascélulasdelclonA5,
estono fueposibledebidoaproblemas técnicos.Apesardeesto, se consideraqueprobablementeestas
células también posean un cariotipo anormal. Esto explicaría las dificultades experimentadas tanto en la
derivacióndeCPIcomoenlageneracióndeCEyenlaimplementacióndelcultivoensuspensión.
24
DISCUSIÓN
25
Durantelosúltimosañosel interésenlamedicinaregenerativahacrecidoenormemente.Sehaempleado
numerosasestrategiasconelfindehallareltipocelularmásadecuadoparaemplearenaplicacionesclínicas,
entreellas la identificaciónydiferenciacióndeprogenitorestejidoespecíficooladiferenciaciónadistintos
tiposcelularesapartirdeCME.ElsurgimientodelasCPIabriólaspuertasaldesarrollodecélulaspaciente-
específicas,marcandounpuntode inflexiónenel campode las terapias regenerativas.Deesta forma, el
tratamientodeenfermedadesdegenerativasmedianteterapiasdereemplazocelulardejódeserunautopía,
ycomenzóaserconsideradocomounaposibilidadconcreta.
EnelpresentetrabajodeTesishemosgeneradoCPIequinasennuestrolaboratorioapartirdefibroblastos
dérmicos(Figura3).LainduccióndelaexpresiónexógenadelosgenesOSKMencélulassomáticasequinas
generócoloniasdecélulasconmorfologíacaracterísticadecélulasmadre.Sinembargo,luegodeaislarestas
coloniasmuchasdeellassufrieroncambiosmorfológicos,principalmente lapérdidadecompactaciónyde
bordes definidos en las colonias, diferenciación y muerte celular. Considerando que sólo el 25% de las
colonias seleccionadas fue capaz de mantener su morfología inicial, esto indica que el proceso de
reprogramación no ha culminado al momento de la selección. Es importante remarcar que el criterio
morfológico empleado se basó principalmente en la morfología de líneas CME humanas y murinas. Este
criteriotambiénfueempleadoporotrosautoresparalaseleccióndeCPIequinas.Nagyetal(32),Bretonet
al (33) y Whitworth et al (34) describen sus colonias como compactas, con bordes definidos y elevada
relaciónnúcleo/citoplasma, locualconcuerdacon lamorfologíade lascoloniasdescriptasenestetrabajo.
Hastalafechanosehareportadoelestablecimientodeunalíneadecélulasmadreequinasembrionariasy
solo existen escasos reportes de líneas CPI por lo tanto existe la posibilidad que el criterio de selección
basadoenlamorfologíaempleadoeneltrabajonohayasidoelóptimo.
Laelevadaactividaddelafosfatasaalcalinaseasociacontiposcelularespluripotentes.Sehaobservadoque
a medida que se va restringiendo la pluripotencia su actividad decae (42). Los ensayos de actividad de
fosfatasaalcalinarealizadosenestetrabajomostraronelevadaactividadenzimáticaparalascélulasdelclon
A5,evidenciadoporlacoloraciónintensa(Figura4).Alensayarlascélulasdeunclonquenoprogresóenel
cultivo (clon 2), la coloración observada fue mucho más tenue y no uniforme dentro de las colonias,
indicandomenoractividadenzimática.EstosugierequelascélulasdelclonA5seencuentranenunestado
másindiferenciadoqueelclon2.Análogamente,laslíneasCPIequinasreportadasporotrosgrupos(32-34)
tambiénpresentanactividadelevadadefosfatasaalcalina.
Elmodelodecinéticadereprogramaciónactualconsideratresetapasenelproceso.Laprimera,‘Iniciación’,
implica una transición mesénquimo-epitelial que se traduce en un cambio en el fenotipo y la firma
26
transcriptómica celular. La siguiente fase es denominada ‘Maduración’, caracterizada por la expresión de
ciertosmarcadoresdepluripotenciacomoOct4,NanogySall4.Finalmente,enla‘Estabilización’seinducela
expresión de marcadores de pluripotencia silenciados anteriormente, como Sox2, Pecam y DppalV.
Adicionalmente, sehaobservadoqueelpasajede la fasedemaduraciónaestabilizaciónrequiereque las
células adquieran la capacidad de sustentarse en ausencia de los factores exógenos. Esto se traduce en
encenderunaredregulatoriaespecíficaquedifieredelanecesariaparamantenerelestadodepluripotencia.
En conjunto, si bien se considera una adquisición secuencial de la pluripotencia, muchas células quedan
bloqueadas en alguna de estas etapas (35). Esto se correlaciona con lo observado en los ensayos de
validación del clon A5. En primer lugar, al analizar el perfil de expresión génica (Figura 5A), se observó
expresión de Oct4 endógeno y silenciamiento de Oct4 exógeno en pasaje 4. A su vez, en pasaje 11 se
observó expresión tanto de Sox2 endógeno como del exógeno. Sorprendentemente, se observó que la
expresión de Oct4 endógeno pudo ser detectada en los fibroblastos 4 días post infección (previo a la
aparición de cambios morfológicos), por lo que esto constituiría un evento muy temprano en la
reprogramación. Por otro lado, al analizar la expresión de estos genes en células de siete clones que no
progresaronencultivo,seobservóquetodospresentanunperfildeexpresióndistintoaldelascélulasdel
clonA5(Figura6).Másaún,todosloscloneshabíansilenciadolosgenesexógenosyalgunosyaexpresaban
Sox2 endógeno.Debido a que las colonias de estos clones no fueron capaces demantener lamorfología
adecuada en el tiempo, es probable que los eventos de la reprogramación hayan ocurrido en un orden
incorrecto,causandounareprogramaciónincompleta.Estosugierequelosprimeroseventosqueocurrenen
lareprogramaciónsonlaexpresióndeOct4endógenoyelsilenciamientodeOct4exógeno,mientrasquela
expresióndeSox2endógenoseríauneventotardío.Asuvez,laexpresióndeambosSox2sugierequeelclon
A5 no ha finalizado el proceso de reprogramación por completo o bien se encuentra bloqueado.
Similarmente,en los trabajospresentadosporWhitwhorthetal yBretonetalseestudió laexpresiónde
diversosgenes,comoOct4,Sox2,Nanog,TERT,Rex1yLin28,paracaracterizarelestadopluripotentedesus
líneasdeCPI.Enamboscasostambiénseobservóexpresiónpersistentedegenesinducidosexógenamente.
EnelcasodeWhitwhorthetaltodoslosclonesseleccionadosexpresabanOct4exógenoenpasaje25yuno
de ellos también presentaba expresión de Sox2 exógeno (34). Breton et al, por otro lado, seleccionaron
cuatroclonesdeloscualesdospresentabanunaexpresiónpersistentedeOct4exógenoy,losotrosdos,de
c-Mycexógeno(33).Estosresultadostambiénsugierenquelareprogramaciónnosehacompletadoobien
quehasidobloqueada.Deesta forma,esposibleque losmétodosdereprogramaciónactualesdebanser
modificadosparalograrinducirelestadopluripotenteenequinosexitosamente.Adicionalmente,alestudiar
lainfluenciadelacitoquinaLIFenelcultivodelclonA5,seobservóqueenausenciadeLIFlaexpresiónde
Oct4 endógeno disminuyó. Esto, junto a los cambios morfológicos observados, sugiere que LIF estaría
involucradaenelmantenimientodelapluripotencia,yenlaexpresiónsostenidadeOct4.Ladependenciade
27
LIF para elmantenimiento de la pluripotencia en equinos también fue observada anteriormente. Existen
trabajosquedescribenlapérdidadelamorfologíatípicadecélulamadrealquitarestacitoquinadelmedio
decultivo(32-34).
Al analizar la expresión de marcadores de pluripotencia mediante ensayos de inmunofluorescencia, se
observóexpresióndeOct4,Sox2yNanog.Sinembargo,dadoqueseutilizó losgenesdeOct4ySox2para
inducir la reprogramación no es posible identificar si la proteína detectada es la endógena o la exógena.
Considerandolosresultadosdeexpresióngénica,esprobablequeenelcasodeOct4setratedelaproteína
endógena,yaqueseutilizócélulasenpasajeochoyseobservósilenciamientodeOct4exógenoenpasaje
cuatro. Enel casode Sox2, sinembargo, esposibleque sehayadetectadoambasproteínas, dado que la
expresióndeARNprovenientedelplásmidoaúnesdetectadaencélulasdepasajeonce.Paralatincióncon
NanogseobservóunamarcaclaramenteconcentradaenlacoloniaCPI.DadoqueNanognofueutilizadoen
la inducciónde lareprogramación,esto indicaquese logró inducir laexpresióndemarcadoresendógenos
de pluripotencia y, por ende, encender redes de señalización relacionadas al estado pluripotente. Es
importante remarcar que en el caso de la marcación con Nanog se observó que algunas células
pertenecientesa lacapanutriciapresentaronunamarcapositiva.Dadoquenosecuentaconanticuerpos
primarios específicos que reconozcan las proteínas equinas que se desea marcar, se debió utilizar
anticuerposcomercialesquedetectanlasproteínashumanas.Debidoaesto,yapesardelahomologíade
secuencias entre ambas especies, no se observó señal al utilizar concentraciones bajas de anticuerpo
primario (1:400-1:100), por lo que fue necesario emplear lamáxima concentración posible (1:50). Por lo
tantoesprobablequelamarcaobservadaparalosfibroblastosmurinosseainespecíficaysedebaalaalta
concentración de anticuerpo primario que fue necesario emplear. Estos resultados coinciden con lo
observadoporotrosautoresquetambiénhanrealizadoinmunomarcacionesparavalidarsusCPIequinas(32,
34).EnestostrabajossepudoobservarexpresióndeOct4,NanogySox2juntoaotrasproteínasutilizadas
comomarcadoresdepluripotenciaenmurinos,comoSSEA1,SSEA4,TRA1-60yTRA1-80.Seconsideraque
losmarcadores de pluripotencia de CMEdeberían ser proteínas que sólo se expresen en aquellas células
correspondientesalMCI, sinembargo laexpresióndemuchosde losmarcadoresempleadosactualmente
varíaentrelasdistintasespecies.Porejemplo,SSEA1(stage-specificembryonicantigen1)seexpresaenCME
murinas pero no en humanas, Oct4 es específico del MCI en murinos pero se expresa en MCI y
trofoectodermoenotrasespecies(humanos,bovinos,caprinos,porcinos).Nanogesespecíficodelepiblasto
pluripotentemurino,perodefineelMCIenembrioneshumanosyestáausenteenlaformacióndelepiblasto
yMCIporcino.EnequinosenparticularsehareportadoexpresióndeOCT4,SSEA1,SSEA3,SSEA4,TRA-1-60
yTRA-1-81enMCIy trofoectodermo,yexpresióndeNanogenventanastemporalesquecoincidencon la
especificacióndelepiblasto (42).Estasdiferenciasprobablementesedebanaqueexistendiferenciasenel
28
desarrolloembrionarioentrelasespecies,porloquelaexpresióngénicatambiéndifiere.Deestaforma,no
es posible analogar marcadores de pluripotencia entre especies, sino que deben ser definidos
específicamente para cada una de ellas. Actualmente aún no existe consenso sobre cuál es el perfil de
expresiónquedefineunacélulapluripotenteequina.
PararealizarlosensayosdediferenciacióninvitroseempleóunprotocolobasadoenlaformacióndeCEyse
los expuso a suero fetal bovino como agente diferenciante. Al término de veinte días se logró distinguir
distintostiposcelulares,principalmentecélulasconmorfologíamesenquimaloneural(Figura8).Dadoque
lamorfologíadeestostiposcelularesdistadeaquelladelasCPIydelosfibroblastos,estoindicaríaquelas
célulasdelclonA5soncapacesdegenerardistintostiposcelulares.Paravalidaresteresultado,seevaluóla
expresión de genes característicos de las tres capas germinalesmediante ensayos de PCR. Se observó la
expresión génica del marcador de endodermo Sox17 y de los marcadores de mesodermo Islet-1 y
T/Brachyury. Sin embargo, a pesar de haber observado células con morfología neural no se observó
expresióndelosmarcadoresdeneuroectodermoPax6yNestina(Figura9).Valeaclararqueseexperimentó
ciertasdificultadesalquererimplementarelprotocolodediferenciaciónenestalíneadecélulasequinas.Los
CE no siempre se formaban correctamente y en la mayoría de los casos sufrían gran perdida de células
conformeavanzabaelcultivoensuspensión.Aúnexistepocainformaciónsobrelosrequisitosnutricionales
delmediode cultivosparaCPI equinas loqueevidencia lanecesidaddeponer apunto losprotocolosde
diferenciación invitro. Losreportesdeotrosgruposdescribenprotocolosmuyvariables,convariantesen
susmediosdecultivo(distintostiposyproporcióndesuero)ytiemposdecultivoensuspensión(decinco
días(32)aseissemanas(34)),sinembargoentodosloscasoslograronidentificarderivadosdelastrescapas
germinales.Lasdificultadespresentadastambiénpuedensersíntomadeunareprogramaciónincompletalo
quelimitaríalacapacidaddeestascélulasdediferenciarsecorrectamente.
ParagenerarcélulasCPIsepartiódefibroblastosfetalesequinos,obtenidosdeunamuestradeunfetoque
habíasidogeneradoporclonaciónycuyagestaciónfueinterrumpidaporunabortoinducido,debidoaque
presentabaproblemasrelacionadosconelcierredelalíneamediaventral.Estainformaciónfuedenuestro
conocimientounavezqueyasehabíaobtenidolasCPI.Porellodecidimosrealizarunanálisisdecariotipode
las células originantes. Éste análisis reveló que el 64% de las células analizadas presentó un número
cromosómicomenora64,elcaracterísticodeequinos,el8%presentóunnúmeromayoryel28%restante
resultó normal (Figura 10). Si bien se intentó analizar el cariotipo de las células del clon A5, esto no fue
posible por causas que exceden a nuestro laboratorio, por lo que estamos a la espera de un resultado
definitivo. Sin embargo, consideramos que es altamente probable que estas células también posean un
cariotipoanormal.Estopodríaexplicarenpartelagrandificultadquepresentólareprogramacióndeestas
célulasyporqué,aunqueelclonA5fueelquemayorescualidadesdeCPIreuníaencomparaciónalrestode
29
los clones generados, aún presenta deficiencias como la pobre diferenciación. Actualmente nos
encontramos adaptando las CPI a un cultivo sin capa nutricia para facilitar el análisis del cariotipo y
generandolíneasdeCPIapartirdefibroblastosadultosconcariotiponormal(Figura10B).
Duranteeltranscursodeestetrabajo,logramosinducirlaformacióndeunalíneadeCPIenunaespeciepara
la cual el campo de estudio es aún muy reciente. Debido a la falta de protocolos establecidos
experimentamosdiversos inconvenientesal intentaradaptarprotocolosempleadoscomúnmenteenotras
especies como humanos omurinos. Pese a esto logramos generar una línea de células CPI partiendode
fibroblastos fetalesequinosmediante la transfeccióndeunvector lentiviral con los genesOSKM. La línea
celular aquí estudiada presenta características asociadas a las células pluripotentes, tales como su
morfología,laexpresióndemarcadoresdepluripotencia(tantoARNcomoproteínas),elevadaactividadde
laenzimafosfatasaalcalinaycapacidaddediferenciarseadistintostiposcelulares.Deestaforma,yapesar
de las limitaciones mencionadas, hemos logrado establecer exitosamente líneas de CPI equinas con
características similares a las descriptas en la bibliografía. Estas líneas podrán, en un futuro cercano, ser
aplicadas en el desarrollo de terapias de medicina regenerativa o bien en investigación relacionada al
desarrollo embrionario, resultando beneficiosas tanto para la medicina veterinaria como para la
investigaciónbásica.
30
MATERIALESYMÉTODOS
31
CélulasUtilizadas
I. FibroblastosEquinosFetales(FEF)
Los fibroblastos equinos fetales fueron derivados a partir de una biopsia de un embrión generado por
clonacióncuyagestaciónfueinterrumpidaporunabortoespontáneo.Paraellosecolocólabiopsiaenuna
placa de cultivo conmedio DMEM 10% SFB (ver apartado ‘Condiciones de Cultivo’) de forma tal que se
adhiriera. Se mantuvo el cultivo aproximadamente una semana. Los fibroblastos equinos fetales fueron
gentilmentecedidosporCrestviewGenetics.
II. HEK293T
LascélulasHEK293TfueronprovistasgenerosamenteporellaboratoriodelDr.DiegoÁlvarez.
III. FibroblastosEmbrionariosMurinos(MEF)
Se obtuvo ratones hembra de 12 a 13 días de preñez de la cepa CD1 del Bioterio del Instituto de
Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad Nacional de SanMartín (IIB-UNSAM), los cuales fueron
sacrificadospordislocacióncervical. Enun flujo laminarvertical se limpióel abdomenconetanol70%, se
ingresóalacavidadperitonealyremovióloscuernosuterinos,quefueroncolocadosenunaplacadePetriy
lavadosconPBS.Luegoseseparólosfetosdelaplacentaydelasmembranasfetales,seloscolocóenuna
segunda placa de Petri y lavó con PBS. Seguidamente fueron decapitados y eviscerados bajo lupa
estereoscópica,pasandoeltejidoremanenteaunanuevaplacadePetridondefuelavadoconPBS.Eltejido
sedisgregóprimeromecánicamenteconhojasdebisturíy luegomedianteelagregadode10mililitrosde
Tripsina-EDTA0,25%(Gibco)yseincubódurante40minutosa37°Cen5%CO2hastaqueeltejidoestuviera
completamentedisgregado.Eltejidoprocesadofuetransferidoauntubocónicode50mlconmedioDMEM
10%SFBysedejódecantarparaluegorecuperarelsobrenadante.Elsobrenadanteobtenidofuedivididoen
XbotellasdecultivoT75(siendoX=NúmerodeEmbrionesObtenidos/3), llevandoelvolumenfinala20ml
conmedioDMEM10%SFB. Las células obtenidas fueron cultivadas a 37°C en5%CO2durante 2 a 3 días
hasta obtener confluencia, para luego ser amplificadas o criopreservadas. Para poder usarlas como capa
nutricia,fuenecesarioinactivarlasmitóticamente,paralocuallosfibroblastosfetalesfueronirradiadoscon
80Gyde radiacióngamma, servicioprovistopor la empresaCEBIRSAS.A. (Centrode Irradiación, FitzRoy
2455,CiudadAutónomadeBuenosAires,Argentina).Finalmente,secontólascélulasirradiadas(MEFi)yse
criopreservódea1,5x106célulasporcriotubo.
32
CultivoCelular
I. CondicionesdeCultivo
Los fibroblastos (tanto FEF como MEF) fueron cultivados en medio DMEM alta glucosa (GIBCO)
suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino (GIBCO), L-glutamina 2mM, aminoácidos no esenciales
2mM y penicilina-estreptomicina 50 U/ml (medio de cultivo ‘DMEM 10% SFB’). Los mismos fueron
mantenidosencultivohastaquesealcanzaraun80%deconfluencia, luegode locualfueronamplificados
y/ocriopreservados.
LascélulasCPIyCPIputativasfueroncultivadasenmedioKO-DMEM(Gibco)suplementadocon20%v/vde
KSR (KnockOut Serum Replacement, Gibco),β-mercaptoetanol 55uM (Sigma), L-glutamina 2mM (Gibco),
aminoácidos no esenciales 2 mM (Gibco), penicilina-estreptomicina 50 U/ml (Gibco), 8 ng/ml de bFGF
(Invitrogen) y 1,000U/ml LIF (Invitrogen) (medio de cultivo ‘KO-DMEM20%KSR’). Elmedio de cultivo se
cambiódiariamente.
Elcultivodecuerposembrioides(CE)fuerealizadoenplacasbacteriológicasdePetriconmedioDMEMalta
glucosa (Gibco) suplementadocon20%v/vdesuero fetalbovinoHyClone(GEHealthcareLifeSciences), L-
glutamina 2 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales 2 mM (Gibco), penicilina-estreptomicina 50 U/ml
(Gibco)(mediodecultivo‘DMEM20%HyClone’).Elmediodecultivosecambiódíapormedio.
Entodosloscasos,lascélulasfueroncultivadasa37°Ccon5%CO2.
II. Criopreservacióndecélulas
Paralacriopreservacióndefibroblastosprimeroseremovióelmediodecultivo,selavóconPBSyseincubó
conTripsin-EDTA0,25%(Gibco)porunosminutosa37°Cen5%CO2paradesprenderlascélulas.Luegode
inhibirlaenzimaconmedioDMEM10%SFB,lasuspensiónresultantefuetransferidaauntubocónicoyse
centrifugó5minutosa1300rpm.LascélulasfueronresuspendidasenmedioDMEMsuplementado20%SFB
y 10% DMSO (Sigma), que fue agregado lentamente mezclando suavemente, como criopreservante. Los
criotubos(Corning)fueroncolocadosenundispositivoMr.Frosty(ThermoScientific)conisopropanol,elcual
permiteundescensocontroladode la temperaturaa razónde1°Cporminuto,queestuvo24hsa -80°Cy
luegofuerontransferidosauntanquedenitrógenolíquido.
Para descongelar las células, los viales fueron removidos del tanque de nitrógeno líquido y rápidamente
calentadosa37°Cenunbañotérmico.Inmediatamentesetransfirióelcontenidoauntubocónicocon10ml
33
deDMEM10%SFB.Secentrifugólasuspensióndurantecincominutosa1300rpm,sequitóelsobrenadante
yseresuspendióelpelletenDMEM10%SFBysesembrólacélulasenunabotellaoplacacorrespondiente.
III. Cultivodecélulasreprogramadas
LasCPIfueronmantenidasenestadoindiferenciadocultivándolassobreunacapanutriciadeMEFi.
La capa nutricia fue plaqueada sobre una placa de cultivo pre-tratada con gelatina bovina 0,1% (Sigma)
duranteunahora,alcabodelocualsedescongelóunvialdeMEFi,yseplaqueólascélulasrepartiendolas
mismasdemaneraequitativaentrepocillos.Luegoseagitólaplacacincominutosysedejó24hsa37°Cen
medioDMEM10%SFB.
PararealizarelpasajedecélulasCPI,primeroseremovióelmediodecultivoyserealizóunlavadoconPBS,
luegoseagregócolagenasatipoIV1mg/ml(Gibco).Sedejóactuarentrecincoydiezminutosa37°C,ohasta
quelosbordesdelascoloniasempezaranasepararsedelacapanutricia.LuegoseagregómedioKO-DMEM
20% KSR para diluir la enzima, se desprendió por completo las colonias de la placa suavemente con una
pipetaautomática,ysetransfirióelvolumentotalauntubocónico.Finalmentesecentrifugócincominutos
a 1300 rpm, se resuspendió el pellet suavemente en medio KO-DMEM 20% KSR y se plaqueó
equitativamente sobre la capa nutricia de MEFi en medio KO-DMEM 20% KSR cuidando que queden
fragmentosdetamañoregular.LasCPInormalmentefueronpasadascada5a7díasenunarelación1:3.
Preparacióndeplásmidos
I. Transformacióndebacteriascompetentes
SetransformóbacteriasEscherichiacolicompetentesmedianteshocktérmicoa42°Cdurante90segundos
con 25 a 50 ng del plásmido a amplificar. Luego se incubó las bacterias enmedio LB líquido (10 g/L de
PeptonadeCaseína,5g/LdeextractodeLevadura,10g/LdeclorurodeSodio)sinantibióticodurante30
minutosa37°Cenagitación.SeplaqueólasbacteriasenplacasdePetriconteniendoLB-agar(medioLBcon
15g/Ldeagar)ampicilina(0,1ng/ml),yselasdejóa37°Cdurante16hs.Finalmenteseseleccionóalgunas
colonias,apartirdelasqueserealizómini-cultivos(50ml)enLB-ampicilinaa37°Cpor16hsenagitación.
II. Midi-Preparacióndeplásmidos
Apartirdelosmini-cultivosenLB-ampicilinaserealizóunamidi-preparaciónconelMidiPrepKit(Promega),
siguiendo las instrucciones del fabricante. Partiendo del cultivo, primero se precipitó las bacterias por
centrifugacióna5000gpor10minutos,selasresuspendióylisó,conlassolucionesderesuspensiónylisis
incluidasenelkit,mezclandoporinversiónyseincubó3minutosatemperaturaambiente.Luegoseagregó
34
lasoluciónneutralizante,mezclóporinversiónyseesperólaformacióndeunfloculado.Acontinuaciónse
colocóunacolumnadentrodeuntubocónicode50ml,seagregóallíel lisadoyse incubódosminutosa
temperaturaambiente, luegode locualsecentrifugóporcincominutosa1500gconel findeclarificar la
suspensión.Enunnuevotubode50mlsecolocóuna‘ColumnadeUnión’(delinglés‘BindingColumn’)ala
queseagregóelfiltradoysecentrifugónuevamente.Seagrególasoluciónde‘RemocióndeEndotoxinas’,
secentrifugónuevamenteysedescartóelfiltrado.Despuésseagregóalacolumnala‘SoluciónLavadode
Columnas’,secentrifugódosvecesdescartandoelfiltradoenamboscasosysedejóescurrirlacolumnaen
papel.Finalmenteserealizólaelución,paralocualsecolocólacolumnaenunnuevotubo,seagregóagua
libredenucleasasysecentrifugócincominutosa2000g.
El filtrado resultante fue colectado, se agregó 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH= 5,2) y 2,5
volúmenesdeetanol95%ysedejó15minutosenhielo.Porúltimo,secentrifugó15minutosa14000rpm,
selavócon70%etanolyseresuspendióelpelletenagualibredenucleasas.Sedeterminólaconcentración
delADNplasmídicoaisladomedianteunespectofotómetroNanoDropOne(Thermofisher).
ReprogramacióndeFibroblastosEquinosFetales(FEF)
I. ConstruccionesVirales
SeutilizóunvectorlentiviralpHAGE-STEMCCA(gentilmentedonadoporelDr.GustavoMostovlasky)enque
seencuentranclonadas lassecuenciasde losgeneshumanosOct4,Sox2,Klf4yc-Myc,quecodificanpara
factores de transcripción cruciales para la determinación y mantenimiento del estado pluripotente. Para
generar las partículas virales se realizó una co-transfección de este plásmido junto a los vectores
empaquetadoresPSPAX2(AddgenePlásmido#12260)yelvectorENV(Addgene#12259)utilizandoFUGENE
(Roche) como agente de transfección. Esto fue realizado en células HEK293T plaqueadas sobre placas de
cultivo pre-tratadas con poli-L-lisina (Sigma) durante 30 minutos en una densidad de 7x105 células por
pocillode9,5cm2.Enunacabinadebioseguridadvertical,serecolectóelsobrenadanteviral48y72hspost-
transfección, este fue clarificadomediante centrifugación a 3000 rpmdurante 10minutos a temperatura
ambiente.Finalmente,elsobrenadanteviralfueutilizadofrescosobrelosfibroblastosareprogramar.
II. MétododeReprogramación
Se plaqueó FEF (105 células por pocillo de 9,5 cm2)en medio DMEM 10% SFB. Luego de 24hs fueron
infectadosconel sobrenadanteviralclarificado.Para favorecer la infección, juntoal sobrenadanteviral se
agregóPolybrene (8ng/µl,Sigma)y secentrifugó40minutosa700g.Luegode tresdías lascélulas fueron
transferidasaunco-cultivosobreunacapanutriciaMEFiutilizandoTryPle(Gibco),ysecambióelmediopor
eldecélulaspluripotentesinducidas(KO-DMEM20%KSR).Enestepasajelascélulasfuerondiluídas1:5.
35
SeestimalaaparicióndecoloniasCPIputativasaproximadamentealdía8postinfección.Lasmismasfueron
identificadasmorfológicamente (8,9), aisladasmecánicamente con una aguja bajomicroscopio óptico en
unacabinadeseguridadbiológica,disociadasyamplificadasdemaneraclonogénicaenpocillosde1,9cm2
sobreunanuevacapanutriciaMEFienmedioKO-DMEM20%KSR.Luegode3o4pasajesmecánicos, las
célulasfueronpasadasenzimáticamenteutilizandoColagenasaIV(Sigma-Aldrich).
ValidacióndelaslíneasCPI.
I. EnsayodeActividaddeFosfatasaAlcalina(FA)
Paraevaluarlaactividaddelaenzimafosfatasaalcalina,seutilizóelKitdeActividaddeFA(Sigma).Primero
se preparó una solución con Fast Red Violet, Naftol y H2O (proporción 2:1:1), que vira a un color rojo-
violáceoenpresenciadeFAactiva.SeincubóestasoluciónsobreunaplacaconCPIpor15minutos,luegode
locualselavóconPBSysevisualizólareaccióncolorimétrica.
II. Expresióngénicademarcadoresdepluripotencia.
PreparacióndeARNtotal
Separtiódecélulascrecidasaconfluencia,quefueronremovidasdelaplacadecultivoconcolagenasatipo
IV(Gibco),pasadasauntuboeppendorfycentrifugadasa1500rpmpor5minutos.Serealizólaextracción
de ARN utilizando Trizol (Thermofisher), según las indicaciones del fabricante. Luego de resuspender las
célulasenTrizol,serealizóunaextracciónconcloroformo(J.T.Baker), seprecipitóelARNconisopropanol
(Sintorgan).Finalmenteselavóconetanol75%yresuspendióenagualibrederibonucleasas.Sedeterminó
laconcentracióndelARNaisladomedianteunespectofotómetroautomáticoNanoDropOne(ThermoFisher).
Retrotranscripción
Para latranscripciónreversaseutilizó1µgdeARNtotal, oligodT500µg/mly dNTPs1mM.Seutilizó la
retrotranscriptasa SuperScript III (Thermofisher) siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.
Brevemente,lapreparación(sinlaenzima)fuellevadaa65°Cdurante5minutosenlatermocicladorapara
lograr la desnaturalización del ARN. Luego, para evitar la renaturalización, lasmuestras fueron colocadas
inmediatamente en hielo durante cinco minutos, seguidamente se agregó FS Buffer y DTT y se llevó 2
minutos a 42°C. Finalmente se agregó 0,5µl de la enzima SuperScript III y se colocó nuevamente en la
termocicladora bajo el siguiente programa: 50minutos a 42°C para que ocurra la retrotranscripción y 15
minutosa70°Cparainactivaralaenzima.Lasmuestrasfueronalmacenadasa-20°Chastasuutilización.
36
PCR
La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 25 µl. Se utilizó la enzima ADN polimerasa TaqPol
(Thermofisher)siguiendolasinstruccionesdelfabricante.PortubodePCRsecolocó2,5µldeBufferdePCR,
1µldeMgCl250mM,0,5µldeunamezcladelos4deoxinucleótidostrifosfato(dNTPs)10mM(dATP,dGTP,
dCTPydTTP)(Thermofisher),2,5µldeprimerforward10µM,2,5µldeprimerreverse10µM,0,2µldela
ADNpolimerasaTaqDNAPolimerasa5U/µl (Invitrogen) y 2µl deADNcopia, completandoel volumena
25µlconagualibredeDNAsas.
SeutilizóelsiguienteprogramadePCR:
1.Desnaturalizacióninicialyactivacióndelapolimerasa:5minutosa94°C.
2.DesnaturalizacióndelADNmolde:30segundosa94°C
3.Apareamiento:30segundosa55°C
4.Extensión:1minutoa72°C
5.ExtensiónFinal:5minutosa72°C
Lospasos2a4fueronrepetidosen35ciclos
En loscasosde lasmuestrasdeembrionesequinosydediferenciaciones invitro,seutilizó laenzimaADN
polimerasa HotStar (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada reacción se utilizó un
volumenfinalde25µlcompuestospor12,5µldeHotStarTaqMasterMix,1µldeprimerforward10µM,1µl
deprimerreverse10µMy2µldeADNcopiaparalasmuestrasdeembrionesy5µlparalasdediferenciación
invitro,completandoelvolumenconagualibredeDNAsas.
SeutilizóelsiguienteprogramadePCR:
1.Desnaturalizacióninicialyactivacióndelapolimerasa:15minutosa95°C.
2.DesnaturalizacióndelADNmolde:30segundosa94°C
3.Apareamiento:30segundosa55°C
4.Extensión:1minutoa72°C
5.ExtensiónFinal:10minutosa72°C
Lospasos2a4fueronrepetidosen35ciclos
LassecuenciasdelosprimersutilizadosseencuentrandetalladasenlaTabla1.
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III. CaracterizacióndelInmunofenotipo
Enlosensayosdeinmunomarcaciónsefijólascélulasconparaformaldehído4%m/v(Sigma)por45minutos
yserealizótreslavadosde5minutoscadaunoconunasolución0,1%deseroalbúminabovina(BSA,Sigma)
enPBS.LuegosepermeabilizóybloqueólascélulasconunasolucióndeBSA10%tritónX-1000,1%(Sigma)
enPBSdurante45minutos.SeremoviólasoluciónyserealizótreslavadosconPBSconunasolución0,1%
BSA en PBS. Para la inmunomarcación se incubó las células con el anticuerpo primario en una solución
compuestaporBSA10%enPBSdurantedoshorasa temperaturaambienteo4°Cduranteunanoche.Se
lavótresvecesporcincominutosconunasolucióndeBSA0,1%enPBS.Luegoseincubólascélulasdurante
45minutos conel anticuerpo secundario correspondiente conjugadoa fluoróforos enunadilución1:400.
Para teñir los núcleos se utilizó 4-6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI, Sigma) 200 ng/ml, por 15 minutos.
FinalmenteserealizótreslavadosconBSA0,1%enPBSdecincominutosyseagregóunvolumenadecuado
dePBS.LosanticuerposutilizadosseencuentrandetalladosenlasTablas2y3.
Elanálisisde lasmuestrasserealizóutilizandounmicroscopio invertidodefluorescenciaOlympusFV1000
equipadoconunlaserHe-Ne543nm,controladoporelsoftwareFV10-ASW.
IV. Diferenciacióninvitro.
Paragenerarcuerposembrioides (CE) se trató lascoloniasdeCPIconColagenasa tipo IV1mg/ml (Gibco)
durantetresacincominutosparalograrsepararlasdelacapanutriciadeMEFi.Secolectólascoloniasenun
tubocónico,selasdejódecantaryselasresuspendiósuavementeenmedioDMEM20%HyClone.Luegose
transfiriólascoloniasaunaplacabacteriológicadepetrinoadherenteyselascultivódurantecuatrodíasen
suspensiónparapermitirlaformacióndelosCE.Elmediodecultivofuerenovadocada48hs.Enelquinto
díaseadhirió losCEenplacasdecultivopre-tratadascongelatinabovina0,1%(Sigma)ysecultivóquince
díasmás.
V. EvaluacióndelCariotipo.
Seevaluóel cariotipode los fibroblastos empleadospara reprogramar y de las CPI obtenidas, lo cual fue
realizadoporelLaboratoriodeBiotecnologíadel Institutode InvestigaciónsobreProducciónAgropecuaria
AmbienteySaluddelaUniversidadNacionaldeLomasdeZamora(IIPAAS,FCA-UNLZ).
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Tabla1:SecuenciasdeoligonucleótidosempleadoscomoprimersenlasreaccionesdePCR
Tabla2:Anticuerposprimariosutilizadosenlasinmunomarcaciones
Tabla3:Anticuerpossecundariosutilizadosenlasinmunomarcaciones
Anticuerpo Fluoróforo Especie Marca NúmerodeCatálogo
Anti-IgGcabra AlexaFluor488 Burro Invitrogen A11055
Anti-IgGratón AlexaFluor488 Cabra Invitrogen A11001
Anti-IgGconejo AlexaFluor568 Cabra Invitrogen A11011
TranscriptoBlanco PrimerForward(sentido) PrimerReverse(antisentido)
OCT4Equino ATTGAGACCCGAGTGAGAGG CTGATCTGCTGCAGTGTGG
SOX2Equino CACCCACAGCAAATGACAGC TTTCTGCAAAGCTCCTACCG
GAPDHEquino CATCATCCCTGCTTCTACTGG TCCACGACTGACACGTTAGG
OCT4Viral TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC TGGAAGCTTAGCCAGGTTCG
SOX2Viral TGGCTCTCCTCAAGCGTATT CAGCTCCGTCTCCATCATGTTA
Sox17Equino CATGGTGTGGGCTAAGGACG TGTAGTTGGGATGGTCCTGC
T/BrachyuryEquino CGCCTTGGAAAGTCCTGAGT TGCCAGTGGAATTAGAGCCG
Islet-1Equino CGCCTTGGAAAGTCCTGAGT TGCCAGTGGAATTAGAGCCG
NestinaEquino CCCGAAGCTGGAGCTACATT GGGCTCAGGACAGAAAGCAA
Pax6Equino CCAGTATAAGCGGGAGTGCC GTAACTGAGCGTGGGCTTCT
Anticuerpo Especie-Tipo Marca NúmerodeCatálogo
Oct3/4 ratón-monoclonal SantaCruz Sc-5279
Sox2 Cabra-policlonal SantaCruz SC-17320
Nanog Conejo-monoclonal CellSignaling 4903S
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BIBLIOGRAFÍA
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AGRADECIMIENTOS
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Enprimerlugarquieroagradeceralautodenominado‘ReproTeam’delIIB-UNSAM.AAdriánporabrirmelaspuertas de su laboratorio y brindarme la oportunidad de realizar este trabajo de tesis allí. A Caro enparticularporguiarmeconpacienciaenesteproceso,compartiendosuconocimientoeintroduciéndomeeneste vasto mundo de células madre, inconscientemente despertando mi interés por un área que antesdesconocía.Tambiénalaschicasdelgrupo,Clau,Mica,Maga,Clari,Bren,Vicky,ViviyMica(2),porsiempreescucharmeyaconsejarme,hacerqueiral laboratoriotodoslosdíasseaunaexperiencialindaydivertida,tenersiempreunmatepreparadoy,principalmente,porencontrartodaslasrazonesposiblesparafestejarconalgunatorta(obizcochitosensudefecto).Quieroahoraagradeceramiscompañerosdecursada,alallamada‘LámparadeArquímedes’,Aldi,Ax,Celes,Fleer, Flor,Guada,Hora, Santi y Seba,porhacerque las interminableshorasde cursada y estudio fuerantolerables, también por las fondue, paellas y otras excusas para juntarnos y engordar, y por intentarapasiguarmipánicoantesdecadaexamen(opeoraún:unseminario).Porotrolado,quieroagradeceraFloyOjos,‘LasNormales’,quienescompartenelrestodemilocura,quesiempre tuvieron un gesto o palabra de apoyo, aunquemuchas veces no entendieranmucho de qué leshablaba. A ‘Rolling Chickens', Geor, Pac,Misu, Chibi, Curi y Fran, que aunque ya no nos juntemos tantosiempreesunbuenmomento.Finalmente a mis padres, Oscar y Susana, que sin querer queriendo me acercaron a la biología y meempujaronparaquepudieracumplirmismetas.