Genetički pristup olakšava izučavanjedogadjaja i procesa u ćeliji, organizmu

• Proteini, su osnova strukture i funkcionisanja ćelija -fenotipa

• mutacije u genima za proteine – posledice na fenotip,izostanak ili promena strukture i/ili funkcije

• Izravni pristup – polazi od fenotipski mutiranih jedinki, ćelija, azatim otkriva gen koji kodira za protein koji nedostaje ili je izmenjen ikoji za posledicu ima izmenjen fenotip– ako se izoluje više mutanata istog gena, prati se više uloga

nekog proteina

• Reverzni pristup - polazi od gena koji se sekvencira i otkrivaju senjegove funkcije ubacivanjem izmenjenih sekvenci u genom ipraćenjem fenotipskog efekta

Upotreba mutanata ugenetici razvića

• 1940s, Edward B. Lewispokazao da mutacije mogu dase iskoriste u istraživanjimarazvića Drosophila.

• Koristio vrlo neobične mutacije,ali koje su pokazale da su geniuključeni u proces razvića

• U kasnim1970tim, ChristianeNüsslein-Volhard i EricWieschaus istražuju mehanizmeranog razvića na molekulskomnivou

• 1995, Nüsslein-Volhard,Wieschaus, i Lewis su dobiliNobelovu nagradu

Cilj je bio da se identifikuju geni koji utiču nasegmentaciju embriona kod DrosophiaDrosophila ima oko 14 000 gena, moglo bi samo nekoliko dautiče na segmentaciju, ili toliko mnogo da je nemoguće analiziratiobrazac delovanjaMutacije koje utiču na segmentaciju su većinom letali još nastupnju embriona ili larve, pa se jedinke sa mutacijom ne moguodržati i reprodukovatiUsled materinskih efekata na formiranje ose jajeta, potrebno jebilo ispitivati i materinske gene, na stupnju oociteFokusirali su se na recesivne mutacije koje su mogliumnožavati preko heterozigota

• Identifikovali su 1,200 gena osnovnih za embrionalno razvićeod kojih je oko120 osnovno za normalnu segmentaciju

• Geni su grupisani po funkcijama, mapirani i klonirani

• MUTACIJE gubitka funkcije (loss-of – function. LOF)• MUTACIJE sticanja funkcije (gain – of – function, GOF)

MUTACIJE SA GUBITKOM FUNKCIJE• većina je takvih mutacija

– menjaju aminokiselinsku sekvencu ili neki od koraka genskeekspresije

• dominantnost medju alelima zavisi od uticaja proteina nafenotip

– nulte, potpuni izostanak funkcije, recesivne• wg (wingless)- wg null mutacija – smrt u ranoj embriogenezi

– hipomorfne, delimični izostanak funkcije• produkti wg imaju funkciju više puta tokom razvića, više alela• wg hipomorfni homozigot – nema krila kao adult

– kondicionalne, temperaturno osetljive; pomak temperaturepomaže da se sagleda vreme kada je potreban neki produkt

– dominantno-negativne• ako je1 kopija gena nedovoljna – mutantni alel je dominantan –

haploinsuficijencija• ako mutacija sa gubitkom funkcije ima dominantni fenotipski efekat

dominantno-negativne

Haploinsificijencija - polovina normalne količine proteina T-lokusa nije dovoljna za normalan repKinky - neki aleli kodiraju subjedinice multimera koje blokiraju aktivnost subjedinica stvorenihnormalnim alelima

Kod proteina sastavljenih od 4 subjedinicekodirane od istog gena, dominantno-negativnamutacija može inaktivirati 15/16 multimera

• FGFR mutacija – dominantno negativna• Normalno su receptori na površini membrane gde jednim delom sa spoljne strane ćelije

vezuju faktora rasta fibroblasta (FGF), koji je ligand (molekul koji učestvuje ukomunikaciji medju ćelijama

• Vezivanje FGF za spoljni deo FGFreceptora izaziva niz promena i signalni mehanizam• Sintetisali su gen koji daje abnormalni FGFreceptor, uneli u embrion miša što je

uzrokovalo niz abnormalnosti – dokaz da FGF signal doprinosi normalnom razvojunogu, na primer.

Mutacije sticanja funkcije (gain –of-function)– daju previše proteina– obično su dominantni aleli– uzrokuju neobične tvorevine

• Dva tipa:– Mutacije koje uzrokuju višak genske funkcije– Mutacije koje izazivaju ektopijsku gensku

ekspresiju

• Mutacije koje uzrokuju višakgenske funkcijeRetke, rezultat specifičnih promena u

genu:– promotori postaju dostupniji za TF i

RNK polimerazu– konstantan signal i bez faktora rasta– povećavanje afiniteta receptora za

ligand u pogrešno vreme (FGFR3 zaFGF)

Primer: ahondroplazija..FGFR3mutacija uzrokuje da hondrociteprerano prestanu da se dele i počnudiferencijaciju bez dovoljnoprekursorskih ćelija za kost

Mutacije koje izazivaju ektopijsku gensku ekspresijuneomorfne mutacije – dominanti alel stvara novi fenotip

– Ili se stvara protein nove funkcije– Ili se stvara normalni protein, ali na drugim mestima i u

drugo vreme

Antennapedia gen, normalno daje proteinu tkivima koja će dati noge

Reverzni pristupCiljana mutageneza•Izmenom regulatornih sekvenci u promotoru nekog gena ili promenama uokviru čitanja menjaju se svojstva amino kiselina i prati promena funkcijeproteina.•Mogu se kreirati mutacije tipa genskog nokauta (trajno), nulti aleli, delecijomciljnog gena – potpuni izostanak funkcije.,•Kondicioni aleli, aktiviraju se zavisno od uslovaUtišavanje gena•Upotrebom dvolančane RNK – RNK interferenca (RNKi) ima za efekat genskinokdaun (privremen)•RNAi usmerava ćelijski sistem ka degradaciji ciljnih mRNA.Interferenca pomoću transgena•unošenjem sekvence jednog u drugi organizam stvara se transgeniorganizam, u kome tada dolazi do prekomerne ekspresije gena od interesa zaizučavanje.•Moguće je ovom metodom, prekomernom ekspresijom mutiranog gena postićivisoki nivo ali nefunkcionalnog proteina

RNK inteferenca – reverzni genetički pristup bezmutacija, bez promene u DNK

• Omogućava identifikaciju samo onihgena koji utiču na razviće, bez izazivanjamutacija

• Posttranskripciono utišavanje• U ćelije se ubrizga dsRNK koja odgovara

sekvenci i-RNK gena. To započinjedegradaciju iRNK u kratke fragmente ićelija ne može da sintetiše odgovarajućiprotein

• miRNK, siRNK• Primer: gen par-1, kod C.elegans, u

ranom razviću ima ulogu u nastanku osapolarnosti, u kasnijem – ulogu u razvićuvulve

• iRNKmetod ne dovodi do naslednihpromena pa se ne može pratiti promenakroz generacije

sklapanje komponenti..

• Da bi se razumela genetička osnova procesa razvićapotrebno je detektovati sve komponente procesa koje sukodirane genima– Saturaciona mutageneza– Skrining prekomerne ili izostajuće ekspresije

• Skrining supresorskih mutacija• Skrining mutacija pojačivača

– Skrining nealelske nekomplementacije

Saturaciona mutageneza• Identifikovati što više gena

istog puta, grupisatikomplemetacionom analizom– Mutacije se izazivaju

mutagenima, deformitetidetektuju na odraslimjedinkama, preko letala, onekoje utiču na rano razviće

• NEDOSTACI: …a) često se ne identifikuju svi geni

jer ih ima više za istu funkciju,pa mutacija u jednom nemaposledice

b) plejotropija , jedan gen za višefunkcija, pa mutacija koja utičena jednu maskira druge funkcije

Skrining prekomerne ili izostajuće ekspresije

• promotorski region se klonira i koristi da indukujeprekomernu ekspresiju na drugom mestu u drugo vreme(ektopijski).

skrining supresorskih mutacija– Nalaženje mutacije u genu koja supresuje mutaciju u drugom genuskrining mutacija pojačivača– Nalaženje mutacije u genu koja pojačava mutaciju u drugom genu

• Obe metode, iako suprotne, omogućavaju identifikacijugena koji učestvuju u istom putu

Primer za oba:• Polazi se od mutacije koja izaziva

vidljivu promenu razvića krilaDrosophila. Zatim se traga zamutacijama koje menjaju efekat

• Notch mutant (na X hromozomu)• dupli mutant (Notch i supresor) ispravlja

Notch fenotip• Notch i mutacija u pojačivaču– pojačava

Notch efekat

Skrining nealelske nekomplementacije

– Nealelska komplementacija -nastale mutacije su običnorecesivne pa se heterozigoti, sa50% normalnog produktanormalno razviju

– Nekomplementacija - u nekimslučajevima heterozigot sasimultanim mutacijama u dvaodvojena gena,ali srodnogproteina po funkciji, seabnormalno razvija

kooperacija...

• ....izolovane su mutacije, utvrdjeni su genikoji učestvuju u ishodu..

• Potrebno je analizirati kako geni zajednoodredjuju razvojne puteve, kojimredosledom, kako kooperiraju ka krajnjemishodu– Saznati što više o genu koji je identifikovan– Utvrditi na koji način geni interaguju u procesu

razvića

• Saznati što više o genu koji je identifikovan– Koji fenotip povezan sa razvićem uzrokuje mutacija u

genu?• Bitno je što ranije u razviću definisati korake koji su prekinuti

mutacijom

– Kakva je priroda proteina kodiranog od mutiranoggena?

• Završetak sekvenciranja genoma omogućava da seidentifikuje mutacija za kratko vreme jer se brzo otkrivaaminokiselinska sekvenca kada se zna sekvenca gena

vreme i mesto...Kada i u kojim tkivima se gen

eksprimira?• Jedan način je - RNK in situ

hibridizacja• Obeleži se cDNK sekvenca da

odgovara probi za iRNK nekoggena i koristi kao proba za uzorketkiva

• Ako mutacija u genu utiče narazviće tkiva drugačijeg od onog ukome se gen transkribuje, hipotezaje da gen kodira za signalnimolekul, npr hormon.

• Mnogi molekuli bitni u komunikacijićelija se sintetišu u jednom tkivu aliutiču na sudbinu ćelija u drugim kojisadrže njihove receptore

Gde se genski produkt nalazi u ćeliji, jedinki?• uvid u funkciju krajnjeg produkta gena

– konstrukcija antitela na delove odredjenihproteina

– konstrukcija gena koji kodira za obeleženiprotein koji će fluorescirati – geni “reporteri”

C) i D) Uz gen koji nasinteresuje unese se genkojikodira za zelenifluorescentni proteinmeduza (GFP)

Bojenje, reakcija antitela: A) fuzionisani genski produkt - cDNK gena seklonira uz gen koji se stvara u velikoj količini u E.coli.Ako se ovaj protein ubrizga u neku jedinku sintetišu se antitela protiv njega.B) Ako se antitela obeleže fluorescentno, može se pratiti kretanje proteina

Koje ćelije i tkiva su pogodjene gubitkomfunkcije gena?

Ako odredjeni protein nedostaje fenotipskiefekat se ne iskazuje uvek i samo na ćelijikoja ga stvara

Ćelije medjusobno komuniciraju i efekatmože biti i na nekoj daljoj ciljnoj ćeliji kojojje taj protein potreban (npr. ako žlezdastvara hormon, ne koristi ga ona, nego seprenosi cirkulacijom na neke dalje ćelijekoje za njega imaju receptor)

Genetički mozaici, himere ćelija različitoggenotipa, jedan mutantni, sa markerom zaneki gen razvića

Ustanovi se koji je gen potreban u kojoj ćeliji

• Kako utvrditi na koji način geni interaguju uprocesu razvića?– Redosled kojim mutacije zaustavljaju razviće govori o

redosledu funkcija gena, epistazama

Ako dve mutacije utiču na uzastopne korake u procesurazvića, dvostruki mutant će uticati na zaustavljanjenastanka fenotipa na ranijem stupnju

Zaključak je da je mutacija ranijeg stupnja epistatična uodnosu na drugu, tj. taj fenotip maskira drugi.

Nekada je obrnuto, epistatičan gen nije prvi u razvićui ne maskira fenotip sledećeg

Primer: formiranje vulve kod C.elegans uključuje genelet-60, lin-45, mek-2

Gain-of-function mutacija let-60 uzrokuje prekomernuekspresiju LIN-45 proteina, pa MEK-2 i formira sepreviše vulvi.

Mutacija gubitka funkcije mek-2 dovodi do suprotnogfenotipa, nema vulve

Dvostruki mutanti nemaju vulve što dovodi do zaključkada je mek-2 epistatičan u odnosu na druge iako jekasniji u procesu

Upotreba dvostrukih mutanata

• Kada se definiše distribucija iRNKnekog gena i/ili proteina u tkivima ilićelijama, potrebno je videti kakomutacije više gena utiču na distribuciju ikako medjusobno utiču jedna na drugu– Drosophila, razviće krila, wingless i

vestigial– Produkti se eksprimiraju u samo

malom delu tkiva (imaginalni disk)koje će dati krila. Jedinke samutacijom u Wg neće stvarati ni Vgprotein, što govori o njihovojzavisnosti

Rezultati epistaza se ne smeju interpretirati odvojeno• Potrebno je prvo znati prirodu mutacija uključenih u

proces (gubitak funkcije, sticanje funkcije)• Potrebno je poznavati opšti tip razvojnog puta (da li

blokada koraka uzrokuje više efekata ili samo jedan)• Potrebno je znati biohemijsku prirodu produkata, tj.

proteina nastalih u koracima (da li su to kinaze kojefosforilišu ciljne proteine ili su TF)

• Potrebno je sakupiti što više podataka pre sklapanjaslike o celom razvojnom putu, ili kolu, ili mreži