genetikk og bioteknologi litt historikk – et perspektiv · 1 lars o. baumbusch inf3350/inf4350...

1

Lars O. Baumbusch INF3350/INF4350 – Høst 2007 1

Forelesning # 6

Lars O. Baumbusch

Senter for Bioinformatikk, IFI, UiORikshospitalet - Radiumhospitalet Medical Centre

Genetikk og bioteknologi


Litt historikk – et perspektiv

1866... Grunnprinsippene for arv*1910 Arveanleggene ("genene") ligger på kromosomer

1940... Arveanleggene (genene) består kjemisk av DNA*1953 Dobbeltheliks strukturen til DNA avklares*1957 Det sentrale dogmet: DNA > Protein*

Det er rekkefølgen av baser i DNA-sekvensen som bestemmer rekkefølgen av aminosyrer i proteinet

1960 Informasjonen overføres fra DNA til protein via budbringeren mRNA

1961 Den genetiske koden "knekkes": nå vet man hvordanen DNA-sekvens oversettes til en proteinsekvens

1965 Et "atlas" over alle kjente proteinsekvenser utgis jevnlig*1970 Endel proteiner er nå sekvensert, og nå kommer

de første metoder for å sammenstille sekvenser


Bioteknologi etableres ...

1970 Første restriksjonsenzymer ble oppdaget1971 Genkloning og starten på moderne bioteknologi

1972 Protein DataBank etableres (med 10 proteiner!)

1977 De første metoder for å sekvensere DNA utvikles

1980... Automatiserte metoder for å sekvensere DNA

1988… Mer effektive metoder for sekvenssammenstilling,NCBI (National Center for Biotechnology Information) etableres

1995 Første levende organisme ferdig sekvensert 1997 E.coli ferdig sekvensert (en bakterie)

1999 Første høyere organisme ferdig sekvensert (bananflue)1999 Første humane kromosom ferdig sekvensert (#22)

2001 ”Frist draft” av menneskets genom ferdig sekvensert


Publiserte genomsekvenser (2003)

Status per september 2003:

16 archae-bakterier

121 bakterier

12 eukaryoter (heriblant mennesket)

... og mer enn 600 andre genomer

er på vei

2


Grunnprinsippene for arv

Mendels lover (1866):• Loven om uavhengig utvelgelse

Uavhengige karaktertrekk (f.eks. høyde og farge på en blomst) arves uavhengig av hverandre

• Loven om uavhengig segregeringUlike former av et gen kalles alleler.Hvert individ har to alleler for hvert gen:en allel fra far og en fra mor. Hver forelder overfører en av de to allelene for hvert gen til hvert barn

• Loven om dominansFor hvert karaktertrekk (gen) er det en allelsom er dominant og en som er recessiv, og disse forekommer i forholdet 3:1

Gregor Mendel


Genene består av DNA

• Fram til 1940-årene så man på gener som diskrete ”arvepartikler” på kromosomene, som genererer enzymer på en eller annen måte

• Det var en vanlig oppfatning at genene måttevære proteiner (siden de var kompliserte nok)

• I 1944 klarte Avery m.fl. å transformere enufarlig bakterie til en dødelig variant ved åkombinere den ufarlige varianten med en inaktivert form av den farlige varianten

• De klarte så å vise at den ”transformerende substansen” var DNA

Oswald Avery


DNA er en dobbeltheliks

• I 1953 foreslo Watson og Crick en struktur for DNA hvor to enkelttråder med DNA er bundet til hverandre (C til G, og A til T) og tvinnet som en heliks

• Modellen var basert påChagraff’s regler (A=T og C=G) og radiologiske undersøkelser fra Rosalin Franklin

• Dette ga umiddelbart en ide til hvordan DNA kunne replikeres(kopieres) når en celle skal dele seg

Watson & Crick with DNA model

Rosalind Franklin with X-ray image of DNA


Det sentrale dogmet

• I 1957 presenterte Crick noen ideer som skulle få stor betydning innen biologi

• Han argumenterte for at genenes primære rolle er å produsere proteiner

• Rekkefølgen av baser i DNA er en kode somforteller rekkefølgen av aminosyrer i etprotein. Minst tre baser må til for å kode foren bestemt aminosyre (siden det er 20 ulike)

• Informasjon overføres fra DNA (og RNA) tilproteiner, men ikke andre veien

Francis Crick

3


Bioinformatikk: Atlas over proteinsekvenser

• I 1965 var endel proteinsekvenser allerede kjent,selv om arbeidet med å finne hver av dem kunnekreve årevis med arbeid

• Dayhoff m.fl. ga dette året ut en liten bok med sekvensinformasjon for 65 proteiner. Dette var det første registeret over sekvenser

• Dette registeret – som ble oppdatert med jevnligemellomrom – var med å legge grunnlaget for moderne sekvensanalyse som er en sentralaktivitet i bioinformatikk

Margaret Dayhoff


Grunnlager i biologi - livssyklusen

n

n

• Ved meiose (2) dannes det haploide kjønnsceller fra diploide celler

Meiose (2) befruktning

2n

• Ved befruktning danner to haploide kjønnsceller til sammen en diploid zygote

Mitose (1)

• Ved gjentatte mitoser (1) dannes flere identiske celler

mitosedifferensieringmorfogeneseapoptose

• Gjennom et komplisert program dannes et nytt individ


Celle-deling

• 1. Mitotiske celle-deling– Normal celledeling– Resulterer i diploide datterceller – Dattercellene er genetisk like

• 2. Meiotiske celle-deling (reduktiv deling)– Gjelder kun primære eggceller og

spermatocyter; gir som resultat gameter (spermceller og eggceller)

– Resulterer i haploide datterceller– Dattercellene er genetisk ulike

2n

2n 2n

2n

n n n n


Cellesyklusen

G1 normal celletilstand; ikke-delende celler forblir i denne tilstanden(da ofte kalt G0)

S forstadium til mitose; DNA replikeres

G2 forstadium til mitosen

M mitose (1);cellen deler seg i to genetisk like datterceller

(fra: www.bioalgorithms.info)

4


Profase:kromosomer kondenserer ogblir synlige; bipolar spindel utviklesMetafase:kromosomer fullt kondensert og lokaliseres i ekvatorialplanetAnafase:sentromerene deler seg og søster-kromatider dras mot hver sin polTelofase:kromosomer dekondenserer og cytoplasma starter ådele seg i to(From: Molecular Cell Biology, by Lodish et al., 2000, Freeman & Co.)

Mitose (1) trinn for trinn


DNA-replikasjon• Ved celledeling må genomet dupliseres. Dette skjer ved en

prosess som kalles DNA-replikasjon

• Etter DNA-replikasjon er DNA-dobbelthelixen erstattet av to nye og identiske DNA-dobbelthelixer. Hver av de to nye DNA-molekylene har fått en tråd fra det opprinnelige DNA-molekylet.

Leading og lagging strand bruker to forskjellige mekanismer for DNA replikasjon


Meiose (2) trinn for trinn

Meiose I

Meiose II

Interfase(DNA-replikasjon)

4n

2n 2n

n n n n

2n

Profase 1Metafase 1Anafase 1Telofase 1

Profase 2Metafase 2Anafase 2Telofase 2


Meiosis (2)MeioseI: Celle separasjonProfase 1: Kromosomer kondenserer, homologe kromosomer søker sammen

og danner en tetrade. Utveksling av genetisk materiale (rekombinasjon) kan skje ved overkrysning = chiasma

Metaphase 1: Kromosomer lokaliseres i ekvatorialplatenAnaphase 1: Homologe kromosomer separeres

(søsterkromatider forblir sammen)Telophase 1: To søsterceller er dannet med et homologe kromosom

i hver søstercelle

MeioseII: Kjønnscelle formasjonProphase 2: DNA repliserer ikke Metaphase 2: Kromosomer stiller seg opp langs den i ekvatorialplatenAnaphase 2: Centromere deler seg

og søsterkromatider migrerer separat til polenTelophase 2: Celledeling er avsluttet.

Fire haploide søsterkromatider havner i hver sin haploide celle

5


Mendels prinsipper

• Gener forekommer i ulike varianter eller alleler

• Vi har alle to utgaver av hvert gen. Disse kan være ulike alleler (heterozygot) eller samme allel (homozygot)

• Segregeringsprinsippet: Hver kjønnscelle (og følgelig hvert avkom) får en av de to utgavene – og det er tilfeldig hvilken av dem det er.

• Prinsippet om uavhengig utplukk: Hvilken utgave vi får av et gen har ingen innvirkning på hvilken utgave vi får av et annet gen, forutsatt at genene ligger på forskjellige kromosomer.


Genotype og fenotype

Et gen (arveanlegg) er et DNA-segment som koder for et funksjonelt produkt

Et allel er en variant av et gen. Ulike alleler koder for litt forskjellige varianter av samme funksjonelle produkt

Et DNA-segment (f.eks. et gen) er polymorftdersom det forekommer i flere varianter i en populasjon

På grunn av polymorfi trenger ikke to individer fra samme populasjon å ha identisk DNA. Hvert individ har sin DNA-variant eller genotype

Ulike genotyper gir opphav til ulike individegenskaper. Hvert individ har sitt uttrykk eller fenotype


Haploide og diploide celler• Haploid celle (n)

– Celle med ett sett av kromosomer og gener.(Eksempler: bakterier, gameter = kjønnsceller)

• Diploid celle (2n)– Celle med to sett av kromosomer, dvs kromosomene

foreligger i par hvor begge har de samme genene– Kromosomene i et par sies å være homologe og kan

inneholde ulike varianter av de samme genene(Eksempler: de fleste celler i mennesket og i andre høyere organismer)

• Polyploid celle (3n, 4n, ...)– Bl.a. er laks og noen planter tetraploide (4n) (det ser

vi i fortsettelsen bort fra og antar eukaryot=diploid)


Heterozygot og homozygot

• For diploide organismer er genotypen for et bestemt gen gitt ved et par av alleler (allel1, allel2), siden hver av de to homologe kromosomene har "sin versjon" av genet

• En organisme/celle er homozygot med hensyn til et gen/en egenskap dersom de to allelene i et genpar er identiske

• I motsatt fall er organismen/cellen heterozygot med hensyn til dette genet/denne egenskapen

gen 1 gen 2

Heterozygot: ulike varianter av gen 1

Homozygot: samme variant av gen 2

6


Dominansmønstre

Hvordan oversettes et allelpar (allel1, allel2) til en fenotype? Flere muligheter:

Dominans: den ene allelen har prioritet over den andre (dvs allelene er dominant og recessiv) og bestemmer fenotypen alene (ex: fiolett + hvit = fiolett)

Kodominans: fenotypen har trekk fra begge de to homozygote fenotypene (ex: flekket + prikket = flekket og prikket)

Ufullstendig dominans: fenotypen har trekk som ligger mellom de to homozygote fenotypene (ex: rød + hvit = rosa)

Imprinting: fenotypen er bestemt av allelen som ble arvet fra mor (evt far) - (sjelden)


Illustrasjon: monohybrid krysning

Krysning av erter med to alleler for form:A = rund (dominant) og a = rynkete (recessiv)

Krysser to homozygoter (A,A)=AA og (a,a)=aa:

AA aax

Gameter: A a

AaF1-generasjonen

P-generasjonen

Alle avkom i F1blir runde

F2-generasjonen AA Aa Aa

0.25% 0.25% 0.25% 0.25% 3 : 1

aa


Illustrasjon: dihybrid krysning

Krysning av erter med to alleler for form og to for farge:A = rund (dominant) og a = rynkete (recessiv)B = gul (dominant) og b = grønn (recessiv)

Krysser doble homozygoter AABB og aabb:

AABB aabbx

AaBb

F1-generasjonen Alle avkom i F1blir gule og runde

P-generasjonen

Gameter: AB ab

Hva skjer når vi krysser erter i F1?


Illustrasjon: dihybrid krysning

AaBb AaBbx

Gameterab

F1-generasjonen

AB Ab aB abAB Ab aB

ab

aB

Ab

AB

abaBAbABF2 -generasjonen:

9 blir gul, rund3 blir gul, rynkete3 blir grønn, rund1 blir grønn, rynketeDvs de fordeler seg

9:3:3:1

7


Genotypen bestemmer fenotypen

genotype fenotype

Eksempel: AB0-blodtypesystemet:

AABBAB0

(A, A)(A, 0)(B, B)(B, 0)(A, B)(0, 0)

FenotypeGenotype

Komplikasjon: ikke alle fenotyper er bestemt av ett gen!


Rekombinasjon er en nesten ubegrenset kilde til genetisk variasjon

Rekombinasjon = utveksling og nykombinasjon av gener (”gene shuffling”)

• Utgangspunkt: diploid celle med n kromosompar og seksuelt paring (M1,P1), ...., (Mn,Pn) (n=23 for mennesker)

• Under meiosen dannes haploide kjønnsceller med n kromosomer• M1 eller P1 eller en rekombinasjon av dem• M2 eller P2 eller en rekombinasjon av dem• osv.

• Utveksling skje ved overkrysning = chiasma (crossing over)

• Dette gir nærmest ubegrenset genetisk diversitet til et individ, en enestående kombinasjon fra begge foreldrene og over mange generasjoner i en art


Genetisk variasjon og mutasjon

Mutasjoner

• er svert sjelden

• skje under DNA replikasjon

• er tilfeldig

• forandrer DNA sekvens/kode > ny variasjon

• er dårlig for enkeltindivid

• sjeldne, trenges flere andre faktorer i tillegg for å transformere en art


Mutasjonstyper

8


Genetic variation: Mouse and human

• Mus har 2.1 x 109 baseparerversus 2.9 x 109 i mensker

• Rundt 95% av alt genetisk materialet er identisk

• 99% av alle 30.000 gener er delt

• De 300 gener som viser ingen homologi mellom de to arterer involvert i immunologi, detoksifisering, luktesans og sex

(Scientific American Dec. 5, 2002)Lars O. Baumbusch INF3350/INF4350 – Høst 2007 30

Pause

(http://jokes4all.net/funpics/random/funpic_222.html)


Hvordan finner man gener?

• Noen ganger er en fenotype eller en sykdom knyttet til et bestemt gen - første trinn er da åfinne ut hvor genet ligger

• Vi trener tilgang til genetisk materiale fra flere generasjoner fra familier som er rammet


Slektstre av en sjelden recessiv fenotype/sykdom

(From: An Introduction to Genetic Analysis by A.J.F. Griffiths et al., 2000, Freeman & Co.)

9


Kartlegging av genomer

• Et genomkart forteller hva som befinner seg hvor i genomet

• Ved konstruksjon av genetiske kart benytter en segav lovmessigheten for arv: overføring av genetiske materiale fra en generasjon til neste

• Genomkart kan variere fra kart som bare angir relativ posisjonav gener eller markører på et kromosom til kart som angir posisjon i antall nukleotider (basepar) fra starten av et kromosom:

> Genetiske kart og fysiske kart


Genetisk kopling

La A,B,C være de maternaleog a,b,c være de paternaleallelene for de tre genene.

Forutsatt at chiasmata (= overkrysning) oppstårmed like stor sannsynlighet alle steder langs et kromosom, er det mer sannsynlig med en overkrysningmellom gen 2 og gen 3 enn det er mellom gen 1 og gen 2.

Da forventer vi flere gameter med (A,B,c) eller (a,b,C) enn med (A,b,c) eller (a,B,C).

1 2 3

Aa Bb Cc


Genetisk kopling

A B C

a b c

Overkrysning mellom gen 1 og gen 2:

Overkrysning mellom gen 2 og gen 3:

1 2 3

mindre

hypp

ig mer hyppig

A b c

a B C

A B c

a b C+ +


Konstruksjon av genetiske kart

• Betrakt to genetiske markører på hvert sitt kromosom:

a

A

b

B

kromosom 1 kromosom 2

0.25ab

0.25Ab0.25aB

0.25ABFrekvensGenotype

Homologer

• Genene segregerer uavhengig av hverandre, og genotypen som overføres til et avkom vil derfor følge disse frekvensene:

10


Konstruksjon av genetiske kart

• Betrakt to genetiske markører på samme kromosom:

a

A

kromosom 1

50%

0%0%50%To rekombinasjoner

25%

25%25%25%En rekombinasjon

50%ab

0%Ab0%aB

50%ABIngen rekombinasjonGenotype

b

B

• Fordelingen til genotypene avhenger av antall rekombinasjonermellom genene:


Genetiske markører

• Vi prøver nå å finne en kjent genetisk markøri nærheten av genet og som er genetisk koplet til genet, slik at vi kan plassere genet på et genetisk kart

• Genetiske variasjoner (i gener) som gir observerbart utslag på individets fysiske trekk (f.eks. øyenfarge)

• DNA-markører hvor biokjemiske tester kan detektere hvilke variant som er tilstede (f.eks. SNPs, mikro-satellitter, RFLPs)


Genetiske markører

• SNPs (single nucleotide polymorphisms)Individual point mutations, or substitutions of a single nucleotide, that do not change the overall length of the DNA sequence in that region. SNPs occur throughout an individual's genome.

• Mikrosatellitter (Microsatellite polymorphisms)Defined by a variable number of repetitions of a very small number of base pairs within a sequence. Oftentimes, these repeats consist of the nucleotides, or bases, cytosine and adenosine.

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLPs are variations in the restriction map of a given locus. RFLPs can result from: Point mutation creating or destroying a restriction site, insertion or deletions altering the length of a given restriction fragment.


Rekombinasjonsfrekvens

• Ved å telle opp antall parentale og antall rekombinante individer i et krysningsforsøk med to gener, kan en finne rekombinasjons-frekvensen mhp de to genene:

antall rekombinanteantall rekombinante + antall parentale

θ =

1cM

A B

a b1% av avkommet errekombinanter

• To gener eller mer generelt: loci på samme kromosom med rekombinasjonsfrekvens θ = 0.01 sies å ha genetisk avstand lik 1 centiMorgan (cM).

11


Mapping-funksjoner

1 ln(1 2 )2

1 ln[(1 2 ) /(1 2 )]4

x

x

x

θ

θ

θ θ

=

= − −

= + −Kosambi:

Ulike måter å definere genetisk avstand (i centiMorgan)ut fra rekombinasjonsfrekvens:

rekombinasjonsfrekvensgenetisk avstand (cM)x

θ ==

Haldane:

Morgan:


Genetiske kart

Genetiske kart angir posisjonen til genetiske markører på et kromosom.

Måles i centiMorgan (cM)

1 cM = rekombinasjons-frekvens 1%


Genetisk kart - fysiske kart

• Genetiske kart viser hvordan et sett med genetiske markørerligger i forhold til hverandre langs et kromosom

– kan bare brukes til å kartlegge genetiske markører– av et generelt dårlig oppløsning– ingen enkel sammenheng mellom genetisk avstand og

fysisk avstand: forholdet varierer med organisme, kromosom og kromosomlokasjon og kompliseres av fenomener som recombination hotspots

• Fysiske kart viser den fysiske posisjonen til et sett med elementer

– angir fysisk posisjon til markører (ikke begrenset til polymorfe DNA-segmenter)

– varierer i oppløsning, fra cytogenetiske kart til sekvenskart

• Integrerte genomkart = Genetiske kart + Fysiske kart


Eksempel: Entrez Map Viewer

Kartlegging av tosett med markører

Avstander i centiMorgan

Andel individer som er hetero-zygote for denne markøren

Tilstedeværelseav ulike typer markører

12


Bioteknologi etableres ... basis for bioinformatikk

1970 Første restriksjonsenzymer ble oppdaget1971 Genkloning og starten på moderne bioteknologi

1972 Protein DataBank etableres (med 10 proteiner!)

1977 De første metoder for å sekvensere DNA utvikles

1980... Automatiserte metoder for å sekvensere DNA

1988… Mer effektive metoder for sekvenssammenstilling,NCBI (National Center for Biotechnology Information) etableres

1995 Første levende organisme ferdig sekvensert 1997 E.coli ferdig sekvensert (en bakterie)

1999 Første høyere organisme ferdig sekvensert (bananflue)1999 Første humane kromosom ferdig sekvensert (#22)

2001 ”Frist draft” av menneskets genom ferdig sekvensert


Basics of biotechnology methods

• Cutting and pasting DNA– Restriction enzymes– Cloning

• Copying DNA– Polymerase Chain Reaction

• Measuring DNA length– Electrophoresis– DNA sequencing

• Hybridization– Southern blotting– Microarrays


Restriction enzymes: Cutting DNA

• Restriction enzymes are discovered in the early 1970’s– Used as a defense mechanism by bacteria

to break down the DNA of attacking viruses– They cut the DNA into small fragments

• Can also be used to cut the DNA of organisms– This allows the DNA sequence

to be in a more manageable bite-size pieces

• It is then possible using standard purification techniques(electrophoresis) to single out certain fragments and duplicate them to macroscopic quantities


Cutting DNA

• Restriction Enzymes cut DNA– cut specific at particular

sequence patterns

• DNA contains thousands of these sites

• Applying different restriction enzymes creates fragments of varying size

Restriction Enzyme “A” Cutting Sites

Restriction Enzyme “A” & Restriction Enzyme “B” Cutting Sites

Restriction Enzyme “B” Cutting Sites

“A” and “B” fragments overlap

13


Pasting DNA

Two pieces of DNA can be fused together

– Hybridization = complementary base-pairing

– Ligation = fixing bonds with single strands


Cut and paste: Cloning DNA

DNA cloning:Insert the fragment into the genome of a living organismand multiply

Vector DNA


Assembling genomes for sequencing genomes

Important for sequencing projects

Make a “DNA library”

– Some of the fragments will overlap

– Fit overlapping sequence fragmentstogether to get complete sequence


Major: Polymerase chain reaction (PCR)

– Separate the two DNA strands with heat

– Add primer sequences, and DNA Polymerase

– Creates double stranded DNA from a single strand

– Primer create a start from which double stranded DNA grows

– You get two copies

– Repeat “x”: Amount of DNA grows exponentially: 1→2→4→8→16→32→64→128→256…

14


Fundamental: Electrophoresis = “gel”

• A polymer of agarose or polyacryl amide, forms a gel with pores sizes dependent upon the concentration of the polymer

• The phosphate backbone of DNA is highly negatively charged, therefore DNA will migratein an electric field

• The size of DNA fragments can then be determined by comparing their migration in the gel to known size standards


Sequencing: Reading DNA

Given a DNA molecule it is possible to obtain all fragments that end in either A, or T, or G, or C and these can be sorted in a gel experiment

– DNA or RNA molecules are charged and move to a definite direction by applying an electric field

– DNA molecules are labeled with radioisotopes or fluorescent dyes (with a laser beam fluorescent probes can be read by automatically)


Chain termination sequencing or dideoxy sequencing

Dideoxynucleotides (ddNTPs)> interrupt chain elongation

Synthesize a complimentary chain*:

• Add target DNA and primer • Divide sample among four test tubes:

– "G" tube: all four dNTP's, ddGTP– "A" tube: all four dNTP's, ddATP– "T" tube: all four dNTP's, ddTTP– "C" tube: all four dNTP's, ddCTP

• Add DNA polymerase

• Run 4 lanes gel and read

* Primer or nucleotides are labeled withradioactivity or fluorescence

(http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/sequencing/sequencing.html) Lars O. Baumbusch INF3350/INF4350 – Høst 2007 56

Assembling Genomes – sequencing problems

• DNA fragments contain sequencing errors

• Two complements of DNA– Need to take into account both directions of DNA

• Repeat problem– 50% of human DNA is just repeats– If you have repeating DNA,

how do you know where it goes?

• Genome (sequencing, annotation and in reality)is quite “dynamic”

15


Hybridization

• Single-stranded DNA (and RNA) naturally binds to complementary strands

• Hybridization is used to locate genes, measurement of gene expression regulation, and determine the degree of similarity between DNA from different sources

• Used for Southern blotting and microarrays


Hybridization: Microarrays

• Microarray exploits the ability of single-stranded RNA/DNA to hybridize to complementary strands

• An array containing thousands of probes (BAC, cDNAs or oligos) allows the measurement of thousands of genes at the same time

• By scanning, the amount of RNA/DNA bound to the spots on the microarray is precisely measured, generating a profile of gene expression (RNA) or DNA copy number profiles (DNA)

Lars O. Baumbusch INF3350/INF4350 – Høst 2007 59(after: Brown PO and Botstein D 1999 and Perou CM et al., 2000)

referenceRNA

label with fluorescent dyes

scan red/green intensity

hybridizeprobe tomicroarray analysis

& clustering

tumorRNA

Microarrays for gene expression and copy number analysis

tissue samples


Biotechnology and Bioinformatics

(http://www.accessexcellence.org)

genetikk og bioteknologi litt historikk – et perspektiv · 1 lars o. baumbusch inf3350/inf4350...

Documents