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Génétique Moléculaire
Dr Caroline ROORYCK THAMBO
Service de Génétique Médicale
CHU PELLEGRIN
DCEM1 UFR 2 Février 2008
La génétique moléculaire médicale: son champ d’application
� Diagnostic moléculaire des maladies génétiques humaines
� Faire le diagnostic (trouver l’étiologie) d’une maladie transmise selon un mode héréditaire
� Au moyen des techniques d’analyse de l’ADN (essentiellement)
� Autres applications courantes : le dépistage des hétérozygotes, le diagnostic prénatal, le conseil génétique aux couples et aux familles
Complexités du champ d’application
� Très nombreux gènes et maladies génétiques
� Hétérogénéité tant sur les anomalies génétiques (génotype) que sur les présentations cliniques (phénotypes)
� Stratégies (et moyens d’analyse) d’un gène à l’autre, d’une maladie génétique à une autre
� La maladie génétique peut ne pas être que d’origine génétique, d’où l’élargissement du champ d’application de la génétique moléculaire vers le diagnostic de la prédisposition génétique à des maladies non exclusivement génétiques
� Au-delà du diagnostic proprement dit, la génétique moléculaire s’ouvre aussi vers une meilleure connaissance des capacités de réponse d’un patient à des agents thérapeutiques (pharmacogénétique)
En guise de plan
� Rappels fondamentaux sur les gènes et le génome
� Diagnostics moléculaires des maladies génétiques (au sens large) : Stratégies
� Evolutions récentes de la génétique moléculaire médicale
Rappels fondamentaux
introns
ATG TGAsites d’épissage
5’UTR 3’UTR
TATACAATenhLCR LCR
UTR : région non traduiteenh : enhancerLCR : locus control region
-40b-70b1-10kb
10-100kb promoteur
Région adjacente 5’ régulatrice exons
site début detranscriptionet capping
signal fin detranscription
sitepolyA
Structure d’un gène
Du gène à la protéine
GENE
(30000)
Transcription
ARN messager
(100000 – 200000)
(100000 – 500000)
PROTEINE
Traduction
…atg gct aaa tcg cgg ggg ata…
…aug gcu aaa ucg cgg ggg aua…
…Met-Ala-Lys-Ser-Arg-Gly-Ile…
GENE
PROTEINE
non muté muté
fonction normale
absence de fonctionou
fonction anormale
Maladie génétique
Environ 2000 gènes responsables demaladies génétiques identifiés à ce jour
Le génome humain
� Taille : 3 000 000 000 de paires de bases
� Le génome est hautement inhomogène (gènes et éléments répétés)
� Nombre de gènes : 30 000 – 35 000
� Proportion du génome transcrite : 12 %
� Proportion de séquences codantes : 1 - 2 %
� Eléments répétés : 30 %
� Le rôle des éléments non codants (>90%) est peu connu: régulation des gènes, maintien de la structure des chromosomes, ou simples vestiges de l’évolution?
Les polymorphismes de l’ADN
� Polymorphismes de longueur de fragments de restriction
� Polymorphismes de répétition:� Minisatellites (10 à 100 pb) (= Variable Numberof Tandem Repeats)
� Microsatellites (2 à 6 pb) (= Short Tandem Repeats)
� Single Nucleotide Polymorphisms = SNP
� Polymorphismes nombre de copies = CNV
Les Microsatellites
� Répétition en tandem de di- tri- ou tétra-nucléotides
� Typiquement formés de dinucléotides CA n>12
� Distribution homogène dans le génome (tous les 6 à 10 Kb)
� Issus du « dérapage » de la réplication
� Hautement polymorphes: 6 à 15 allèles/locus
> INFORMATIVITE ELEVEE 80 – 90 %
� Marqueur de choix pour les empreintes parentales
MICROSATELLITES
Génotypage : PCR avec une amorce fluorescente, séquenceur automatique
allele 1
allèle 2
allèle 3
= CA, CAC, CACT oligonucléotidepour PCR
CEN
D15S128 D15S986
D15S97
D15S1002 D15S1048
D15S165
D15S1007
D15S210
Gène PGènes UBE3A/SNRPN
0,3 0,8 1,08 0,1 1,44 1,4 2.470,1
344 Kb
TEL
D15S1019
0.2
D15S217D15S156 D15S1233
(Mb)
Gène UBE3A
102 Kb
D15S122
D15S1021
0,1 0,6
D15S1035
2
Locus AOC2 15q11.2
Exemple d’utilisation des microsatellites:
recherche de délétion à un locus donné
Microsatellites Analyse de fragments
Père
Cas index
Soeur
Mère
D15S217
D15S128
Père
Cas index
Soeur
Mère
Non delete178-184164-188172-188178-188164-172D15S 1007
Non delete-200-222200-228200-224228-222D15S 1048
Non delete208-212208-212208-212208-212208-208D15S 1019
Delete176-190176160-176176-188160-180D15S 217
Non informatif231-231219219-231219-221219-231D15S 156
Delete106-120106106-118106-106116-118D15S 1002
DeleteNon informatif-185185-185185-185185-185D15S 986
Delete147-147153147-153147-153145-147D15S 122
Delete191-201199199-205197-199205-205D15S 128
Non informatif136-136136136-148136-136136-148D15S 1021
Non delete247-247176-180176-254180-254176-256D15S 1035
PCR semiQ BaranCommentairesTemoinBaran 040578Soeur 040579Pere 040577Mere 040576
Mise en évidence d’une délétion chez le cas index
Les SNPsSingle Nucleotide Polymorphisms
� 80% de tous les polymorphismes� 1/1000 pb� Bialléliques (moins informatifs que les microsatellites)� Plus stables que les microsatellites� Génotypage par test + ou - , automatisable
Carte des SNPs :
- identification des SNPs par séquençage (génome, EST), SSCP, DHPLC, analyse bioinformatique
- plus d’un million de SNP déjà répertoriés : très grande densité- extra- ou intra-géniques (régions codantes, promoteurs)- optimisation de la carte: régions riches en gènes, fonction
du taux de recombinaison des différentes régions du génome
Applications liées à l’étude de SNP
� Recherche d’anomalies de dosage génique� CGH array avec plusieurs milliers de SNP
o Etude de gènes candidats en pharmacogénétique
POLYMORPHISMES DE NOMBRE DE COPIESCNV: Copy Number Variation
o Délétions/Duplications
o Dus à la présence de duplications segmentaires
o Une des sources les plus importantes de polymorphis me
o Représente environ 12% du génome ( Redon et al., 2006 )
o Concerne des segments de quelques kb à plusieurs centaines, voire milliers, de kb
o Peuvent contenir plusieurs gènes
CNV: intérêt en CGH array
Validation des anomalies de dosage génique en CGH array� Nombreuses publications avec plusieurs centaines de témoins issus des banques mondiales (HapMap..)
� Bases de données sur les CNV:� Database of Genomic Variants (Toronto)
� Database of Sanger Institute
Les mutations géniques
1) Petites délétions, duplications, insertions, inversions intragéniques : taille: quelques dizaines de bases à quelques kbavec ou sans décalage du cadre de lecturedécalage : structure anormale, aboutit à codon STOP
2) Mutations ponctuelles : - non sens : STOP (TAA, TGA, TAG)- faux sens : substitution d’un AA par un autre (pathogénicité?)- création/abolition d’un site d’épissage- délétion, insertion d’1 ou plusieurs nucléotides (2 - 5) : décalage du
cadre de lecture
3) Mutations instables avec amplification :- (CGG)n : X fragile- (CTG)n : Steinert- (CAG)n - polyglutamines : maladies neurodégénératives- (GAA)n : Friedreich- (GCG)n - polyalanines- (CCCCGCCCCGCG)n
Se rencontrent dans : éléments régulateurs, exons, introns, jonctions int ron-exon
Conséquences possibles des mutations ponctuellesd’un gène et de ses régions régulatrices
Diagnostic moléculaire des maladies génétiques
DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
o de sujets atteints : diagnostic de certitude, prise en charge spécifique, prévention, pronostic
o de « porteurs sains » de la mutation (maladies récessives)
> permet le conseil génétique
o fœtal : diagnostic prénatal
o diagnostic préimplantatoire
o diagnostic présymtomatique (législation)
DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
o Cas du gène exprimé dans un tissu profond, dont la fonction est difficile à mettre en évidence : analyse du produit du gène impossible
o Le gène peut être analysé sur n'importe quelle cellule (globules blancs)
o Diagnostic possible dans certains cas même si gène non identifié
Le matériel biologique
� Analyser quoi?
o ADN génomique
o ARNm (>ADNc)
� Où? (le génome est partout)
o Cellules nuclées du sang
o Cellules de desquamation buccale
o Cellules de la racine du cheveu
oEct…
� Type de prélèvement
o Sang (leucocytes) prélevé sur tube avec anticoagulant EDTA +++ (3 ml)
o Sang séché sur papier buvard
o Prélèvement biopsique
Cas du diagnostic prénatal
� Prélèvements par voie trans-abdominale
� Villosités choriales (cellules du trophoblaste, 9ème-11ème SA) (avantage= pas de culture+++)
� Amniocytes (cellules du liquide amniotique, 17ème SA)
Extraction, purification, quantification de l’ADN
� Méthodes manuelles et automatiques
� Procédé classique� Phénol : dénature les protéines� Chloroforme : élimine les traces de phénol� Protéinase K : hydrolyse les protéines
� Quantification : spectrophotométrie UV� 260 nm : absorbance des acides nucléiques� 280 nm : absorbance des protéines� Rapport DO (260 nm)/ DO (280 nm) = 1,8 � < 1,8 : mauvaise qualité d’ADN
Stratégies d’analyse des mutations géniques
DIAGNOSTIC DIRECTRECHERCHE DE DELETIONS/DUPLICATIONS
• Situation normale au niveau somatique :• séquences autosomiques : 2 copies• séquences portées par X et Y : fille 2X; garçons 1X, 1Y
• Nombreuses situations pathologiques avec aneusomie :• microdélétions : cancers, Di-george, Williams-Beuren, Rubinstein-Taybi,
Duchenne, retards mentaux (télomères 6-8%), surdités …• duplications : CMT1A, …• amplification : cancers
• Intérêt analyse de la ploïdie :• diagnostic• identification de gènes responsables de maladies : clonage positionnel
• Techniques• Southern Blot, PCR semi quantitative ou quantitative, FISH, CGH array…
Southern Blot- Principe
� Digestion de l’ADN par enzyme de restriction
� Séparation des fragments de restriction par électrophorèse sus gel d’agarose
� Transfert des fragments d’ADN du gel sur membrane de nylon
� Hybridation de la membrane par une sonde spécifique marquée au P32
� Exposition sur un écran et révélation
Southern Blot- X fragile
M Marqueur1 Garçon normal (Villosité)2 Fille normale3 Garçon muté4 Garçon muté5 Fille normale6 Garçon normal7 Garçon normal8 Fille normale9 Garçon muté10 Fille mutée (Villosité)11 Garçon muté
Southern Blot- X fragile
PCR semi-quantitative et quantitative
� Plusieurs techniques: QMF-PCR, QM-PSF, MLPA, MPLC, PCR-Q avec Sybrgreen ou avec sondes Taqman
� Principe QMF-PCR: (Niel et al. 2004)� Amplification multiplex en condition limitante (23 à 24 cycles)
� Analyse des pics sur séquenceur automatique
� Comparaison de la hauteur des pics entre témoins et patients
QMF-PCR
P e a k he i gh t E x o n sE x o ns T h 0 3 0 8 5 7 D S C R 1 F c IX E x o n2 E x on 3 E x on 7 E x o n1 0 E x on 1 5 E x on 2 0 E x on 2 4 E x on 2 5D SC R 1 5 07 4 1 8 9 1 - 0 ,9 2 2 ,7 6 2 ,1 1 2 ,1 9 1 , 6 0 1 , 9 4 1 , 9 4 1 ,0 2 0 ,9 6
Fc IX 2 55 6 1 0 3 4 1 , 0 9 - 3 ,0 0 2 ,2 9 2 ,3 8 1 , 7 4 2 , 1 1 2 , 1 0 1 ,1 1 1 ,0 5E x on 2 4 90 7 6 6 2 0 , 3 6 0 ,3 3 - 0 ,7 6 0 ,7 9 0 , 5 8 0 , 7 0 0 , 7 0 0 ,3 7 0 ,3 5E x on 3 7 00 1 1 2 3 8 0 , 4 7 0 ,4 4 1 ,3 1 - 1 ,0 4 0 , 7 6 0 , 9 2 0 , 9 2 0 ,4 8 0 ,4 6E x on 7 6 01 5 1 0 2 2 0 , 4 6 0 ,4 2 1 ,2 6 0 ,9 6 - 0 , 7 3 0 , 8 9 0 , 8 8 0 ,4 6 0 ,4 4
E x o n1 0 4 76 3 1 1 0 8 0 , 6 2 0 ,5 8 1 ,7 2 1 ,3 2 1 ,3 7 - 1 , 2 1 1 , 2 1 0 ,6 4 0 ,6 0E x o n1 5 4 08 3 7 8 3 0 , 5 1 0 ,4 7 1 ,4 2 1 ,0 8 1 ,1 3 0 , 8 2 - 1 , 0 0 0 ,5 2 0 ,5 0E x o n2 0 5 55 3 1 0 6 9 0 , 5 2 0 ,4 8 1 ,4 3 1 ,0 9 1 ,1 3 0 , 8 3 1 , 0 0 - 0 ,5 3 0 ,5 0E x o n2 4 5 00 5 1 8 2 9 0 , 9 8 0 ,9 0 2 ,7 1 2 ,0 7 2 ,1 5 1 , 5 7 1 , 9 1 1 , 9 0 - 0 ,9 5E x o n2 5 6 37 3 2 4 6 2 1 , 0 4 0 ,9 5 2 ,8 6 2 ,1 8 2 ,2 7 1 , 6 6 2 , 0 1 2 , 0 1 1 ,0 6 -
P e a k he i gh t E x o n sE x o ns T h 0 3 0 8 5 7 D S C R 1 F c IX E x o n2 E x on 3 E x on 7 E x o n1 0 E x on 1 5 E x on 2 0 E x on 2 4 E x on 2 5D SC R 1 5 07 4 1 8 9 1 - 0 ,9 2 2 ,7 6 2 ,1 1 2 ,1 9 1 , 6 0 1 , 9 4 1 , 9 4 1 ,0 2 0 ,9 6
Fc IX 2 55 6 1 0 3 4 1 , 0 9 - 3 ,0 0 2 ,2 9 2 ,3 8 1 , 7 4 2 , 1 1 2 , 1 0 1 ,1 1 1 ,0 5E x on 2 4 90 7 6 6 2 0 , 3 6 0 ,3 3 - 0 ,7 6 0 ,7 9 0 , 5 8 0 , 7 0 0 , 7 0 0 ,3 7 0 ,3 5E x on 3 7 00 1 1 2 3 8 0 , 4 7 0 ,4 4 1 ,3 1 - 1 ,0 4 0 , 7 6 0 , 9 2 0 , 9 2 0 ,4 8 0 ,4 6E x on 7 6 01 5 1 0 2 2 0 , 4 6 0 ,4 2 1 ,2 6 0 ,9 6 - 0 , 7 3 0 , 8 9 0 , 8 8 0 ,4 6 0 ,4 4
E x o n1 0 4 76 3 1 1 0 8 0 , 6 2 0 ,5 8 1 ,7 2 1 ,3 2 1 ,3 7 - 1 , 2 1 1 , 2 1 0 ,6 4 0 ,6 0E x o n1 5 4 08 3 7 8 3 0 , 5 1 0 ,4 7 1 ,4 2 1 ,0 8 1 ,1 3 0 , 8 2 - 1 , 0 0 0 ,5 2 0 ,5 0E x o n2 0 5 55 3 1 0 6 9 0 , 5 2 0 ,4 8 1 ,4 3 1 ,0 9 1 ,1 3 0 , 8 3 1 , 0 0 - 0 ,5 3 0 ,5 0E x o n2 4 5 00 5 1 8 2 9 0 , 9 8 0 ,9 0 2 ,7 1 2 ,0 7 2 ,1 5 1 , 5 7 1 , 9 1 1 , 9 0 - 0 ,9 5E x o n2 5 6 37 3 2 4 6 2 1 , 0 4 0 ,9 5 2 ,8 6 2 ,1 8 2 ,2 7 1 , 6 6 2 , 0 1 2 , 0 1 1 ,0 6 -
Principe de la technique de CGH-Array
Elle permet la comparaison du nombre de copie d'une région génomique dans un ADN génomique à tester par rapport à un ADN de référence.
Co-hybridation de deux sondes (ADN test + ADN de référence ) marquées avec des fluorochromes différents (Cyanines 3 et 5) sur une biopuce portant un clone de la région
d’intérêt (BACs, cosmides, produits de PCR, cDNAs)
Clone « normaux » dans l’ADN à tester
marquagemarquageMélange et co-hybridation
Clone délétés dans l’ADN à tester
Clone amplifiés dans l’ADN à tester
ScanMesure des intensités de fluorescence
ADN test ADN de référence
Puces ADN ( macroarray et microarray )
• Sondes– oligonucléotides de synthèse ou produits PCR– spécifiques de certains gènes– permettent de détecter des cibles complémentaires m arquées et
présentes dans le mélange à analyser
• Sondes immobilisées sur un support solide (matrice)– Membrane de nylon (densité de dépôt faible) [macroarray]– Lame de verre (densité de dépôt forte) [microarray]
• Sondes marquées– Radioactivité [ macroarray]– Fluorescence (cyanines 3 et 5) [microarray]
• Détection des signaux d’hybridation– Phosphoimager [ macroarray]– Scanner de fluorescence [microarray]
• Logiciels d’analyse d’image, de traitement des résu ltats, de quantification
Lame CGH 244K :Un clone tous les 5 à 10 Kb
Stratégies d’analyse des mutations géniques
Recherche d’une mutation connue
a1
a2
Amplification PCR d’un fragment portant la mutation
Détection de la mutation
DIAGNOSTIC DIRECT DE LA MUTATIONMUCOVISCIDOSE : MUTATION ∆∆∆∆F508
Gène CFTR : cystic fibrosis conductance transmembrane regulator
Ile Pheallèle normal : ....... C ATC TT T GG .......
allèle DF508 : ..... C AT- - -T GG .......Ile
PCR
F508
électrophorèse :allèle normal : 97 pballèle ∆F508 : 94 pb
N/N N/∆∆∆∆F ∆∆∆∆F/∆∆∆∆F
97 pb94 pb
DIAGNOSTIC DIRECT DE LA MUTATIONMUCOVISCIDOSE : MUTATION G551D
Gène CFTR : cystic fibrosis conductance transmembrane regulator
allèle normal : ....... GGT CAA CGA .......allèle G551D : ....... GAT CAA CGA ...….
(site HincII : GTCAAC)
HincII
PCR
digestion HincII
allèle normal allèle G551D
850 pb
530 pb 320 pb
530 pb
320 pb
N/N N/ΜΜΜΜ ΜΜΜΜ/ΜΜΜΜ
530 pb320 pb
850 pb
Recherche en une seule étape de 8 mutations du gène CFTR par hybridation inverse
Stratégies d’analyse des mutations géniques
Cas des gènes avec de nombreux exons
C’est le cas général
Exemple : mucoviscidose 27 exons ; plus de 1000 mut ations
1er temps : recherche des mutations les plus fréque ntes [de30 à 40) incluant F508del (environ 65%)]existence de kits commerciaux
2ème temps : recherche des autres mutations par balaya ge des 27 exons
Principe : recherche par différentes techniques électrophorétiques
ou chromatographiques d’une anomalie sur un exon et séquençage de cet exon
BALAYAGE D’EXONS
mutation
? ? ? ? ? ?
Amplification PCR de chacun des exons
Amorces dans les introns à environ 50 pb des exons(jonctions intron – exon)
Eventuellement analyse du promoteur et de régions int roniques
2) Analyse des homo et hétéroduplex: DGGE, DHPLC, HRM
1) Analyse des simples brins:SSCP
ou
Balayage d’exons par analyse de polymorphisme de co nformation du simple brin (SSCP, single strand conformation polymo rphism)
Principe : dans des conditions non dénaturantes (i. e. très différentes de la DGGE), l’ADN mono brin adopte une structure secondaire dictée par sa séquence
Le changement d’un seul nucléotide va entraîner un changement de structure secondaire, donc une modification de la migration électrophorét ique
Principe des hétéroduplexes
G T G C A T A C A C T G
Homoduplexesauvage
Homoduplexemuté
Homoduplexemuté
HétéroduplexesHomoduplexe
sauvage
Après amplification par PCR, l’ADN est à nouveau dénaturé et on augmente progressivement la température
> En cas d’hétérozygotie du patient il y a formation de quatre populations
Balayage d’exons par électrophorèse en gradient de gel dénaturant (DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis)
Principe : Dans des conditions dénaturantes, selon qu’il con tient ou pas une simple mutation ponctuelle, un même segment d’ADN n’aura pas la mêm e résistance à la dénaturation
En cas de mutation, il y aura ralentissement à la mi gration pour un double brin ADN muté/mutépar comparaison un ADN muté/normal
DHPLC
NV
Time (Minutes)6543210
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
MUT1 57.5T10 57.5T11 57.5T12 57.5
Time (Minutes)21
Abs
orba
nce
(mV
)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Principe: Dans des conditions de dénaturation parti elle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les h omoduplexes et hétéroduplexes
Technique HRM (high resolution melting, fusion haute r ésolution)
Technique qui permet, après une PCR, de discriminer , sur une montée en température très progressive, les différents variants amplifiés, et ce avec un simple fluorochrome intercalant.
En effet, l’utilisation de cette nouvelle chimie sa ture complètement les structures doubles brins et permet de distinguer des variations, même d’une seule base, selon le profil de dénaturation.
Flu
ores
cenc
e
Var
iatio
n de
fluo
resc
ence
Température Température
Homozygote allèle sauvage (GG)
Homozygote allèle sauvage (GG)
Homozygote allèle muté (AA)
Homozygote allèle muté (AA)
Hétérozygote (GA)
Hétérozygote (GA)
Exemple: Mutation G20210A du gène de la prothrombine (facteu r II)
O1’
2’3’
4’
Base
OH
HO – P – O – P – O – P – O – CH2
OH OH OH
OO O5’
désoxyribonucléotide (dNTP)
O1’
2’3’
4’
BaseHO – P – O – P – O – P – O – CH2
OH OH OH
OO O5’
didésoxyribonucléotide (ddNTP)
SÉQUENÇAGE par la méthode de Sanger dite méthode enzymatique
en présence de didésoxyribonucléotides (ddNTP)
Gène de taille modeste (quelques exons)
Séquençage direct
Hétérogénéité des gènes et mutations connues
Une centaine5118 Kb11q14.3Gène TYR (albinisme oculo-cutané)
Polymorphisme (allèle de prédisposition)
Unique
Très nombreusesDe types très variés
NombreusesDe types très variés
Nb de Mutations
2943 Kb2pGène de l’apolipoprotéine B100 (hypercholestérolémie familiale)
19q13.2
7q31.2
Xp21.2
Localisation
43,6 KbGène de l’apolipoprotéine E (dyslipémie III)
27250 KbGène CFTR (mucoviscidose)
792,5 MbGène de la dystrophine (myopathie de Duchenne et Becker)
Nbd’exons
Taille (kb)
Gène (maladie)
Stratégies d’analyse des mutations géniques
DIAGNOSTIC SEMI-DIRECT
- Gène connu - Mutation inconnue (nombreuses mutations)
Analyse de liaison génétique avec marqueurs polymorphes intra- ou juxta-géniques
Marqueurs utilisés : microsatellites
marqueurs à distance # 0 cM du gène
1cM 1cMjuxta 1 intra juxta 2
GENE
DIAGNOSTIC PRENATAL SEMI-DIRECTMaladie récessive liée à l’X
Risque d’erreur associé au diagnostic : 0.01 x 0.01 = 0.01 %Très faible car marqueurs très proches de la mutation
Mk1Mk2
13
13
13
13
21
25
25
13
21
21
21
25
21
1cM 1cMjuxta intra juxta
GENE
Mk1 Mk2
DIAGNOSTIC INDIRECT
- Gène inconnu(pas de marqueur intra ou juxta)
Analyse de liaison génétique avec marqueurs polymorphes extra-géniques
Marqueurs utilisés : microsatellites
GENEextra 1 extra 2
7 cM 10 cM
=> Nécessité d'utiliser deux marqueurs flanquants
DIAGNOSTIC PRENATAL INDIRECTMaladie récessive liée à l’X
Risque d’erreur associé au diagnostic
avec les deux marqueurs : 0.07 x 0.1 = 0.7 % : acce ptableavec le marqueur extra 1 seul : 7 % : inacceptableavec le marqueur extra 2 seul : 10% : inac ceptable
GENEextra 1 extra 2
7 cM 10 cM
Mk1 Mk2
Mk1Mk2
13
13
13
13
21
25
25
13
21
21
21
25
21
� Découverte de nombreux nouveaux gènes:
� Modification des connaissances sur les modes d’hérédité
� Modification des stratégies d’analyse moléculaire (exemple pratique du diagnostic de l’AOC)
� Classification moléculaire des maladies : albinisme oculo-cutané, rétinite pigmentaire, surdités, MAPKinases-pathies
� Décryptage de voies métaboliques, de signalisation, développementales=> hypothèses fonctionnelles pour identifier de nouveaux gènes
Evolutions conceptuelles
� Pharmacogénétique et pharmacogénomique
� Mise au point de nouveaux médicaments
� Génétique des maladies multifactorielles
� Evolution techniques : PCR temps réel, puces ADN
� Corrélation génotype – phénotype, aspects de pronostic
Evolutions conceptuelles
Hétérogénéité génétique de l’albinisme oculo-cutané.Implications pour le diagnostic moléculaire
Albinisme oculo-cutané(AOC)Introduction
� Maladie génétique, de transmission autosomique récessive, caractérisée par une dépigmentation de la peau, des phanères, et des yeux.
� Quatre types d ’AOC non syndromique (1,2,3,4).
� Incidence mondiale générale : 1/20 000.� L’AOC 2 est le plus fréquent, mais variations d ’un continent à l ’autre.
Symptomatologie
� Leucodermie homogène généralisée� Phanères dépigmentés de couleur variable� Atteinte oculaire: iris dépigmenté, photophobie, nystagmus, strabisme, acuitévisuelle réduite, absence de vision binoculaire par anomalie du trajet des nerfs optiques
� Hypersensibilité aux UV > risque accru de cancer cutané.
Physiopathologie de l’AOC
� Défaut de biosynthèse des polymères de mélanine au sein des mélanocytes.
� Anomalie de maturation des mélanosomes� Dysfonction d ’une ou plusieurs protéines
mélanosomales : TYR, P, TYRP1, TYRP2, MATP� Blocage dans le cycle de synthèse de la
mélanine
Cycle de synthèse de la mélanine
Diagnostic de l’AOC
� Clinique � Ophtalmologique: étude des segments antérieur et
postérieur, électrophysiologie oculaire.� Dermatologique:
� Recherche de l’activité DOPA oxydase de la tyrosinase sur bulbe de cheveu�AOC 1: activité négative �AOC 2, 3, et 4: activité positive
� Biopsie cutanée: étude en microscopie électronique de la morphologie de mélanosomes
Diagnostic génétique de l’AOC
HETEROGENEITE GENETIQUE: 4 gènes connus :� gène TYR (tyrosinase) en 11q14.3 (AOC 1) 5 exons >100 mutations
� gène OCA2 (pink-eyed dilution) en 15q12q13 (AOC 2) 25 exons >60 mutations
� gène TYRP1 (tyrosinase-related-protein 1) en 9p23 (AOC 3)8 exons -5 mutations
� gène MATP (membrane associated transporter protein) en 5p13 (AOC 4) 7 exons -24 mutations
(Albinism Database: http://albinismdb.med.umn.edu/)
Stratégies d’analyse moléculaire
� Analyse de liaison génétique à l’aide de marqueurs microsatellites dans les familles informatives, aux loci AOC 1, AOC 2, AOC 3, AOC4.
� Étude moléculaire des 4 gènes (TYR, OCA2, TYRP1 et MATP) chez les cas isolés : � gène TYR par séquençage direct � gènes OCA2,TYRP1 et MATP par DHPLC puis séquençage des variants.
Présence de 2mutations
Évocation Diagnostic différentiel
Absencede 2 mutations
Recherchedélétion et mutation
TYR
Diagnostic d’AOC 1
Recherche délétion et mutation
OCA2
Absencede 2 mutations
Diagnostic d’AOC 2
Présence de 2mutations ou délétion
Recherche délétion et mutation
TYRP1
Présence de 2mutations
Absencede 2 mutations
Diagnostic d’AOC 3
Absencede 2 mutations
Recherche délétion et mutation
MATP
Présence de 2mutations
Patient caucasien
Patient noir d’origine africaine
Diagnostic d’AOC 4
Mesure activitéTyrosinase sur bulbe de
cheveu
Recherche délétion récurrente 2,7 Kb
exon 7 OCA2
Négative
Positive homozygote
Diagnostic d’AOC 2
Positive hétérozygote ou négative
Positive
Arbre décisionnel AOC
Exemple de Tony D
T373K/-
TYR
T373K/--/-
R290G/-
OCA2
R290G/--/-
Pas de digénisme. Mécanisme?
Exemple de Tony D
Classification moléculaire des maladies et décryptage de voies métaboliquesexemple des MAPkinases-pathies
PY
PY
PY
PY
PY
PY
La voie Ras
Récepteur
NRAS KRAS HRASRasGAP
SHP-2Grb2SOS
BRAF
MEK1
ERK1
MEK2
Neurofibromatose
Syndrome de Noonan(40%) Syndrome
LEOPARD
Syndrome CFC
CRAFARAF
ERK2
KinasesMNK1,2MSK1,2RSK
F de transcriptionPPARγELK1ETSSTAT1,3
Expression de gènesProgression du cycle cellulaireMort cellulaire
Syndrome de Costello
Syndrome de Noonan(<5%)
Niihori & al, 2006Rodriguez-Viciani & al, 2006
Syndrome de Noonan
� Incidence: 1/1000 à 1/2500 naissance� Gènes
� PTPN11: 50% (code pour Shp2)� KRAS: <5% (Schubbert et al., Nat genet Mars 2006)� SOS1: 20% des patients PTPN11 ou KRAS négatifs (Roberts et al., Nat genet Janvier 2007)
> Hétérogénéité génétique� Syndrome allélique: syndrome de LEOPARD (PTPN11)
� KRAS muté dans le CFC syndrome…
Syndrome de Noonan
Syndrome de LEOPARD
Syndrome de Costello
� Syndrome rare ++� Mutations dans les gènes HRAS (90%) et récemment KRAS2
� Phénotype plus sévère
Conclusion
� La génétique moléculaire médicale= domaine de connaissance en constante évolution� Mucoviscidose : deuxième gène SCNN1Bidentifié dans les formes modérées…
� Implications pour l’analyse moléculaire� Implications pour le conseil génétique:
� Identification de nouveaux gènes = nouveaux diagnostics
� Détermination d’autre modes d’hérédités � Corrélations génotype/phénotype, pronostic