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Génie métabolique chez les végétaux
Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique
www.imagesdepicardie.com
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Génie métabolique
Optimisation des procédés de fermentation industrielle basée sur la compréhension et la modulation de voies métaboliques
Conditions de culture Génie génétique
Définition valable pour seulement pour des aspects très restreints du génie métabolique chez les végétaux
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« Champs de microbes » : utilisation industrielle de bactéries photosynthétiques par
l’entreprise Solazyme
Protéines recombinantes
Caroténoïdes
Masanaru Misawa
Production de métabolites secondaires par le biais de cultures de cellules ou de tissus
végétaux en bioréacteurs
Ex: Shikonine
Génie métabolique végétal dans le cadre de cultures en « bioréacteurs »
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Génie métabolique appliqué aux « plantes entières »
Productivité Assimilation des éléments Tolérance aux stress Phytoremédiation
Qualité Augmentation des teneurs
Vitamines, Principes actifs médicamenteux, Pigments, Parfums, Arômes, Acides gras insaturés …
Diminution des teneurs Glucosinolates, Acide érucique, Arômes
indésirables, Tannins, Lignine
Points abordés dans les cours
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Génie métabolique appliqué à la production de composés à usage pharmaceutique et cosmétique
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Principaux métabolites secondaires utilisés dans l’industrie pharmaceutique et cosmétique
Alcaloïdes Alcaloïdes indoliques Etc..
Composés mixtes et glycosides Glycosides cardiotoniques
Composés phénoliques Flavonoïdes, quinones … etc…
Isoprénoïdes Tocopherol…etc..
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Le problème de la production des métabolites IIaires
Synthèse organique Lorsqu’elle est possible…
Culture de plantes au champ Lorsqu’on la maîtrise
Culture in vitro Lorsque les molécules en valent la peine…
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Synthèse organique : les plantes comme modèle
• Souvent possible, à bas prix Ex : aspirine
• Mais, ce n’est pas toujours possible…
Réaction de Kolbe
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Culture de plantes aux champs
Plantes médicinales ~7000 ha en France Culture peu coûteuse
Mais, ce n’est pas toujours possible…
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Exemples de plantes médicinales difficiles à cultiver
L’if
Pervenche de Madagascar
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Autres organismes biologiques
Expression hétérologue de gènes de plantes chez d’autres microorganismes hôtes ?
Caractères fortement polygéniques Expression étroitement coordonnée de
plusieurs dizaines de gènes dans la synthèse d’un seul métabolite
Génie métabolique appliqué aux végétaux
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Cultures in vitro pour la production de métabolites secondaires
Un dogme ancien et erroné : « les suspensions cellulaires ne produisent pas de métabolites secondaires » (1940-1970)
Une technologie récente (1975-1985) et des résultats assez peu nombreux…
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Les espoirs initiaux
1956 : Pfizer inc. Dépose un brevet concernant la production de métabolites par des cultures cellulaires de plantes
Fin des années 60 : La visnagine et la diosgenine sont produites à plus
fortes concentrations dans des cultures cellulaires que dans les plantes
Ça « coince » avec les molécules les intéressantes : vinblastine, vincristine…
Un succès : la Xn de shikonine commercialisée en 1983 par Mitsui Petrochemicals
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Japon : la tête de proue
Outils de fermentation industrielle Extension aux cultures végétales
70s (Japan Tobacco Inc) production de biomasse pour la confection de cigarettes (réacteurs de 20 000 L)
Meiji Seika, Nitto Denko Co : production de masse de Panax ginseng in vitro
1982 : 5ème congrès de l’IAPTC (=IAPB) au japon : nombreuses avancées dans la production de métab II, dont la shikonine par Mitsui Petrochemicals
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http://homepage1.nifty.com
Lithospermum erythrorhizon (Borraginacées)
http://crop.nics.go.kr
Shikonine : 10% de la MS de la racine
Cosmétique
Phytothérapie
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Cultures en bioréacteur de cellules de Lithospermum erythrozhizon
www.uni-tuebingen.de/pharmazie/abteilungen/biologie/de/shikonin.html
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Trois succès durables
Shikonine Berbérine
Cultures cellulaires Saponines du ginseng
Cultures de racines à grande échelle
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Un alcaloïde isoquinolique : la berbérine
Malaria Principal alcaloïde accumulé dans le
rhizome de Coptis japonica (Renonculacée)
Années 70 : selection d’une souche hyperproductrice de berbérine, transférée à Mitsui Biochemicals
Optimisation : culture à haute densité (optimisation de l’oxygénation et du milieu), 0.45 g /L / jour http://www48.tok2.com/home/
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Production de saponines par Panax ginseng
Traitement des ulcères 5 ans de culture Destruction de la racine pour
extractionwww.01sante.com/. ../ginseng.htm.
Culture de racines en réacteur
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Quelque systèmes de production à l’étude
taxol Vinblastine, Vincristine
Elly Lilly & Co Glycosides
Concurrence avec la synthèse chimique
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Paclitaxel (taxol)
Écorce de Taxus brevifolia (If du pacifique)
Propriétés pharmacologiques Antimitotique tubulo-affine
Applications cancers à métastases
Cancer de l’ovaire et du sein
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Culture in vitro pour la synthèse de Taxol
Taxol: traitement 1g /an 1g = 3 arbres (Taxus sp., l’If) de 150 ans
Productivité in vitro :
100-150 mg / L en deux semaines
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Taxus baccata (Taxaceae)
10-désacétylbaccatine III dans les feuilles : récolte non-destructrice Précurseur d’hémisynthèse Toxotère® par Sanofi-Aventis
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Catharanthus roseus (Apocynaceae)
http://www.ntbg.org/plants/plantresource
Le thé de pervanche utilisé en pharmacopée traditionnelle en Jamaïque comme antidiabétique
Années 50 :
Stimulation de la sécrétion d’insuline ??
Pas du tout mais diminution des globules blancs
Traitement des leucémies
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Vinblastine et vincristine
Faible rendements …
•Vinblastine : 2-10 g (50-250 k€) / tonne de MS
•Vincristine : 0.5 g / tonne de MS
Maladie de Hodgkin
Leucémies
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Les alcaloïdes de la pervenche de Madagascar
Au moins 70 alcaloïdes identifiés dont :
Dans les feuilles Vincristine et vinblastine
(anticancéreux) Dans les racines et les suspensions
cellulaires Serpentine et Ajmalicine :
(antihypertenseurs)
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Production d’ajmalicine par C. roseus
Hypothèses : 800 Kg / an 260 µg ajmalicine / g MS / jour
Suspensions cellulaires : 3150 $/Kg Plantes entières : 619 $ / Kg
Source : FAO (http://www.fao.org/docrep)
Au contraire la culture de Lithospermum est longue (maturité 3-5 ans) et sensible au variations climatiques : les cultures cellulaires sont plus rentables
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L’hémisynthèse
1974 Équipe de Potier (Paris)
Dimérisation de deux alcaloïdes monomeriques : catharantine et vindoline
vinorelbine (navelbineTM)
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ß-methyl-digoxine (Digitalis)
Cardiotoniques Mais de nouveaux cardiotoniques de
synthèse sont apparus Les projets de production par CIV sont
tombés à l’eau
Les suspensions cellulaires sont tout de même utilisées pour réaliser les étapes finales :bioconversion
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Bioconversion
Premières étapes de synthèse chimiqueFinalisation des molécules par culture in vitro
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Ajout de précurseurs dans le milieu de culture : bioconversion
Amélioration
A B C
A C coût B / coût C ?B
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Bioconversion 12-hydroxylation de la beta-methyl-
digitoxine digoxine
Digitalis lanata
OH
Reinhard et Alfermann 1982
Boehringer Mannheim Co : réacteurs de 4 000 L
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Bioconversion des extraits végétaux
Bioconversion des extraits par fermentation lactique en réacteur
teneurs en trois ginsenosides d’interêt : X 60 Pathologies causées par Helicobacter pilorii
(ulcères)
Brevet (2003) Ginseng Science
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Méthodes de production in vitro
Du prototype à la technologie industrielle
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Mise au point en flacons de culture
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Principes de base
La plupart des métabolites secondaires sont intracellulaires, intravacuolaires
Quantité produite = biomasse produite X concentration
Production in vitro
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• Biomasse
temps
Nombrede cellules
3 semaines
Alors : dX = dtX
et ln X = (t-t0)X0
X0
Croissance exponentielle
t0
Production in vitro
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• Production de métabolites
temps
Quantité de cellules Quantité de métabolitessecondaires
Découplage croissance/synthèse de Métabolites Iiaires
Production in vitro
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Exemple : Production d’ajmalicine par Catharanthus en deux étapes:
L’inoculation de la phase de production avec des cellules en phase stationnaire avancée donne une productivité 4 fois supérieure
Indicateur : inoculation avec des cellules qui ont consommé tout le nitrate dans leur milieu
Schaltmann et al (1996) Biotech. Bioengineering
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..
..
.
..
.
..
MG5
M9
Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes
Tabata et al.Mitsui Corp.
200 L9 j
750 L14 j
Filtration FiltrationAir Air
Shikonine
Inoculum
Croissance
Production
4 g/L
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Culture en bioréacteurs
http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm
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Passage du flacon au réacteur
Dans certains cas : diminution de la synthèse : Catharantus
Composition de la phase gazeuse: Taxus:
Baisse de O2 augmentation taxol Augmentation CO2 diminution taxol
Mirjalili (1996) Biotechnol Bioengineering
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Réacteurs forte capacité
Contrôle des paramètres pH, O2, nutriments, précurseurs,
éliciteurs… Agitation, aération Qualité de lumière
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•Les freins du « scale up »
•Transferts de masse gaz-liquide (oxygène)
• Sensibilité au cisaillement ( 100 t/min)
• Homogénéisation du milieu :
• Sédimentation
• Attachement
• Contact cellules-liquide
Production in vitro
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Agitation mécanique
Bullage
Pales
Tambour rotatif
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Wave bioreactors
http://www.wavebiotech.com
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Culture d’organes
Dans plusieurs cas, les cellules indifférenciées ne produisent pas la molécule désirée: cellules de Catharanthus : pas de
vinblastine Cellules de pavot : pas de morphine
Production de saponines par le Panax ginseng : culture de racines obligatoire
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Culture d’organes
Racines transformées (hairy roots) Croissance Production de molécules Stabilité génétique
Cultures de tiges feuillées
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Hairy roots de Psoralea lachnostachys
Stratégies alternatives : hairy roots
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La croissance
Stratégies alternatives : hairy roots
![Page 51: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/51.jpg)
« plantes à traire »
INPL-ENSAIA, Nancy
•Cultures en hydroponie
•Solution nutritive en circuit fermé avec filtration des métabolites exsudés par les racines
E. Gontier et F. Bourgaud
Datura inoaxia :
Hyoscyamine, scopolamine (neurosédatifs)
![Page 52: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/52.jpg)
Perméabilisation de cellules
Amélioration
Faire sortir les produits intracellulaires
Petite taille moléculaire des métabolites secondaires
perméabilisation des membranes phospholipidiques
![Page 53: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/53.jpg)
Optimisation de la synthèse
Impact des conditions de culture sur la synthèseElicitation
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Comment augmenter la synthèse?
Sélection de lignées fortement productrices
Choix de la source carbonée et ajout de précurseurs simples
Paramètres physiques et temporels de la culture
Eliciteurs biotiques ou abiotiques
Hormones
![Page 55: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/55.jpg)
Elicitation par un facteur biotique de la synthèse de sanguinarine
Un alcaloïde isoquinoléique synthétisé dans les suspensions cellulaires d’opium
![Page 56: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/56.jpg)
TYDC
TYDC TYDC
![Page 57: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/57.jpg)
Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)
Con
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mg
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Temps après élicitation (h)
Elicitation des teneurs en sanguinarine par l’extrait de Botrytis
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Act
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C (
%)
Temps après élicitation (h)
Elicitation de l’activité tyrosine décarboxylase par Botrytis
Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)
![Page 59: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/59.jpg)
L’acide Jasmonique
Un éliciteur « miracle »
![Page 60: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/60.jpg)
Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.
Elicitation de la synthèse d’acide rosmarinique chez Lithospermum erythrorhizon
Méthyl Jasmonate
Control
Yeast Extract
![Page 61: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/61.jpg)
Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.
![Page 62: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/62.jpg)
Utilisation industrielle de l’acide jasmonique
Elicitation des cellules de Taxus pour la synthèse de taxol
Fin des années 90 : rendement multiplié par 100 en particulier grâce au méthyl-jasmonate
La production industrielle in vitro devenait alors envisageable
![Page 63: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/63.jpg)
Génie génétique et génie métabolique
Stratégies moléculaires pour manipuler des voies de biosynthèse
![Page 64: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/64.jpg)
L’outil moléculaire au service du génie métabolique
Caractérisation des voies de biosynthèse Caractérisation des principales étapes
enzymatiques Clonage des gènes correspondants Transgénèse
Surexpression de gènes homologues De gènes hétérologues (plantes,
bactéries…) RNAi
![Page 65: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/65.jpg)
Transgenèse de lignées cellulaires ou de plantes entières
Système plante entière insatisfaisant
Système in vitro insatisfaisant
Souches cellulaires transformées
Plantes entières transformées
![Page 66: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/66.jpg)
Capell et Christou (2004) Curr. Opin. Biotech.
Stratégie « Étape enzymatique »
![Page 67: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/67.jpg)
Modulation de la voie synthèse de la scopolamine chez Hyoscyamus
Häkkinen et al.
![Page 68: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/68.jpg)
Surexpression de la hyoscyamine 6-hydroxylase (H6H) et de la putrescine methyl-esterase (PMT)
Témoin racines transformées par A. rhizogenes
H6H PMT
PMT + H6H
Témoin
Zhang et al.
![Page 69: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/69.jpg)
Stratégie « Facteurs de transcription»
Moduler l’expression de gènes codant les enzymes impliquée dans toute une chaîne de biosynthèse
![Page 70: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/70.jpg)
Stratégie « Facteurs de Transcription »
![Page 71: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/71.jpg)
Catharanthus
Promoteurs régulés par le facteur de
transcription ORCA3
Gantet et Memlik 2002 Trends in Pharm Sci
![Page 72: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/72.jpg)
CONCLUSIONS
Production de métabolites 2aires
Quelques réussites en CIV De gros efforts de recherche depuis 40
ans L’espoir renouvelé par le génie
génétique CIV Plantes entières
![Page 73: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/73.jpg)
Lecture conseillée pour approfondir les aspects « bioréacteur »
http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e00.htm#con
PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE
![Page 74: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/74.jpg)
Génie métabolique et horticulture
Manipulation de la voie de biosynthèse des anthocyanes
Moonshadow (Florigene)
![Page 75: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/75.jpg)
CHS
F3’HF3’5’H
DFR DFRDFR
![Page 76: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/76.jpg)
Expression de la DFR de maïs chez le Pétunia
1987 (Nature) Premier succès : obtention de pétunias oranges contenant de la pelargonidine
Expression hétérologue d’une DFR (dihydroflavonol réductase) de maïs
![Page 77: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/77.jpg)
F3’H
F3’5’H
DFR de maïs DFR de pétunia
naringenine
![Page 78: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/78.jpg)
Comment obtenir une rose bleue ?
(Pari lancé en 1840…)
Les roses sont déficientes en F3’5’-hydroxylases :
pas d’anthocyanes dérivées de la delphinidine
![Page 79: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/79.jpg)
Surexpression de la F3’5’H
Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600
![Page 80: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/80.jpg)
Pour améliorer la qualité du bleu….
Silencing de la DFR de rose Surexpression de la
DFR d’Iris
Surexpression de la F3’5’H de violette
F3’H
F3’5’H
![Page 81: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/81.jpg)
Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600
![Page 82: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/82.jpg)
Génie métabolique et plantes aromatiques
![Page 83: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/83.jpg)
Biosynthèse du menthol
Amélioration quantitative et qualitative de l’huile essentielle de menthe par génie métabolique
mentholOH
![Page 84: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/84.jpg)
Trichomes glandulaires chez la menthe
www.microscopix.co.uk/ plants/oils/.
Turner et Croteau (2004) Plant Phy.
![Page 85: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/85.jpg)
Le menthol : un monoterpène
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
IPP
![Page 86: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/86.jpg)
Deux approches
Quantitative Modulation des activités enzymatiques
en amont de la voie de biosynthèse Qualitative
Modulation des activités enzymatiques en aval de la voie de biosynthèse
![Page 87: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/87.jpg)
2 x acétyl CoA
Mévalonate
Mévalonate 5-diphosphate
DXPS
DXR
MCT
CMK
MECPS
2-C-Méthyl-D-erythritol-2,4-
cyclodiphosphate
Isopentényl diphosphate
Diméthylallyl diphosphate
IPPI
MDC
Pyruvate + G3P
Terpenoïdes
CytosolPlaste
Goulot d’étranglement ?
![Page 88: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/88.jpg)
Surexpression de la 1-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) chez la menthe poivrée
Augmentation de rendement sans changement de composition
Lignée Rendement huile (mg/g MF)
Sauvage 1.8
DXR6 2.6
DXR7 2.3
DXR8 2.4
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
![Page 89: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/89.jpg)
Biosynthèse du menthol
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
Cytochromes P450 (Réticulum)
Leucoplastes Mitochondrie
![Page 90: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/90.jpg)
Antisens sur la menthofurane synthase
lignée Oil yeald (mg/g FW)
Limonene Menthone Menthofurane Pulégone Menthol
sauvage 1.7 2.3 60.2 13.9 7.8 4.0
MFS-as 1.8 2.6 68.8 5.3 2.8 7.3
Changement de composition sans changement de rendement
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
![Page 91: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/91.jpg)
Génie métabolique appliqué à la foresterie
www.nazflora.org
![Page 92: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/92.jpg)
Modification du contenu en lignine par transgenèse
![Page 93: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/93.jpg)
Principaux constituants du bois
Lignine (25%)
(exemple de polymérisation de quelques unités G)
Cellulose (50%)
Hémicellulose (25%)
![Page 94: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/94.jpg)
Problématique
Fabrication de papier
Ecorçage/Mise en copeaux Délignification au sulfate alcalin=procédé kraft Délignification au bisulfite (acide)
Blanchiment : Chlore, Peroxyde
Coût énergétique Impact environnemental
La lignine : un facteur majeur de difficulté dans le procédé de fabrication
Circuit fermé
Effluents
![Page 95: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/95.jpg)
Hu et al. 1999 Nature Biotechnology
![Page 96: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/96.jpg)
Augmenter le ratio cellulose/lignine par génie génétique
Stratégie n°1 : amélioration quantitative
![Page 97: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/97.jpg)
![Page 98: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/98.jpg)
Répression par stratégie antisens
![Page 99: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/99.jpg)
Réprimer la 4CL, mais laquelle ?
Chez le peuplier : deux isoformes Quelles sont leurs spécificités de
substrat? Dans quels tissus sont-elles exprimées?
Les deux isoformes contribuent-elles à la synthèse de lignines ?
![Page 100: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/100.jpg)
Hu et al. 1998 PNAS
![Page 101: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/101.jpg)
Pt4CL2
Pt4CL1
Spécificités de substrat des deux isoformes de la 4-coumarate:CoA ligase
![Page 102: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/102.jpg)
Localisation histologique de l’expression de Pt4CL1 et Pt4CL2
ÉpidermeXylème
Northern Blot
Activité GUS
Feuilles
Tiges
4CL24CL1
Hu et al. 1998 PNAS
![Page 103: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/103.jpg)
Conclusions
La 4CL1 est impliquée dans la synthèse des monomères de la lignine
La 4CL2 est impliquée dans la synthèse d’autres composés phénoliques (métabolites secondaires)
Pour altérer la synthèse des monomères de la lignine, une stratégie « antisens » doit être ciblée sur la 4CL1
![Page 104: Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062511/551d9d8e497959293b8c31b8/html5/thumbnails/104.jpg)
Contrôle du phénotype : quantité de lignines
Hu et al. 1999 Nature Biotechnology
Témoin Lignées transgéniques
% L
igni
n re
duct
ion
Témoin
Transgénique
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Phénotype : ratio cellulose / lignine
Hu et al. 1999 Nature Biotechnology
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Implications
Vitesse de croissance accrue Avantage technologique Questionnement sur les flux de gènes ?
Effets secondaires possibles de la diminution des niveaux de lignine Attaques pathogènes Décomposition du bois dans la litière
rôle de puit de carbone pour les arbres
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Modifier la composition de la lignine par génie génétique
Stratégie n°2 : amélioration qualitative
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Bois dur ou bois tendre ?
Lignine G Lignine S/G
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Hu et al. 1999 Nature Biotechnology
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La lignine : un polymère d’unités phénylpropanoïdes
Liaison moins résistante : procédé de fabrication du papier plus facile
Lorsque la position 5 est disponible pour la
polymérisation : lignine plus résistante
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Approche retenue: expression de la F5H sous le contrôle d’un promoteur de la C4H spécifique des tissus du xylème
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% de lignine S dans les transformants
Huntley et al (2003) J. Agric. Food Chem.
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Efficacité de la mise en pâte chimicothermomécanique
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Conclusions
Le génie métabolique appliqué à l’amélioration des espèces ligneuses horticoles, aromatiques ou médicinales est une approche crédible
Cette approche ouvre un champ large d’applications
Plusieurs applications sont déjà au stade de la commercialisation