genÓtipos da talassemia alfa e haplÓtipos do … · resumo objetivo: verificar associações...

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Andr Rolim Belisrio

GENTIPOS DA TALASSEMIA ALFA E HAPLTIPOS DO

AGRUPAMENTO DE GENES DA GLOBINA BETA COMO

MODULADORES DA GRAVIDADE NA DOENA FALCIFORME

EM CRIANAS DO PROGRAMA ESTADUAL DE TRIAGEM

NEONATAL DE MINAS GERAIS MATRICULADAS NO

HEMOCENTRO DE BELO HORIZONTE DA FUNDAO

HEMOMINAS

Universidade Federal de Minas Gerais

Faculdade de Medicina

Belo Horizonte

2010

ii

Andr Rolim Belisrio

GENTIPOS DA TALASSEMIA ALFA E HAPLTIPOS DO AGRUPAMENTO DE

GENES DA GLOBINA BETA COMO MODULADORES DA GRAVIDADE NA DOENA

FALCIFORME EM CRIANAS DO PROGRAMA ESTADUAL DE TRIAGEM

NEONATAL DE MINAS GERAIS MATRICULADAS NO HEMOCENTRO DE BELO

HORIZONTE DA FUNDAO HEMOMINAS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias da Sade da Faculdade

de Medicina da Universidade Federal de Minas

Gerais, rea de Concentrao Sade da Criana e

do Adolescente, como requisito parcial para

obteno do ttulo de Mestre.

Orientador: Marcos Borato Viana

Coorientadoras: Cibele Velloso Rodrigues

Marina Lobato Martins

Universidade Federal de Minas Gerais

Faculdade de Medicina

Belo Horizonte

2010

Belisrio, Andr Rolim. B432g Gentipos da talassemia alfa e hapltipos do agrupamento de genes da globina beta como moduladores da gravidade na doena falciforme em crianas do Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais... [manuscrito]. / Andr Rolim Belisrio. - - Belo Horizonte: 2010.

177f.: il. Orientador: Marcos Borato Vianna. Co-Orientador: Cibele Velloso Rodrigues, Marina Lobato Martins. rea de concentrao: Sade da Criana e do Adolescente. Dissertao (mestrado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. 1. Anemia Falciforme. 2. Talassemia alfa. 3. Globinas beta. 4. Hapltipos. 5. Prognstico. 6. Dissertaes Acadmicas. I. Viana, Marcos Borato. II. Rodrigues, Cibele Velloso. III. Martins, Marina Lobato. IV. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. V. Ttulo. NLM: WS 300

iii

iv

v

Universidade Federal de Minas Gerais

Faculdade de Medicina

Ps-graduao em Cincias da Sade

rea de Concentrao Sade da Criana e do Adolescente

Reitor: Prof. Ronaldo Tadu Pena

Vice-Reitora: Profa. Heloisa Maria Murgel Starling

Pr-reitor de Ps-graduao: Profa. Elizabeth Ribeiro da Silva

Pr-Reitor de Pesquisa: Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares

Faculdade de Medicina

Diretor: Prof. Francisco Jos Penna

Vice-diretor: Prof. Tarcizo Afonso Nunes

Programa de Ps-graduao em Cincias da Sade - rea de Concentrao

Sade da Criana e do Adolescente

Coordenador do Centro de Ps-Graduao: Prof. Carlos Faria Santos Amaral

Subcoordenador do Centro de Ps-Graduao: Joo Lcio dos Santos Jr.

Chefe do Departamento de Pediatria: Profa. Maria Aparecida Martins

Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade rea de

Concentrao em Sade da Criana e do Adolescente: Prof. Joel Alves

Lamounier

Subcoordenadora do Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade - rea de

Concentrao em Sade da Criana e do Adolescente: Profa. Ana Cristina Simes e Silva

Colegiado do Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade rea de

Concentrao em Sade da Criana e do Adolescente:

Coordenador - Prof. Joel Alves Lamounier

Subcoordenador - Profa. Ana Cristina Simes e Silva

Profa. Ivani Novato Silva

Prof. Jorge Andrade Pinto

Profa. Lcia Maria Horta Figueiredo Goulart

Profa. Maria Cndida Ferrarez Bouzada Viana

Prof. Marco Antnio Duarte

Profa.Regina Lunardi Rocha

Gustavo Sena Sousa (Repr. Discente)

vi

Toda a nossa cincia, comparada com a

realidade, primitiva e infantil, e, no entanto, a

coisa mais preciosa que temos``.

Albert Einstein

vii

minha famlia, principalmente, Maria

Eduarda, que so tudo de mais importante que

tenho na vida!

viii

Agradecimentos

Agradeo, inicialmente, a todos que contriburam de alguma forma para o

desenvolvimento e concretizao deste trabalho.

Especialmente s mes, pais ou responsveis e s crianas, sujeitos desta pesquisa,

pela colaborao e confiana, tornando possvel a realizao deste trabalho.

Ao maior tesouro que tenho nessa vida, Maria Eduarda Ferreira Belisrio, que mesmo

estando longe, continua sendo a maior fonte de inspirao e vontade de crescimento

profissional e, principalmente, pessoal.

Ao Professor Marcos Borato Viana, inicialmente, pela excelente orientao e pelos

inmeros ensinamentos. Pelo exemplo e sua admirvel e singular dedicao no

desenvolvimento de pesquisas cientficas. Pela confiana depositada em mim, pela

oportunidade, pelo incentivo e por acreditar no meu trabalho.

minha coorientadora Cibele Velloso Rodrigues, pela sua amizade, confiana e

incentivo que j perduram desde o perodo da graduao. Pelas essenciais contribuies no

desenvolvimento do trabalho e na redao da dissertao. Pela primeira oportunidade dada a

mim para trabalhar com pesquisa cientfica e pelos infinitos ensinamentos ao longo dessa

jornada. Pelo exemplo de dedicao e dignidade na vida profissional.

minha coorientadora Marina Lobato Martins, pela confiana e oportunidade de

desenvolver sua brilhante idia. Pelo seu apoio incondicional, sempre disponvel para me

receber com carinho e ateno nos momentos de dvidas e incertezas, e pelas contribuies

essenciais no desenvolvimento do trabalho e redao da dissertao.

Aos meus pais, Carlos Henrique Torres Belisrio e Maria Cristina Rolim Belisrio,

pela integral presena na minha vida fazendo com que eu escolhesse caminhos certos, mesmo

em momentos de desespero. Pelo amor incondicional e os ensinamentos, valorizando sempre

coisas no palpveis, como o a honestidade, respeito e humildade. E principalmente pela

educao que me proporcionaram.

minha irm, Gabriela Rolim Belisrio, pela amizade, companheirismo e

cumplicidade em cada momento de nossas vidas.

ix

A todos os meus amigos e familiares, pelo apoio, pacincia e, principalmente, por

acreditarem em mim.

Aos acadmicos de Medicina Antnio Osvaldo de Freitas, Aline Pimentel Amaro,

Camila Blanco Cangussu, Daniela Guimares Silva, Daniela Lino Macedo, Marcela S. Braga

e, principalmente, Poliana Giovani, pela essencial contribuio na construo do banco de

dados e/ou auxlio na coleta dos termos de consentimento.

Ao Farmacutico Felipe Carlos Brito Souza, pelo apoio na realizao dos

procedimentos laboratoriais, na construo do banco de dados e na coleta dos termos de

consentimento.

acadmica de Farmcia Ana Mercy Siebra Brito, pela importante contribuio na

realizao dos procedimentos laboratoriais.

acadmica de Cincias Biolgicas Marina Alves, pela contribuio na coleta das

amostras dos sujeitos junto ao servio de hematologia.

acadmica de Cincias Biolgicas Cristina Sbato, pelo apoio na coleta dos termos

de consentimento e na realizao de alguns procedimentos laboratoriais.

funcionria do NUPAD Ivanir, pelo seu importantssimo, indispensvel e generoso

apoio na coleta dos termos de consentimento.

s colegas de ps-graduao, Fernanda Silva Pimentel e Marcilene Rezende Silva,

pela parceria e pelos favores trocados.

Dr. Clia Maria Silva, pela parceria com o banco de dados e na coleta dos termos de

consentimento e, principalmente, por ceder informaes relativas ao Doppler transcraniano,

indispensvel fonte de dados para este trabalho.

Ao pessoal do Servio de Hematologia e Coagulao da Fundao HEMOMINAS,

pela pacincia e pelo apoio na coleta das amostras dos sujeitos da pesquisa.

Ao pessoal do Servio de Pesquisa da Fundao HEMOMINAS, pela convivncia,

favores e pelos ensinamentos.

Ao pessoal do cadastro e da recepo dos pacientes da Fundao HEMOMINAS, pela

pacincia e colaborao.

x

Ao NUPAD, pelo apoio logstico da Central de Projetos e, principalmente, a Maria

Piedade, pelo apoio na reviso de literatura.

Fundao HEMOMINAS, por ceder o espao logstico e pelo financiamento.

FAPEMIG, por financiar as bolsas de iniciao cientfica dos estudantes que

contriburam com a realizao deste trabalho.

CAPES, pelo financiamento da bolsa de mestrado.

A Deus, pela vida MARAVILHOSA que me concedeu!

Muito obrigado de corao!!!

xi

Resumo

Objetivo: verificar associaes entre os gentipos de -Tal e os hapltipos do agrupamento

de genes da S-globina com caractersticas clnicas e hematolgicas em uma populao de

crianas triadas pelo Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais (PETN-MG) e

acompanhadas no Hemocentro de Belo Horizonte (HBH) da Fundao HEMOMINAS.

Mtodos: coorte retrospectiva, com amostra aleatorizada, na qual foram includas crianas

triadas pelo PETN-MG e encaminhadas ao HBH, com perfil eletrofortico compatvel com

anemia falciforme (SS ou S0-talassemia), nascidas no perodo entre 01/01/1999 e

31/12/2006. Os dados foram coletados nos pronturios mdicos do HBH. Os pacientes foram

acompanhados por, no mnimo, dois anos e meio, at 30/06/2009. A genotipagem de -Tal foi

realizada por PCR multiplex (alelos: -3.7

; -4.2

; --SEA

; --FIL

; --MED

; -()20.5

e --THAI

). Os

hapltipos S foram determinados por PCR-RFLP. Resultados: Foram analisadas 221

crianas, sendo 119 (53,8%) do sexo feminino e 102 (46,2%), do masculino. A idade variou

entre 2,5 e 10,4 anos. Duzentos e oito (94,1%) eram homozigotos para o alelo S

e 13 (5,9%)

possuam o gentipo S0-tal. Dos 208 sujeitos SS, 58 (27,9%) eram heterozigotos (-3.7/) e

trs (1,4%) homozigotos para -Tal (-3.7

/-3.7

). Dos 13 sujeitos S0-tal, cinco (38,5%) eram

heterozigotos (-3.7

/). Entre os 208 sujeitos SS, havia 82 (39,43%) com o gentipo

CAR/CAR, 69 (33,17%) Ben/CAR, 49 (23,56%) Ben/Ben, dois (0,96%) CAR/Atp, dois

(0,96%) Ben/Atp, dois (0,96%) rabe-Indiano/Ben e dois (0,96%) no puderam ser

caracterizados. Dos 412 cromossomos S genotipados nos sujeitos homozigotos (Hb SS), 57%

eram do tipo CAR, 41,5% eram Ben, 0,5% eram rabe-Indiano e 1% eram atpicos. Nos

sujeitos homozigotos, a presena de -Tal associou-se significativamente com a diminuio

dos nveis de VCM, HCM, leuccitos e reticulcitos, e no influenciou os nveis de Hb total,

Hb F e plaquetas. No houve associao significativa entre hapltipos S e os nveis mdios

de Hb total, Hb F, VCM, HCM, leuccitos e reticulcitos. O nvel de plaquetas foi

significativamente maior no grupo com o gentipo Ben/CAR quando comparado com o

Ben/Ben e CAR/CAR. No houve associao significativa entre a presena de -Tal e a

frequncia de episdios de sndrome torcica aguda, transfuses sanguneas e sequestro

esplnico agudo. A presena de -Tal foi fortemente associada com a diminuio do risco de

doena cerebrovascular (Doppler transcraniano alterado ou AVC clnico; P=0,007). No

xii

houve associao significativa entre os hapltipos S e a frequncia de episdios de sndrome

torcica aguda, transfuses sanguneas, sequestro esplnico agudo e doena cerebrovascular.

Concluses: A associao significativa mais importante encontrada foi a da -Tal com

diminuio do risco de doena cerebrovascular. A presena ou no de -Tal bem como o

hapltipo S no permitem prever as caractersticas clnicas da doena. Outros fatores

moduladores devem ser estudados para definir subfentipos da doena e, assim, serem

utilizados em conjunto como ferramenta clnica no acompanhamento dos pacientes. Ressalte-

se que a amostra de crianas proveio de uma nica fonte, foi aleatorizada e o

acompanhamento seguiu o mesmo protocolo de tratamento num nico hemocentro, o que

refora as concluses do estudo.

xiii

Abstract

Objectives: To examine associations between the alpha-thalassemia (-Thal) genotypes and

the S gene cluster haplotypes (

S haplotypes) with clinical and hematological features in a

population of children derived from the Newborn Screening Program of Minas Gerais (NSP-

MG) and followed-up at the Blood Center of Belo Horizonte (HBH) of HEMOMINAS

Foundation. Methods: children with electrophoretic profile compatible with sickle cell

anemia (SS or S0-thalassemia) screened by NSP-MG between 01/01/1999 to 12/31/2006 and

followed-up at HBH were included in a randomized retrospective cohort study. Data were

collected from patients medical records at HBH. All patients were followed-up for a

minimum of two years and a half, up to 6/30/2009. Genotyping of -Thal was performed by

multiplex PCR (alleles: -3.7

; -4.2

; --SEA

; --FIL

; --MED

; -()20.5

e --THAI

). S haplotypes were

determined by PCR-RFLP. Results: 221 children were analyzed, 119 (53.8%) females and

102 (46.2%) males. The age ranged from 2.5 to 10.4 years. Two hundred and eight (94.1%)

were homozygous for the S allele and 13 (5,9%) were S

0-thal. Of the 208 SS subjects, 58

(27.9%) were heterozygous (-3.7

/) and three (1.4%) homozygous for -Thal (-3.7

/-3.7

). Of

the 13 S0-thal subjects, five (38.5%) were heterozygous (-

3.7/). Among the 208 SS

subjects, 82 (39.43%) were CAR/CAR, 69 (33.17%) Ben/CAR, 49 (23.56%) Ben/Ben, two

(0.96%) CAR/Atp, two (0.96%) Ben/Atp, two (0.96%) Arab-Indian/Ben and two (0.96%)

could not be genotyped. Of 412 S

chromosomes genotyped in homozygous subjects for S

hemoglobin (SS), 57% were CAR type, 41.5% were Ben, 0.5% were Arab-Indian e 1% were

atypical. In homozygous subjects for S hemoglobin, the presence of -Thal was significantly

associated with decreased levels of MCV, MCH, WBC and reticulocytes, and not with the

levels of total Hb, Hb F and platelets. There was no significant association between S

haplotypes and total Hb, Hb F, MCV, MCH, WBC and reticulocyte levels. Platelet count was

significantly higher in the group with Ben/CAR genotype when compared with the Ben/Ben

and CAR/CAR. There was no significant association between the presence of -Thal and the

frequency of episodes of acute chest syndrome, blood transfusions and acute splenic

sequestration. The presence of -Thal was strongly associated with decreased risk of

cerebrovascular disease (abnormal transcranial Doppler or clinical stroke; P=0.007). There

was no significant association between S haplotypes and the frequency of episodes of acute

xiv

chest syndrome, blood transfusions, acute splenic sequestration and cerebrovascular disease.

Conclusions: The most important significant association found was between co-inheritance

of -Thal and decreased risk of cerebrovascular disease. Neither the presence/absence of -

Thal nor S haplotypes can alone predict the clinical course of the disease. Other modulating

factors should be investigated to subphenotype the disease and thus be used together as a

clinical tool in monitoring patients. It should be noted that the sample of children has come

from a single source and was randomized; follow-up was uniform and done in a single blood

center, what reinforces the conclusions of the study.

xv

Sumrio

Resumo xi

Abstract xiii

Lista de abreviaturas e siglas xviii

Lista de tabelas xxii

Lista de figuras xxiv

1. APRESENTAO..............................................................................................................26

2. INTRODUO E JUSTIFICATIVA...............................................................................27

3. REVISO BIBLIOGRFICA...........................................................................................29

3.1 Hemoglobinopatias.............................................................................................................29

3.2 Doena Falciforme: aspectos conceituais e moleculares....................................................31

3.3 A Anemia Falciforme no Brasil..........................................................................................33

3.4 Princpios moleculares dos processos de falcizao, vaso-ocluso e inflamao na Anemia

Falciforme.................................................................................................................................37

3.5 Manifestaes clnicas e laboratoriais.................................................................................40

3.51 Eventos clnicos agudos mais relevantes na infncia........................................................42

3.511 Crises vaso-oclusivas ou crises de dor...........................................................................42

3.512 Sndrome Torcica Aguda..............................................................................................42

3.513 Sequestro Esplnico Agudo.............................................................................................43

3.514 Acidente Vascular Cerebral............................................................................................45

3.515 Crise Aplstica................................................................................................................47

3.516 Infeces..........................................................................................................................48

xvi

3.6 Mortalidade, expectativa de vida e medidas de reduo da morbidade e mortalidade.......49

3.7 Interferentes genticos na diversidade fenotpica da Anemia Falciforme..........................51

3.71 Hapltipos do agrupamento de genes da beta-globina......................................................53

3.711 Origem, distribuio geogrfica e caracterizao dos hapltipos S ............................53

3.712 Relao entre os hapltipos S

e a diversidade fenotpica da anemia falciforme..........57

3.713 Os hapltipos S no Brasil...............................................................................................59

3.714 Hapltipos S

no restante do mundo...............................................................................66

3.72 A Talassemia Alfa.............................................................................................................82

3.721 A co-herana de Talassemia Alfa na Anemia Falciforme..............................................86

3.722 A Talassemia Alfa associada Anemia Falciforme no Brasil.......................................93

4. OBJETIVOS........................................................................................................................96

4.1 Objetivo Geral.....................................................................................................................96

4.2 Objetivos Especficos..........................................................................................................96

5. MATERIAIS E MTODOS..............................................................................................97

5.1 Desenho e local de realizao do estudo.............................................................................97

5.2 Caracterizao da populao estudada e metodologia de seleo......................................97

5.3 Extrao e quantificao do DNA genmico....................................................................100

5.4 Genotipagem do alelo S...................................................................................................101

5.5 Diagnstico Molecular da Talassemia Alfa......................................................................103

5.6 Genotipagem dos hapltipos do agrupamento de genes da S-globina.............................106

5.7 Doppler transcraniano.......................................................................................................110

5.8 Variveis hematolgicas...................................................................................................111

5.9 Variveis clnica................................................................................................................113

5.10 Anlise estatstica............................................................................................................114

5.11 Aspectos ticos................................................................................................................116

5.12 Financiamento.................................................................................................................116

xvii

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................114

7. ARTIGO 1.........................................................................................................................129

8. ARTIGO 2.........................................................................................................................147

9. CONCLUSES.................................................................................................................165

10. ANEXOS..........................................................................................................................166

11. APNDICES....................................................................................................................169

xviii

Lista de abreviaturas e siglas

alfa

-Tal talassemia alfa

beta

gama

delta

psilon

zeta

l microlitros

M micromolar

oC Graus Celsius

A Adenina

ACI - Artria Cartida Interna

ACM Artria Cerebral Mdia

AVC - Acidente Vascular Cerebral

Ben Benin

BH - Belo Horizonte

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

C - Citosina

Ca++

- ons de clcio

Cam Camares

CAPES - Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior

CAR - Central African Republic - Repblica Central Africana

CEP Comit de tica em Pesquisa

CHCM - Concentrao de Hemoglobina Corpuscular Mdia

cm/s centmetros por segundo

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

COEP - Comit de tica em Pesquisa da UFMG

DCV - Doena cerebrovascular

DNA - Desoxirribonucleic acid - cido desoxirribonuclico

xix

dNTP - deoxynucleotide triphosphate - desorribonuleotdeo trifosfatado

DRS - Diretoria regional de sade

DTC Doppler transcraniano cerebral

EDTA - EthyleneDiamineTetrAcetic acid - cido etilenodiamino tetra-actico

EUA - Estados Unidos da Amrica

FCP - F-cell production Produo de clulas F

fL fentolitros

FS - Padro eletrofortico com hemoglobinas fetal e S

FSA - Padro eletrofortico com hemoglobinas fetal, S e A

FSC - Padro eletrofortico com hemoglobinas fetal, S e C

G Guanina

g - gramas

g/dL - gramas por decilitro

Glu cido glutmico

Hapltipos S - Hapltipos do agrupamento de genes da

S-globina

Hb - Hemoglobina

Hb A Hemoglobina A

Hb AA - Gentipo homozigoto para hemoglobina A

Hb A2 - Hemoglobina A2

Hb AS - Trao falcmico ou trao falciforme

Hb C - Hemoglobina C

Hb D - Hemoglobina D

Hb F - Hemoglobina Fetal

Hb H Hemoglobina H

Hb S - Hemoglobina S

Hb SS Gentipo homozigoto para hemoglobina S

HBH - Hemocentro de Belo Horizonte

HCl cido Clordrico

HCM Hemoglobina Corpuscular Mdia

HEMOBA Fundao de Hematologia e Hemoterapia da Bahia

HEMOMINAS - Fundao Centro de Hematologia e Hemoterapia de

Minas Gerais

HEMOPE - Fundao de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco

HEMORIO - Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti

xx

HPLC - High Performance Liquid Chromatography -

Cromatografia Lquida de Alta Resoluo

HU - Hidroxiureia

IGF- Insulin-like Growth Factor

IGFBP - Insulin-like Growth Factor Binding Protein

IC - Intervalo de confiana

IEF - Isoelectric focusing - Eletroforese por Focalizao Isoeltrica

IVS - intervening sequence ntron

K+

- ons de potssio

kb kilobase

KCl - Cloreto de potssio

Km Quilmetro

LDH - Lactate dehydrogenase - desidrogenase ltica

LEU - leucometria total

LCR - Locus control region Regio controladora do locus

MCH mean corpuscular hemoglobin

MCV mean corpuscular volume

MG - Minas Gerais

MgCl2 Cloreto de Magnsio

mL mililitros

mM milimolar

n - nmero de amostras

NaCl Cloreto de Sdio

NCBI - National Center for Biotechnology Information

NO Nitric Oxide - xido ntrico

NUPAD - Ncleo de Aes e Pesquisa em Apoio Diagnstico

da Faculdade de Medicina da UFMG

OMS - Organizao Mundial de Sade

pb pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction - Reao em cadeia da polimerase

pmol - picomols

PETN - Programa Estadual de Triagem Neonatal

pg picogramas

PLAQ Plaquetometria

xxi

Pu Purines - Purinas

Py Pyrimidines - Pirimidinas

Retic Contagem de reticulcitos

RFLP - restriction fragment length polymorphism - polimorfismo de tamanho de fragmento

de restrio

RR Risco relativo

S+-talassemia - Gentipo duplo heterozigoto para hemoglobina S e

+-talassemia

S0- talassemia - Gentipo duplo heterozigoto para hemoglobina S e S

0- talassemia

SC Gentipo duplo heterozigoto para hemoglobinas S e C

SD Gentipo duplo heterozigoto para hemoglobinas S e D

SDS Sodium Dodecylsulphate Dodecil Sulfato de Sdio

SEA - Sequestro Esplnico Agudo

Sen Senegal

SNP Single Nucleotide Polymorphism Polimorfismo de Base nica

SPSS - Statistical Package for the Social Sciences

STA Sndrome Torcica Aguda

STOP - Stroke Prevention Trial in Sickle Cell Anemia

T Timina

TAE - Tris-acetate-EDTA

TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TMO - Transplante de medula ssea

Tris - Tris(hidroximetil)aminometano

U Unidade

UFC - Universidade Federal do Cear

UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

Val Valina

VCAM-1 - Molculas celulares de adeso vascular

VCM - Volume corpuscular mdio

VMM - Velocidade mdia mxima

vs versus

WBC White blood cell

xxii

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Frequncia gnica aproximada de algumas hemoglobinopatias, classificadas por

regies da OMS.........................................................................................................................31

Tabela 2 - Incidncia dos fentipos da doena falciforme, segundo o Programa Estadual de

Triagem Neonatal de Minas Gerais (PETN-MG), em um milho de crianas triadas no

perodo de 1998 a 2002.............................................................................................................35

Tabela 3 - Principais alteraes moleculares das hemcias em consequncia do fenmeno de

falcizao..................................................................................................................................39

Tabela 4 - Caractersticas laboratoriais da anemia falciforme..................................................41

Tabela 5 - Manifestaes clnicas da doena falciforme de acordo com o principal

componente fisiopatolgico......................................................................................................41

Tabela 6 - Caractersticas gerais encontradas nos hapltipos clssicos da anemia falciforme.58

Tabela 7- Sinopse dos principais estudos envolvendo os hapltipos S abordados na reviso de

literatura....................................................................................................................................80

Tabela 8 Gentipos de -Tal: nomenclatura, nmeros de genes alfa e proporo de produo

de cadeias alfa...........................................................................................................................85

Tabela 9 - Efeito da -Tal em alguns ndices hematolgicos da anemia falciforme................88

Tabela 10 - Efeitos da -Tal em propriedades reolgicas das hemcias..................................89

Tabela 11 - Efeito da -Tal nos eventos clnicos agudos da anemia falciforme......................91

Tabela 12 - Efeito da -Tal em outros eventos clnicos da anemia falciforme.........................92

xxiii

Tabela 13 - Sequncia dos oligonucleotdeos sintticos para cada tipo de deleo da -Tal,

respectivas concentraes utilizadas nas reaes de PCR e tamanho esperado dos produtos da

amplificao............................................................................................................................105

Tabela 14 - Direo, posio e sequncia dos iniciadores para determinao dos hapltipos do

gene da S-globina...................................................................................................................106

Tabela 15 - Caractersticas dos RFLPs para genotipagem dos hapltipos do agrupamento de

genes da S-globina.................................................................................................................109

xxiv

Lista de Figuras

Figura 1 - Representao esquemtica da mutao gnica responsvel pela Hb S..................32

Figura 2 - Incidncia da anemia falciforme (Hb SS)(*) em nascidos vivos, por Diretorias

Regionais de Sade. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais - 1998/2001...36

Figura 3 - Incidncia do trao falciforme (Hb AS) em nascidos vivos, por Diretorias

Regionais de Sade. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais - 1998/2001...36

Figura 4 - Incidncia da doena falciforme(*) em nascidos vivos, por Diretorias Regionais de

Sade DRS. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais - 1998/2001.............37

Figura 5 - Curva de probabilidade de ocorrncia do primeiro episdio de SEA, conforme

tempo de exposio de cada criana em uma populao de crianas triadas pelo PETN-MG e

acompanhadas no HBH (Mtodo de Kaplan-Meier)................................................................44

Figura 6 - Curvas de sobrevida, por tipo de hemoglobinopatia, das 1396 crianas com doena

falciforme, diagnosticadas pelo Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais

entre maro de 1998 e fevereiro de 2005 (mtodo de Kaplan-Meier)......................................50

Figura 7 - Representao esquemtica da influncia dos hapltipos S e dos gentipos de -

Tal na gravidade clnica da anemia falciforme.........................................................................53

Figura 8 - Regio de origem e abrangncia dos trs principais hapltipos S africanos e um

asitico......................................................................................................................................55

Figura 9 - Crossing-over desigual entre os dois cromossomos 16 dando origem a +-

talassemia..................................................................................................................................83

Figura 10 - Subfentipos da anemia falciforme........................................................................93

xxv

Figura 11 - Fluxograma da seleo amostral na populao estudada.......................................99

Figura 12 - Ilustrao do agrupamento de genes da globina alfa, extenso das delees e

posio dos oligonucleotdeos sintticos................................................................................104

Figura 13 - Principais hapltipos do agrupamento de genes da globina beta definidos pelo

padro de atividade das enzimas de restrio Xmn I, Hind III, Hinc II e Hinf I nos seis

fragmentos amplificados localizados em 5G,

G,

A, , 3 e 5....................................108

26

1. APRESENTAO

Esta dissertao representa o produto final de um trabalho desenvolvido pelo

programa de ps-graduao em Cincias da Sade, rea de concentrao Sade da

Criana e do Adolescente, da faculdade de medicina da UFMG e com a parceria da

Fundao HEMOMINAS. Inicialmente, ser apresentada uma introduo e as

justificativas da execuo do projeto, seguida de uma reviso de literatura completa que

incluiu trabalhos publicados em diversas regies do mundo. A seo seguinte descreve

detalhadamente a metodologia utilizada no desenvolvimento do estudo. Posteriormente,

foram apresentados dois artigos cientficos que contm os resultados obtidos no

trabalho, sendo que o primeiro foi publicado no volume 124 do peridico Acta

Haematologica e o segundo no volume 34 do peridico Hemoglobin. Finalizando, uma

concluso breve, sintetizando os principais achados do estudo.

27

2. INTRODUO E JUSTIFICATIVA

O Servio de Pesquisa da Fundao Centro de Hematologia e Hemoterapia de

Minas Gerais (HEMOMINAS) prope-se a realizar pesquisas que possam aprimorar a

qualidade do atendimento aos pacientes e doadores da Fundao, visando aplicao de

seus resultados na abordagem de doenas genticas ou na segurana transfusional.

Os ambulatrios da Fundao HEMOMINAS so referncia no estado quanto ao

atendimento dos pacientes nas reas das coagulopatias (hemofilias, doena de von

Willebrand, dentre outras) e hemoglobinopatias (doenas falciformes, talassemias,

dentre outras). Esto cadastrados nos ambulatrios aproximadamente 6.000 pacientes

com hemoglobinopatias cujo atendimento por mdicos, enfermeiros, psiclogos,

assistentes sociais, dentistas, dentre outros, garante uma abordagem multidisciplinar a

pacientes portadores de uma enfermidade complexa.

O presente trabalho reflete o compromisso das atividades de pesquisa da

Fundao HEMOMINAS em contribuir diretamente com a melhoria da qualidade de

ateno sade, levando a uma resolubilidade maior, satisfao do usurio e

legitimao da poltica de sade no estado.

Ao mesmo tempo, Minas Gerais (MG) um estado modelo no Brasil em relao

ao diagnstico precoce das doenas falciformes, com a introduo do Programa de

Triagem Neonatal do Estado de Minas Gerais (PETN-MG) em maro de 1998. Este

programa coordenado pelo Ncleo de Aes e Pesquisa em Apoio Diagnstico

(NUPAD, Faculdade de Medicina da UFMG) que encaminha os recm-nascidos

diagnosticados com doena falciforme para acompanhamento multidisciplinar na

Fundao HEMOMINAS. Ao final de 2009, aproximadamente 3.500 crianas com

doena falciforme que foram triadas pelo PETN-MG esto cadastradas nos ambulatrios

da rede HEMOMINAS.

28

A anemia falciforme, uma doena hereditria causada por uma nica mutao no

gene da -globina, produz uma diversidade de expresses fenotpicas nos pacientes

acometidos (Serjeant, 1992).

As cadeias de alteraes que ligam o defeito molecular s manifestaes clnicas

nos pacientes com anemia falciforme devem ser consideradas em trs nveis: molculas

e clulas; tecidos e rgos; e o organismo completo. Cada um desses nveis implica em

vias preferenciais e numerosos fatores condicionantes que podem intensificar ou

diminuir os efeitos, gerando essa impressionante variabilidade clnica observada. Os

principais fatores que podem influenciar o fentipo da anemia falciforme so:

1. fatores genticos que podem influenciar no processo de polimerizao da

hemoglobina S (Hb S), no fenmeno da falcizao e na hemlise;

2. outros fatores genticos que podem alterar a resposta individual

doena, a suas complicaes ou ao tratamento;

3. fatores ambientais como o local onde vive o paciente, prevalncia de

doenas infectocontagiosas, condies socioeconmicas e acesso e

qualidade da assistncia mdica (Zago e Pinto, 2007).

A maior parte das diferenas clnicas e hematolgicas entre os pacientes com

anemia falciforme deve-se a variabilidade gentica relacionada a genes (que podem

estar ligados, ou no, ao gene da -globina) que so capazes de modificar a expresso

da doena. Entre os fatores genticos que explicam a variabilidade da expresso clnica

da anemia falciforme esto a co-herana de -Talassemia (-Tal) e os hapltipos do

agrupamento de genes da S-globina (Hapltipos

S) (Nagel, 2005; Steinberg, 2005;

Steinberg, 2009). Estes dois fatores sero analisados no presente estudo.

A relao entre a interao de -Tal e os aspectos clnicos e hematolgicos de

pacientes portadores da anemia falciforme uma rea ainda inexplorada no estado de

MG e pouco documentada no Brasil.

Alguns estudos populacionais sobre os hapltipos S em pacientes com anemia

falciforme foram realizados no Brasil nos ltimos anos. Cada regio geogrfica

estudada apresenta caractersticas prprias quanto frequncia dos diferentes

hapltipos, refletindo a origem do fluxo de escravos africanos recebidos na poca do

Brasil colnia. A relao entre os hapltipos S e os aspectos clnicos e hematolgicos

29

de pacientes com anemia falciforme uma rea ainda inexplorada em MG. Alguns

estudos relacionaram esses hapltipos com o quadro clnico da doena, existindo muitas

controvrsias entre eles. A maioria desses estudos foi desenvolvida na Jamaica e nos

Estados Unidos, onde o hapltipo Benin muito mais frequente do que o hapltipo

CAR, tornando inadequadas comparaes entre eles. Estudos realizados em So Paulo

(Zago et al., 1992; Goncalves et al., 1994; Figueiredo et al., 1996; Lyra et al., 2005) e

no Rio de Janeiro (Fleury, 2007) mostraram uma grande prevalncia de indivduos

homozigotos para o hapltipo CAR e Benin no sudeste brasileiro, o que propicia uma

anlise mais adequada e faz de MG um potencial candidato para realizao de estudos

dessa natureza.

O estudo dos hapltipos S e a investigao dos gentipos de -Tal podero ser

utilizados como marcadores prognsticos da doena em associao com outras

caractersticas clnicas e hematolgicas. Adicionalmente, o presente estudo pretende

constituir-se em fonte pioneira de dados referentes frequncia dos hapltipos S e

prevalncia de -Tal em pacientes com anemia falciforme em MG, podendo ser teis no

estudo de populaes, origem e evoluo humana.

A identificao de determinantes da gravidade do quadro clnico da anemia

falciforme pode contribuir, ainda, para um manejo adequado e diferenciado da doena, e

consequentemente, para melhor qualidade de vida e aumento da sobrevida dos pacientes

acometidos por essa doena.

3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Hemoglobinopatias

30

A hemoglobina humana uma molcula tetramrica, tendo como tomo central

um on ferro num complexo denominado heme, e dois pares de subunidades

polipeptdicas idnticas, cada par codificado por um gene diferente. O agrupamento de

genes da globina alfa (, 1 e 2) est localizado no cromossomo 16, e o agrupamento de

genes da globina beta (, G,

A, e ) est localizado no cromossomo 11.

Curiosamente, os genes esto presentes, em ambos os cromossomos, na mesma ordem

em que so expressos durante o desenvolvimento humano. Durante a vida fetal, o tipo

predominante de hemoglobina a hemoglobina Fetal (Hb F-22). Durante o perodo

ps-natal, a Hb F gradualmente substituda pela hemoglobina A (HbA-22). A

hemoglobina A2 (22) um tipo minoritrio de hemoglobina adulta, que representa

menos de 2,5% da hemoglobina circulante em indivduos normais (Frenette e Atweh,

2007).

Os distrbios das hemoglobinas humanas, ou hemoglobinopatias, so um grupo

heterogneo de doenas geneticamente determinadas, de ampla distribuio e que

apresentam morbidade significativa em todo o mundo (Weatherall e Clegg, 1999).

Estima-se que aproximadamente 7% da populao mundial so portadores de doenas

desse tipo e que 500.000 bebs com formas mais graves destas doenas nascem a cada

ano. Apesar desses distrbios ocorrerem em maior frequncia nas regies tropicais,

devido s migraes eles so encontradas na maioria dos pases (Weatherall e Clegg,

2001; Weatherall, 2008). A Tabela 1 mostra a frequncia gnica aproximada de algumas

hemoglobinopatias, classificadas por regies da Organizao Mundial de Sade (OMS).

As informaes nela contida devem ser interpretadas com reserva, pois grande parte dos

dados foi obtida a partir de estudos pontuais que foram extrapolados para grandes

populaes (Weatherall, 2008).

As hemoglobinopatias podem ser divididas, fundamentalmente, em dois grandes

grupos: 1) hemoglobinopatias estruturais, em que a alterao na estrutura da

hemoglobina se d pela substituio, insero ou deleo de um ou mais aminocidos

em uma ou em ambas as cadeias polipeptdicas; e 2) as hemoglobinopatias por

deficincias de sntese ou talassemias, em que ocorre o desequilbrio na quantidade de

cadeias produzidas, principalmente ou (Wenning et al., 2000; Weatherall e Clegg,

2001). As hemoglobinopatias so responsveis pela maioria das doenas genticas letais

(Modell e Bulyzhenkov, 1988).

31

Tabela 1 - Frequncia gnica aproximada de algumas hemoglobinopatias, classificadas

por regies da OMS

Regies de OMS Hb S Hb C Hb E -Tal 0-Tal

+-Tal

frica Subsaariana 1-38 0-21 0 0-12 0 10-50

Amricas 1-20 0-10 0-20 0-3 0-5 0-40

Mediterrneo Oriental 0-60 0-3 0-2 2-18 0-2 1-60

Europa 0-30 0-5 0-20 0-19 1-2 0-12

Sudeste Asitico 0-40 0 0-70 0-11 1-30 3-40

Pacfico Ocidental 0 0 0 0-13 0 2-60 Fonte: Weatherall, 2008

3.2 Doena Falciforme: aspectos conceituais e moleculares

As doenas falciformes constituem um conjunto de desordens genticas

autossmicas recessivas, caracterizadas pela presena de, pelo menos, um alelo mutante

S e o fentipo com a concentrao de Hb S superior a 50% (Ashley-Koch et al., 2000;

Naoum, 2000; Stuart e Nagel, 2004). Os gentipos da doena falciforme mais comuns

em nosso meio so: Hb SS, Hb SC, Hb S+-tal, Hb S

0-tal e Hb SDPunjab (Januario,

2002).

Nesse grupo destaca-se a anemia falciforme, geneticamente determinada pela

homozigose do gene da hemoglobina S (Hb SS). Este gentipo apresenta maior

gravidade clnica e hematolgica, e maior morbidade e mortalidade (Naoum, 2000;

Frenette e Atweh, 2007). A causa dessa doena uma mutao de ponto no gene da -

globina, com padro de herana autossmico recessivo, determinando uma hemoglobina

anormal, denominada Hb S, ao invs da hemoglobina normal, a Hb A. Essa mutao

causa a modificao de um nucleotdeo no sexto cdon do gene da -globina e assim, a

substituio do aminocido cido glutmico por uma valina (Figura 1) (Guasch et al.,

1999; Adorno et al., 2005; Silva et al., 2006; Frenette e Atweh, 2007). Os indivduos

portadores do trao falciforme (heterozigotos AS) apresentam em um cromossomo o

alelo normal e no outro o alelo mutante S, produzindo, fundamentalmente, uma

32

mistura de Hb A e Hb S (Hb AS). Esses indivduos so assintomticos, no sendo

classificado como doena (Ashley-Koch et al., 2000).

Figura 1 Representao esquemtica da mutao gnica responsvel pela Hb S

Quando um alelo S

coexiste com um alelo causador de -Talassemia (-Tal

diversos alelos mutantes do gene da -globina que resultam na no transcrio de

mRNA para produo de cadeias beta ou na transcrio de nveis significativamente

diminudos), a gravidade da doena falciforme depende do tipo de mutao que causa a

-Tal (Steinberg, 2008). Quando o alelo -talassmico coexistente causa a completa

inativao do gene , a doena falciforme resultante conhecida como S0-Talassemia

(S0-Tal) e a gravidade clnica tente a ser semelhante da anemia falciforme (Hb SS)

(Serjeant et al., 1979). Entretanto, quando o alelo -talassmico coexistente causa a

diminuio da transcrio do gene , a doena falciforme resultante conhecida como

S+-Talassemia (S

+-Tal), caracterizada por um amplo espectro de gravidade clnica

que depende do nvel de comprometimento da produo de cadeias beta (Serjeant et al.,

1973).

O cido glutmico um aminocido que tem sua cadeia lateral carregada

negativamente, com ponto isoeltrico de 2,77. A valina tem o ponto isoeltrico de 5,97,

sendo assim classificada como um aminocido neutro. Essa troca de aminocidos

envolvendo a sada de um aminocido com carga negativa e a entrada de outro neutro

resulta na perda de cargas negativas da Hb S em relao Hb A, fato que modifica uma

srie de propriedades fsico-qumicas da hemoglobina, levando a todas as alteraes

presentes na doena, inclusive a mobilidade eletrofortica mais lenta da Hb S,

facilitando o diagnstico (Naoum, 2000).

33

Estudos genticos e arqueolgicos indicam que o alelo S mutante

evolutivamente recente, com estimativas de que a mutao ocorreu pela primeira vez

entre 3.000 a 10.000 anos atrs (Flint et al., 1993; Currat et al., 2002). Sabe-se que o

alelo S confere uma vantagem seletiva aos portadores do trao falciforme, protegendo-

os contra a malria. Esta presso seletiva levou persistncia do alelo S em regies

endmicas para a malria (Aidoo et al., 2002; Feng et al., 2004) e o aumento rpido da

sua frequncia ao longo de vrias geraes (Hanchard et al., 2007). Esta proteo faz do

agrupamento de genes da -globina uma rea apropriada para se estudarem as

assinaturas genticas da seleo natural e a origem e disperso de populaes humanas

(Crawford et al., 2002).

3.3 A Anemia Falciforme no Brasil

O alelo S nunca foi encontrado em populaes amerndias, embora mais de

3.000 indivduos tenham sido testados. A presena deste alelo no continente americano

o resultado do fluxo gnico originrio da frica durante 400 anos de trfico de

escravos (Rogers et al., 1989). Com isso, as frequncias do alelo S so proporcionais

intensidade relativa do fluxo migratrio africano e ao grau de miscigenao das

populaes africanas com outras populaes. Essa distribuio desigual nas Amricas

do Norte, Sul e Central e nas ilhas caribenhas. O trfico de escravos para o Brasil durou

cerca de trs sculos e teve como principal motivao a necessidade de mo de obra

gratuita para a lavoura, minerao e afazeres domsticos. A contribuio do alelo S

trazido diretamente por imigrantes europeus (portugueses e italianos do sul)

insignificante (Zago et al., 1992).

A anemia falciforme a doena hereditria monognica mais comum do Brasil,

ocorrendo, predominantemente, mas no exclusivamente, em afro-descendentes (Di

Nuzzo e Fonseca, 2004; Canado e Jesus, 2007). O Ministrio da Sade estima a

prevalncia de 25.000 a 30.000 indivduos com anemia falciforme no pas e a incidncia

de 3.500 novos casos a cada ano (o nascimento de uma criana com anemia falciforme

34

para cada 1.000 recm-nascidos vivos). Com relao ao trao falciforme, estima-se a

prevalncia de 7.200.000 casos, sendo 4% (2% a 8%) na populao geral e 6% a 10%

entre afro-descendentes. Estima-se a incidncia de 200.000 novos portadores do trao a

cada ano (Canado e Jesus, 2007).

A distribuio do alelo S no Brasil bastante heterognea. A prevalncia de

heterozigotos (Hb AS) maior nas regies norte e nordeste (6% a 10%), enquanto nas

regies sul e sudeste a prevalncia menor (2% a 3%) (Silva e Shimauti, 2006;

Canado e Jesus, 2007).

Estudos pontuais em diversas regies do Brasil tm demonstrado essa

distribuio heterognea. No estado da Bahia, em populaes do Recncavo Baiano, a

prevalncia de portadores do trao falciforme (Hb AS) foi de 10,5% e de homozigotos

(Hb SS) 1,24% (Silva et al., 2006), sendo que na cidade de Salvador a prevalncia

estimada do trao falciforme foi 9,8%, enquanto da anemia falciforme foi 0,2% (Adorno

et al., 2005). No Distrito Federal, a prevalncia do trao falciforme em recm-nascidos

foi de 3,23% e da anemia falciforme 0,09% (Diniz et al., 2009). Na cidade de Natal, Rio

Grande do Norte, a prevalncia do trao falciforme em recm-nascidos foi de 1,5% e da

anemia falciforme 0,05% (Arajo et al., 2004). Na cidade de Porto Alegre, Rio Grande

do Sul, em um estudo piloto para triagem neonatal de hemoglobinopatias, foi

encontrado a frequncia de 1,2% para portadores do gene S, entre heterozigotos e

homozigotos (Daudt et al., 2002). Em outro estudo, envolvendo o estado do Rio Grande

do Sul como um todo, a prevalncia do trao falciforme foi 1,14% (Sommer et al.,

2006). No estado do Paran, a prevalncia do trao falciforme em recm-nascidos foi de

1,52%, enquanto para anemia falciforme e S0-tal foi de 2,2 e 2,7 a cada 100 mil

nascidos vivos, respectivamente (Watanabe et al., 2008). No estado de So Paulo, na

cidade de Campinas, o programa de triagem neonatal encontrou a frequncia de 1,98%

de portadores do trao falciforme e 0,01% para anemia falciforme (Brandelise et al.,

2004). As diferentes prevalncias desta hemoglobinopatia, nas diferentes regies, reflete

a diversidade de origens raciais e os variados graus de miscigenao presentes no Brasil

(Sommer et al., 2006).

A Tabela 2 mostra a incidncia da anemia falciforme, bem como de outros

fentipos da doena falciforme, no estado de MG. Estima-se o nascimento de uma

35

criana com anemia falciforme para cada 2.500 recm-nascidos vivos no estado de MG

(Januario, 2002).

As figuras 2, 3 e 4 ilustram a incidncia da anemia falciforme, trao falciforme e

doena falciforme, respectivamente, em nascidos vivos no estado de MG no perodo de

1998 at 2001, de acordo com as diretorias regionais de sade (DRS). Notar que a DRS

de Belo Horizonte est inserida no grupo que possui os nveis de maior incidncia da

doena falciforme em MG.

Tabela 2 - Incidncia dos fentipos da doena falciforme, segundo o Programa Estadual

de Triagem Neonatal de Minas Gerais (PETN-MG), em um milho de crianas triadas

no perodo de 1998 a 2002

IEF: Focalizao Isoeltrica (Isoelectrofocusing)

FS: homozigotos SS

FSC: duplo heterozigoto SC

FSA: heterozigoto AS

Fonte: Januario, 2002

36

Figura 2 - Incidncia da anemia falciforme (Hb SS)(*) em nascidos vivos, por

Diretorias Regionais de Sade. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais

- 1998/2001

Fonte: Januario, 2002

Figura 3 - Incidncia do trao falciforme (Hb AS) em nascidos vivos, por Diretorias

Regionais de Sade. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais -

1998/2001

Fonte: Januario, 2002

37

Figura 4 - Incidncia da doena falciforme(*) em nascidos vivos, por Diretorias

Regionais de Sade. Programa Estadual de Triagem Neonatal - Minas Gerais -

1998/2001

Fonte: Januario, 2002

3.4 Princpios moleculares dos processos de falcizao, vaso-ocluso e inflamao

na Anemia Falciforme

Em determinadas situaes como hipxia, desidratao e acidose, as molculas

de Hb S formam polmeros alongados que modificam o citoesqueleto das hemcias,

dando origem forma caracterstica de foice (falcizao) (Stuart e Nagel, 2004; Silva e

Shimauti, 2006; Frenette e Atweh, 2007). A Hb S desoxigenada promove a formao de

pontes de hidrognio entre os aminocidos valina da posio nmero 1 da globina S,

que normalmente sintetizada para esta posio, e a valina mutante que substituiu o

cido glutmico na posio 6 da mesma globina. A formao dessas pontes de

hidrognio modifica a estrutura espacial da molcula de Hb S e promove contatos

38

intermoleculares com outros aminocidos da globina S que participam da formao do

tetrmero. Os principais aminocidos envolvidos so a fenilalanina da posio 85 e a

leucina da posio 88. Como consequncia, formam-se agregados desses filamentos que

se polimerizam e alteram a estrutura globular das molculas de Hb S, modificando

tambm a morfologia discide da hemcia para diversos formatos, dos quais o mais

conhecida o de foice (Naoum, 2000).

A polimerizao da Hb S desoxigenada o evento primrio, indispensvel para a

patognese molecular da doena falciforme. Esse evento depende da concentrao

intraeritrocitria de Hb S, do grau de desoxigenao da clula, do pH e da concentrao

intracelular de Hb F (Stuart e Nagel, 2004). necessrio que as hemcias sofram um

retardo na circulao, criando as condies que facilitem a falcizao, como comumente

ocorre no bao. A ocluso de vasos esplnicos leva a repetidos infartos que resultam em

fibrose e destruio do rgo na maioria dos pacientes (Zago e Pinto, 2007).

A formao de polmeros de Hb S no citoplasma tem como consequncia

mltiplas alteraes na hemcia (Tabela 3) (Zago e Pinto, 2007).

As modificaes na membrana plasmtica: a) aumentam a adeso das hemcias

ao endotlio, desencadeando fenmenos inflamatrios; b) enrijecem a membrana e toda

a hemcia, encurtando sua sobrevida em circulao; c) provocam leses

microvasculares; d) causam depleo de xido ntrico (NO), o que contribui para

vasocontrio e ativao da inflamao; e) ativam a coagulao. Essas modificaes

tm consequncias que as amplificam, levando s manifestaes clnicas (Zago e Pinto,

2007).

A Anemia Falciforme caracteriza-se por manifestaes inflamatrias crnicas,

sendo que a gnese da maioria das manifestaes clnicas liga-se a trs mecanismos

inter-relacionados: 1) adeso celular ao endotlio vascular; 2) fenmenos inflamatrios

crnicos, acentuados por episdios agudos; 3) produo de intermedirios inflamatrios,

como citocinas e alteraes do metabolismo de NO (Zago e Pinto, 2007).

O evento primrio crucial para que ocorra a vaso-ocluso a adeso de hemcias

(reticulcitos e poucas clulas densas deformveis) ao endotlio vascular e,

provavelmente, o mecanismo primrio pelo qual as alteraes moleculares que

ocorrem nas hemcias so transmitidas aos tecidos, como por exemplo, a obstruo do

vaso, com agravamento da falcizao e o desencadeamento de fenmenos inflamatrios

(Stuart e Nagel, 2004; Zago e Pinto, 2007).

39

Tabela 3 - Principais alteraes moleculares das hemcias em consequncia do

fenmeno de falcizao

Aumento do Ca++

intracelular e de membrana

Perda de ons monovalentes, especialmente K+

Perda de gua (desidratao celular)

Aumento da densidade dos eritrcitos

Reduo da deformabilidade, fragilidade e vesiculao

dos eritrcitos

Oxidao da Hb: formao de metemoglobina e

superxidos

Desnaturao da Hb: formao de hemicromos, heme

livre e ferro livre

Anormalidades das protenas de membrana: anquirina,

banda 3, espectrina

Exposio de fosfatidil-serina na membrana celular

Aumento da adeso ao endotlio mediada por molculas

plasmticas, da membrana e do endotlio

Fonte: Zago e Pinto, 2007

As hemcias falcizadas induzem a expresso de mediadores inflamatrios e de

coagulao, levando ativao do endotlio vascular, e podem, tambm, estimular as

clulas do endotlio diretamente pela adeso. Essa adeso pode causar obstruo e

hipxia local, com agravamento da falcizao, desencadeando, ao mesmo tempo,

fenmenos inflamatrios. A aderncia de leuccitos a clulas endoteliais com formao

de agregados heterocelulares (leuccitos e clulas falciformes irreversveis) tambm

contribui para a obstruo, resultando em hipxia local, aumento da formao de

polmeros de Hb S e propagao da ocluso para vascularizao adjacente (Stuart e

Nagel, 2004). Concomitantemente, ocorrem alteraes de coagulao, alm da

mobilizao de clulas inflamatrias agudas (granulcitos) e crnicas (moncitos).

Ativados, os neutrfilos aderem a hemcias discides e falcizadas da circulao,

levando a episdios transitrios de ocluses vasculares (Frenette e Atweh, 2007; Zago e

Pinto, 2007).

A presena de leuccitos aderente em pequenas vnulas ps-capilares um fator

que contribui para a vaso-ocluso. Os leuccitos so clulas grandes, relativamente

40

rgidas, e que no so facilmente deformados. Essas propriedades fsicas fazem com que

os leuccitos tenham, em relao s hemcias, falcizadas ou no, um potencial maior

para promover a obstruo vascular e reduo do fluxo sanguneo. Estudos recentes

sugerem que a maioria das interaes entre hemcias e leuccitos in vivo mediada por

neutrfilos aderentes (Stuart e Nagel, 2004). Como a adeso de leuccitos desempenha

um papel chave na vaso-ocluso, eles se tornam um alvo teraputico para esta doena.

Estudos demonstraram que contagem elevada de leuccitos apresenta alta correlao

com a mortalidade (Platt et al., 1994), sndrome torcica aguda (Castro et al., 1994) e

acidente vascular cerebral (Ohene-Frempong et al., 1998).

3.5 Manifestaes clnicas e laboratoriais

As manifestaes clnicas em pacientes com anemia falciforme variam desde

morte precoce na infncia a ausncia de sintomas com expectativa de vida quase normal

(Serjeant, 1992). Por ser uma anomalia da globina beta, os sintomas comumente s

surgem aps o sexto ms de vida quando a produo da cadeia variante j

claramente predominante em relao cadeia da Hb F (Naoum, 2000; Thein e

Menzel, 2009). A fisiopatologia da anemia falciforme faz com que os pacientes

possuam caractersticas laboratoriais alteradas e peculiares (Tabela 4).

Os fenmenos vaso-oclusivos e a hemlise crnica so os principais

determinantes das manifestaes clnicas da anemia falciforme (Tabela 5). Apesar da

alterao principal estar restrita s hemcias, trata-se de doena sistmica cujos efeitos

podem incidir sobre qualquer rgo (Reed e Vichinsky, 1998).

As manifestaes clnicas mais comuns em crianas so as crises lgicas e a

sndrome torcica aguda (STA, incluindo as pneumonias), seguidas da anemia aguda

(sequestro esplnico agudo e anemia aplstica aguda), meningite-septicemia e

osteomielite (Tarer et al., 2006).

41

Tabela 4 Caractersticas laboratoriais da anemia falciforme

Fonte: Naoum, 2000

Tabela 5 - Manifestaes clnicas da doena falciforme de acordo com o principal

componente fisiopatolgico

Complicaes da doena falciforme

Hemlise crnica:

Anemia

Litase biliar

Crise aplstica (parvovrus)

Ictercia

Atraso no crescimento

Vaso-ocluso:

Crises de dor (crise lgica)

Sndrome torcica aguda

Acidente vascular cerebral

Priapismo

Retinopatia

Necrose ssea avascular

Sequestro esplnico

Asplenia funcional

lceras nas pernas

Hipostenria e enurese

Nefropatia crnica Fonte: Reed e Vichinsky, 1998

42

3.51 Eventos clnicos agudos mais relevantes na infncia

3.511 Crises vaso-oclusivas ou crises de dor

As crises vaso-oclusivas ou crises de dor so caracterizadas por episdios de

ocluso microvascular em um ou vrios locais, causando dor e inaptido, acompanhada

por uma inflamao local (Stuart e Nagel, 2004). Os episdios so recorrentes, com

durao de horas ou dias, podendo chegar a semanas, embora mais comumente tenham

de cinco a sete dias de durao (Serjeant, 1992).

A ocluso microvascular origina-se, predominantemente, em reas localizadas

da medula ssea, levando necrose. Os mediadores inflamatrios ativam fibras

nervosas aferentes nociceptivas, evocando a resposta de dor. As reas afetadas so ossos

longos, costelas, esterno, coluna vertebral e pelve, muitas vezes com envolvimento de

vrios locais simultaneamente (Stuart e Nagel, 2004).

A sndrome mo-p (dactilite) caracterizada por um edema doloroso das mos,

ps ou ambos, que afeta crianas menores de trs anos. Corresponde a um processo

inflamatrio complexo, iniciado por necrose da medula ssea nas pores distais dos

membros. Por isso, a dor acompanhada de sinais inflamatrios evidentes, como edema

e calor (Zago e Pinto, 2007).

A maioria dos episdios de crise de dor pode ser tratados em casa, com uma

combinao de agentes anti-inflamatrios, hidratao oral e analgsicos opiides e no-

opiides (Stuart e Nagel, 2004; Brasil, 2006).

3.512 Sndrome Torcica Aguda

A sndrome torcica aguda (STA) uma causa frequente de hospitalizaes e a

principal causa de morte em jovens adultos com doena falciforme (Platt et al., 1994).

43

Trata-se de complicao comum, caracterizada por dor peitoral pleurtica, febre,

estertores na ausculta pulmonar e infiltrado pulmonar na radiografia de trax (Castro et

al., 1994).

Em um estudo multicntrico realizado nos EUA, do qual 30 centros

participaram, as causas especficas dos episdios de STA foram identificados em 38%

dos pacientes. As infeces foram a principal causa (29%), seguidas da embolia

gordurosa (9%) (Vichinsky et al., 2000). As causas das infeces so igualmente

distribudas entre bacteriana, micoplasma, vrus e infeces por clamdia (Stuart e

Nagel, 2004). A infeco pelo parvovrus B19 causa necrose na medula e uma forma

grave de STA (Lowenthal et al., 1996).

Episdios repetidos de STA podem predispor doena pulmonar crnica,

incluindo a hipertenso pulmonar (Vichinsky et al., 2000). Os fatores de risco incluem o

gentipo homozigoto (Hb SS), baixas concentraes de Hb F e nveis basais altos de

hemoglobina e leuccitos (Castro et al., 1994).

O tratamento da STA consiste na identificao da causa, quando possvel, e o

uso de antibiticos, mesmo nos casos em que a causa infecciosa no tenha sido

identificada. Eritrocitafrese em casos graves e transfuso simples nos casos moderados

podem salvar vidas. O tratamento com antibitico macroldeo uma importante

ferramenta. Em casos de necrose ssea (alm da embolia gordurosa pulmonar), a

gordura pode atravessar a microvasculatura pulmonar, ganhando acesso circulao

sistmica, com disseminao de embolias a vrios locais, incluindo o sistema nervoso

central. Esta sndrome de falncia de mltiplos rgos muitas vezes letal e exige

eritrocitafrese imediata (Stuart e Nagel, 2004).

3.513 Sequestro Esplnico Agudo

O sequestro esplnico agudo (SEA), classicamente definido como aumento

sbito do volume esplnico, associado queda de pelo menos 2 g/dL na concentrao

de hemoglobina e reticulocitose (Stuart e Nagel, 2004; Rezende et al., 2009), resultado

do aprisionamento de sangue no bao, em consequncia da falcizao das hemcias e

obstruo do fluxo vascular.

44

O espectro de gravidade amplo, com casos raros de aumento agudo do bao

acompanhado por colapso circulatrio e morte por anemia e choque hipovolmico

(Stuart e Nagel, 2004). As crises de SEA no tm etiologia definida.

Em um estudo de coorte retrospectiva realizado com uma casustica oriunda do

mesmo centro de referncia dos sujeitos da pesquisa do presente trabalho (HBH), a

incidncia de SEA foi de 10,2 primeiros episdios por 100 pacientes/ano, com

recorrncia de 57,3%. Em relao aos fatores clnicos associados, 52,6% dos episdios

de SEA apresentaram algum outro diagnstico clnico associado, sendo 89,6%

relacionado a doenas infecciosas. Destacou-se a palpao do bao abaixo do rebordo

costal esquerdo durante algum momento da evoluo clnica como fator de risco (duas

vezes maior que para as crianas sem esplenomegalia). Como fatores de proteo,

destacou-se os nveis mais elevados de Hb F e leucometria basal mais baixa.

Figura 5 - Curva de probabilidade de ocorrncia do primeiro episdio de SEA,

conforme o tempo de exposio individual em uma populao de crianas triadas pelo

PETN-MG e acompanhadas no HBH da Fundao HEMOMINAS (Mtodo de Kaplan-

Meier)

Fonte: Rezende et al., 2009

A curva de probabilidade de ocorrncia do primeiro episdio de SEA indica a

estimativa de que 27,1, 33 e 37% das crianas j teriam sofrido o primeiro episdio

45

quando atingida a idade de 2, 3 e 5 anos, respectivamente (Figura 5). A letalidade geral

dos episdios de SEA foi de 2,9% (Rezende et al., 2009).

O tratamento imediato inclui a correo da hipovolmica com transfuso (Stuart

e Nagel, 2004; Brasil, 2006). Como a taxa de reincidncia alta (cerca de 50%), o

acompanhamento clnico crucial. Para crianas com mais de 2-3 anos, a esplenectomia

recomendada logo aps o episdio agudo (Stuart e Nagel, 2004). Todas as mes

devem ser educadas para fazer a palpao do bao de seus filhos, bem como reconhecer

os sintomas deste evento potencialmente ameaador vida. Tais medidas tm reduzido

o nmero de mortes (Stuart e Nagel, 2004; Canado e Jesus, 2007).

3.514 Acidente Vascular Cerebral

O acidente vascular cerebral (AVC) uma das complicaes mais graves da

anemia falciforme, acometendo 11% dos pacientes at 18 anos de idade (Quinn et al.,

2004).

Os dois principais mecanismos responsveis pelo AVC em indivduos com

doena falciforme so: 1) arteriopatia oclusiva em que existe proliferao da camada

ntima e aumento dos fibroblastos e das clulas musculares lisas na parede das artrias,

e como consequncia, estreitamento segmentar progressivo da poro distal da artria

cartida interna e ramos proximais das principais artrias intracranianas (polgono de

Willis); 2) agregao das clulas falciformes e, consequentemente, ocluso do lmen de

pequenos vasos (Hillery e Panepinto, 2004).

O AVC isqumico mais comum nas crianas; nos adultos predomina a

hemorragia intracraniana. Tambm ocorrem ataques isqumicos transitrios, definidos

como eventos isqumicos cujos sintomas se resolvem em menos de 24 horas de

evoluo sem sequelas motoras.

O primeiro AVC ocorre mais comumente na primeira fase da infncia (1,02 por

100 pacientes/anos em crianas de 2 a 5 anos). H diminuio da incidncia em

pacientes de 6 a 9 anos (0,79 por 100 pacientes/ano) (Ohene-Frempong al., 1998).

Dados do Dallas Pediatric Sickle Cell Program mostram que a taxa global de AVC

entre os indivduos SS e S0-tal (n=448) foi de 0,85/100 paciente-ano em indivduos

acompanhados at 18 anos de idade. O mesmo estudo mostra que as probabilidades

46

estimadas de sobrevida livre do primeiro AVC com 2, 6 e 10 anos so de 99,5 (IC95%

98,8-100), 94,3 (IC95% 91,8-96,8) e 91,6 (IC95% 88,4-94,5) em crianas SS e S0-tal

(Quinn et al., 2004).

O risco de recorrncia grande, principalmente nos primeiros anos aps o

primeiro evento. Quando o tratamento no realizado aps o primeiro AVC isqumico,

o risco de recorrncia observado em estudos de coorte variou entre 46% e 67% (Powars

et al., 1978; Balkaran et al., 1992).

Os fatores de risco para a ocorrncia de AVC em indivduos com doena

falciforme so o gentipo homozigoto (Hb SS), histrico de ataque isqumico

transitrio, nvel basal baixo de Hb basal, contagem alta de leuccitos, aumento da

presso arterial sistlica e histrico de sndrome torcica aguda (Ohene-Frempong et al.,

1998).

Na fase aguda do AVC isqumico necessria a transfuso sangunea imediata

para reduzir a Hb S para nveis menores que 30%, com um acompanhamento

transfusional para manter a concentrao de Hb S em menos de 30%. Essa terapia, com

acompanhamento de trs anos, reduziu a taxa de reincidncia de 50% para cerca de 10%

(Stuart e Nagel, 2004). Em um estudo de coorte onde participaram pacientes de 14

centros de referncia dos EUA, a frequncia de recorrncia em pacientes que receberam

transfuso por no mnimo cinco anos foi 22% (2,2 por 100 pacientes/ano) (Scothorn et

al., 2002). Em um estudo realizado nos Estados Unidos, nenhum dos 15 pacientes

submetidos a esta terapia tiveram recorrncia do evento durante 1.023 pacientes/meses

de terapia (Cohen et al., 1992).

A terapia transfusional traz riscos para os pacientes como reaes transfusionais,

infeces, aloimunizao e sobrecarga de ferro. Como a retirada do tratamento de

transfuso pode acarretar na recorrncia de AVC, a terapia com hidroxiureia (HU) foi

sugerida para prevenir a recorrncia, sendo o uso iniciado antes do fim do perodo de

transfuses (Ware et al., 1999).

O Doppler transcraniano cerebral (DTC), ao medir as velocidades de fluxo

sanguneo nos vasos cerebrais, uma importante ferramenta que ajuda na deteco

precoce de doentes em risco de sofrer AVC. Essa ferramenta permite incluir os

pacientes em risco em regime de transfuso para evitar a ocorrncia do primeiro

episdio de AVC. Em um estudo randomizado realizado com crianas com anemia

falciforme e risco de AVC (velocidade na artria cartida interna ou cerebral mdia

47

200 cm por segundo), houve uma diferena de 92% no risco do primeiro AVC,

comparando o grupo tratado com transfuses em relao ao grupo submetido ao

tratamento observacional (Adams et al., 1998). A realizao, no mnimo anual, do DTC

recomendada para crianas de dois a 16 anos com o gentipo homozigoto (Hb SS)

(Stuart e Nagel, 2004).

No HBH da Fundao HEMOMINAS, foi analisada uma coorte de 262 crianas

triadas pelo PETN-MG, com perfil hemoglobnico FS, nascidas entre maro de 1998 e

dezembro de 2005 e acompanhadas at maio de 2009. As crianas com velocidade

mdia mxima (VMM) do fluxo sanguneo cerebral 3,0 g/dl) com ausncia de reticulcitos no sangue perifrico,

ou, se presentes, com aumento dirio de acordo com a fase de recuperao (Serjeant et

al., 1993).

Embora a maioria das pessoas se recupere espontaneamente em poucos dias, a

anemia pode ser to grave que causa descompensao cardaca e morte, se a anemia e a

reticulocitopenia no so reconhecidas e tratadas (Stuart e Nagel, 2004).

Em um estudo de coorte realizado com 308 crianas com anemia falciforme, a

infeco pelo Parvovrus B19 foi a causa da maioria, se no todas as crises aplsticas

(Serjeant et al., 1993).

48

3.516 Infeces

Os pacientes com doena falciforme tm vrias anormalidades do sistema

imunolgico. A perda precoce das funes esplnicas remove um sistema projetado para

trazer antgenos circulantes para um estreito contato com o tecido reticuloendotelial. H

tambm alteraes no complemento, nas imunoglobulinas, na funo dos leuccitos e

na imunidade celular. Alm disso, a necrose da medula ssea ou outros tecidos pode

facilitar a instalao de bactrias e a ocorrncia de infeces crnicas. O resultado

dessas anormalidades o aumento do risco de infeces pneumoccicas e osteomielite

por salmonela e, possivelmente, um aumento de Haemophilus influenzae e septicemias

por Escherichia coli (Serjeant, 1992).

Os agentes etiolgicos associados a episdios de infeco bacteriana invasiva

em um estudo incluindo 3.820 indivduos com anemia falciforme, em ordem

decrescente de frequncia, foram: Streptococos pneumoniae, Salmonella spp,

Haemophilus influenzae (tipo B), Escherichia coli e Klebsiella spp. A incidncia

cumulativa mostrou que o Streptococos pneumoniae e o Haemophilus influenzae

ocorreram predominantemente antes dos cinco anos de idade e raramente aps os cinco

anos. Salmonella spp aumentou quase linearmente com a idade; Klebsiella spp e

Escherichia coli predominaram nos pacientes com mais de 10 anos de idade.

Escherichia coli foi encontrada em crianas mais velhas, quase exclusivamente em

meninas (Magnus et al., 1999). extremamente importante lembrar que qualquer

infeco bacteriana no indivduo com anemia falciforme tem grande potencial de

evoluir para septicemia, muitas vezes com xito letal, se no for identificada e tratada

precocemente (Di Nuzzo e Fonseca, 2004). O risco de septicemia em indivduos com

anemia falciforme permanente, principalmente devido ausncia ou reduo da

funo esplnica, sobretudo nos primeiros seis anos de vida (Castro, 1999).

A profilaxia medicamentosa e imunizaes reduzem a incidncia e mortalidade

causadas por infeces em pacientes com anemia falciforme (Di Nuzzo e Fonseca,

2004).

49

3.6 Mortalidade, expectativa de vida e medidas de reduo da morbidade e

mortalidade

A doena falciforme continua a causar morbidade e mortalidade significativas,

apesar do aumento da expectativa de vida (Hagar e Vichinsky, 2008). A letalidade pode

atingir at 25% das crianas nos primeiros cinco anos de idade, sendo as principais

causas de bito a infeco causada por germes capsulados e a crise de sequestro

esplnico (Watanabe et al., 2008). Entretanto, em locais onde j se estabeleceu a

triagem neonatal e o acompanhamento das crianas rgido, a mortalidade pela doena

falciforme est diminuindo, a idade mdia de morte est aumentando e uma menor

proporo de mortes causada por infeces (Quinn et al., 2004).

Um estudo realizado em MG descreveu as circunstncias de bito em 78

crianas com doena falciforme, entre as 1.396 que foram diagnosticadas e

acompanhadas pelo PETN-MG no perodo de maro de 1998 a fevereiro de 2005 (total

de crianas triadas: 1.833.030). A mortalidade geral no perodo foi de 5,6%. A anemia

falciforme, estado homozigoto para Hb S, apresentou a maior prevalncia de bito

(80,8%). A mediana da idade ao bito foi 13,7 meses, sendo que 72% dos bitos

ocorreram em crianas de at dois anos de idade. As infeces (incluindo pneumonia e

septicemia) foram a principal causa dos bitos nesse grupo (38,5%), seguida pelo

sequestro esplnico (16,6%). As probabilidades estimadas de sobrevida para as crianas

com os gentipos SS, SC e S+tal aos cinco anos foram de 89,4%, 97,7% e 94,7%,

respectivamente (Figura 6) (Fernandes, 2007).

A reduo na morbidade e mortalidade na doena falciforme tem ocorrido

devido implementao de quatro princpios: (1) o diagnstico precoce, (2)

acompanhamento preventivo (acompanhamento clnico e profilaxias), (3) rpido

tratamento das complicaes que envolvem risco de vida e (4) desenvolvimento e

implementao de novas modalidades de tratamentos (Vichinsky, 1991).

50

O diagnstico neonatal, a pronta instituio do tratamento (imunizaes e

penicilina profiltica) e a orientao do reconhecimento precoce do sequestro esplnico

pelas mes ou cuidadoras contriburam para a reduo da mortalidade das crianas nos

primeiros cinco anos (Canado e Jesus, 2007).

Figura 6 - Curvas de sobrevida, por tipo de hemoglobinopatia, das 1396 crianas com

doena falciforme, diagnosticadas pelo Programa Estadual de Triagem Neonatal de

Minas Gerais entre maro de 1998 e fevereiro de 2005 (mtodo de Kaplan-Meier)

Fonte: Fernandes, 2007

Opes eficazes de tratamento atualmente relativamente disponveis para o

tratamento da anemia falciforme so o transplante de medula ssea (TMO) e a

hidroxiureia (HU).

O TMO, apesar de ser a medida curativa, quando dispe de um doador

compatvel, considerado de alto risco por apresentar grande ndice de complicaes e

mortalidade (Silva e Shimauti, 2006; Frenette e Atweh, 2007). O TMO ainda no foi

muito utilizado em pacientes com doenas falciformes, sendo relatados

aproximadamente 500 casos no mundo e apenas 14 no Brasil.

51

A HU um frmaco inibidor da redutase ribonucleotdeo que tem sido usado no

tratamento de doenas mieloproliferativas. uma droga oral disponvel que

relativamente bem tolerada e simples de usar. Aps a demonstrao de sua capacidade

de induzir a produo de Hb F em babunos, o uso da HU foi testada em ensaios

clnicos em adultos com doena falciforme (Platt et al., 1984; Rodgers et al., 1990;

Charache et al., 1992). Um grande estudo mostrou o decrscimo na frequncia de crises

lgicas, STA, reduo na necessidade de transfuses e de hospitalizaes em adultos

com doena falciforme tratados com HU (Charache et al., 1995). Aps nove anos de

acompanhamento, pacientes com doena falciforme tratados com HU apresentaram

maior sobrevida (Steinberg et al., 2003).

A HU tem outros efeitos que podem beneficiar os pacientes com doena

falciforme, como por exemplo, diminuir a adeso de clulas falcizadas ao endotlio

vascular e diminuir o nvel de expresso da molcula VCAM-1 solvel (Bridges et al.,

1996; Saleh et al., 1999). Devido sua atividade mielossupressora, a HU reduz a

contagem de leuccitos circulantes e provavelmente o nmero de leuccitos aderentes

parede de vnulas de pequeno porte (Frenette e Atweh, 2007). Alm disso, a HU pode

causar efeito citoredutivo em neutrfilos, aumento do teor de gua nas hemcias,

aumento da deformabilidade e capacidade de navegao microvascular de hemcias

falciformes e alterar a capacidade de adeso das hemcias ao endotlio (Aliyu et al.,

2006).

3.7 Interferentes genticos na diversidade fenotpica da Anemia Falciforme

A anemia falciforme causada pela substituio de um nico nucleotdeo, mas o

fentipo da doena o produto de muitos genes (Nagel e Steinberg, 2001). A reduo

do nvel da Hb S e/ou o aumento do nvel da Hb F podem influenciar no processo de

falcizao e modificar o fentipo da doena. Alm disso, vrios processos na

52

vasculatura e rgos influenciam no fenmeno de vaso-ocluso e tambm levam

diversidade de gravidade da doena (Rund e Fucharoen, 2008).

Sabe-se que as manifestaes clnicas dos pacientes portadores da anemia

falciforme so influenciadas por trs tipos de genes: 1) gene que abriga a mutao

primria, ou seja, alelo da S globina; 2) genes pleiotrpicos, que esto envolvidos na

fisiopatologia secundria, sendo indispensvel a presena da primeira mutao, cada um

com o potencial de modificar a extenso e a caracterstica das manifestaes clnicas do

paciente (ex: hemlise, hiperplasia eritride na medula ssea, necrose ssea e outros); e

3) genes epistticos (polimorfismos nos genes pleiotrpicos) que modulam

significativamente a fisiopatologia da doena em um paciente em particular. Esses

eventos secundrios contribuem de forma significativa para o fentipo e explicam

parcialmente as diferenas interindividuais marcantes na gravidade da doena (Nagel,

2005).

Sabe-se que os hapltipos S parecem ter um papel importante na determinao

da gravidade da doena, em parte pelo menos por influenciarem o nvel de Hb F

(Naoum, 2000). A coexistncia de -Tal causa a reduo da Hb S no interior das

hemcias e a diminuio da polimerizao, o que produz consequncias clnicas e

hematolgicas que diferem esses pacientes daqueles sem a interao (Steinberg, 2009).

Powars (1991), utilizando taxas de incidncia ajustada por idade de falncia dos

principais rgos, props um termmetro da gravidade da anemia falciforme baseado

na influncia dos hapltipos S e dos gentipos de -Tal (Figura 7).

Outros genes, no ligados ao agrupamento de genes da -globina, participam de

eventos patolgicos relevantes. Por exemplo, a rpida destruio das clulas

falciformes, a formao de clulas densas e a adeso ao endotlio so controladas por

genes pleiotrpicos. Experimentos com microarrays esto sendo usados para identificar

genes mais ou menos envolvidos em vrios processos patolgicos que ocorrem em

rgos afetados pela doena em seres humanos e camundongos transgnicos. Depois

que os genes pleiotrpicos so localizados, os polimorfismos podem ser pesquisados

para identificar genes epistticos que vo ajudar a definir o risco individual, o que,

eventualmente, permitiria intervenes futuras antes do aparecimento de leses de

rgos (Stuart e Nagel, 2004).

53

Figura 7 - Representao esquemtica da influncia dos hapltipos S e dos gentipos

de -Tal na gravidade clnica da anemia falciforme

Fonte: Powars, 1991

3.71 Hapltipos do agrupamento de genes da beta-globina

3.711 Origem, distribuio geogrfica e caracterizao dos hapltipos S

54

Hapltipos, definidos como padres de vrios polimorfismos no DNA ao longo

de uma regio de um cromossomo, so utilizados para inmeras finalidades, por

exemplo, como marcadores para migrao de populaes em estudos antropolgicos e

para detectar distncias genticas entre os principais grupos tnicos em estudos sobre

a origem das raas humanas. Hapltipos especficos so encontrados nos cromossomos

portadores do alelo S (Nagel e Ranney, 1990).

A mutao S est em desequilbrio de ligao com mltiplos stios polimrficos

ao longo do agrupamento de genes da -globina (Hanchard et al., 2007; Liu et al.,

2009). Os hapltipos S so definidos pela variao de sequncias de DNA no

agrupamento de genes da -globina - cerca de 60 kb no cromossomo 11 (Pagnier et al.,

1984) - que alteram o stio de reconhecimento de endonucleases de restrio (Stuart e

Nagel, 2004). Eles podem ser usados de vrias formas: para a determinao da origem

unicntrica ou multicntrica de evento mutacional responsvel pelo alelo S; na

discriminao entre os diversos eventos epistticos ligados ao alelo S que podem

modular a expresso fenotpica da mutao estrutural; no monitoramento do fluxo do

alelo S em populaes humanas; no estudo de origem e evoluo da raa humana

(Nagel e Ranney, 1990; Lapoumeroulie et al., 1992); e para a compreenso das foras

seletivas que moldam a distribuio da variao gentica dentro e entre populaes

humanas (Crawford et al., 2002).

Esses hapltipos so nomeados de acordo com a regio geogrfica em que

predominam e so usados na definio da provvel regio onde teve origem a mutao.

Eles so classificados em cinco diferentes tipos: 1) o Bantu ou Repblica Central

Africana (CAR Central African Republic), associado s regies centro-sul e leste do

continente africano; 2) o Benin (Ben), associado regio centro-oeste africana; 3) o

Senegal (Sen), associado ao oeste atlntico africano; 4) o Camares (Cam), associado s

regies ao longo da costa oeste da frica (Pagnier et al., 1984) e 5) o tipo rabe-

Indiano, predominante na Arbia Saudita, Bahrein, Kuwait, Om e ndia (Figura 8)

(Stuart e Nagel, 2004).

55

Dessa forma, acredita-se que a mutao que originou a Hb S ocorreu pelo menos

cinco vezes durante a evoluo humana (quatro na frica e uma na sia). Uma hiptese

alternativa, com base na seleo e converso gnicas, no explica a homogeneidade

rigorosa dos hapltipos ligados ao alelo S em reas geograficamente distintas. Essa

hiptese tambm no explicaria a ausncia da coexistncia do hapltipo original com o

hapltipo convertido nas reas geogrficas distintas. Alm disso, como todos os

principais hapltipos S tm frequncia cromossmica alta nas diferentes regies

geogrficas, todos eles so capazes de ser selecionados pela malria (Nagel e Ranney,

1990).

Figura 8 - Regio de origem e abrangncia dos trs principais hapltipos S africanos e

um asitico

Fonte: Stuart e Nagel, 2004

Pagnier et al. (1984) definiram 11 stios de restrio no agrupamento de genes

da -globina de indivduos com anemia falciforme de regies africanas separadas

(Benin, Repblica Central Africana, Senegal e Arglia) e observaram que em todos os

pacientes de Benin e da Arglia os cromossomos portadores do alelo S possuam o

56

mesmo hapltipo. Na Repblica Central Africana e no Senegal a grande maioria dos

cromossomos S foi associada com um hapltipo especfico para cada regio. Dos 124

cromossomos analisados naquele estudo, 110 hapltipos eram geograficamente

especficos e 120 poderiam ser classificados em trs grupos: Benin, Senegal e CAR

(populaes de dialeto Bantu). Como os trs hapltipos diferem entre si em pelo menos

trs stios a 5 e a 3 de um ponto quente (hot spot) de recombinao no agrupamento

de genes da -globina, os autores sugeriram que o alelo S provavelmente surgiu pelo

menos trs vezes em hapltipos pr-existentes.

O hapltipo Cam, que difere dos outros trs hapltipos africanos em regies 5 e

3 da mutao S, encontrado no grupo tnico Eton. Este hapltipo est associado ao

gene A

T e idntico ao hapltipo II, encontrado algumas vezes associado -

talassemia no Mediterrneo. A quarta mutao S

na frica (hapltipo Cam)

provavelmente expandiu-se tambm pela presena da malria (Nagel e Ranney, 1990).

Um desequilbrio de ligao entre o alelo S e o hapltipo rabe-Indiano foi

descrito, independentemente, por Bakioglu et al. (1985), Wainscoat et al. (1985) e

Miller et al. (1987) em pacientes com anemia falciforme na parte oriental da Arbia

Saudita. Esse hapltipo tambm encontrado na ndia, representando mais de 90% dos

hapltipos neste pas (Nagel e Ranney, 1990).

Labie et al. (1989), estudando trs tribos isoladas do subcontinente indiano,

separadas por mais de 3.200 Km e que no possuem nenhum tipo de comunicao atual

e nem por um longo tempo atrs, encontraram o mesmo hapltipo (rabe-Indiano)

ligado ao alelo S. Provavelmente este alelo

S teve origem unicntrica; as tribos

isoladas teriam uma origem comum. Existe uma hiptese de que a localizao

geogrfica deste ancestral comum poderia ter sido da civilizao Harappa, residente

numa rea endmica para malria, fator indispensvel para seleo e disperso do alelo

S

(Nagel e Ranney, 1990).

A maioria dos cromossomos portadores do alelo S

possui o padro gentico de

um dos cinco hapltipos clssicos,