germinarea semintelor
TRANSCRIPT
UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAŞI FACULTATEA DE BIOLOGIE
DIANA CAMELIA BATÎR - RUSU CERCETĂRI PRIVIND INFLUENŢA MICROMICETELOR PARAZITE ŞI SAPROFITE
ASUPRA SEMINŢELOR ŞI FRUCTELOR UNOR SPECII DE CEREALE ŞI LEGUMINOASE DIN COLECŢIA BĂNCII DE GENE SUCEAVA
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Conducător ştiinţific, Prof. univ. dr. Mihai MITITIUC 2010
UNIVERSITATEA "ALEXANDRU IOAN CUZA" IAŞI RECTORATUL Nr. ......... din .........................
Doamnei / Domnului.........................................................................
Vă facem cunoscut că în data de………………., ora ........, sala ........,
Facultatea de Biologie, va avea loc susţinerea publică a tezei de doctorat intitulată
"“Cercetări privind influenţa micromicetelor parazite şi saprofite asupra seminţelor
şi fructelor unor specii de cereale şi leguminoase din colecţia Băncii de Gene Suceava”, elaborată de Diana Camelia BATÎR - RUSU, în vederea obţinerii titlului
ştiinţific de doctor în Ştiinţe ale Naturii, domeniul de doctorat Biologie.
Comisia de doctorat are următoarea componenţă:
PREŞEDINTE:
Prof. univ. dr. Maria Magdalena ZAMFIRACHE
Director al Departamentului de Biologie
Facultatea de Biologie, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
Prof. univ. dr. Mihai MITITIUC
Facultatea de Biologie, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi
REFERENŢI ŞTIINŢIFICI:
Prof. univ. dr. Toader CHIFU
Facultatea de Biologie a Universităţii "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi
Prof. univ. dr. Eugen ULEA
Facultatea de Agricultură a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară
“Ion Ionescu de la Brad” Iaşi
Conf. univ. dr. Marcel PÂRVU
Facultatea de Biologie a Universităţii “Babeş-Bolyai” Cluj-Napoca
Vă transmitem rezumatul tezei de doctorat şi vă invităm să participaţi la şedinţa
de susţinere publică a tezei.
2
CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT
MULŢUMIRI 1 INTRODUCERE 2 CAPITOLUL I 4 SĂMÂNŢA - “ORGANISM VIU ŞI FRAGIL” 1.1. Importanţa seminţei 5
1.2. Monitorizarea stării fitosanitare a cariopselor
de cereale şi seminţelor de leguminoase
destinate conservării genetice 6
1.3. Mecanismul producerii infecţiei la cariopsele
de cereale şi seminţele de leguminoase 17
CAPITOLUL II ISTORICUL CERCETĂRILOR PRIVIND PATOLOGIA SEMINŢEI PE PLAN NAŢIONAL 31 CAPITOLUL III
FACTORII CARE CONDIŢIONEAZĂ APARIŢIA ŞI DEZVOLTAREA MICROMICETELOR PE CARIOPSELE 35 DE CEREALE ŞI SEMINŢELE DE LEGUMINOASE CAPITOLUL IV 45 MICOTOXINELE - O PROBLEMĂ DE SIGURANŢĂ ALIMENTARĂ 4.1. Caracteristici generale ale micotoxinelor şi biosinteza lor 45
4.2. Caracterizarea chimico-toxicologică a micotoxinelor
produse de micromicetele toxinogene
întâlnite în loturile de seminţe la cereale 59
CAPITOLUL V 65 SISTEMUL DE EXPERIMENTARE 5.1. Obiective 65
5.2. Condiţiile de experimentare 66
5.3. Materialul biologic de experimentare 66
5.4. Metodele şi tehnicile de cercetare aplicate 85
5.4.1. Protocolul de lucru în analiza fitopatologică 85
3
5.4.1.1. Tehnica de lucru experimentală în analiza fitopatologică
prin metoda CGA (cartof - dextroză - agar) 93
5.4.1.2. Tehnica de lucru experimentală în analiza fitopatologică prin metoda Sabouraud
(extract de drojdie - dextroză - cloramfenicol - agar) 102
5.4.2. Protocolul de lucru pentru determinarea cantitativă
a micotoxinelor din cereale 107
5.4.2.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale
prin metoda cromatografiei în strat subţire (C.S.S.) 107
5.4.2.2. Determinarea cantitativă a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2)
din cereale prin metoda ELISA 114
5.4.2.3. Determinarea cantitativă a ochratoxinei A din cereale
prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate 122
5.4.2.4. Determinarea cantitativă a zearalenonei din cereale
prin metoda ELISA 136
5.4.3. Protocolul de lucru în analiza citogenetică
a probelor luate în studiu 141
5.5. Metode de calcul statistic utilizate 144
CAPITOLUL VI REZULTATE EXPERIMENTALE PRIVIND CARACTERIZAREA FITOPATOLOGICĂ, TOXICOLOGICĂ ŞI CITOGENETICĂ A PROBELOR DE CEREALE ŞI LEGUMINOASE LUATE ÎN STUDIU 146 6.1. Evaluarea fitopatologică la speciile de cereale şi leguminoase
luate în studiu 146
6.1.1. Micromicetele saprofite şi parazite
întâlnite la cerealele şi leguminoasele luate în studiu
(Analiza calitativă macroscopică şi microscopică) 146
6.1.2. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit
(Analiza cantitativă prin cuantificarea datelor
şi interpretarea rezultatelor) 206
6.1.2.1. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit
întâlnită la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum)
luate în studiu 206
6.1.2.2. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit
întâlnită la probele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba)
4
luate în studiu 229
6.1.2.3. Determinarea numărului total de colonii de
microorganisme fungice identificate prin metoda Sabouraud
la probele de cereale şi leguminoase luate în studiu 257
6.2. Evaluarea acţiunii micromicetelor identificate
asupra germinaţiei cariopselor de cereale şi seminţelor de leguminoase
luate în studiu, în funcţie de umiditatea acestora 260
6.2.1. Evaluarea acţiunii micromicetelor identificate
asupra germinaţiei cariopselor de cereale (Zea mays, Triticum aestivum)
luate în studiu, în funcţie de umiditatea acestora 262
6.2.2. Evaluarea acţiunii micromicetelor identificate
asupra germinaţiei seminţelor de leguminoase
(Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate în studiu,
în funcţie de umiditatea acestora 267
6.3. Determinarea cantitativă toxicologică a micotoxinelor
secretate de micromicetele întâlnite la probele de cereale
luate în studiu (Zea mays, Triticum aestivum) 274
6.3.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale
prin metoda cromatografiei în strat subţire (C.S.S.) 274
6.3.2. Determinarea cantitativă a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2)
din cereale prin metoda ELISA 274
6.3.3. Determinarea cantitativă a ochratoxinei A din cereale
prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate 290 6.3.4. Determinarea cantitativă a zearalenonei din probele
de Zea mays luate în studiu prin metoda ELISA 299 6.4. Modificările citogenetice induse de agenţii patogeni fungici
la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum)
şi leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate în studiu 305
6.4.1. Modificările citogenetice induse de agenţii patogeni fungici
la probele de Zea mays luate în studiu 305
6.4.1.1. Indicele mitotic şi frecvenţa fazelor diviziunii mitotice
în apexul radicular la probele de Zea mays luate în studiu 306
6.4.1.2. Frecvenţa aberaţiilor interfazice totale şi
a tipurilor de aberaţii interfazice la probele de Zea mays
luate în studiu 307
6.4.1.3. Frecvenţa aberaţiilor cromozomiale totale şi
a tipurilor de aberaţii cromozomiale în ana-telofaza (A-T) mitozei
5
la probele de Zea mays luate în studiu 309
6.4.2. Modificările citogenetice induse de agenţii patogeni fungici
la probele de Phaseolus vulgaris luate în studiu 313
6.4.2.1. Indicele mitotic şi frecvenţa fazelor diviziunii mitotice
în apexul radicular la probele de Phaseolus vulgaris luate în studiu 313
6.4.2.2. Frecvenţa aberaţiilor interfazice totale şi
a tipurilor de aberaţii interfazice la probele de Phaseolus vulgaris
luate în studiu 315
6.4.2.3. Frecvenţa aberaţiilor cromozomiale totale şi
a tipurilor de aberaţii cromozomiale în ana-telofaza (A-T) mitozei
la probele de Phaseolus vulgaris luate în studiu 317
6.4.3. Modificările citogenetice induse de agenţii patogeni fungici
la probele de Vicia faba luate în studiu 321
6.4.3.1. Indicele mitotic şi frecvenţa fazelor diviziunii mitotice
în apexul radicular la probele de Vicia faba luate în studiu 321
6.4.3.2. Frecvenţa aberaţiilor interfazice totale şi
a tipurilor de aberaţii interfazice la probele de Vicia faba
luate în studiu 323
6.4.3.3. Frecvenţa aberaţiilor cromozomiale totale şi
a tipurilor de aberaţii cromozomiale în ana-telofaza (A-T) mitozei
la probele de Vicia faba luate în studiu 325
CONCLUZII 333 BIBLIOGRAFIE 337 LISTA LUCRĂRILOR ŞTIINŢIFICE CU REFERIRE LA SUBIECTUL TEZEI DE DOCTORAT 346 ANEXE 347
6
INTRODUCERE Viaţa fiecărui organism este permanent ameninţată de către alte organisme,
ceea ce constituie una din caracteristicile esenţiale ale lumii vii.
Pe parcursul perioadei de vegetaţie sau pe parcursul valorificării lor, plantele
sunt atacate de microorganisme fungice, care determină apariţia unor modificări
citologice, fiziologice şi biochimice la organele afectate. Aceste modificări apar după o
perioadă variabilă de timp, determinată de virulenţa atacului fitopatogen.
Patologia seminţei şi rolul acesteia în transmiterea bolilor la plante este o parte
integrantă a patologiei plantei în ansamblul ei.
În cadrul acestei lucrări am sintetizat cunoştinţele referitoare la importanţa
seminţei, importanţa analizei fitosanitare a seminţelor destinate conservării genetice,
modul de contaminare a seminţei, factorii care influenţează pierderea viabilităţii
seminţelor, precum şi unele aspecte fitopatologice legate de acţiunea micoflorei epifite
şi endofite prezentă în condiţii de depozitare pe cariopsele de cereale şi seminţele de
leguminoase luate în studiu, acţiunea agenţilor patogeni fungici asupra facultăţii
germinative şi umidităţii probelor analizate, precum şi caracterizarea chimico-
toxicologică a micotoxinelor secretate de micromicetele identificate, determinarea
cantitativă a acestora şi unele modificări citogenetice induse de agenţii patogeni fungici.
Am pus accent pe anumite aspecte fitopatologice şi genetice privind evoluţia
micromicetelor saprofite şi parazite pe cariopsele cerealelor şi seminţele leguminoaselor
luate în studiu, care provin din zone pedoclimatice diverse şi au fost conservate
perioade diferite de timp, în depozite cu atmosferă controlată (T = + 4 ºC; umiditatea
relativă a aerului (U%) = 30 - 40%; procentul de umiditate al seminţelor (U = 5 - 8%).
Cerealele şi leguminoasele reprezintă culturi de tradiţie în agricultura ţării
noastre prin valoarea nutritivă ridicată a seminţelor, care constituie sursa primară de
hrană în alimentaţia oamenilor şi animalelor, dispunând în majoritatea zonelor de
condiţii favorabile de climă şi sol.
Porumbul este una din cele mai importante plante de cultură. Cariopsele sale se
utilizează în alimentaţia oamenilor, în industrie şi furajarea animalelor (constituie nutreţul
concentrat cel mai important pentru toate speciile de animale).
Bobul se cultivă pentru seminţele sale, care se folosesc în alimentaţia oamenilor
şi animalelor. Faţă de celelalte leguminoase, bobul prezintă avantajul că în anumite
zone din ţara noastră dă o producţie mai mare şi relativ mai constantă, asigurând la
7
unitatea de suprafaţă o cantitate de proteine mai ridicată şi la un cost mai redus. Însă, în
ţara noastră, cultura acestei plante s-a redus mult, fiind înlocuită cu cea a fasolei şi
mazării, în prezent suprafeţe mai mari cultivate cu bob găsindu-se în zonele umede şi
răcoroase (Bucovina, Oltenia, Maramureş) şi mult mai mici în alte regiuni, din sudul ţării,
unde apare sporadic (Ionescu, 1967).
Cu toate acestea, producţiile obţinute pe suprafeţe mari cât şi în gospodăriile
rurale referitoare la cereale şi leguminoase nu s-au ridicat la nivelul potenţialului
biologic al soiurilor cultivate sau au prezentat fluctuaţii de la un an la altul.
Una din cauzele principale care generează aceste neajunsuri poate fi
cunoaşterea slabă a problemelor legate de sănătatea seminţelor, cât şi neglijarea
măsurilor de prevenire şi combatere a principalilor agenţi fitopatogeni care afectează
culturile (Plăcintă, 2007).
Prin problematica abordată, acest studiu aduce noi contribuţii la cunoaşterea
principalilor patogeni seminali ai cerealelor şi leguminoaselor, cu importanţă majoră în
agricultură.
* * *
Finalizarea tezei de doctorat îmi dă ocazia să prezint gânduri de mulţumire şi
recunoştinţă îndrumătorului meu de doctorat, Domnului Profesor Dr. Mihai MITITIUC,
pentru încrederea acordată, pentru sfaturile şi sugestiile privind concepţia lucrării, pentru
îndrumarea permanentă, dar şi pentru criticile competente de-a lungul anilor stagiului de
pregătire.
Cu respect, aduc cele mai frumoase gânduri de mulţumire preşedintei şi referenţilor
oficiali ai acestei teze (Prof. univ. dr. Maria Magdalena Zamfirache, Director al
Departamentului de Biologie - Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” Iaşi, Prof. univ. dr.
Toader Chifu - Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” Iaşi, Prof. univ. dr. Eugen Ulea -
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară „Ion Ionescu de la Brad” Iaşi, Conf.
univ. dr. Marcel Pârvu - Universitatea „Babeş Bolyai” Cluj Napoca) pentru amabilitatea cu
care au acceptat să citească lucrarea şi să vină cu sugestii competente.
8
De asemenea, adresez alese şi speciale mulţumiri profesorilor de la Catedra de
Biologie Vegetală (Prof. univ. dr. Toader Chifu, Prof. univ. dr. Cătălin Tănase, Prof. univ.
dr. Maria Magdalena Zamfirache, Prof. univ. dr. Constantin Toma, Conf. univ. dr.
Lăcrămioara Ivănescu, Prof. univ. dr. Alexandrina Murariu) care au fost prezenţi de fiecare
dată în consiliile de examen, mi-au dat sfaturile şi îndrumările necesare, precum şi Lector dr.
Cristian Tudose de la Catedra de Genetică, pentru sprijinul în realizarea analizelor
citogenetice de laborator, respectiv Domnului fizician Dumitru Răileanu de la Laboratorul de
Microscopie Electronică din cadrul Universităţii „Alexandru Ioan Cuza” Iaşi pentru
fotografiile realizate.
Adresez calde mulţumiri Doamnelor Mariana Preda, respectiv Elvira Tanasciuc din
cadrul laboratoarelor Toxicologie şi Control Reziduuri de la Direcţia Sanitar Veterinară
Suceava pentru colaborarea reuşită în realizarea analizelor toxicologice şi fitopatologice.
Recunoştinţa mea se îndreaptă şi către Doamna Prof. univ. dr. Viorica Iacob -
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară „Ion Ionescu de la Brad” Iaşi,
pentru amabilitatea şi ajutorul acordat în determinarea unor specii de micromicete identificate
la microscopul electronic.
Pentru tot sprijinul oferit, mulţumirile mele se adresează şi colegelor dr. ing. agronom
Danela Murariu care mi-a fost alături în momentele grele, mi-a ridicat moralul,, m-a
încurajat cu multă răbdare şi profesionalism ori de câte ori simţeam că nu reuşesc să ajung la
rezultatul pe care mi-l doream şi mi-a acordat un real suport în interpretarea statistică a
rezultatelor, respectiv dr. ing. agronom Domnica Plăcintă, pentru numeroasele surse
bibliografice puse la dispoziţie cu atâta căldură, care au constituit un important rol în
formarea mea ca cercetător. Sunt recunoscătoare conducerii Băncii de Gene Suceava dr. biolog
Silvia Străjeru pentru înţelegerea acordată.
Toată recunoştinţa, dragostea şi admiraţia se îndreaptă către FAMILIA MEA care
mi-a fost alături în tot acest timp; sunt profund recunoscătoare pentru înţelegerea, bunătatea,
răbdarea de care au dat dovadă soţul meu, părinţii şi fratele meu, precum şi pentru sprijinul
moral şi financiar pe care mi l-au oferit în decursul anilor de studiu. * * *
9
CAPITOLUL I
SĂMÂNŢA - “ORGANISM VIU ŞI FRAGIL”
Sămânţa însumează, prin însăşi componentele structurale şi funcţiile
ei, toate atributele esenţiale ce definesc viaţa: metabolismul, respiraţia,
capacitatea de reproducere a unui nou organism, reacţia specifică sub acţiunea
factorilor de mediu.
Transmiterea agenţilor patogeni fungici prin seminţe a constituit
dintotdeauna mijlocul cel mai rapid de răspândire a bolilor de la o regiune la alta
şi din această cauză apare astfel necesitatea cunoaşterii lor prin simptome, prin
biologia şi modul de transmitere a fitopatogenilor care le produc, pentru ca odată
semnalate să poată fi asigurată în mod eficient prevenirea şi combaterea lor
(Baker, 1966).
1.1. Importanţa seminţei Sămânţa reprezintă una din pârghiile utilizate pentru stimularea
agriculturii şi mărirea producţiei, dar şi un mijloc de contaminare cu
micromicetele provenite din micoflora de câmp şi de depozit, pe perioada
păstrării (Străjeru şi colab., 2001, Plăcintă, 2007). Prin structura şi funcţiile ce
o definesc: metabolism, respiraţie, capacitate de reproducţie, sămânţa poate fi
definită ca un "organism viu şi fragil". Sămânţa trebuie considerată un mijloc
important de producţie, fără de care nu se poate asigura obţinerea unor recolte
mari şi cu indici calitativi superiori (Raicu şi colab., 1978). Ca mijloc de producţie, sămânţa reprezintă un start bun pentru viitoarea
cultură, atunci când prezintă o germinaţie rapidă şi are o valoare biologică
ridicată, provenind din soiuri ameliorate cu indici calitativi superiori din punct de
vedere genetic, fiziologic, morfologic, fitopatologic etc. (Străjeru şi colab., 2001).
Ca factor biologic şi economic, sămânţa constituie sursa majoră de
hrană pentru om şi animale (Străjeru şi colab., 2001).
10
Hrănirea populaţiei pe viitor atât în ţara noastră cât şi în lume se va
asigura printr-o agricultură ce protejează resursele genetice vegetale, o
agricultură intensivă ce păstrează diversitatea soiurilor, care contribuie la
protecţia climatică şi la reglarea echilibrului apei pe planetă.
Sămânţa trebuie să îndeplinească trei condiţii esenţiale pentru a asigura o
agricultură performantă:
să fie un bun material genetic
să prezinte puritate biologică şi valoare culturală ridicată
să fie liberă de agenţi patogeni fungici.
În afară de agenţii fitopatogeni care infectează sau contaminează
seminţele, o importanţă deosebită au şi microorganismele fungice saprofite, care
în condiţii favorabile de dezvoltare pot deveni parazite şi pot produce pagube
însemnate în special pe perioada depozitării (Raicu şi colab., 1978).
Pe lângă neajunsurile pe care o sămânţă infectată le aduce direct
producţiei, ea poate ridica probleme atunci când este folosită în hrana omului şi
animalelor. O serie de agenţi patogeni fungici care colonizează sămânţa au
capacitatea de a produce micotoxine foarte periculoase vieţii.
1.2. Monitorizarea stării fitosanitare a cariopselor de cereale şi
seminţelor de leguminoase destinate conservării genetice
Noţiunea de sămânţă cu valoare biologică ridicată include ca o condiţie
esenţială o stare sanitară corespunzătoare a acesteia. Alături de însuşirile de
productivitate, puritate, facultate germinativă, starea de sănătate a seminţei nu
poate şi nu trebuie să lipsească din calificativul acordat unui lot anume.
Aprecierea calitativă a seminţelor şi recomandarea folosirii lor pentru loturile
semincere nu este completă dacă nu se ţine seama de infecţia acestora cu
agenţi patogeni.
Analiza sanitară permite alegerea loturilor de sămânţă liberă de infecţie
sau infectată într-un grad redus, care să garanteze reuşita viitoarei culturi. De
asemenea, ca urmare a analizei sanitare se poate preciza oportunitatea aplicării
11
unui tratament al seminţei, astfel ca gradul de infecţie să fie redus la minimum
sau chiar total (Raicu şi colab.,1978).
O calificare a loturilor de sămânţă din punct de vedere sanitar hotărăşte
valorificarea acestora ca material de înmulţire sau de consum, sau scoaterea lor
din circuitul agricol (Străjeru şi colab., 2001).
Analiza sanitară constituie un mijloc eficace pentru prevenirea răspândirii
multor boli transmisibile prin sămânţă. Ea permite aprecierea valorii culturale a
seminţei, contribuind astfel efectiv la reuşita unei culturi, din punct de vedere al
calităţii şi productivităţii (Raicu şi colab., 1978).
Factorii implicaţi în analiza stării sanitare a seminţei sunt:
starea seminţei în momentul analizei
agentul patogen ca factor implicat în analiza seminţei.
Starea fitosanitară a seminţelor are drept scop determinarea procentului
de boabe contaminate de una sau mai multe ciuperci şi este dependentă de
genotip, tehnologie şi condiţiile climatice din perioada formării, maturizării şi
recoltării seminţelor (Anghel şi colab., 1959).
În transmiterea bolilor plantelor de la an la an şi în răspândirea lor de la
un loc la altul, seminţele au un rol deosebit de important întrucât prin intermediul
lor se păstrează şi se vehiculează agenţii fitopatogeni. Acest fapt face ca
aprecierea calitativă a seminţelor şi recomandarea folosirii lor (pentru consum
sau semănat) să nu fie completă, dacă nu se ţine seama şi de infecţia acestora
cu agenţii patogeni fungici (Iacob, 2002).
Unii agenţi patogeni au supravieţuit în seminţele depozitate chiar şi timp
de 23 ani. Comparativ cu seminţele păstrate în condiţii de mediu necontrolat,
unde inoculul se găseşte în proporţii ridicate, conservarea genetică în bănci de
gene asigură pe o perioada îndelungată de timp condiţii improprii dezvoltării
inoculului prezent pe seminţe, menţinându-l în stare constantă, diminuându-se
astfel în timp, ceea ce determină păstrarea viabilităţii seminţelor pe durate mari
de timp. O parte din agenţii patogeni pot rămâne viabili şi în astfel de condiţii
de depozitare, datorită organelor de rezistenţă sau a miceliilor din interiorul
seminţei (Plăcintă, 2007).
12
Micromicetele existente pe seminţele depozitate pot cauza în perioada
stocării o serie largă de modificări, cu consecinţe negative sub aspect tehnologic,
nutritiv, igienic şi comercial.
Conservarea genetică a seminţelor în bănci de germoplasmă reprezintă o
strategie importantă în lume şi în ţara noastră, deteminând reducerea
deteriorării genetice şi garantarea amelioratorilor cu material genetic viabil ce
are ca rezultat final crearea de noi soiuri şi hibrizi, precum şi creşterea
producţiei de sămânţă comercială (FAO - Food and Agriculture Organization of
the United Nations, 1994).
Conservarea sub formă de sămânţă este cea mai practică şi mai
practicată metodă de păstrare a resurselor genetice vegetale (Cristea, 1985).
Pentru seminţele destinate conservării genetice, care sunt păstrate în
depozite frigorifice, standardele de depozitare trebuie să fie următoarele:
pentru conservare pe termen mediu: T = + 4,5 0C (± 1 0C), umiditatea
relativă a aerului = 30 - 40 %, iar conţinutul de umiditate al seminţelor între 5 - 8
%.
pentru conservare pe termen lung: T = - 15 0C; - 20 0C (±1 0C), umiditatea
relativă a aerului = 30 %, iar conţinutul de umiditate al seminţelor de 5±1 %
(Străjeru şi colab., 2001).
Calitatea unei seminţe destinate conservării este definită în principal prin
viabilitate, cuantificată prin procentul de seminţe germinate în condiţii de mediu
controlate.
În ceea ce priveşte comportamentul cariopselor de cereale şi seminţelor
de leguminoase din timpul depozitării, putem preciza că acestea fac parte din
grupa “seminţelor ortodoxe”, în sensul că îmbătrânirea şi moartea acestora este
nu numai în funcţie de timp, ci şi de nivelul de temperatură şi conţinutul de
umiditate al seminţelor. Astfel, în acest caz este posibil de influenţat perioada de
supravieţuire a seminţelor prin controlul mediului de depozitare. Cu cât
temperatura şi umiditatea au valori mai mici, cu atât creşte longevitatea
seminţelor (Străjeru şi colab., 2001).
În timpul depozitării seminţelor au loc anumite schimbări fiziologice,
13
biochimice şi citogenetice, în ceea ce priveşte capacitatea germinativă,
permeabilitatea membranelor celulare, activitatea enzimatică, procesul
respirator. Viabilitatea seminţelor este în funcţie de însuşirile lor biologice şi de
condiţiile de păstrare (Cristea, 1985).
Cu cât perioada de păstrare devine mai lungă, cu atât seminţele destinate
însămânţării pierd treptat facultatea germinativă, chiar dacă au fost bine păstrate,
astfel încât culturile rezultate din ele nu realizează desimea necesară şi
producţiile obţinute sunt slabe. Micromicetele aflate pe seminţe au şi ele
viabilitate variabilă. Majoritatea pot trăi în seminţe aproape tot atât cât şi
sămânţa, iar în afara acesteia pot rămâne viabile mai mult timp.
Seminţele au vigoarea cea mai ridicată la maturitatea lor, iar apoi în cursul
păstrării ele se deteriorează continuu din punct de vedere calitativ. Deteriorările
care au loc în seminţele păstrate o perioadă lungă de timp sunt:
- diminuarea activităţii metabolice
- creşterea sensibilităţii la condiţiile nefavorabile de mediu
- creşterea numărului de germeni anormali (aberaţii cromozomiale)
- pierderea capacităţii germinative (Plăcintă, 2007).
Seminţele viguroase se caracterizează prin faptul că:
sunt mai puţin afectate de factorii nefavorabili în cursul depozitării;
au o rezistenţă ridicată la agenţii patogeni după semănatul în câmp;
au capacitatea de a dezvolta plante normale.
Cauzele ce pot influenţa vigoarea cariopselor la cereale şi a seminţelor la
leguminoase pot fi de mai multe feluri:
genetice - unele cultivare au o sămânţă mai rezistentă la condiţiile
nefavorabile de mediu sau au însuşirea de a creşte mai repede;
fiziologice - aici pot fi incluse două aspecte: maturitatea la recoltare şi
deteriorările în timpul păstrării;
morfologice - în cadrul aceluiaşi soi, seminţele mici produc adesea
germeni mai puţin viguroşi;
mecanice - prezenţa fisurilor sau necrozelor;
activitatea microorganismelor (ciuperci şi bacterii) în câmp sau în
14
timpul păstrării.
Alţi factori care influenţează viabilitatea materialului depozitat şi conduc la
înmulţirea şi răspândirea micromicetelor de pe seminţe sunt:
factori externi (abiotici şi biotici)
factori interni (genetici).
Factorii externi abiotici: - factorii climatici, pedologici, agrotehnici înainte de
recoltare
- temperatura de depozitare
- deteriorările mecanice.
Factorii externi biotici: - bolile şi dăunătorii seminţelor depozitate
Factorii interni: - conţinutul în umiditate al seminţelor
- maturitatea seminţelor şi mărimea lor
- vârsta seminţelor
- repausul seminal
- structura şi compoziţia seminţelor
- variaţiile între specii, precum şi cele între soiuri.
Cariopsele de cereale şi seminţele de leguminoase contaminate cu
diferiţi agenţi patogeni în proporţii variabile, semănate în câmp, pot determina
apariţia patogenilor în cultură, în proporţii diferite, în funcţie de anumiţi factori
exerni.
Aceşti factori au o influenţă puternică asupra plantei gazdă, agentului
patogen cât şi asupra relaţiei dintre planta gazdă şi agentul patogen, fiind
reprezentaţi de:
factorii climatici (temperatură, umiditate, precipitaţii, vânt);
factorii pedologici (reacţia solului, textura, conţinutul de umiditate al
solului);
factorii agrotehnici (perioada optimă de semănat, adâncimea de
semănat, densitatea culturii).
15
1.3. Mecanismul producerii infecţiei la cariopsele de cereale şi seminţele de leguminoase
Contaminarea seminţei se realizează în majoritatea cazurilor prin simpla
diseminare a agenţilor patogeni. Această diseminare poate avea loc în câmp, după
maturarea seminţei prin intermediul vântului, apei, insectelor, sau după recoltare, în
timpul treieratului şi transportului (Raicu şi colab., 1978).
Utilizarea seminţelor contaminate de către microorganismele fungice, în
timpul vegetaţiei, la recoltare şi pe durata conservării antrenează în fiecare an pierderi
însemnate ce afectează atât randamentul cât şi calitatea producţiei recoltate şi
stocate (Champion, 1997, citat de Plăcintă, 2007).
Mecanismul contaminării seminţelor se produce adesea în funcţie de
condiţiile agroclimatice, putând să apară diferenţe de infestare de la o regiune la alta
sau de la o parcelă la alta, diferenţe care apar în funcţie de cantitatea de inocul
existentă pe sămânţă (Plăcintă, 2007).
Conform afirmaţiilor făcute de Champion (1997), inoculul prezent pe cariopsele
de cereale şi seminţele de leguminoase are ca punct de plecare diverse origini, şi ca
urmare există mai multe surse de contaminare:
Sămânţa mamă - reprezintă un mijloc de contaminare înainte de semănat;
Resturile de plante bolnave - rămase după recoltare constituie un mijloc de contaminare, afectând germinaţia seminţei şi apariţia
tinerelor plantule; Mediul abiotic - reprezintă un mijloc de contaminare în
timpul vegetaţiei. Condiţiile meteorologice (temperaturi ridicate, umiditate
ridicată, variaţii de temperatură) favorizează producţia de inocul în timpul
vegetaţiei sau diseminarea acestuia (prin vânt, ploaie); Lucrările agrotehnice - sunt mijloace de contaminare
pe toată durata perioadei de vegetaţie, recoltarea având un rol important
în transportul de spori şi infestarea seminţei; Condiţiile de depozitare - temperatura de depozitare şi
16
umiditatea seminţelor sunt principalii factori fizici care diminuează sau sporesc
contaminarea seminţelor (Străjeru şi colab., 2001, Plăcintă, 2007).
În loturile cariopselor de cereale şi seminţelor de leguminoase, sursele de
contaminare a seminţei sunt foarte variate, inoculul purtat de acestea fiind format
din mai multe tipuri de micromicete ce influenţează vigoarea. Ciupercile ce se
transmit prin seminţe au o natură foarte variată. După modul de acţiune asupra
plantei gazdă şi asupra seminţei pot exista mai multe grupe de micromicete
cum ar fi:
micromicete parazite;
micromicete oportuniste;
micromicete saprofite;
micromicete producătoare de micotoxine;
micromicete antagoniste (Străjeru şi colab., 2001).
Micromicetele transmise prin cariopsele de cereale şi seminţele de
leguminoase infestează, în funcţie de biologia lor şi de condiţiile întâlnite
învelişurile exterioare ale seminţei sau produc infecţii în interior la nivelul
embrionului, influenţând facultatea germinativă şi vigoarea plantelor în câmp
(Mititiuc, 1994).
Micoflora asociată cariopselor de cereale şi seminţelor de leguminoase, fie că
provine dintr-o contaminare superficială sau o contaminare internă, aflată uneori în
stare latentă cât condiţiile de dezvoltare nu sunt prielnice, este capabilă să-şi reia
activitatea în condiţii favorabile, la semănat sau în timpul depozitării, diminuând
viabilitatea seminţei, determinând mai multe tipuri de contaminare şi în final
compromiterea viitoarelor culturi (Plăcintă, 2007).
Tipurile de contaminare sunt:
a. Contaminarea externă;
b. Contaminarea internă;
c. Contaminarea mixtă - externă şi internă;
d. Contaminarea cu resturi de plante ce conţin spori de ciuperci
sau micelii;
e. Contaminarea după recoltare (Străjeru şi colab., 2001).
17
Căile de transfer ale patogenilor în timpul contaminării seminţei sunt:
- transferul de la sămânţă la sămânţă;
- transferul de la sămânţă la plantă;
- transferul de la sol - sămânţă - plantă;
- transferul de la planta mamă la sămânţă (Străjeru şi colab., 2001, Plăcintă,
2007).
Cele mai importante măsuri de prevenire a atacului patogenilor şi
saprofiţilor sunt :
1. Certificarea calităţii seminţei;
2. Recoltarea şi condiţionarea seminţei;
3. Măsurile de prevenire a infecţiei în timpul depozitării;
4. Măsurile privind tratarea seminţelor (Plăcintă, 2007).
Sămânţa destinată semănatului, neutilizată în anul recoltării acesteia,
poate fi folosită cu succes în anii următori, cu condiţia păstrării în depozite cu
atmosferă controlată, deoarece durata de păstrare influenţează longevitatea unor
ciuperci saprofite şi parazite, în sensul că cu cât durata de păstrare este mai
mare, cu atât gradul de infecţie este mai redus, însă sămânţa trebuie să aibă
facultatea germinativă de peste 85% (Străjeru şi colab., 2001).
Este foarte importantă analiza probelor de seminţe atunci când acestea
urmează a fi conservate în depozite cu atmosferă controlată (bănci de gene) în
vederea identificării probelor contaminate cu diverse micromicete saprofite şi
parazite mai mult sau mai puţin periculoase, în aşa fel încât în depozit să fie
introdusă doar sămânţă sănătoasă. De asemenea, în timpul conservării
seminţelor, periodic, odată cu determinarea germinaţiei seminţelor (la intervale
de 5 ani) este indicat să se facă analize privind gradul de atac cu diferite
micromicete, pentru a se evita riscurile de diseminare şi pierderile de material
genetic (Străjeru şi colab., 2001).
18
CAPITOLUL II
ISTORICUL CERCETĂRILOR PRIVIND PATOLOGIA SEMINŢEI PE PLAN NAŢIONAL
În România, primele menţiuni referitoare la ciupercile care produc boli
plantelor datează din secolul al XVIII-lea.
În secolul XX s-au elaborat diferite sisteme de clasificare a ciupercilor şi s-
au aprofundat cunoştinţe privind sexualitatea la ciuperci şi genetica interacţiunii
gazdă - parazit (Tănase, Mititiuc, 2001).
Odată cu înfiinţarea Institutului de Cercetări Agronomice din România,
studiul ciupercilor microscopice şi al celor fitopatogene a progresat mult prin
apariţia unei lucrări de referinţă "Herbarium mycologicum romanicum" (1929), de
o deosebită importanţă atât pe plan naţional cât şi internaţional, editată sub
directa îndrumare a lui Traian Săvulescu. În cadrul acestui institut au lucrat
micologi cu o activitate remarcabilă: Traian Săvulescu care a editat 2 monografii
de referinţă asupra uredinalelor (1953) şi ustilaginalelor din România (1957), Al.
Alexandri, Ana Hulea, Vera Bontea, Olga Săvulescu (Tănase, Mititiuc, 2001).
Vera Bontea şi Becerescu (1952) au publicat un manual de fitopatologie,
iar mai târziu, Vera Bontea (1985, 1986) a publicat o lucrare de sinteză asupra
ciupercilor saprofite şi parazite din România.
O contribuţie deosebită a avut-o şi E. Rădulescu care a dezvoltat cercetări
de fitopatologie teoretică şi practică (Tănase, Mititiuc, 2001).
În anul 1967 în "Îndrumătorul pentru determinarea bolilor şi dăunătorilor la
seminţe" - un compendiu metodologic, unde sunt prezentate procedee şi metode
tehnice de analiză, având ca autori pe Rădulescu şi Negru apare prima cheie
pentru determinarea bolilor cariopselor de cereale şi seminţelor de leguminoase.
În anul 1969, Rădulescu şi Răfăilă descriu amănunţit principalele boli ce
se transmit prin sămânţă la graminee şi leguminoase cultivate, în “Tratatul de
fitopatologie agricolă”.
19
În 1973 Hulea, Negru şi Severin publică lucrarea "Principalele boli ale
culturilor semincere", unde prezintă detaliat o serie de patogeni pe
cariopsele de cereale şi seminţele de leguminoase, respectiv micoflora
asociată, epifită şi endofită (Plăcintă, 2007).
În 1978 în "Patologia seminţei", Raicu şi Baciu descriu amănunţit
principalii agenţi patogeni purtaţi de sămânţă la aceste două familii botanice,
ciupercile saprofite de depozit precum şi metodele de analiză a acestora.
Tatiana Seşan a adus contribuţii importante la studiul micoflorei seminţelor
de leguminoase cultivate în România. A contribuit la studiul patologiei
seminţei şi combaterii micozelor plantelor de cultură prin lucrarea "Ciuperci
parazite pe sămânţa de fasole şi combaterea lor" (1982), în care a descris
principalele ciuperci parazite care se transmit prin sămânţa de fasole, metodele
de analiză pentru determinarea acestora şi măsuri de prevenire şi combatere a
acestora.
Activitatea de cercetare în domeniul fitopatologiei a fost susţinută în
centrele universitare de profesori care au format generaţii de specialişti în
domeniul biologic şi agricol: Olga Săvulescu, E. Docea, I. Comeş, Al. Lazăr, M.
Hatman, I. Bobeş, M. Toma, Viorica Iacob, M. Mititiuc, T. Chifu, C. Tănase,
Aurelia Crişan (Tănase, Mititiuc, 2001).
CAPITOLUL III
FACTORII CARE CONDIŢIONEAZĂ APARIŢIA ŞI DEZVOLTAREA MICROMICETELOR PE CARIOPSELE DE CEREALE ŞI
SEMINŢELE DE LEGUMINOASE
Starea sanitară a culturilor de cereale şi leguminoase, gradul de coacere
şi conţinutul în umiditate al seminţelor, condiţiile climatice din perioada de
maturare, din timpul şi imediat după recoltare, metoda de recoltare,
condiţionarea seminţelor după recoltare, tipul de depozit, rolul vârstei seminţelor
în timpul păstrării, rolul dăunătorilor în înmulţirea şi răspândirea micromicetelor în
20
timpul depozitării şi condiţiile de mediu specifice de depozit sunt principalii factori
care condiţionează apariţia şi dezvoltarea micromicetelor pe cariopsele de
cereale şi seminţele de leguminoase (Plăcintă, 2007).
Înmulţirea, creşterea şi activitatea de degradare a micromicetelor parazite
şi saprofite sunt favorizate de condiţiile de depozitare în care trăiesc, cum ar fi:
substratul nutritiv unde se dezvoltă masa de seminţe;
temperatura şi lumina;
umiditatea relativă din atmosfera depozitului şi dintre spaţiile
intergranulare;
ventilaţia aerului şi compoziţia atmosferei din depozit (Străjeru şi
colab., 2001).
CAPITOLUL IV
MICOTOXINELE - O PROBLEMĂ DE SIGURANŢĂ ALIMENTARĂ
Contaminarea cu micotoxine a producţiei primare şi a produselor rezultate
prin prelucrarea industrială prezintă un risc crescut pentru sănătatea
consumatorilor, datorită proprietăţilor lor citotoxice şi imunodepresive pronunţate.
Deşi contaminarea cu micotoxine survine în timpul vegetaţiei, nivelul acestora
poate creşte substanţial în timpul depozitării şi al prelucrării produselor agricole.
Supravegherea atentă şi depozitarea corectă a alimentelor sunt importante în
prevenirea dezvoltării micotoxinelor.
Micotoxinele sunt metaboliţi secundari cu o structură chimică mai mult sau
mai puţin cunoscută, simplă sau complexă, produşi de anumiţi fungi sau
mucegaiuri care cresc pe alimente şi pot contamina hrana animalelor şi omului.
Au capacitatea de a modifica structuri biologice normale, ele perturbă procesele
oxidative la nivel celular, producând un efect negativ asupra sistemului imun,
asupra integrităţii materialului genetic, având efect citotoxic şi carcinogen, atât la
om, cât şi la animale. Aceste toxine pot fi depozitate în sporii fungilor, în
mucegai, în miceliul vegetativ, în organele de fructificare, sau de cele mai multe
21
ori eliminate în substratul de creştere (aliment), ca produşi de secreţie pe
substratul pe care s-a dezvoltat mucegaiul. Toxinele pot lua naştere în timpul
creşterii recoltei sau în urma unei depozitări incorecte (Savu şi colab., 2004).
Sunt produşi secundari de metabolism, elaboraţi de miceţii toxinogeni,
printr-o serie de reacţii catalizate de enzime, în condiţii specifice de umiditate şi
temperatură. Micotoxinele cele mai importante, cu riscuri seminificative pentru
siguranţa alimentaţiei umane sunt aflatoxinele, fumonisinele, ochratoxinele,
patulina, trichotecina şi ergotoxina (Savu şi colab., 2004). Prezenţa miceţilor nu
este neapărat un indicator al prezenţei micotoxinelor (Popa şi colab., 1986).
Caracteristicile generale ale micotoxinelor sunt:
- au structură chimică complexă;
- au molecule nepolare;
- prezintă masă moleculară mică;
- sunt rezistente la acţiunea agenţilor fizici şi chimici;
- au toxicitate ridicată;
- au efecte grave asupra sistemelor biologice;
- pot fi secretate înainte de recoltare sau după recoltare (Coman şi colab., 1985).
Pierderile economice cauzate de micotoxine se produc pe tot parcursul
lanţului alimentar. În plus, ca rezultat al consumului de către animale a furajelor
contaminate, care conţin de regulă mai multe micotoxine, există riscul major ca
micotoxinele să ajungă în produsele alimentare de origine animală - ouă, lapte,
carne. În acest context, se impune necesitatea dezvoltării capacităţii de
determinare a conţinutului de micotoxine pe întreg lanţul alimentar plantă -
animal - produse alimentare de origine animală (Savu şi colab., 2004).
Contaminarea cu micotoxine a produselor alimentare este condiţionată de
temperatura şi umiditatea aerului, dar mai ales de umiditatea produsului
respectiv. Infectarea cu spori de mucegai poate avea loc în câmp, în timpul
recoltării, condiţionării, depozitării sau distribuţiei.
Efectele nocive ale micotoxinelor se regăsesc la nivelul a patru paliere
medicale: simptomatologia clinică, modificările fiziopatologice de natură
22
biochimică şi hematologică, modificările histopatologice şi leziunile
ultrastructurale (Cotrău şi colab., 1991).
Menţinerea calităţii produselor alimentare pentru a garanta sănătatea
consumatorilor reprezintă un obiectiv foarte important în sectorul agro-alimentar.
Alimentele trec printr-o succesiune de transformări tehnologice, iar produsul final
trebuie să prezinte un risc microbiologic minim.
Cercetările efectuate au pus în evidenţă 240 de mucegaiuri toxicogene,
indentificându-se peste 2000 substanţe toxice, iar o anumită specie de mucegai
poate elabora un complex de micotoxine cu structuri diferite şi acceaşi toxină
poate fi produsă de mai multe mucegaiuri.
Micotoxinele contaminează produsele agricole înainte sau după recoltare.
Ele pot fi sintetizate când produsele alimentare sunt infectate cu mucegaiuri, în
timpul perioadei de creştere a plantelor sau în timpul depozitării. În general,
umiditatea şi temperaturile înalte favorizează înmulţirea ciupercilor şi producerea
de micotoxine. Condiţiile proaste din timpul recoltării, depozitării, transportului şi
comercializării contribuie şi ele la înmulţirea mucegaiurilor şi la creşterea riscului
de producere a micotoxinelor (Savu şi colab., 2004) (fig. 1).
Micotoxine Micotoxine
↓ ↓
Cultura în câmp ► Recoltare ► Transport
▼ ← Micotoxine Depozitare
▼ ← Micotoxine
Produsul finit ___________________ Prelucrare
Consumator
Fig. 1 - Traseul micotoxinelor pe lanţul alimentar (Savu şi colab., 2004)
23
Micotoxinele pot ajunge în organismul uman nu numai prin consumul de
cereale, produse alimentare preparate din cereale sau seminţe contaminate, ci şi
prin consumul de lapte, carne sau ouă provenite de la animale hrănite cu furaje
contaminate (Savu, 1999).
Factorii care influenţează dezvoltarea miceţilor şi producerea de
micotoxine sunt: capacitatea genetică a mucegaiurilor, substratul nutritiv,
umiditatea, pH-ul substratului, coeficientul de activitate al apei, temperatura,
aeraţia (compoziţia atmosferei), luminozitatea, agenţii biologici,
microorganismele concurente, perioada de timp de la contaminare, precum şi
lucrările agrotehnice, fitosanitare (Derache, 1988).
Pentru simplificarea prezentării acestui grup de produşi toxici care pot
influenţa calitatea alimentelor sau nutreţului, cu efecte grave asupra
consumatorului, micotoxinele elaborate de micromicetele întâlnite pe materialul
biologic luat în studiu au fost grupate în 2 categorii:
- micotoxine cu acţiune cancerigenă (aflatoxinele, ochratoxinele)
- micotoxine cu efecte nocive la om şi animale (zearalenona sau toxina F2).
Limitele maxime admise şi recomandate de UE pentru micotoxinele
identificate la cereale şi produse derivate din acestea prevăzute în ordinul
145/2004 (tabel 1)
Tabelul 1
Micotoxina Unitatea de măsură Limitele maxime admise
Aflatoxine totale µg/kg (ppb) 4
Aflatoxina B1 µg/kg (ppb) 2
Ochratoxina A µg/kg (ppb) 5
Zearalenona µg/kg (ppb) 50
24
CAPITOLUL V SISTEMUL DE EXPERIMENTARE
Acest studiu reprezintă, pe de o parte, o evaluare a florei micologice
epifite şi endofite care apare pe cariopsele de cereale şi seminţele de
leguminoase după depozitarea pe termen mediu, iar pe de altă parte, o
caracterizare complexă (morfologică, toxicologică, citogenetică) în vederea
evitării sau diminuării pagubelor produse de agenţii patogeni fungici.
Scopul prezentei cercetări constă în:
evaluarea fitopatologică a micoflorei epifite şi endofite de pe seminţele
conservate la intervale diferite de timp, în depozite cu atmosferă
controlată (T=+4 0C; umiditatea relativă a aerului = 30 - 40%);
stabilirea influenţei duratei de conservare asupra activităţii micromicetelor
aflate pe seminţele depozitate;
determinarea influenţei micromicetelor asupra viabilităţii seminţelor
depozitate pe perioade mari de timp;
stabilirea unei corelaţii cu privire la umiditatea seminţelor conservate şi
evoluţia activităţii micoflorei de depozit;
stabilirea influenţei tipului de substrat mediu CGA (cartof - dextroză -
agar), mediu Sabouraud (extract de drojdie - dextroză - cloramfenicol -
agar), hârtie sugativă asupra evoluţiei agenţilor patogeni fungici;
determinarea cantitativă a conţinutului de micotoxine secretate de
microorganismele fungice la cereale;
analiza citogenetică la probele luate în studiu.
Condiţiile de experimentare pot fi grupate astfel:
condiţiile specifice de depozitare pentru conservare pe termen mediu:
T = +4 0C (±1 0C), umiditatea relativă a aerului = 30 - 40%, iar procentul de
umiditate al seminţelor între 5 - 8 % (Străjeru şi colab., 2001);
condiţiile de laborator în care s-au realizat analize fitopatologice (prin
25
determinarea prezenţei pe seminţele analizate a micromicetelor specifice, după
perioade distincte de depozitare), toxicologice şi citogenetice.
Materialul biologic ales pentru studiu este reprezentat de populaţii locale şi
soiuri ce aparţin la 2 specii de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) şi 2 specii
de leguminoase (Vicia faba, Phaseolus vulgaris). În cadrul fiecărei specii s-au
constituit 30 probe medii de 300 seminţe din colecţia Băncii de Resurse Genetice
Vegetale Suceava:
seminţe conservate timp de 8 şi 17 ani la T = +4 °C (pentru Zea
mays)
seminţe conservate timp de 8, 15 şi 18 ani la T = +4 °C (pentru
Triticum aestivum)
seminţe conservate timp de 8, 18 şi 23 ani la T = +4 °C (pentru
Vicia faba)
seminţe conservate timp de 6 şi 15 ani la T = +4 °C (pentru
Phaseolus vulgaris).
Majoritatea probelor de seminţe provin din aceeaşi categorie biologică
(populaţii locale), dar s-au luat în studiu şi unele soiuri (la Triticum aestivum)
Probele luate în studiu au origini diferite (fig. 2, 3), provenind din
expediţiile de colectare realizate de Banca de Gene Suceava (cazul populaţiilor
locale) sau de la alte instituţii de cercetare (cazul soiurilor).
Pentru probele de seminţe studiate s-au folosit metodele clasice de
analiză fitopatologică (metoda Ulster pe mediu CGA (cartof - dextroză - agar),
metoda sugativei şi metoda Sabouraud (extract de drojdie - dextroză -
cloramfenicol - agar), metoda cromatografiei în strat subţire (CSS) - pentru
aflatoxina B1, respectiv metoda imunoenzimatică ELISA pentru determinarea
cantitativă a micotoxinelor (aflatoxinele totale B1+B2+G1+G2, ochratoxina A,
zearalenona) şi metoda preparatelor microscopice pentru analiza citogenetică.
26
Metodele şi tehnicile de cercetare aplicate
Pentru a face posibil acest studiu fitopatologic de evaluare a
micromicetelor prezente pe cariopsele de cereale şi seminţele de leguminoase,
precum şi pentru a evidenţia implicaţiilor acestora asupra scăderii viabilităţii
probelor analizate s-au aplicat următoarele metode de cercetare:
Fig. 2, 3 - Reprezentarea pe hartă a originii probelor luate în studiu
27
Analiza macroscopică a seminţei;
Metoda Ulster (Malone şi Muskett, 1941) pe mediu CGA (cartof -
dextroză - agar);
Metoda Sabouraud (extract de drojdie - dextroză - cloramfenicol
- agar);
Metoda gravimetrică de determinare a umidităţii;
Testul standard de germinaţie (metoda sugativei).
CAPITOLUL VI
REZULTATE EXPERIMENTALE PRIVIND CARACTERIZAREA FITOPATOLOGICĂ, TOXICOLOGICĂ ŞI CITOGENETICĂ A PROBELOR DE CEREALE ŞI LEGUMINOASE LUATE ÎN STUDIU
6.1. Evaluarea fitopatologică la speciile de cereale şi leguminoase luate în studiu
6.1.1. Micromicetele saprofite şi parazite izolate pe cariopsele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) şi seminţele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate în studiu (Analiza calitativă macroscopică şi microscopică)
Micoflora de depozit identificată la probele de cereale luate în studiu este
reprezentată de:
- Torula herbarum
- Oedocephalum sp.
- Chaetomium sp.
- Fusarium moniliforme
- Tilletia tritici
Aceste specii de ciuperci saprofite şi parazite au apărut cu frecvenţă
ridicată la probele de Zea mays şi Triticum aestivum analizate, pe aceeaşi
sămânţă fiind prezente mai multe microorganisme fungice care au atacat
învelişurile exterioare ale seminţei sau au produs infecţii în interior la
28
nivelul embrionului, fără ca acestea să determine diminuarea accentuată a
facultăţii germinative a seminţelor.
Foto 1 - Conidii în lanţ de Torula herbarum pe mediu CGA la Triticum aestivum în câmpul microscopic (original)
Foto 2 - 4 Conidiofori cu conidii de Oedocephalum sp. pe mediu CGA la Zea mays în câmpul microscopic (original)
Foto 5 - 7 - Peritecie cu peri de Chaetomium sp.pe mediu CGA la Triticum aestivum
în câmpul microscopic (original)
29
Foto 8 - 10 - Peritecie cu peri de Chaetomium sp. pe mediu CGA la Zea mays în câmpul microscopic (original)
Foto 11 - 12 - Hife şi microconidii de Fusarium moniliforme pe mediu CGA la Zea mays în câmpul microscopic (original)
30
Foto 13 - 15 - Colonii de Fusarium moniliforme pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)
Foto 16 - Teliospori de Tilletia tritici la Triticum aestivum în câmpul microscopic
(original)
31
Micoflora de depozit identificată la probele de leguminoase luate în
studiu este reprezentată de:
- Stachybotrys atra
- Botrytis fabae
- Uromyces viciae - fabae, ultimele 2 specii fiind componente ale micoflorei de
câmp ce apar în timpul vegetaţiei plantelor, producând pierderi de
Foto 17 - 21 - Clamidospori de Tilletia tritici la Triticum aestivum
la microscopul electronic (original)
32
randament, scăderea masei a 1000 de seminţe, reducerea vigorii şi calităţii
acestora. De asemenea, aceste micromicete influenţează facultatea
germinativă, produc putrezirea seminţei înainte de apariţia radiculei când
sunt incubate şi determină apariţia de plantule anormale la răsărit. După răsărit
atacă plantele mamă, organele reproducătoare şi seminţele. Aceste ciuperci
contaminează sămânţa înainte de recoltare şi în perioada de depozitare
(Plăcintă, 2007).
Foto 22, 23 - Conidiofori şi conidii de Stachybotrys atra pe mediu CGA la Vicia faba
în câmpul microscopic (original)
Foto 24 - Colonie de Botrytis fabae pe mediu CGA la Vicia faba (original)
33
Foto 25 - Conidiofori cu conidii de Botrytis fabae pe mediu CGA la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
Foto 26 - Uredospori şi teleutospori de
Uromyces viciae - fabae la Vicia faba în câmpul microscopic
(original)
34
Micoflora de depozit identificată atât la cereale, cât şi la leguminoase
este reprezentată de microorganismele fungice saprofite: Alternaria alternata,
Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium commune, Penicillium
notatum (chrysogenum), Penicillium viridicatum, Penicillium rugulosum,
Penicillium variabile, Mucor mucedo, Rhizopus nigricans, Epicoccum
purpurascens, Trichoderma viride, Trichothecium roseum, Cladosporium
herbarum, Stemphylium botryosum.
Dintre acestea, unele sunt producătoare de micotoxine, cum sunt cele
din grupul Aspergillus, Penicillium. Din grupul celor antagoniste fac parte
Trichoderma viride şi Epicoccum purpurascens, care afectează facultatea
germinativă a seminţelor depozitate. Au o mare capacitate de inhibare şi
distrugere a patogenilor, înainte ca aceştia să producă pagube, au o capacitate
de diseminare rapidă, pot supravieţui în condiţii extreme şi nu afectează
plantele în cursul perioadei de vegetaţie (Iacob şi colab., 1998).
Foto 27 - 29 - Uredospori şi teleutospori de Uromyces viciae - fabae la Vicia faba
la microscopul electronic (original)
35
Agenţii patogeni fungici sunt prezenţi pe plante înainte de recoltare, în
momentul recoltării, în timpul depozitării, în raport cu condiţiile de depozitare
(Bontea, 1953).
Foto 30 - 31 - Colonii de Alternaria alternata pe mediu CGA la Vicia faba (original)
Foto 32 - Conidii de Alternaria alternata pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris
în câmpul microscopic (original)
Foto 33 - Conidii de Alternaria alternata
pe mediu CGA la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
36
Foto 34 - Colonie de Aspergillus flavus pe mediu CGA la Zea mays (original)
Foto 35 - Colonie de Aspergillus flavus pe mediu Sabouraud
la Vicia faba şi Phaseolus vulgaris (original)
Foto 36, 37 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus pe mediu CGA
la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
37
Foto 38 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus
pe mediu CGA la Zea mays
în câmpul microscopic (original)
Foto 39, 40- Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus
pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris în câmpul microscopic (original)
Foto 41 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus
pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris
în câmpul microscopic (original)
38
Foto 42 - 44 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus
pe mediu CGA la Zea mays
în câmpul microscopic (original)
Foto 45 - 46 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus
pe mediu CGA la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
39
Foto 47 - Colonie de Penicillium rugulosum
pe mediu CGA la Vicia faba (original)
Foto 48 - Colonii de Penicillium
chrysogenum (notatum) pe mediu CGA
la Vicia faba (original)
Foto 49, 50 - Seminţe de Vicia faba infectate de Penicillium sp. pe hârtie sugativă (original)
Foto 51 - Aversul şi reversul coloniei de Penicillium variabile pe mediu Sabouraud
la Phaseolus vulgaris (original)
40
Foto 52 - 56 - Colonii de Penicillium commune pe mediu CGA şi Sabouraud
la Phaseolus vulgaris (original)
41
Foto 57 - 62 - Colonii de Penicillium rugulosum pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris
(original)
Foto 63 - 66 - Colonii de Penicillium viridicatum pe mediu Sabouraud
la Vicia faba (original)
42
Foto 67 - Conidiofori cu conidii de Penicillium notatum (chrysogenum) pe mediu Sabouraud la Triticum aestivum în câmpul microscopic (original)
Foto 68 - Conidiofori cu conidii de Penicillium variabile pe mediu CGA la Vicia faba
în câmpul microscopic (original)
Foto 69 - Conidiofori cu conidii de Penicillium rugulosum pe mediu Sabouraud
la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
43
Foto 70, 71 - Conidiofori cu conidii de Penicillium commune pe mediu Sabouraud
la Phaseolus vulgaris în câmpul microscopic (original)
Foto 72 - Conidiofori cu conidii de Penicillium
rugulosum pe mediu Sabouraud la Zea mays în câmpul microscopic (original)
Foto 73 - 76 - Conidiofori cu conidii de Penicillium rugulosum pe mediu CGA
la Phaseolus vulgaris în câmpul microscopic (original)
44
Foto 77 - 80 - Conidiofori cu conidii de Penicillium notatum (chrysogenum) pe mediu CGA la Zea mays în câmpul microscopic (original)
45
Foto 81 - 83 - Conidiofori cu conidii de Penicillium chrysogenum (notatum)
pe mediu CGA la Triticum aestivum în câmpul microscopic (original)
Foto 84 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu CGA la Vicia faba (original)
Foto 85 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Vicia faba
(original)
Foto 86 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Vicia faba
(original)
Foto 87 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Zea mays
(original)
46
Foto 88 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu CGA la Vicia faba
în câmpul microscopic (original)
Foto 89, 90 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu CGA
la Zea mays în câmpul microscopic (original)
Foto 91 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Zea mays
în câmpul microscopic (original)
Foto 92 - Colonie de Rhizopus nigricans
pe mediu CGA la Zea mays (original)
47
Foto 93 - Sporangiofori de Rhizopus
nigricans pe mediu CGA la Zea mays în câmpul microscopic (original)
Foto 94, 95 - Sporange cu spori şi rizoizi de Rhizopus nigricans pe mediu CGA
la Phaseolus vulgaris în câmpul microscopic
(original)
Foto 96 - Sporangiofori de Rhizopus nigricans pe mediu Sabouraud la Zea mays
în câmpul microscopic (original)
48
Foto 97, 98 - Sporange cu spori şi rizoizi de Rhizopus nigricans pe mediu Sabouraud
la Vicia faba în câmpul microscopic (original)
Foto 99, 100 - Colonii de Epicoccum
purpurascens pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)
Foto 101 - Conidiofori cu conidii de Epicoccum
purpurascens pe mediu CGA la Triticum aestivum în câmpul microscopic (original)
49
Foto 102, 103 - Conidiofori cu conidii de Epicoccum purpurascens
la Vicia faba la microscopul electronic (original)
Foto 104 - Colonie de Trichoderma viride
pe mediu CGA la Vicia faba (original)
Foto 105 - Colonie de Trichoderma viride
pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)
50
Foto 106 - Conidiofori cu conidii de Trichoderma viride pe mediu Sabouraud
la Phaseolus vulgaris
în câmpul microscopic (original)
Foto 107 - Colonie de Trichothecium roseum
pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)
Foto 108 - Conidiofori cu conidii de Trichothecium roseum
pe mediu Sabouraud la Zea mays
(original)
Foto 109 - Colonii de Cladosporium herbarum
pe mediu CGA la Vicia faba (original)
51
Foto 110 - Colonii de Cladosporium herbarum
pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)
Foto 111 - Conidiofori cu conidii de Cladosporium herbarum
pe mediu CGA la Zea mays (original)
Foto 112 - Conidiofori şi conidii de Cladosporium herbarum
la Triticum aestivum
la microscopul electronic (original)
52
6.1.2. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit
(Analiza cantitativă prin cuantificarea datelor şi interpretarea rezultatelor)
Rezultatele experimentale obţinute în cadrul acestui studiu au răspuns
următoarelor obiective:
• Evaluarea acţiunii micromicetelor pe cariopsele şi seminţele analizate
prin indicarea numărului de cariopse infectate şi a genurilor de ciuperci izolate;
• Identificarea microorganismelor fungice în funcţie de perioada de
depozitare a cariopselor analizate;
• Identificarea genurilor de micromicete în funcţie de tipul de substrat
utilizat;
• Evidenţierea corelaţiilor între evoluţia micromicetelor identificate,
perioadele de depozitare a seminţelor şi tipul de substrat folosit.
Foto 113 - Colonie de Stemphylium botryosum pe mediu CGA
la Phaseolus vulgaris (original)
Foto 114 - Conidie de Stemphylium botryosum
pe mediu CGA la Vicia faba
în câmpul microscopic (original)
53
Cuantificarea elementelor analizate s-a realizat astfel:
- Micromicetele s-au evaluat prin numărarea cariopselor şi seminţelor
infectate, iar frecvenţa atacului s-a exprimat în procente, realizându-se prin
estimarea vizuală a suprafeţei cariopsei.
Informaţiile obţinute în urma analizelor şi determinărilor efectuate sunt
prezentate în tabele şi grafice, iar la o parte dintre acestea s-au folosit metode
statistice de calcul, pentru evidenţierea unor corelaţii şi regresii semnificative
între diferite elemente (Ceapoiu, 1968).
6.1.2.1. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit întâlnită la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) luate în studiu
Fig. 4 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe mediu CGA la probele de Zea mays depozitate în condiţii de mediu controlate (+ 40 C, pe o perioadă de depozitare de 8 şi respectiv 17 ani)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SVG
B-11
265
SVG
B-11
267
SVG
B-11
255
SVG
B-13
769
SVG
B-13
797
SVG
B-72
49
SVG
B-79
02
SVG
B-37
14
SVG
B-37
73
SVG
B-16
67
SVG
B-16
85
SVG
B-35
53
SVG
B-16
60
SVG
B-16
29
SVG
B-17
89
SVG
B-16
95
SVG
B-16
58
SVG
B-36
81
SVG
B-36
11
SVG
B-16
00
SVG
B-51
91
SVG
B-12
26
SVG
B-38
29
SVG
B-53
97
SVG
B-54
65
SVG
B-52
20
SVG
B-16
27
SVG
B-15
94
SVG
B-16
54
SVG
B-17
84
Penicillium sp. Aspergillus sp Rhizopus sp. Mucor sp. Cladosporium herbarum
Alternaria alternata Trichothecium roseum Chaetomium sp. Fusarium moniliforme Oedocephalum sp.
+ 40C - 8 ani + 40C - 17 ani
54
Fig. 5 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe hârtie sugativă la probele de Zea mays depozitate în condiţii de mediu controlate (+ 40 C, pe o perioadă de depozitare de 8 şi respectiv 17 ani)
Evidenţierea corelaţiilor între evoluţia micromicetelor izolate pe probele de Zea mays luate în studiu şi perioadele diferite de depozitare (8 şi 17 ani)
La nivelul probelor de Zea mays analizate, s- a evidenţiat un număr redus
de corelaţii asigurate statistic la ambele perioade de depozitare.
După 17 ani de depozitare a cariopselor de Zea mays la temperatura de +
4 °C, există doar două corelaţii pozitive semnificative între acţiunea agenţilor
patogeni fungici Mucor sp. x Aspergillus sp. şi Cladosporium herbarum x
Penicillium sp.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SV
GB
-112
65
SV
GB
-112
67
SV
GB
-112
55
SV
GB
-137
69
SV
GB
-137
97
SV
GB
-724
9
SV
GB
-790
2
SV
GB
-371
4
SV
GB
-377
3
SV
GB
-166
7
SV
GB
-168
5
SV
GB
-355
3
SV
GB
-166
0
SV
GB
-162
9
SV
GB
-178
9
SV
GB
-169
5
SV
GB
-165
8
SV
GB
-368
1
SV
GB
-361
1
SV
GB
-160
0
SV
GB
-519
1
SV
GB
-122
6
SV
GB
-382
9
SV
GB
-539
7
SV
GB
-546
5
SV
GB
-522
0
SV
GB
-162
7
SV
GB
-159
4
SV
GB
-165
4
SV
GB
-178
4
Penicillium sp. Aspergillus sp. Rhizopus sp.Cladosporium herbarum Alternaria alternata Trichothecium roseum
+ 40C - 8 ani + 40C - 17 ani
55
Fig. 6 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe mediu CGA la probele de Triticum aestivum depozitate în condiţii de mediu controlate (+ 4 0C, pe o perioadă de depozitare de 8, 15 şi respectiv 18 ani)
Fig. 7 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe hârtie sugativă la probele de Triticum aestivum depozitate în condiţii de mediu controlate (+ 4 0C, pe o perioadă de depozitare de 8, 15 şi respectiv 18 ani)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SVG
B-14
059
SVG
B-14
125
SVG
B-15
018
SVG
B-15
203
SVG
B-15
972
SVG
B-72
44
SVG
B-73
63
SVG
B-74
41
SVG
B-87
90
SVG
B-88
23
SVG
B-88
24
SVG
B-89
09
SVG
B-91
86
SVG
B-91
88
SVG
B-94
85
SVG
B-95
15
SVG
B-95
19
SVG
B-95
21
SVG
B-10
261
SVG
B-12
781
SVG
B-12
784
SVG
B-12
791
SVG
B-12
799
SVG
B-12
804
SVG
B-12
812
SVG
B-12
832
SVG
B-25
39
SVG
B-25
69
SVG
B-51
48
SVG
B-55
21
Penicillium sp. Rhizopus sp. Epicoccum sp. Cladosporium herbarum Alternaria alternata
Trichoderma viride Torula herbarum Stemphylium botryosum Chaetomium sp.
+ 40C - 8 ani + 40C - 18 ani + 40C - 15 ani
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
SVG
B-14
059
SVG
B-14
125
SVG
B-15
018
SVG
B-15
203
SVG
B-15
972
SVG
B-7
244
SVG
B-7
363
SVG
B-7
441
SVG
B-8
790
SVG
B-8
823
SVG
B-8
824
SVG
B-8
909
SVG
B-9
186
SVG
B-9
188
SVG
B-9
485
SVG
B-9
515
SVG
B-9
519
SVG
B-9
521
SVG
B-10
261
SVG
B-12
781
SVG
B-12
784
SVG
B-12
791
SVG
B-12
799
SVG
B-12
804
SVG
B-12
812
SVG
B-12
832
SVG
B-2
539
SVG
B-2
569
SVG
B-5
148
SVG
B-5
521
Penicillium sp. Rhizopus sp. Cladosporium herbarumAlternaria alternata Trichoderma viride Torula herbarum
+ 40C -15 ani+ 40C - 8 ani + 40C - 18 ani
56
Evidenţierea corelaţiilor între evoluţia micromicetelor izolate pe probele de Triticum aestivum luate în studiu şi perioadele diferite de depozitare (8, 15 şi 18 ani)
La nivelul probelor de Triticum aestivum analizate, s-a evidenţiat un număr
ridicat de corelaţii asigurate statistic la probele depozitate 8 ani, după cum
urmează:
Trichoderma viride x Alternaria alternata - corelaţie negativă semnificativă;
Torula herbarum x Epicoccum sp. - corelaţie negativă semnificativă;
Torula herbarum x Cladosporium herbarum - corelaţie negativă foarte
semnificativă;
Stemphylium botryosum corelază negativ semnificativ cu Cladosporium
herbarum şi Trichoderma viride şi pozitiv semnificativ cu Torula herbarum şi
Alternaria alternata;
Chaetomium sp. corelează negativ semnificativ cu Alternaria alternata,
negativ foarte semnificativ cu Stemphylium botryosum şi pozitiv semnificativ cu
Trichoderma viride.
Fig. 8 - Dreapta de regresie pentru corelaţia dintre numărul de cariopse infectate de Torula
herbarum şi numărul de cariopse infectate de Cladosporium herbarum pe probele de Triticum aestivum depozitate timp de 8 ani în condiţii de mediu controlate (+ 4 0C)
y = -0,5x + 3,2r = 0,977***
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7
Cariopse infectate cu agentul patogen fungic Torula herbarum
Car
iops
e in
fect
ate
cu a
gent
ul p
atog
en fu
ngic
C
lado
spor
ium
her
baru
m
57
În condiţiile păstrării cariopselor la temperatura de + 4 0C, după o perioadă
de depozitare de 8 ani, Torula herbarum inhibă acţiunea agentului patogen
fungic Cladosporium herbarum.
6.1.2.2. Evaluarea acţiunii micoflorei epifite şi endofite de depozit întâlnită la probele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate în studiu
Fig. 9 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe mediu CGA la probele de Phaseolus vulgaris depozitate în condiţii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioadă de depozitare de 6 şi 15 de ani)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
SVG
B-13
906
SVG
B-13
936
SVG
B-13
941
SVG
B-13
944
SVG
B-13
946
SVG
B-13
972
SVG
B-14
001
SVG
B-14
006
SVG
B-14
022
SVG
B-14
046
SVG
B-14
057
SVG
B-14
060
SVG
B-14
061
SVG
B-14
065
SVG
B-14
080
SVG
B-14
105
SVG
B-14
106
SVG
B-14
175
SVG
B-14
180
SVG
B-14
185
SVG
B-14
204
SVG
B-13
626
SVG
B-13
628
SVG
B-13
639
SVG
B-13
749
SVG
B-13
750
SVG
B-13
751
SVG
B-13
775
SVG
B-13
776
SVG
B-13
777
Penicillium sp. Aspergillus sp. Rhizopus sp. Epicooccum sp. Cladosporium herbarum
Alternaria alternata Trichothecium roseum Trichoderma viride Stachybotrys atra Stemphylium botryosum
+ 40C - 6 ani + 40C - 15 ani
58
Fig. 10 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe hârtie sugativă la probele de Phaseolus vulgaris depozitate în condiţii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioadă de depozitare de 6 şi 15 ani)
Evidenţierea corelaţiilor între evoluţia micromicetelor izolate pe
probele de Phaseolus vulgaris luate în studiu şi perioadele diferite de depozitare (6 şi 15 ani)
La nivelul probelor de Phaseolus vulgaris analizate, s-a evidenţiat un
număr redus de corelaţii asigurate statistic la ambele perioade de depozitare.
După 15 ani de depozitare a seminţelor de Phaseolus vulgaris la
temperatura de 4°C, există numai o singură corelaţie pozitivă foarte semnificativă
între acţiunea agenţilor patogeni fungici Rhizopus sp. x Aspergillus sp.
În condiţiile păstrării seminţelor la temperatura de + 4 0C, alături de genul
Aspergillus apare şi Rhizopus sp.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SV
GB
-139
06
SV
GB
-139
36
SV
GB
-139
41
SV
GB
-139
44
SV
GB
-139
46
SV
GB
-139
72
SV
GB
-140
01
SV
GB
-140
06
SV
GB
-140
22
SV
GB
-140
46
SV
GB
-140
57
SV
GB
-140
60
SV
GB
-140
61
SV
GB
-140
65
SV
GB
-140
80
SV
GB
-141
05
SV
GB
-141
06
SV
GB
-141
75
SV
GB
-141
80
SV
GB
-141
85
SV
GB
-142
04
SV
GB
-136
26
SV
GB
-136
28
SV
GB
-136
39
SV
GB
-137
49
SV
GB
-137
50
SV
GB
-137
51
SV
GB
-137
75
SV
GB
-137
76
SV
GB
-137
77
Penicillium sp. Aspergillus sp. Rhizopus sp. Cladosporium herbarumAlternaria alternata Trichothecium roseum Trichoderma viride
+ 40C - 6 ani + 40C - 15 ani
59
Fig. 11 - Dreapta de regresie pentru corelaţia dintre numărul de seminţe infectate de Aspergillus sp. şi numărul de seminţe infectate de Rhizopus sp. pe probele de Phaseolus
vulgaris depozitate în condiţii de mediu controlate (+ 4 0C) timp de 15 ani
Fig. 12 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe mediu CGA la probele de Vicia faba depozitate în condiţii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioadă de depozitare de 8, 18 şi 23 de ani)
y = 2,5625x + 0,75r = 0,925 ***
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5
Număr seminţe infectate de Aspergillus sp .
Num
ăr s
eminţe
infe
ctat
e de
Rhi
zopu
s
sp.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SV
GB
-175
SV
GB
-176
SV
GB
-179
SV
GB
-196
SV
GB
-203
SV
GB
-212
SV
GB
-232
SV
GB
-268
SV
GB
-270
SV
GB
-272
SV
GB
-278
SV
GB
-285
SV
GB
-293
SV
GB
-312
8
SV
GB
-427
8
SV
GB
-427
9
SV
GB
-428
0
SV
GB
-428
1
SV
GB
-428
3
SV
GB
-280
SV
GB
-298
SV
GB
-300
SV
GB
-308
SV
GB
-333
SV
GB
-271
SV
GB
-273
SV
GB
-279
SV
GB
-282
SV
GB
-290
SV
GB
-303
Penicillium sp. Aspergillus sp Rhizopus sp. Epicoccum sp. Cladosporium herbarum Alternaria alternata
Mucor sp. Trichothecium roseum Trichoderma viride Botrytis fabae Stachybotrys atra Stemphylium botryosum
+ 40C - 8 ani + 40C - 18 ani + 40C - 23 ani
60
Fig. 13 - Procentele de infecţie ale agenţilor patogeni fungici izolaţi pe hârtie sugativă la probele de Vicia faba depozitate în condiţii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioadă de depozitare de 8, 18 şi 23 de ani)
Evidenţierea corelaţiilor între evoluţia micromicetelor izolate pe
probele de Vicia faba luate în studiu şi perioadele diferite de depozitare (8, 18 şi respectiv 23 ani)
La nivelul probelor de Vicia faba analizate, s-au evidenţiat corelaţii
asigurate statistic la toate cele trei perioade de depozitare.
După 8 ani de conservare a seminţelor de Vicia faba la temperatura de +
4 °C se observă că există 5 corelaţii negative distinct semnificative între acţiunea
următorilor agenţi patogeni fungici: Stachybotrys atra x Epicoccum sp.,
Trichothecium roseum x Rhizopus sp., Stemphylium botryosum x Epicoccum sp.,
Stachybotrys atra x Rhizopus sp., şi Trichothecium roseum x Epicoccum sp.,
precum şi o corelaţie pozitivă distinct semnificativă între acţiunea
microorganismelor fungice Alternaria alternata x Rhizopus sp.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SVG
B-17
5
SVG
B-17
6
SVG
B-17
9
SVG
B-19
6
SVG
B-20
3
SVG
B-21
2
SVG
B-23
2
SVG
B-26
8
SVG
B-27
0
SVG
B-27
2
SVG
B-27
8
SVG
B-28
5
SVG
B-29
3
SVG
B-31
28
SVG
B-42
78
SVG
B-42
79
SVG
B-42
80
SVG
B-42
81
SVG
B-42
83
SVG
B-28
0
SVG
B-29
8
SVG
B-30
0
SVG
B-30
8
SVG
B-33
3
SVG
B-27
1
SVG
B-27
3
SVG
B-27
9
SVG
B-28
2
SVG
B-29
0
Penicillium sp. Aspergillus sp. Rhizopus sp. Cladosporium herbarum Alternaria alternata Trichothecium roseum Botrytis fabae
+ 40C - 8 ani + 40C - 23 ani + 40C - 18 ani
61
6.1.2.3. Determinarea numărului total de colonii de microorganisme fungice identificate prin metoda Sabouraud la probele de cereale şi leguminoase luate în studiu
Pe mediu Sabouraud numărul cel mai mare de unităţi formatoare de
colonii (UFC/ml) din numărul de colonii obţinut în vasele Petri s-a înregistrat la
probele de Zea mays şi Vicia faba luate în studiu.
6.2. Evaluarea acţiunii micromicetelor identificate asupra germinaţiei cariopselor de cereale şi seminţelor de leguminoase luate în studiu, în funcţie de umiditatea acestora
Fig. 14 - Germinaţia probelor de Zea mays luate în studiu şi numărul de cariopse infectate în funcţie de umiditatea acestora, în condiţiile conservării la temperatura de +4 0C timp de 8 şi 17 ani
05
101520253035404550556065707580859095
100105
SV
GB
-112
65
SV
GB
-112
67
SV
GB
-112
55
SV
GB
-137
69
SV
GB
-137
97
SV
GB
-724
9
SV
GB
-790
2
SV
GB
-371
4
SV
GB
-377
3
SV
GB
-166
7
SV
GB
-168
5
SV
GB
-355
3
SV
GB
-166
0
SV
GB
-162
9
SV
GB
-178
9
SV
GB
-169
5
SV
GB
-165
8
SV
GB
-368
1
SV
GB
-361
1
SV
GB
-160
0
SV
GB
-519
1
SV
GB
-122
6
SV
GB
-382
9
SV
GB
-539
7
SV
GB
-546
5
SV
GB
-522
0
SV
GB
-162
7
SV
GB
-159
4
SV
GB
-165
4
SV
GB
-178
4
0
5
10
15
20
25
30
Germinaţia cariopselor Umiditatea cariopselor Cariopse infectate
+ 40C - 8 ani + 40C - 17 ani
62
Fig. 15 - Germinaţia probelor de Triticum aestivum luate în studiu şi numărul de cariopse infectate în funcţie de umiditatea acestora, în condiţiile conservării la temperatura de +4 0C timp de 8, 15 şi 18 ani Fig. 16 - Germinaţia probelor de Phaseolus vulgaris luate în studiu şi numărul de seminţe infectate în funcţie de umiditatea acestora, în condiţiile conservării la temperatura de +4 0C timp de 6 şi 15 ani
05
101520253035404550556065707580859095
100105
SV
GB
-140
59
SV
GB
-142
15
SV
GB
-150
18
SV
GB
-152
03
SV
GB
-159
72
SV
GB
-724
4
SV
GB
-736
3
SV
GB
-744
1
SV
GB
-879
0
SV
GB
-882
3
SV
GB
-882
4
SV
GB
-890
9
SV
GB
-918
6
SV
GB
-918
8
SV
GB
-948
5
SV
GB
-951
5
SV
GB
-951
9
SV
GB
-952
1
SV
GB
-102
61
SV
GB
-127
81
SV
GB
-127
84
SV
GB
-127
91
SV
GB
-127
99
SV
GB
-128
04
SV
GB
-128
12
SV
GB
-128
32
SV
GB
-253
9
SV
GB
-256
9
SV
GB
-514
8
SV
GB
-552
1
0
5
10
15
20
25
30
35
Germinaţia cariopselor Umiditatea cariopselor Cariopse infectate
+ 40C - 15 ani + 40C - 8 ani + 40C - 18 ani
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
SV
GB
-139
06
SV
GB
-139
36
SV
GB
-139
41
SV
GB
-139
44
SV
GB
-139
46
SV
GB
-139
72
SV
GB
-140
01
SV
GB
-140
06
SV
GB
-140
22
SV
GB
-140
46
SV
GB
-140
57
SV
GB
-140
60
SV
GB
-140
61
SV
GB
-140
65
SV
GB
-140
80
SV
GB
-141
05
SV
GB
-141
06
SV
GB
-141
75
SV
GB
-141
80
SV
GB
-141
85
SV
GB
-142
04
SV
GB
-136
26
SV
GB
-136
28
SV
GB
-136
39
SV
GB
-137
49
SV
GB
-137
50
SV
GB
-137
51
SV
GB
-137
75
SV
GB
-137
76
SV
GB
-137
77
0
5
10
15
20
25
30
35
Germinaţia seminţelor Umiditatea seminţelor Seminţe infectate
+ 40C - 6 ani + 40C -15 ani
63
Fig. 17 - Germinaţia probelor de Vicia faba luate în studiu şi numărul de seminţe infectate în funcţie de umiditatea acestora, în condiţiile conservării la temperatura de +4 0C timp de 8, 18 şi 23 ani
6.3. Determinarea cantitativă toxicologică a micotoxinelor secretate de micromicetele întâlnite la probele de cereale luate în studiu (Zea mays, Triticum aestivum)
6.3.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale prin metoda
cromatografiei în strat subţire (C.S.S.) Prin interpretarea cromatogramei obţinute după developare, la camera
U.V. nu s-a confirmat prezenţa aflatoxinei B1 pe probele de cereale luate în
studiu (30 probe de Zea mays şi 30 probe de Triticum aestivum), observându-se
doar prezenţa standardului, probele fiind negative.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
SV
GB
-175
SV
GB
-176
SV
GB
-179
SV
GB
-196
SV
GB
-203
SV
GB
-212
SV
GB
-232
SV
GB
-268
SV
GB
-270
SV
GB
-272
SV
GB
-278
SV
GB
-285
SV
GB
-293
SV
GB
-312
8
SV
GB
-427
8
SV
GB
-427
9
SV
GB
-428
0
SV
GB
-428
1
SV
GB
-428
3
SV
GB
-280
SV
GB
-298
SV
GB
-300
SV
GB
-308
SV
GB
-333
SV
GB
-271
SV
GB
-273
SV
GB
-279
SV
GB
-282
SV
GB
-290
SV
GB
-303
0
5
10
15
20
25
30
35
Germinaţia seminţelor Umiditatea seminţelor Seminţe infectate
+ 40C - 18 ani + 40C - 23 ani + 40C - 8 ani
Foto 115 - Interpretarea cromatogramei la camera U.V. (original)
64
6.3.2. Determinarea cantitativă a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2) din cereale prin metoda ELISA
Prin determinarea concentraţiei aflatoxinei totale la cele 30 de probe de
Zea mays, doar 2 probe au avut o concentraţie de aflatoxine totale peste limita
maximă admisă de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB - 13797 şi SVGB -
13769, cu concentraţiile 5634,46 µg/kg ppt (5,64 µg/kg ppb), respectiv 4943,09
µg/kg ppt (4,94 µg/kg ppb). În acest caz, aflatoxinele au fost secretate de
microorganismele fungice din genurile Penicillium, Aspergillus şi Rhizopus.
La Triticum aestivum, doar 3 probe au avut o concentraţie de aflatoxine
totale peste limita maximă admisă de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB
- 14215, SVGB - 15203 şi SVGB - 15018, cu concentraţiile 7124,10 µg/kg ppt
(7,12 µg/kg ppb), 6867,61 µg/kg ppt (6,87 µg/kg ppb), respectiv 6962,28 µg/kg
ppt (6,96 µg/kg ppb). Cele 3 probe au un număr ridicat de cariopse infectate cu
Penicillium sp. şi Rhizopus sp.
Fig. 18 - Agenţii patogeni saprofiţi izolaţi pe probele de Triticum aestivum ce au prezentat concentraţii ridicate de aflatoxine totale
6 6
7,1 7 7 6,8
4
8
6,9
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
SVGB-14215 SVGB-15018 SVGB-15203
Penicillium sp. Rhizopus sp. Concentraţia de aflatoxină
65
6.3.3. Determinarea cantitativă a ochratoxinei A din cereale prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate
Prin determinarea concentraţiei ochratoxinei A la cele 30 de probe de Zea
mays, doar 4 probe au prezentat o concentraţie de ochratoxină A peste limita
maximă admisă de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB - 13797, SVGB -
11265, SVGB - 11255 şi SVGB -11267 cu concentraţiile 8,09 µg/kg ppb (8090
µg/kg ppt), 7,71 µg/kg ppb (7710 µg/kg ppt), 8, 51 µg/kg ppb (8510 µg/kg ppt) şi
10,17 µg/kg ppb (1017µg/kg ppt). Toate cele 4 probe au un număr ridicat de
cariopse infectate cu Penicillium sp. şi Aspergillus sp.
Fig. 19 - Agenţii patogeni saprofiţi izolaţi pe probele de Zea mays ce au prezentat concentraţii ridicate de ochratoxină A
La Triticum aestivum, doar 4 probe au avut o concentraţie de ochratoxină
A peste limita maximă admisă de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB -
14215, SVGB - 15018, cu concentraţiile 7,95 µg/kg ppb (7950 µg/kg ppt), 12,34
µg/kg ppb (1234 µg/kg ppt). În acest caz, ochratoxina A a fost secretată de
speciile genului Penicillium.
8
2
8,09
17
3
7,71
14
0
8,61
5
1
10,17
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SVGB-11255 SVGB-13797 SVGB-11265 SVGB-11267
Penicillium sp. Aspergillus sp. Concentraţia de ochratoxină
66
6.3.4. Determinarea cantitativă a zearalenonei din probele de Zea
mays luate în studiu prin metoda ELISA
Prin determinarea concentraţiei de zearalenonă la cele 30 de probe de
Zea mays s-a observat că toate probele au avut o concentraţie de zearalenonă
sub limita maximă admisă de UE, fiind considerate astfel negative.
6.4. Modificările citogenetice induse de agenţii patogeni fungici la
probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) şi leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate în studiu
Alterarea materialului genetic al seminţelor sub acţiunea infestării cu
agenţi patogeni fungici a fost studiată, la nivel celular, pentru 3 specii: Zea mays,
Phaseolus vulgaris şi Vicia faba. Modificările citogenetice induse de agenţii
patogeni fungici nu au fost cercetate şi pentru specia Triticum aestivum 2n = 6x =
42 din cauza fenomenului de hexaploidie care împiedică o comparaţie corectă cu
celelalte 3 specii.
În cazul probelor luate în studiu au fost analizate: indicele mitotic şi
frecvenţa fazelor diviziunii mitotice în apexul radicular, frecvenţa aberaţiilor
interfazice totale şi a tipurilor de aberaţii interfazice, frecvenţa aberaţiilor
cromozomiale totale şi a tipurilor de aberaţii cromozomiale în ana-telofaza (A-T)
mitozei.
La Vicia faba s-a observat şi apariţia de interfaze cu un micronucleu şi, în
procent foarte mic interfaze cu două micronuclee (foto 116, 117).
Foto 116 - Interfază cu micronucleu la proba SVGB - 300 (original)
Foto 117 - Continuitate cromatică între nucleu şi micronucleu în interfază la
proba SVGB - 271 (original)
67
Tipurile de aberaţii cromozomiale prezintă o mare varietate, fiind
distribuite aleatoriu. S-au înregistrat aberaţii cromozomiale simple, de tipul: o
punte, un micronucleu, două micronuclee, A-T tripolare, cromozomi expulzaţi şi
câteva aberaţii cromozomiale complexe, de tipul: o punte cu două micronuclee şi
A-T tripolară cu cromozom expulzat (foto 118 - 124). Frecvenţa cea mai ridicată
o înregistrează micronucleele, ana-telofazele tripolare şi cromozomii expulzaţi.
Foto 118 - Ana- telofază cu 2 fragmente la proba SVGB - 272
(original)
Foto 119 - Anafază multipolară la proba SVGB - 271 (original)
Foto 120 - Ana- telofază cu fragmente la proba SVGB- 300 (original)
68
Foto 121 - Ana- telofază cu o punte (SVGB - 272) - original Foto 122 - Ana - telofază hexapolară
(SVGB - 271) - original
Foto 123 - Telofază cu micronuclee (SVGB - 272) - original
Foto 124 - Ana - telofază pentapolară cu punte şi cromozomi expulzaţi (SVGB - 271) - original
69
CONCLUZII Micoflora de depozit dezvoltată pe seminţele speciilor luate în studiu (Zea
mays, Triticum aestivum, Vicia faba şi Phaseolus vulgaris), care au fost
depozitate în condiţii controlate de mediu în Banca de Gene Suceava a fost
analizată în funcţie de genotip, de durata de conservare a seminţelor, de tipul de
substrat folosit şi astfel s-au stabilit unele corelaţii între evoluţia micromicetelor
izolate pe seminţe, precum şi influenţa acţiunii acestora asupra facultăţii
germinative a seminţelor.
1. Din cele 120 de probe supuse testării viabilităţii în condiţii de laborator,
după perioade diferite de conservare, în condiţii controlate de mediu, majoritatea
au prezentat o germinaţie de peste 85 %.
2. Cariopsele cerealelor şi seminţele leguminoaselor luate în studiu,
plasate pe mediu CGA, mediu Sabouraud şi hârtie sugativă, după perioada de
incubare, au prezentat un grad de infecţie diferit cu microorganisme fungice în
funcţie de tipul de substrat şi perioada de păstrare a probelor luate în studiu.
3. Toate genurile de micromicete au fost izolate pe un număr mult mai mic
de seminţe atunci când probele analizate au fost incubate pe hârtie sugativă, în
comparaţie cu numărul de seminţe plasate pe mediu CGA (cartof - dextroză -
agar).
4. Durata de conservare a influenţat longevitatea agenţilor patogeni
fungici, în sensul că cu cât aceasta este mai mare, cu atât gradul de infecţie este
mai redus.
5. La fiecare specie analizată, pe probele luate în studiu, toţi agenţii
patogeni fungici identificaţi au avut o comportare foarte diferită, în funcţie de
vechimea seminţelor.
6. Pe mediu Sabouraud (extract de drojdie - dextroză - cloramfenicol -
agar), numărul cel mai mare de unităţi formatoare de colonii (UFC/ml) s-a
înregistrat la probele de Zea mays şi Vicia faba luate în studiu.
7. Pe mediu CGA, comparativ cu mediul Sabouraud, după incubarea
seminţelor s-a izolat o diversitate mai mare de agenţi patogeni fungici.
70
8. Germinaţia probelor luate în studiu nu a fost influenţată foarte mult
de gradul de infecţie al seminţelor cu agenţi patogeni fungici, ceea ce
demonstrează că prin conservarea probelor în condiţii de atmosferă controlată,
pe perioade diferite de timp, scăderea germinaţiei nu este determinată numai de
apariţia micromicetelor. Creşterea frecvenţei apariţiei micromicetelor pe seminţe
este determinată de un complex de factori (genotip, compoziţie chimică,
rezistenţă genetică) care împreună pot duce la scăderea viabilităţii seminţelor.
De asemenea, întrucât localităţiile de provenienţă a probelor luate în studiu sunt
diferite, putem concluziona că procentul de transmitere a infecţiilor este în funcţie
de localitate, starea fitosanitară a seminţelor depinzând de tehnologia şi condiţiile
climatice din perioada formării, maturizării şi recoltării acestora.
9. În vederea stabilirii acţiunii complementare a unor micromicete
identificate pe seminţele probelor luate în studiu în diferite perioade de
conservare, s-au determinat coeficienţii de corelaţie între acţiunea agenţilor
patogeni fungici identificaţi pe probele de cereale şi leguminoase analizate. La
nivelul probelor luate în studiu, s-au înregistrat 9 corelaţii foarte semnificative
asigurate statistic Torula herbarum x Cladosporium herbarum, Chaetomium sp. x
Stemphylium botryosum (corelaţii negative - la Triticum aestivum), Stachybotrys
atra x Epicoccum sp., Trichothecium roseum x Rhizopus sp., Stemphylium
botryosum x Epicoccum sp., Stachybotrys atra x Rhizopus sp., Trichothecium
roseum x Epicoccum sp. (corelaţii negative - la Vicia faba), Rhizopus sp. x
Aspergillus sp. (corelaţie pozitivă - la Phaseolus vulgaris) şi Alternaria alternata x
Rhizopus sp. (corelaţie pozitivă - la Vicia faba).
10. Prin evaluarea acţiunii micoflorei de depozit întâlnită la probele luate
în studiu s-a observat că toate probele care au avut o concentraţie ridicată de
aflatoxine totale şi ochratoxină A au fost păstrate 8 ani la temperatura de + 4 0C.
11. Toate probele cu un număr mare de cariopse infectate, pe lângă
conţinutul ridicat de aflatoxină totală au prezentat şi o concentraţie ridicată de
ochratoxină A, ceea ce demonstrează corelaţia dintre micotoxinele secretate de
microorganismele fungice toxinogene şi numărul de cariopse infectate.
71
12. Determinarea micotoxinelor secretate de microorganismele
toxinogene a avut un rol important în determinarea mai precisă a unor specii de
Aspergillus şi Penicillium.
13. Determinarea micotoxinelor din cariopsele cerealelor destinate
conservării genetice reprezintă o activitate primordială în băncile de gene,
prevenindu-se astfel contaminarea acestora prin regenerarea sau multiplicarea
germoplasmei în câmpurile experimentale sau prin folosirea de către diverşi
utilizatori externi.
14. Studiul modificărilor citogenetice induse de agenţii patogeni fungici la
probele luate în studiu a arătat că, în general, valorile indicelui mitotic scad
proporţional cu creşterea numărului de micromicete care infestează seminţele şi
cu creşterea perioadei de conservare a seminţelor. Agenţii patogeni fungici au
dus la apariţia unui număr relativ crescut, dar semnificativ din punct de vedere
statistic, de aberaţii interfazice şi de aberaţii cromozomiale în ana-telofaza
mitozei la toate probele analizate şi la toate speciile studiate prin comparaţie cu
probele martor. 15. După analiza minuţioasă a rezultatelor obţinute şi compararea lor cu
datele din literatura de specialitate putem afirma că efectele citogenetice produse
de infestarea cu agenţi patogeni fungici sunt similare cu cele produse de
acţiunea unui agent mutagen slab.
72
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
• Anghel Gh., Raianu M., Matei C., Bucurescu N., Rădulescu I., Anganu I., Velea C., 1959, Determinarea calităţii seminţelor, Ed. Academiei Române, Bucureşti, 31 - 35, 199 - 204 ,
208 - 211, 258 - 259, 278 - 279
• Baicu T., Seşan T., 1996, Fitopatologie agricolă, Ed. Ceres, Bucureşti, 67 - 80, 141 -
143, 174 - 175
• Baker K.F., 1966, Dynamics of seed transmission of plant pathogens, Ann. Rev.
Phytopathol., 4, 311
• Băra C.I., 2008 - Radiaţia ultravioletă - factor mutagen fizic. Efecte ale iradierii cu UV la
fasole (Phaseolus vulgaris L.), Ed. Universităţii „Al.I.Cuza”, Iaşi,103 -114, 272 - 286
• Beratlief C., Oprea M., 1994, Caracteristici ale ecosistemului depozitelor de produse
agricole şi implicaţii sanitare, Probleme de protecţia plantelor, Bucureşti, 22: 13, 44
• Berjak P., 1987, Stored seeds. The problems caused by microorganisms (with
particulare reference to the fungi). Seed Pathology. International Advanced Course Abrates,
Brasil, 2, 22
• Bîlteanu Gh., 1998, Fitotehnie, Cereale şi leguminoase pentru boabe, Ed. Ceres,
Bucureşti, 1 (2): 204 - 210, 490
• Bontea V., 1985, 1986, Ciuperci parazite şi saprofite din România, Ed. Academiei
Române, Bucureşti, 1, 2
• Bontea V., Becerescu D., 1952, Manual de fitopatologie, Ed. de Stat pentru
Literatura ştiinţifică, Bucureşti, 44 - 57
• Booth C., 1971, Fusarium - Laboratory guide to the identification of the major
species, Common Wealth Agricultural Institute, Surrey, England, 49 - 53
• Cahagnier B., 1995, Les mycotoxines, Paris
• Căpraru G., Băra I., 2008 - Cereale, pesticide, mutaţii: Efecte citogenetice şi
fiziologice induse de tratamentul cu pesticide la orz, orzoaică şi secară, Ed. Univ. „Al. I. Cuza”,
Iaşi, 34 -74, 121-128
• Ceapoiu N., 1968, Metode statistice aplicate în experienţele agricole şi biologice, Ed.
Agro-Silvică, Bucureşti
• Champion R., 1997, Identifier les champignons transmis par les semences, Ed. INRA
(L’Institut National de la Recherche Agronomique), Paris, 2 - 15, 92 - 93, 96 - 97, 99 - 101, 119 -
121, 122 - 125,153 - 159, 164 - 165, 234 - 236, 241 - 243, 253 - 255, 309 - 313, 357 - 359
• Christensen C.M., 1973, Loss of viability in storage micoflora. Seed Science and
Technology, Ed. C.M. Christensen, 1, 350 - 380
• Cîmpeanu M., Maniu M., Surugiu C.I., 2002 - Genetica - metode de studiu, Ed.
Corson, Iaşi, 26 - 44
73
• Coman I., Popescu. O, 1985, Micotoxine şi micotoxicoze, Ed. Ceres, Bucureşti, 88 -
126
• Coman I., Mareş M., 2000, Micologie medicală aplicată, Ed. Junimea, Iaşi, 75 - 270,
318 - 336
• Cotrău, M., Popa L., Stan T., Preda N., 1991, Toxicologie, Ed. Didactică şi
Pedagogică, Bucureşti
• Cristea M., 1985, Conservarea genetică a plantelor şi agricultura, Ed. Academiei
Române, Bucureşti, 57
• Delouche J.K., 1976, Standardization of vigor tests, Journal of Seed Technology, 1, 2,
75 - 85
• Derache R., 1988, Micotoxine, Med. et Nut, 6 - 24, 351
• Docea E., Severin V., Baicu T., Pop I., 1976, Îndrumător pentru recunoaşterea şi
combaterea bolilor plantelor cultivate, Ed. Ceres, Bucureşti, 12 - 70, 146 - 150, 157 - 158
• Ellis M. B., 1971, Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute,
Kew Surrey, England, 1 - 608
• Faiad M.G.R., Wetzel M. M. V., 1996, Evaluation of fungi in seed germplasm before
long term storage. Genetic Resources Biotechnology National Research Center, Brasil, Seed
Science Technology, 24, 350 - 360
• Fowler J., Cohen L., 1990, Practical statistics for field biology, Open University Press,
New York, 45 - 79
• Guest E., 1979, Principles and practices of seed storage in Agriculture Handbook, Washington, 22 - 28
• Goran, G.V., 2005, Micotoxicoze, Tratat de Medicină Veterinară, Ed. Tehnică, 4
• Harrington, 1972, Seed Biology, Ed. Tehnică Kozlovski, Acad. Press New York şi
Londra, 145 - 185
• Hatman M., Bobeş I., Lazăr Al., Gheorghieş C., Glodeanu C., Severin V., Tusa C., Popescu I., Vonica I., 1989, Fitopatologie, Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 280 - 285,
468
• Hulea A., Negru Al., Severin V., 1973, Principalele boli ale culturilor semincere, Ed.
Ceres, Bucureşti, 35 - 70
• Hulea A., Rădulescu E., Bontea V., 1983, Dicţionar de termeni populari, tehnici şi
ştiinţifici în fitopatologie, Ed. Ceres, Bucureşti, 143
• Hulea A., Iliescu P., 1986, Determinator pentru identificarea mucegaiurilor potenţial
toxigene, Societatea de Medicină Veterinară din România, Bucureşti
• Iacob V., Ulea E., Puiu I., 1998, Fitopatologie agricolă, Ed. „Ion Ionescu de la Brad”,
Iaşi, 80, 211
• Iacob V., Hatman M., Ulea E., Puiu I., 1999, Fitopatologie generală, Ed. Cantes, Iaşi,
74
53 - 92
• Iacob V., 2002, Bolile plantelor cultivate - prevenire şi combatere, Ed. „Ion Ionescu de
la Brad”, Iaşi
• Ionescu D., 1967, Cultura leguminoaselor pentru boabe, Ed. Agro-Silvică, Bucureşti,
46, 211
• Justice O.L., Bass L.N., 1980, Principles and practices of seed storage, Agriculture
Handbook, Washington
• Kuckarek T. A., Kommedahl T., 1966, Kernel infection and corn stalk rot caused by
Fusarium moniliforme, Phytopathology, 56
• Malone J.P., Muskett A.E., 1941, The Ulster method for the examination of flax seed
for the presence of seed borne parasites, Annals Appl. Biol., 8 - 13, 28
• Maniu M., Truţa E., Tudose C., Maniu C., 2002, Efecte citogenetice induse de tratamentul singular şi combinat cu Oltisan extra şi UV-B la linia DH74-2 de orzoaică de primavară, În
Analele Societăţii Nationale de Biologie Celulară - C. Crăciun, A. Ardelean (editori), 6: 1, 112 - 114
• Maniu M., Tudose C., Tudose M., 2005, In vivo mutagenesis induced by sodium azide
in DH10-9 double haploid line of barley, Romanian Biotechnological Letters, 10 (4): 2255 - 2261
• Mititiuc M., 1993, Bolile plantelor legumicole, Ed. Univ. “Al. I. Cuza”, Iaşi
• Mititiuc M., 1994, Fitopatologie, Ed. Univ. “Al. I. Cuza”, Iaşi, 387 - 389, 409
• Mititiuc M., 1995, Micologie, Ed. Univ. “Al. I. Cuza”, Iaşi, 111 - 112, 133 - 135, 227,
234 - 235, 238
• Molard R., Cahagnier B., 1992, Microflore des cereales, croissance microbiene et
hydratation, consequence du developpment des moisissures, La Rochelle, Paris, 77
• Neergaard P., 1977, Seed pathology, Ed. Macmillan Press, Londra, 1: 550 - 556
• Osweiler G.D., 2000, Mycotoxins - contemporary issues of food animal health and
productivity. Veterinary Clinic of North American Food Animal, 16, 511 - 530
• Pârvu M., 1996, Fitopatologie, Ed. Sincron, Cluj Napoca, 99 - 277
• Plăcintă D., 2007, Micromicete ce se transmit prin seminţele de cereale păioase.
Prevenire şi combatere, Ed. Univ. Suceava, 13 - 19, 20 - 29, 30 - 32, 46 - 48
• Raicu C., Baciu D., 1978, Patologia seminţei, Ed. Ceres, Bucureşti, 1 - 50, 109 - 111,
170 - 184
• Raper K. N., Thom C., 1968, A Manual of the Penicillia, Hafner Publishing Company,
New York
• Rădulescu E., Negru A., 1967, Îndrumător pentru determinarea bolilor şi dăunătorilor
la seminţe, Ed. Agro-Silvică, Bucureşti, 266 - 271, 277 - 280
• Rădulescu E., Răfăilă C., 1969, Tratat de fitopatologie agricolă, Ed. Academiei
Române, Bucureşti, 2: 68 - 74
• Samson R. A., Pitt J. I., 1990, Modern concepts in Penicillium and Aspergillus
75
classification, Plenum Press, New York, 1 - 478
• Savu C., Georgescu N., 2004, Siguranţa alimentelor, riscuri şi beneficii, Ed. Semne,
Bucureşti, 146 - 152
• Săvulescu O., Eliade E., Mărgăriteanu S., Popa E., 1965, Lucrări practice de
fitopatologie, Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, ediţia a 4- a, 25 - 43, 70 - 77
• Seşan T., 1982, Ciuperci parazite pe sămânţa de fasole şi combaterea lor, Bucureşti,
47 - 60
• Seşan T., Baicu T., 1995, Biological control of fungus diseases of cropped plants in
Romania. Plant pathology, Abstracts of the International Symposium of the Plant Protection,
Holland, 2 - 7, 13 - 20
• Seşan T., Tănase C., 2006, Mycobiota - sisteme de clasificare, Ed. Univ. „Al. I. Cuza”,
Iaşi
• Scuteanu E., Danielescu N., Popescu O., Trif Al., 1995, Toxicologie şi toxicoze, Ed.
Didactică şi Pedagogică, Bucureşti
• Străjeru S., Murariu D., Popa M., Plăcintă D., 2001, Conservarea şi utilizarea
resurselor genetice vegetale, Suceava, 5 - 7, 39 - 41, 75, 100 - 154
• Tănase C., 2002, Micologie, Ed. Univ. „ Al. I. Cuza”, Iaşi
• Tănase, C., Mititiuc, M., 2001, Micologie, Ed. Univ. „Al. I. Cuza”, Iaşi, 12 - 13, 92 - 98,
108, 119 - 124, 171 - 173, 236 - 237, 244
• Tănase, C., Seşan T., 2006, Concepte actuale în organizarea şi clasificarea fungilor,
Ed. Univ. „Al. I. Cuza”, Iaşi
• Thom C., Raper K. N., 1945, A Manual of Aspergillia, Wilkiams Wilkins Company
Baltimore
• Tudose I., 1967, Genetica. Indrumător de laborator, Ed. Univ. "Al . I. Cuza" Iaşi, 40 - 48
• Zanoschi V., Toma C., 1985, Morfologia şi anatomia plantelor cultivate, Ed. Ceres,
Bucureşti, 73 - 75
• Webster J., 1993, Introduction to fungi (2nd edition), Cambridge University Press,
Cambridge
1993, Handbook on seed health testing, International Seed Testing Association, Zurich
FAO/IPGRI, Genebank Standards, 1994, Food and Agriculture Organization of the
United Nations/International Plant Genetic Resources Institute, Roma
Surse internet: http://mcavalla.free.fr/galerie/category.php?cat=16 http://schimmel-schimmelpilze.de http://www.indexfungorum.org http://www.mycotoxins.com
76
LISTA LUCRĂRILOR ŞTIINŢIFICE CU REFERIRE LA
SUBIECTUL TEZEI DE DOCTORAT
1. Diana Batîr-Rusu, Danela Murariu - Assessment of deposit mycoflora action on Vicia faba beans
from Suceava Genebank collection, Ed. Univ. “Ştefan cel Mare” Suceava, 2009 (sub tipar)
2. Diana Batîr-Rusu, Danela Murariu - Assessment of deposit mycoflora action on Phaseolus
vulgaris beans from Suceava Genebank collection, Ed. Univ. “Ştefan cel Mare” Suceava, 2009 (sub
tipar)
3. Diana Batîr-Rusu, Cristian Tudose - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in Vicia
faba L. beans from the collection of Suceava Genebank, Analele Ştiinţifice ale Universităţii „Al. I.
Cuza” Iaşi, Secţiunea Geneticã şi Biologie Molecularã, TOM X, fasc. 3, 2009, 17 - 24
4. Diana Batîr-Rusu, Cristian Tudose - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in Zea
mays L. seeds from the collection of Suceava Genebank, Analele Ştiinţifice ale Universităţii „Al. I.
Cuza” Iaşi, Secţiunea Geneticã şi Biologie Molecularã, TOM X, fasc. 4, 2009 (sub tipar)
5. Cristian Tudose, Diana Batîr-Rusu - Efecte citogenetice induse de micoflora de depozit la
seminţele de Phaseolus vulgaris L. din colecţia Băncii de Resurse Genetice Vegetale Suceava, Analele
SNBC, 2 (Rezumatele lucrărilor celei de-a XXVII-a Sesiuni Ştiinţifice Anuale a Societăţii Române de
Biologie Celulară), Bistriţa, 11 - 14 iunie 2009, 5
6. Cristian Tudose, Diana Batîr-Rusu, Mihaela Ionela Tudose - Efecte citogenetice induse de
micoflora de depozit la seminţele de Zea mays ssp.mays din colecţia Băncii de Resurse Genetice
Vegetale Suceava, Supliment la Analele Ştiinţifice ale Universităţii „Al. I. Cuza” Iaşi (Rezumatele
lucrărilor Sesiunii Ştiinţifice Biologia în Anul Omagial Darwin, dedicată lui Charles Darwin: 200 de
ani de la naştere şi 150 de ani de la publicarea „Originii speciilor”), 6 - 7 noiembrie 2009, 33
7. Cristian Tudose, Diana Batîr-Rusu - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in
Phaseolus vulgaris L. beans from the collection of Suceava Genebank, Annals of the Romanian
Society for Cellular Biology, A. Ardelean, C. Crăciun (Editors), XIV, issue 2, 2009 (sub tipar)