gestion de colonias
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Bioseguridad, Bioética .TRANSCRIPT
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GESTIÓN DE COLONIAS DE RATONES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
LEGISLACIÓN DE RMGs
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• La gestión de una colonia de ratones puede definirse como la provisión de todos los recursos materiales, humanos, y temporales, necesarios para conseguir unos objetivos preestablecidos.
Gestión en general
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• recursos materiales: – Modelo animal – Instalación, equipamiento – Espacio – Financiación – Registros de datos
• recursos humanos: – Formación
– Personal suficiente
• recursos temporales:
– Tiempo necesario
Gestión en RMG
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Redactar PROYECTO
• Cual es el objetivo científico
• Qué RMG espero obtener
– Genotipos, edades, sexos, etc.
• Qué datos espero obtener
– Muestras, experimentos, técnicas, etc.
• Cuales serán los controles
• Establecer una cronología
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Queremos traer ratones Apoe Vamos a estudiar ateroesclerosis en diferentes genotipos con dietas ricas en grasa Se crían bien. Necesitaremos grupos de 10 machos y hembras
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• Información sobre el gen – Publicaciones – MGI
• Información sobre la modificación – Mutantes espontaneos – Mutantes inducidos (químico, radiaciones)
– Mutaciones dirigidas (técnicas de recombinación) – Mutantes condicionales (Cre-lox, Tet-on, etc.)
– Transgénicos
Recoger información
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All alleles(39) : Targeted(18) Gene trapped(19) Transgenic(1) Spontaneous(1) Mutations at this locus cause diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis.
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• Información genética: “Apoe” nomenclatura
– B6.129P2-Apoetm1Unc/J
– B6.129P2-Apoetm1(APOE*2)Mae
– B6.129P2-Apoetm1(APOE*3)Mae
– B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd
– SHL/StmRbrc
Recoger información
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“Apo E”
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• Información genética: fondo genético
– 129S6/SvEv-Apoetm4Mae/J
– B6.129P2-Apoetm1Unc/J
– AKR.129P2(B6)-Apoetm1Unc/J
– D2.129P2(B6)-Apoetm1Unc/J
– B6.Cg-Apoetm1Unc (D12Mit182-D12Mit2)/Pgn
Recoger información
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• Información genética: fondo genético
DBA/2J
SUSCEPTIBILIDAD A DIETAS ALTAS EN GRASAS
AKR/J
C57BL/6J
C57BLKS/J
Recoger información
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Mouse Phenome Database
http://phenome.jax.org/
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• Información genética: genotipo
Recoger información
– Muestras para genotipado e identificación.
– Edad de genotipado
– Técnicas de genotipado
NO INICIAR LA PRODUCCIÓN SIN TENER LA TÉCNICA
TESTAR SIEMPRE LOS FUNDADORES
TESTAR SIEMPRE LOS FONDOS GENETICOS
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• Información genética: genotipo
FELASA guidelines for the production and nomenclature of transgenic rodents
Recoger información
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• Información genética: genotipo
– alelo “wild type”
– alelo KO
– transgén
– homocigoto
– heterocigoto
– hemicigoto
Recoger información
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• Información genética: genotipo
B6.Apoe KO -/-, +/-, +/+
B6.Apoe Tg
-/-, +/-, +/+
B6.Tg Apoe KO
(+/+) (-/-) (+/-) (+/-) (+/+) (-/-) (-/-) (+/-) (+/+)
Recoger información
B6.129P2-Apoetm1Unc/J
B6.Cg-Tg(GFAP-APOE*3)37Hol Apoetm1Unc/J
B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd
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• Información genética: genotipo
B6.Apoe KO -/-, +/-, +/+
B6.Apoe Tg
-/-, +/-, +/+
B6.Tg Apoe KO
(+/+) (-/-) (+/-) (+/-) (+/+) (-/-) (-/-) (+/-) (+/+)
Recoger información
B6.129P2-Apoetm1Unc/J
B6.Cg-Tg(GFAP-APOE*3)37Hol Apoetm1Unc/J
B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd
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“Apo E”
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– Alteraciones reproductivas
– Fenotipo esperado en el tiempo
• Fertilidad, • Desarrollo, • Prolificidad, • Parto, • Destete,
• Cancer • Neurodeg., • Endocrinas, • Metabólicas, • Cardiovascular
Recoger información
• Información genética: fenotipo
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Bases de datos
Id. ratón/Marcaje
Trazabilidad
Id. de la muestra Id. en la cubeta Genotipo
Base de datos
Datos: reproductivos, cruces, muestras, etc.
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Establecer la producción
• ¿Cuántos animales necesitamos?
• ¿Cada cuanto tiempo?
• ¿De qué edad?
• ¿De qué sexo?
• ¿De qué genotipos?
• ¿Qué información del cruce necesitamos?
• ¿Cuántos animales por camada produce la cepa?
• ¿Cuántos cruces fértiles tiene la cepa?
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Establecer la producción
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6.8
4.8
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Factores a tener en cuenta
• Factores ambientales (Luz, Tª, HR %, Ruido, etc..)
• Instalación
• Alojamiento
• Manejo y experiencia
• Enriquecimiento
• Estado sanitario
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Sistemas de cruces
• Discontinuo Vs. Continuo
• Monogamia-Trios Vs. Poligamia
• Programado Vs. Al azar
• Pubertad 6-8 semanas
• Ciclo estral: 4-5 días
• Sincronización de ciclos
• Monta 1-3 hembras
• Tapón ≠ Gestación
• Efecto Whitten / Lee-Boot / Bruce
• Gestación 18-22 días
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Sistemas de cruces
Homocigosis (A/A)
• Menor coste (genotipos)
• Niveles de expresión (transgénicos)
• Toda la producción puede utilizarse para experimentos
Heterocigosis (A/a)
• Se obtienen controles “wild type”
• Se evita la creación de sub-estirpes
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Mantenimiento del fondo genético
• Stocks no consanguíneos
• Estirpes Consanguíneas
• Estirpes híbridas
• Establecimiento de congénicos (Speed Congenics)
Sistemas de cruces
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RMGs-stocks no consanguíneos
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Ventajas • Isogenicidad
• Homocigosidad
• Uniformidad genotípica
• Estabilidad en el tiempo
• Individualidad
• Distribución internacional
• Identificables
• Sensibilidad
RMGs-estirpes consanguíneas
Desventajas • Baja capacidad de reproducción
• Caras
• Sensibles a factores ambientales
• 129X1/SvJ • A/J • BALB/cByJ • BALB/cJ • C3H/HeJ • C57BL/6J • C57BL/6NJ • C57BL/10J
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RMGs-estirpes híbridas
B6 BALB/c B6CF1
x F1
F2 B6CF1 B6CF1
x
B6CF2
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RMGs-Congénicos
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• No consanguíneas
– Parentales en heterocigosis
– Los WT CONTROLES
Elecciones de controles
• Consanguíneas
– Parentales en ambos
– La CEPA es CONTROL
• Híbridos
– Primera generación
– Los F1 son CONTROL
– Parentales en ambos – La CEPA es CONTROL – Los WT CONTROLES
• Congénicos
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Mantenimiento de RMGs
X X
Núcleo fundador Colonia de expansión
Congelación de embriones
Congelación de esperma
Técnicas de reproducción asistida
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A tener en cuenta
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A tener en cuenta
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• Recabar información genética
• Recabar información del fenotipo
• Identificar los animales (genotipado)
• Plantear los cruces dependiendo de las necesidades y la instalación
• Analizar los animales
• Evitar la variabilidad (3Rs)
RESUMEN
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• http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene.shtml
• http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/index.shtm
Bases de datos
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Legislación RMGs
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Legislación RMGs • Legislación sobre animales de experimentación
– RD 1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos
– Ley 32/2007, de 7 de noviembre, para el cuidado de los animales, en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio, incorpora un régimen sancionador.
– Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos
• Legislación sobre OMGs – Ley 9/2003 sobre régimen jurídico de la utilización confinada, liberación
voluntaria y comercialización de OMGs. – RD 178/2004 con el reglamento para el desarrollo y ejecución de la ley 9/2003.
• Legislación sobre bioseguridad – RD 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los
riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo – NTP 468: Trabajo con animales de experimentación
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• Hasta ahora, necesaria la aprobación del CEEA y comunicar a la autoridad para hacer un RMG: explicar objetivos, técnicas a realizar, nº de animales, eliminación del dolor, etc. NO ES NECESARIO PARA SU MANTENIMIENTO.
• A partir de ahora, además, siempre que haya un fenotipo potencialmente dañino, incluso en mutaciones espontaneas, para el mantenimiento de RMGs será necesario autorización expresa de la autoridad competente .
Legislacion RMGs
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• Objetivo: la protección de la salud humana y del medio ambiente.
• Designa a la Administración General del Estado o Autonomías,
dar la autorización para utilización confinada o liberación controlada.
– Incluye la producción de nuevos OMGs como la multiplicación
de OMG ya existentes con técnicas naturales. – El transporte de animales queda expresamente encuadrado en
el concepto de utilización confinada de OMGs
Legislacion OMGs
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• Debe registrarse antes de iniciar la actividad por primera vez . • Debe evaluar y clasificar las actividades que se vayan a
realizar. I, II, III, IV • Posteriormente evaluar cada actividad. Si son de tipo I, es
decir de riesgo nulo o insignificante, no deberán ser comunicadas a la autoridad competente.
• Cualquier otro tipo precisa comunicación de cada
experimento a realizar en los términos que especifica el reglamento.
Requisitos de un animalario con RMGs
![Page 44: Gestion de Colonias](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042511/563db7ee550346aa9a8f4b42/html5/thumbnails/44.jpg)
• Evaluación de riesgos para la salud humana y el medio ambiente (Anexo I) – Tipo I: Riesgo nulo o insignificante – Tipo II: Bajo riesgo – Tipo III: Riesgo moderado – Tipo IV: Alto riesgo
• Llevar un registro de la evaluación • Cumplir las normas específicas de higiene y seguridad en el
trabajo. • Aplicar las normas de confinamiento especificadas por el
reglamento para cada tipo de actividad.
Evaluación de un animalario con RMGs
![Page 45: Gestion de Colonias](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042511/563db7ee550346aa9a8f4b42/html5/thumbnails/45.jpg)
• OMGs que sea poco probable que el organismo de origen o el receptor causen enfermedades a seres vivos (humanos, plantas, o animales)
• Aquellos en los que la naturaleza del vector y el material
incorporado no originen en el OMG resultante un fenotipo que pueda causar enfermedad a seres vivos.
• Aquellos en que el OMG resultante sea poco probable que pueda
causar enfermedad en el ser humano animales o plantas en caso de exposición accidental en el medio ambiente o efectos nocivos sobre el medio ambiente
Evaluación de RMGs-Tipo I
![Page 46: Gestion de Colonias](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042511/563db7ee550346aa9a8f4b42/html5/thumbnails/46.jpg)
Especificaciones Grado de confinamiento
1 2 3 4 Aislamiento de la unidad de animales Opcion. Exigida Exigida Exigida
Locales separados con puertas bloqueables
Opcion. Exigida Exigida Exigida
Locales descontaminables y faciles de lavar (jaulas)
Opcion. Opcion. Exigida Exigida
Suelos y paredes fáciles de
lavar Opcion.
Exigida (suelo)
Exigida Exigida
Confinamiento de animales en jaulas corrales o cajas
Opcion. Opcion. Opcion. Opcion.
Filtros en las cajas de aislamiento o habitaciones aisladas
Opcion. Opcion. Exigida Exigida
Medidas de confinamiento animalario con RMGs
![Page 47: Gestion de Colonias](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042511/563db7ee550346aa9a8f4b42/html5/thumbnails/47.jpg)
Medidas de confinamiento animalario con RMGs
• Prácticamente todos los RMGs son de tipo I
• Todos los animalarios cumplen tipo I
• Es necesario registrarse
• Es necesario llevar un registro
• Es necesario evaluar
• El transporte es más complejo
![Page 48: Gestion de Colonias](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042511/563db7ee550346aa9a8f4b42/html5/thumbnails/48.jpg)
MARTIN J. EVANS
Gracias
José Manuel Sánchez Ernesto de la Cueva Bueno Belén Pintado The Jackson Laboratory
MARIO CAPECCHI OLIVER SMITHIES