glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase...

7
Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus Hiroyuki Miyazaki, 1 Takashi Ono, 1 Yasunobu Okuma, 1 Kazuo Nagashima 2 and Yasuyuki Nomura 1 1Department of Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, Sapporo 060±0812, Japan 2 Department of Molecular and Cellular Pathology, Graduate School of Medicine, Hokkaido University, Sapporo 060±8638, Japan Keywords: CA1, dopamine b-hydroxylase, dopamine, forebrain ischemia, neuronal death Abstract Recently, we have reported that glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), which supports the survival of dopaminergic neurons, prevents delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region induced by transient forebrain ischemia. In the present study, we examined the role of GDNF in the expression of tyrosine hydroxylase (TH) mRNA induced by transient forebrain ischemia in rats. The expression of TH mRNA was increased in a time-dependent manner, with a signi®cant increase in 24 h to 7 days, in the hippocampus after induction of transient forebrain ischemia, as determined using the reverse transcription and polymerase chain reaction method. Although it has been suggested that the increase of dopamine b-hydroxylase mRNA expression correlates with the activation of noradrenergic neurons, no increase of dopamine b-hydroxylase mRNA in the hippocampus was observed in our system. Western blot analysis revealed that TH protein, but not dopamine b-hydroxylase protein, was produced in a time-dependent manner in the hippocampus during the ischemia. Interestingly, the induction level of TH mRNA was reduced by intrahippocampal microinjection of GDNF (1.0 mg), and this local GDNF treatment also reduced the increase of TH-like immunohistochemistry-positive terminals in the hippocampus. In contrast, local GDNF treatment of normal rats increased the TH mRNA expression at 6±12 h. These ®ndings suggest that GDNF protects against neuronal degeneration including delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region by modulating the expression levels of TH mRNA and protein. Introduction Transient forebrain ischemia induces delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region. Ischemia-induced neuronal injury includ- ing delayed neuronal death is thought to be mediated, in part, by a variety of neurotransmitters. There is considerable evidence of a role for glutamate toxicity in ischemic neuronal injury (Hagberg et al., 1985; Collingridge & Lester, 1989; Choi & Rothman, 1990). It was shown that dopamine (DA) was released in excessive amounts into the hippocampus following transient forebrain ischemia in in vivo microdialysis studies (Bhardwaj et al., 1990; Baker et al., 1991). In neuroanatomical studies, the hippocampus was found to receive projections from the ventral tegmental area and adjacent substantia nigra (Swanson, 1982; Gasbarri et al., 1994b,c), which contain the dopaminergic neurons of the A10 and A9 groups, respectively. Moreover, there is evidence that DA neurons of the retrorubral ®eld project to the hippocampal formation (Gasbarri et al., 1994a). Recently, it has been reported that the DA system has a role in modulating memory processes in the hippocampus (Gasbarri et al., 1996). Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), a member of the transforming growth factor-b superfamily, is a potent neuro- trophic factor that exhibits a variety of biological activities, having effects on several types of neurons from both the central (Oppenheim et al., 1995; Sauer et al., 1995; Cigola et al., 1998) and peripheral (Buj-Bello et al., 1995; Ebendal et al., 1995) nervous system. It is known that GDNF has neuroprotective and regenerative effects on DA neurons in vivo. In addition, GDNF normalizes nigral DA levels and increases the number of tyrosine hydroxylase (TH)-immunor- eactive positive cells in the lesioned substantia nigra (Hoffer et al., 1994; Bowenkamp et al., 1997). Previously, we reported that an intrahippocampal microinjection of GDNF (1.0 mg) prevented delayed neuronal death induced by transient forebrain ischemia in the hippocampal CA1 region in rats (Miyazaki et al., 1999a). Moreover, it has been reported that the GDNF mRNA in the hippocampus is upregulated after the systemic injection of kainate, which induces a syndrome characterized by acute limbic status epilepticus and subsequent neuronal brain damage in adult rats (Humpel et al., 1994). Martin et al. (1995) reported that GDNF inhibits kainate-induced seizure activity and neuronal cell death in the hippocampal, thalamic and amygdaloid regions. These ®ndings suggest that GDNF has neuroprotective effects not only on dopaminergic and adrenergic neurons but also on pyramidal neurons in the hippocampus. In the present study, we examined the expression of TH mRNA and protein induced by transient forebrain ischemia and the effects of GDNF on TH mRNA expression and production induced by the ischemia. We found that the excessive expression of TH mRNA and protein in the hippocampus induced by transient forebrain ischemia is modulated by GDNF. Correspondence: Dr Yasuyuki Nomura, as above. E-mail: [email protected] Received 10 August 1999, revised 29 February 2000, accepted 2 March 2000 European Journal of Neuroscience, Vol. 12, pp. 2032±2038, 2000 Ó European Neuroscience Association

Upload: hiroyuki-miyazaki

Post on 06-Jul-2016

215 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

����� ���� ��������� ��� � ���� ���� � �������������������� �� ���� �� ������ ������� � �� ������ ������

�� ���� ���������� ������� �� �� ����� �� ������� ��� !�"������# ��� �������� ! ����

�������� �� ����������� ������� ������ �� ����������� ��������� �������� ���������� ������� ����� �!� "����!������� �� #�������� ��� $������� �������� ������� ������ �� #�������� �������� ���������� ������� ���� �% � "����

��������& $'�� ������� �(�����)������ �������� ����*���� �������� �������� ����

$������

%�������� &� ���� �� �� ���� "���� ���� ��������� ��� � ���� ���� '�(!)*� &���� ���� �� ��� ������� � ������"����� ��� ������� ����� ��� ��� ���� �� ��� ���� ������ +$� �"� � ����� �� �������� � ����� ��������, -� ��� ����������� &� ������� ��� �� � �(!) �� ��� ������� � � �� ���� �� ������ '��* �%!$ ����� �� �������� � ����� ���������� ���, ��� ������� � � �� �%!$ &�� ������� �� � ������������ ������ &��� � ��"��.���� ������� �� #/ � � 0 ���� �� ������� ������ ���� ������ � � �������� � ����� ��������� �� ������� ����" ��� ����� ��������� � �� � ������� ���������� � ���� , $��� �"� �� ��� ���� ��""���� ���� ��� ������� � ������ ���� ������ �%!$ ������� � � ������ &��� ����������� � � � ����"�� ��� ��� � ������� � ������ ���� ������ �%!$ �� ��� ���� ������ &�� ����� �� � ������,1����� �� � �������� ������ ���� �� � ����� ��� � � ������ ���� ������ � ����� &�� � ��� �� � ������������ ������� ��� ���� ������ ���" ��� ��������, -��������"��� ��� ������ � ����� � �� �%!$ &�� ���� �� �������� ��������� ��2���� � � �(!) '�,3�"*� �� ���� � ��� �(!) �������� ��� ���� ��� ������� � ������� ����� ���� ���������� �������������� �� ��� ���� ������, -� � ������ � ��� �(!) �������� � � ��� ��� ������� ��� �� �%!$ ������� � �� 45�# �, �����.���"� ��""��� ���� �(!) � ����� �"����� ��� ��� �"������ � �������" ����� ��� ��� ���� �� ��� ���� ������ +$� �"� ��� � ������" ��� ������� � ������ � �� �%!$ �� � ����,

-�� ���� �

��������� ������� ��� ���� ������� ������� ������� ���� �� � �

��������� ��� ������ ��� ������������ ������� ������ �������

��� ������� ������� ���� �� � �� � � �� ��������� �� ����� �� �

������� ����������������� � ��� �� ����������� �������� � ���

� ��������� ������� �� ��� ���� ������� ������ � ������ �� ����

�!"#$ ����������� % &������ �!"!$ � � % '� ���� �!!()� �� *��

� *� � �� ������� �+�) *�� �������� �� ��������� ������ ���

� � ��������� ��*��� ��������� ������� ��� ���� �� �� ����

������������ ������� �, ���*�� �� ���� �!!($ ,�-�� �� ���� �!!�)� ��

������������� �������� � � ��������� *�� ��� � �������

��������� �� � � ������� ��������� ���� ��� �������� ����������

����� �.*����� �!"/$ 0������� �� ���� �!!1���)� * �� ������ � �

����������� ������ � � ��( ��� �! ������ �������������

2������ � ��� �� �������� � �� +� ������ � � ���������� 3���

������ � � � ��������� ������ �0������� �� ���� �!!1�)�

'�������� �� �� ���� ������� � �� � � +� ������ �� � ��� ��

��������� ����� �������� �� � � ��������� �0������� �� ����

�!!4)�

0���� ���� ������������ ������� �� ���� �0+56)� � ������

� � ���������� ��*� ������ ����������� �� � ����� �����

��� �� ���� � �� �� ����� � ������� �������� ����������� �����

����� � ������� ����� ������ �� �� � � ������� �7���� ���

�� ���� �!!#$ .���� �� ���� �!!#$ ����� �� ���� �!!") ��� ����� ����

�,���,��� �� ���� �!!#$ 8������ �� ���� �!!#) ������ ������� �� ��

-�*� � �� 0+56 �� ������������� ��� ������������ ����� �

+� ������ �� ����� �� �������� 0+56 ������9�� ������ +� ������

��� ��������� � � ������ ������� ��������� �� )��������

������� ������� ����� �� � � ������� ���������� ����� � �� �� ����

�!!1$ ,*��-��� �� ���� �!!:)�

;��������� *� ������� � �� �� ����� ��������� ������������

0+56 ���(��) ��������� ������� ������� ���� ������� ��

��������� ������� ��� ���� �� � � ��������� ��� ����� �� ����

�2���9�-� �� ���� �!!!�)� 2������ �� �� ���� ������� � �� � �

0+56 �'5� �� � � ��������� �� ����������� ���� � � ��������

�������� -������� * �� ������� � ������� � ��������9�� ��

����� ������ ������ ����������� ��� �����<���� ������� ����� ������

�� ����� ���� � ����� �� ���� �!!1)� 2����� �� ��� ��!!#) ������� � ��

0+56 �� ����� -�������������� ���9��� �������� ��� ������� ����

���� �� � � ���������� � ������ ��� ��������� ������� � ���

3������ ������� � �� 0+56 �� ������������� ����� �� ��� �

����������� ��� ���������� ������ ��� ��� � ��������� ������

�� � � ����������

�� � � ������� ������ *� �������� � � ��������� � �'5�

��� ������ ������� �� ��������� ������� ��� ���� ��� � � �����

0+56 � � �'5� ��������� ��� �������� ������� �� � �

��� ����� =� ��� � �� � � ��������� ��������� � �'5� ���

������ �� � � ��������� ������� �� ��������� ������� ��� ���� ��

�������� �� 0+56�

������ ����> +� ?�����-� 5����� �� �����8�����> �����@� ���� -����������

������� �� ������ ����� ����� �� ������ ����� ������� � ���� ����

������� ������ �� ����������� !��" ��� ��" ��#�$��#%� ���� � ������� ���������� �����������

Page 2: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

�������� �� ���� �

�������� ���� �� � �������

� �������� ���� .�������+�*��� ���� �A���� &������� �������

����� �-�� A����) *��� ��� /"(BC#( � *��� ����� ���������

������� ��� ���� *�� ������� �� � ���3����� � � ��� �

;��������� % ,������� ��!:!)� ,���D�� � � ������ �������� *���

������ � ��� � ������� ������������ ������� ��� ��������� ��

� � ���������� ������ ��� ����� ����� ������ ���� *�� �����

������������ �1(��E-�� ����)� � ���- � ���� *�� ����� ������

����� ��� ������ *�� �� ������������ � � ������ ��� D*� � �

��������� �������� *��� �������������9�� *�� � ������ ��������

� ��� � � ���� ������� ���� / ����� � � ������ �������� *��� ���

������ ��� ������� � �#��� *�� ����� ���������� ����� �

������ � ��������� �������� ,�� ����������� *�� ���������� ��

C:�#� (�# �� *�� � � ������������� �������� ������� ����� ��

� ���������� ����� � � ������ �������� *��� ��������� ��� ��

�������� 6� �������� ������� ������������ ��� ��������� � ���

������� �'��;�') ��� =������ ��� ��������� ���� *��� -����� ��

����������� �� ������ ���� ������ ��� � �� � � ��������� *��

������� ������ ��� ����� �� B"( �� ����� �������� ������ ����������� *��� ������� �� �� ��������� *�� � �

5� 0���� � ���� ��� F�� &������� ������� ��� ������� ��

� � ������ ���� ��� ��� �������� --��� F����������

��������������� ������� ���� ����

���� ���������� 0+56 *�� ���� ���� �� =�- ;���

� ������ �� &��� �7��-�� A����)� 0+56 �(�#��E�& �� /�&)��������� �� ����3���� ������������ D��� ���.6$ �� �2> 5���� �1($

G��� C�C#$ 2���/� ���#$ ����/� ��/4$ 5�/ ;71� ��/$ ��� 5� /;71�

(�C$ � :�1)� � ��.6 �� � �� ���� *�� �������� ������������ ��� � �

��� � ��������� ��� ����� ��������� BC�C��$ �������� ��"��$

��� �� /�4��� �������� � � � ������)� *�� �������� � � � �����

;����� % =���� ��!"4)� /(��� ���� � ��������� ������� *��

������� ����� �H ��� ��� ������ ����� 8�� �� 0+56 � � �

�� ���� *�� ������������ ��� � � ��������� ��� ����� ���

�(���� ��� � � ������ ��� �� ����� � � ��� �� /��� ����

�������

������

���� �������� '5� *�� �������� �� ��������� ������� ��

����� � � ���� ��������� � ��������E� ���E� ���� �������

��� ��������� � �������� � � ��������� � ��� ������� �� ��������� �+, ) �'5� �� � � ��� ���� ���������� *� ���������

���� � �� �� ��������� '��;�' ��� ��<��� � � /����� ������� �

��� � �'5� *��� #��������00�������0����0�C� ��� #�������0�0�00���0������C�� ����������� � ����������

#(/B#// ��� �(/"B�(1: � � �+5� ��<������ ������������� ��� � �

�������� ��9� � � ;�' ������ *�� #14 ���� ������ � � ������� �

��� +, �'5� *��� #����������0������00����C� ��� #��0�0�0����0�������������C�� ����������� � ������

����� "1�B"4( ��� �/4"B�/"! � � �+5� ��<������ �������������

��� � � �������� ��9� � � ;�' ������ *�� 11! ���� ������

'��;�' � � ��� ��������� �'5� *�� � ��� +, �������

������� ���� ����� � � ��������� ��9��> ������������ ##( ���

1#( ���� ������ ������������� � ��������� � � �������� � ���

�������� � ��� ����� *��� ����3�� ��� ����� �������� ��� ��'C��

����� ����������� 5�� �������)� � � ��<����� ��� ��������� � �

������� *��� ��3���� �� �������� ��<�������� ��� � � ���� ����

������3�� �� ����� ��������� � � � ��������� #14 ��� 11! �� �������

�� ;�' � ��� +, �+5�� �������������

� � ����� '� ������� ���� �� � � ������� *�� ������9�� ��

�������� ����������� ;�' �������� *�� ������� � ������� �#������00�����������������C� ��� #������0���0�������������0�C�� ����������� � ���������� �#"CB�4(1 ���

/1(#B/1/4� ������������� � � ���� ��<�����)�

� �� �� ��� ���� ���

� � ��������� *�� ��������� �� ��& /(�2 ����� �� �� :�1)

��������� ��2 2���/� (�#�2 ���9������� ���� ����� �������

������� �� �����) ��� (�#�2 � ������� ������ ��� D�����

������� ������� �� �����)� ����� �( ���-�� � �����B��D�

�����9��� � � ������� *�� �������� �� &������I� ����

�4/�#�2 ����� /H ����� ������ ���� ���� �(H �������� #H /�

��������� ���� (�(�H ���� ��� ����� � :�1)� ;����� �������

�"( �� ������ ��� ����) *��� ���������� �� ����� ������

���� ����������������� ��� ������� ����� �"H �������������)

��� ���������� �� � � ���� � � ������������� ��D�����

�������� �� ������������ �� � ������� ������ �((J � �

�� 1 ��� ���� � � ������������� ��D����� �������� �� ������������� *�� � �� ��� ���� ��������� #H �� ������� �-�����

���- �+��� A����) � ���- �������3� ������ �������� �� *��

��������� *�� � � 3��� ������� ������� ������� ��������

������� � > �(((� ,� ������ 2�� ���� 0������) �� 1 �� ������ ����� � �� *�� � � ����� ������� � �������� �������������-��

�������� ��0 �������� ������� � > /(((� ����� ��� FG) �

C(���� .����<������� � � ����� *��� �������� ����� � � �� �����

� ��������������� �������� ������ �8�& -��� ����� ��)� � �

������ ����� � �� ������������ *�� ��������� ���� �� �������� �

K���� 3��� �K�7��� A,��� G��-� A����) #BC( � ���� ��������

����������� �����

���� � ������������ ������ ������� *��� ������ ���9�� *�� ��

������ ����� ������������ �4(��E-�� ����)� ��� � � ����� *��

������� *�� 1H ���������� ��� �� (��2 � �� ����������

������ �� :�1) ��� � � ��������� ����� �� ��������� ��������� �G���

�� ���� �!"4)� � � ����� *�� ������ ��� 3��� *�� � � ���� ������

� �� ����� �� ��������� /1 � ����� ������� *��� ��-�� �� �����

�������� �� ����3�� ��� ������� *�� ������ ������� ��������

� � ���������������������������� ������ ��� � *�� ���� ��

����� ���� ������ ������� �� ��������� �5���� ��� �� ���� �!!/)�

,���D�� ���� ������3��9����� � � ��������� *��� ������� *�� (�CH

/7/���� ��� � �������� �������� ��������� ��������� ���������

*�� �(H ����� ������ ����� ��� ���*�� � ����� *�� ������

������� �������� ������� �� �H ����� ����� ������� �� 1 �������� �� ���������� *�� �H ����� ����� ������� ��� *��� ����

�� �������� ������� � � ������� � �� ������� *�� ������

������� ������� *��� ������� *�� ����������� ������ ��������

��0� � � ���������������������������� ������� ������� *���

�������9�� *�� C�C�����������9����� ����� ���� ����� �.����� .��&���� 27� F.�) ��� �������������� *�� �����������

%������

!"�� ���� � ���� � #�" ��� ���$ ��# ��� ����#�� # � ������ �� � ����� ���� ���

���� '5� ������� �� � � ��� ��������� ������� �� ��� ����

���� *�� ���� � '��;�' ����� � � ��� +, �'5� ����������

6����� � � *� � � ��������� � ��� +, �'5� �� � �

��������� ������� �� ��������� ������� ��� ����� �� � ���

������� ����� ����� � ������ � � �'5� *�� �������� �� � �

��������� ������� �� : ���� ���� � � � ���������� �6��� ���

���� .� ��� �,)� �� �� ����� ��� ����� �� � *�)� *����� �#����

2������� � ��������� �� 0+56 /(CC

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"

Page 3: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

��������� ������� ��� ���� ������� � � ��������� � �'5� ��

� �������������� ������� *�� � �����3���� �������� �� /1 � : �����

7� � � � �� ���� � ��� *�� � � ���� �� � � ��������� +,

�'5� ������� �� ��������� ������� ��� ����� +, �'5� *��

��������� �� � � � ���������� ���� �� ������� � � �'5�

�6��� ��� ���� .� ��� ��)�

� ��3�� � � �������� � ������ �� � � ���������

����������� � � ��������� � �'5�� =������ ��� ��������

*�� ������� ����� ������ ������� �������� 8����������� �

������ �� ��� ���� ��� ��������� �� � � ���������� � *� �������

"(�� ������ ��� ���� � � � =������ ��� ��������$ � ������ �� ���������� ������� �� L "(�� ��� ����� � ������ �� � � ���������*�� ���-���� ������� �� ��������� ������� ��� ���� *�� �� C ����

� /*��-� �6��� /� ��� ,)� ������� � � � �������� � �'5�

���������� � � ������ ��������� ������� � ���-������ �������*��� ���� �� � ������

! ��� ����� � �� ��� �# ��� # � �������� ���� � � ���� � #�" ��� ���$ "�� ����

���� '5� �� ��� ���� � � ��������� ������� C� 4 ��� �/

���� �� ����� ��������� ������������ 0+56 �(�#��E�&� /�&) � ����� ���� *�� ��������� � '��;�'� J� �������������6��� C�� ���� /) � ������������ �6��� C�� ����� �� C� # ��� :)

��������� ��� �� ������� � �'5�� �� � � �����������

��������� �� �������� � �'5� *�� �����3������ ��������� ��

4B�/ ���� ���� 0+56 ��������� �6��� C�� ����� 4 ��� "� ��� C�)�

* ����� 0+56�������� � �'5� ��������� *�� �� ������� �

M /1 ���� � � 0+56 ���������� �������������� � � ��������� �������

��� ������������ � �'5� ��������� CB: ���� ���� ����������

��� �� � �� �� C ���� ���� ���������� *�� �����3������ ������� ��

��(�� 0+56 ��������� �6��� C,� ����� 1 ��� 4� ��� C+)� * ������� ������������ �6��� C,� ���� /) ��� ������������ ���������

�6��� C,� ����� �� C ��� #) � *�� � � ���� �� � � ���������

� �'5�� ������� *�� ����� ������� ���� 6��� � ��� C+)�

� ��� ������� �������� � �� 0+56 ���� ������ � � ���������

6�0� �� 8��������� � ��� +, �'5� �� � � ��������� ������� ����������� ������� ��� ���� �� ���������� �� '��;�'� �+5� �������������� �� � � ��������� �� ������ ���� ����� ��� C� 4� �/� /1 ��� C�: ����) ���� � � ��� ���� *��� �����3�� �� C( ������ ;�' � � ���+, �'5�� ������������� ��) '������ ������� *��� ������� ����� �� �4H ������������� ��� ��� �������9�� �� �� ����� ������ D���������� � ������� � ���������� ��� ����� .) *�� ������� *�� �� : ���� ���� � ��������� * �� ��� �� ������ �������� +��� ��� �� �� ����������������� �� ����������� ������������ �, ��� �) N�����3����� � � '��;�' ���� � � �,) ��� +, ��) *��� ������� �� ������������ ������������� ��������������� ��*��� �5� ������ J����� ��4�)� +��� ��� ����� ������� �.82 �� ����������� ������������ .���������� �������� *��������� ����� �57J� ��*�� �� +������I� �����

6�0� /� � ������ �������� �� � � ��������� ������� �� ���������������� ��� ����� ��) ���� �������� � � ��������� ������� �������� ���� ����� ��� C� 4� �/� /1 � C� : ����� ��� /*��-�) ���� � � ��� ����*��� ��������� �� ����� ������ ���� ����������������� ��� ������� ������ ��*�� �� �������� �������� ����� ������ � ���������������������� � � ������ � ���������� ��� ����� .) *�� ������� *�� ��: ���� ���� � � �������� * �� ��� �� ������ �������� +��� ��� �� ������������ ������� �� ����������� ������������ �,) N�����3����� � �=������ ��� �������� *�� ������� �� ������������ �������� ����� ��������������� ��*��� �5� ������ J����� ��4�)� +��� ��� ����� �� ������ .82 �� ����������� ������������ .���������� �������� *�� ������������ �57J� ��*�� �� +������I� �����

/(C1 � 2���9�-� �� ��"

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"

Page 4: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

��������� � �'5� ������� �� � � ��� ����� ��� �� 0+56

������� � � ��������� � �'5� �� ����� �����

! ��� ����� � �� ��� �# ��� # � �������� ���� �� ���� #� � ���� � #�" ��� ����������� �����

� ������ � � �����9���� � ������ �� � � ���������� *�

������� �� ����� ���� ������ ����� ����� ������ �������

�������� �� � ���������� ����� �* � �������� ������� ���������

��� ����� *��� �������� �� � � ������ ��������� ��� �����

�6��� 1� ��� ,)� �� � � ����� ������� * �� �������� �� ����

��������� � � � ��� � ��������� ��� ������ *����� �#����

��������� ������� ��� ���� �������� �� � � ��������� �����������

� �������� ��������� � �� ����� � � ��������� : ���� ����

� � ��� ���� �6��� 1� ��� +)� � ��� ������� ��������� *��� �������

�� C ���� ���� ��������� ������� ��� ����� ���������� �� � � ���

������ ��� �� �� ��/� ��C � � � ������� ����� � � ���������

����� �� � *�)� �� ������� � � � �� ���� ���������� 0+56

��������� ���-���� ������� � � �������� � ������ �� �� ���

������� ��������� �� � � ��������� ��� ����� �6��� 18)� �� � �

������������ ���������� � � ������� � �������� �������

��������� *�� ������� � � �� � � ����� ������� �6��� 16)� ��

����� ����� �������������� ������������ 0+56 ���������

��������� � � ������ � �������� ��������� �� � � ������ ���

����� � � ���������� ��� �� � � � ������������ ���� ����� ��

� *�)�

6����� # � *� � � ������� � �������� ������ ��� 3���� �� � �

�� ����� ��� 0+56�������� ��������� ��� ������ �� ����� ����

������� *�� �� ����� � � ������� � *�� �����3������ ���������

�� ��� C ���� � � ��� ����� ��� � �� *�� ��������� ���� ��� ����

�� : ����� �� ������� � � � ����� ����� � � ������� � *��

�����3������ ������� � � � ����� �� � � � ���������� ����� ��

��������� *�� ��(�� 0+56 *�� �� : ���� ���� � � ��� ����� ��� ���������� ����� � � ������� � *�� �����3������ ��������� ��

��(�� 0+56 ���������� � ��� 0+56 �� ������ � � �������� � ������ �� � � ��������� ������� �� � � ��� ����� ��� �� 0+56

��������� � ������� �� � � � ���������� ��������

6�0� C� 8���� 0+56 � � �'5� ��������� �� � � ��� ���������� ��) � �'5� ��������� �� C� 4 ��� �/ ���� ����� ��������� ������������ 0+56 �(�#��E�&� /�&) �� � � ����� ���� *�� ������� �� � ��� � '��;�'� ������������ ���������� �� �� ����� �� C� # ��� :) ��� ����������� ���������� �� ������� /� 1� 4 ��� ") ������� � � 0+56�������� ��������� *��� �����3�� �� C( � /( ������ ;�' � � � ������� �'5�� ������������� .����� �������� ������ � ��� /) *�� ������� �� �/ ���� �� ���� ���.6� /�&) ���������� �,) �� � � ��������� ������� ��� ���� ������ 0+56 �(�#��E�&� /�&) *�� ����������� � � ��� � ��������� ��� ����� /(��� ���� � � ��� ����� �+5� ������� *��� �����3�� �� C( � /( ������ ;�' � � � ������� �'5��������������� ������������ ���������� �� �� ����� �� C ��� #) ��� ����������� ���������� �� �� ����� /� 1 ��� ") ����� � � 0+56�������� ��������� ��� � *��� � ������ ����� ��� ������ � ��� /) ������� *�� �� ���� ���.6� /�&) *�� ������� *�� �� : ���� ���� � � ��� ����� +��� ��� �� � ������� ���������� ������ �������������� �� ����������� ������������ �� ��� +) N�����3����� � � '��;�' ���� *��� ������� �� ������������ �������� ����� �����������������*��� �5� ������ J����� ��4�)� +��� ��� ����� �� ����� �.82 �� ����������� ������������ .���������� �������� *�� ������� ����� �57J� ��*���� +������I� ���� � � � ���� � *� �� � ��� �� .������I� ������ ��� ������������ ���� � � � ���� � *� �� +� OO&L (�(� ������� *�� � � �� ������������ �����PP&L (�(� ������� *�� � � ����� � � ������������ �����

2������� � ��������� �� 0+56 /(C#

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"

Page 5: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

(������� �

+������ ������� ���� ������� �� ��������� ������� ��� ���� ��

� �� � � �� ������ �� �� �������� �� � � ������������� ��/Q

����������� ��� ���������� �������� �������9���� ��� ������

���� �������� ��������� �� ��������� ��������� ������� ������ � �

��� ����� � � ������������� ����������� ��� ��/Q �� � -�� ����

�� ������� ����������� �� ���� �� ���� �!"4$ � �� �!"")� *�����

� � ��� ����� ������� ������� ���� ������� ��-�*�� =� ���

������� � � ����� �J��#!� * �� �� ����� � � '����� ��/Q

� ����� ��� ��/QE��2���������� ������� � ��� ��� ���� �����

������ �2���9�-� �� ���� �!!!�)� �J��#! �� ������ � � ������� ����

�� � � ��������� ��� ����� �� ��� ���� #(H ��*���

��������� ������� ��� ����� 7� �� ��/Q ����������� ��� ��

���������� ��������� ��� ������������ ��� �� �� ���� � � �������

���� ����� �� ������������ ��������� � ��� 3������ ������� � ��

��� ������) � ��� �������) � �� � �� �� �������� �������������

��/Q ��� �� ������� �� ��� ������������ ����� ������� �� *�� ��������

������� � �� +�� � � �������� ������ ���������������� ��������

�������� �� ������ ������ �������� ��������������� �� �������

�������� �7�� �� ���� �!!:)� �� �������� 2����� �� ��� ��!!:) �������

� �� ������������ ����������� � �� �� �����3� �� ����� � �

+� ����������� �� � � ��������� ��� ����� ��� �� �������� �

�������9���� � � +/ ����������� ��� � � �����<���� �������� ��

� � ������� +� � �� ����� ��*��� ��� ����� 2������ �� ��

���� ������� � �� �������� �������9���� ��������� � �'5�

��������� �� ���� ������ ���� ��� � �� '����� ��/Q � ������

������� � �� ������������������ ��������� � � +� � ������

������ �� ���� �!!")� � ��� ���������� ������� � �� +�� ������� �

� � ������������� ��/Q� ��� ��� �� �������� ��� �� ������� ���� ��

� � ��������� ��� ����� ��*��� ����� ��� �����

0+56� * �� ������ � � �������� ��� ��� ������ �����

�������� ����������� ������ �,��- �� ���� �!!#$ ���� �� ����

�!!#) ��� �������� �7���� ��� �� ���� �!!#$ ?�� �� ���� �!!#)�

�� �����3���� ������������� ����� � ��� ���� ����� ������� �� ��

���� ������� � �� 0+56 ������� ����� �������� ������� � � �����

6�0� 1� 8���� 0+56 � � ������ �� � � ����� ���� ������ ������ 2���� ����� � ����� ������� � � ��� ��������� ��� ����� ������� *�� ��������� ������� � �� �� ��� ,) � � � ����������� �� ��� +) ����� ��� ����� ��� �8 ��� 6) ��� ���� ������� *�� 0+56 �������� ��� � � ��� � ����������������� �� � ��� 8) ��� ��� ������������� ����� ,� + ��� 6) ��������� ��� ����� ������������ *�� �� ���� ���.6� /�&) � 0+56 �(�#��E�&� /�&)� . ���������� ��� ����� ���� *��� �������� *�� �� ���� ��� � � ��� � ��������� ��� ������ 2���� ����� � ��� �� � ������� ���������� ��� ��� �������������� �� ����������� ������������ .���� ���� /(���

/(C4 � 2���9�-� �� ��"

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"

Page 6: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

�������� �=��� �� ���� �!!:) ��� ����� ���� �� ���� �!!:) �������

�� ������ �������� ������ �������� ��� ���-� � � �������� ������

���� � �� ���������� ������ �������� ������ ������� ���

��������� �=��� �� ���� �!!:)� �� �� ��� ���� ������� � �� ����

0+56 ��������� � � � �������� ����� ������� � � ��������

��������������� � ��������� ���8) ��� ��������C ��;;C/)� * ��

��� ������� � ��������� ������� ��� ��D������� �6���������

������� �� ���� �!!1$ =��� �� ���� �!!1)� ������� �� ���������

������ �������� ������ ������� �� ���� �G�����*� �� ���� �!!")�

������������ �� �� ���� ������� � �� 0+56 ������� � � ��������

������� �������� +� ������ �� ������� �� ���������� �������

�����-�� �� ���� �!!:)� '�������� *� ��� ������� � �� 0+56

������� ������� ������� ������� ���� � * �� ��� ������� �������

� ������� ���� ���� �� ���������� �� �� ���� �������� � +5�

������������ �� � � ��������� ��� ����� ��*��� ���������

������� ��� ���� �2���9�-� �� ���� �!!!�)�

�� �� -�*� � �� 0+56 ��������� � � �������� � �� � � �������

������ ������� 0+56 ������� �������� +� ������ �������

����������� ��� ������������� ��������� 4� ������������

�G����� �� ���� �!!:$ .���� �� ���� �!!#$ � ��&������� �� ���� �!!:)�

����������� �������� ����� ���1�� �������/�C�4������ ��������

���� ����� �� ���� �!!#)� � ������������� ����������� � �

������ ������� ������ �,��- �� ���� �!!#)� � ��� � � ������������

�� 0+56 ��� �� ������� �� ��������� ������ � � ����������� �

� � ������� � ����������� � �������� �� ������� � � � ��� ����

������� ��� �������� +� ������ � ������� ������� � 4�

�������������

�� � � ������� ������ *� ������������ � � ��������� � �'5� ��

� � ��������� ������� �� ��������� ������� ��� ���� ��� � �

����� 0+56 � � � � �'5� ��������� ��� ������ ������� =�

��� � �� ��������� ������� ��� ���� ������� � �'5� ���������

�� � �������������� ������� *�� � ���- �� CB: ����� �� � �

���������� ��� � �� � � ��������� +, *�� �� � ������

&����� �� -�*� ���� � � �������� +, � �� �������� ��9��� �

�������� ���� ������ ����� ������ ��� ���� ��� ������������$ ���

�������� ��� � ��� ��������� ������ ����� ��� ���� � ���- �� ����

�!"4)� � ��� �� ����� � �� � � ��������� +, �'5� ��� ��

� ���� ������ ��������� ������� ��� ����� 7� � � � �� ���� � �

������ � ������ *��� ��������� �� � �������������� �������

������� � � � ������ � �'5�� � ��� 3������ ��������� � �� +�

����� �� �������� ��� �� ������� ������� ���� ������� �� ���������

������� ��� ����� �� ��������� *�� ������� ������ �'�� ����

�� ���� �!!C$ ?����� �� ���� �!!1$ 2����� �� ���� �!!:)�

����� ��������� ������������ 0+56 ���(��) � � � ����� ����������� � � ��������� � �'5� *�� � ���- 4B�/ ����� �6��� C�

��� �)� �������������� �� ������ � �� 0+56 ��������� �������� � ��

�� ���������� � � ��������� ��������� � �'5� �� CB: ����

��*��� ��������� ������� ��� ���� �6��� C, ��� +)� � ������ � �

����� 0+56 � ��� ������������ � �'5� ���������� *� ����

�������� � � ����� 0+56 � � �������� �� � � ���������

������� �� � � ��� ����� ����� � ��� � ����� ���� ��������

��� ������������ � �������� *�� ���-���� ��������� CB: ����

���� � � ��� ����� �� ��������� *�� � �'5� ���������� � �

������� ��������� *��� ����������� � ��� �� � � ��������� ���

������ � �� � �'5� ���������� * �� �������� � � �������� +�

������� ����� �� �������� ��� �� ������� ���� � ������� �

��������� ������� �� � � ��� ���� *�� ���������� ����� �� � � ���

������ * ��� ������� ������� ���� *�� �������� �� �� ����

������� � �� ��������� *�� .G6C"C!C �� +� ������� ������)

����������� � � ��� ������������ �������� �� � � ��� �����������

�������� �� ��� ��������� ������ �?����� �� ���� �!!1)� 2������

���� ������������� �������� �� +/ ������� ���������)

����������� ��������������� �� � � 2������ ������ �2�����

�� ���� �!!:)� � ��� ��������� +� ��� �� �� ����������� ���� �

������� ���� � �� ������� � � ��� �������� ��������� *�� 0+56

���-���� ��������� � � ��������� �������� � �� � � ����

������ ��� ������ ��� �� 0+56 ��������� � � ��������� � ��

����� ������� �6��� C� ��� �)� � ������ 0+56 ��� ������� � �

��������� � �'5� �� � � ���������� 0+56 ��� � �� ����

������� ���� �� ��� �� �������� � � �������� ���� ������) �

������) ��� �� ������ ���� ��� �������� ��� ��� �� �������� � �

��������� ��������� � �'5�� 8���������� ��� �� ����

������������� +� �� ��� �� ������������E������� ����� ������

�������� � ���� ������� � �������������� +���������� �����

��� � � ��������� � ��� �� �������� 6��� �� ������� ��� ������

� ���� � 3��� ���������

� � 3������ �� � � ������� ����� � * � �� � � ��������� �

�'5� ��� ������ �� � � ��������� ��� ����� *�� ������� ��

��������� ������� ��� ����� ��� ������� � �� 0+56 �������� � �

��������� � �'5� ������� �� � � ��� ����� �� �� �������� � ��

0+56 �� � ������� �� ����� * �� �� ����� ������� ����

��������� ������� �� ��������� � � ��������� � �'5� ��

� � ����������

$��� &��"������

=� � ��- +�� 6���� ��� . ���9� �+��������� 2������� ��� ��������;�� ���� 0������� .� � 2�������� --��� F���������� .�����A����) � � ��� ������� � �� *�- *�� �������� �� � 0����������� �.������3� '������ �� � � 2������� 8�������� .������� .���� ����������� A�����

$�������� ��

��.6� ������������ D���$ +�� �������$ +, � ������� �� ���������$0+56� ����� ���� ������������ ������� �� ����$ '��;�'� ������������������� ��� ��������� � ��� �������$ � � ������� ����������

6�0� #� N����������� �������� � *� � � ������� � �������� ������ ���3���� �� � � ��� � ��������� ��� ������ J� ���� ���.6� /�&)������������ �����) ��� 0+56 �(�#��E�&� /�&)�������� ������ �����) ��������� ��� ����� ����/) *��� �������� *�� �����������������*��� �5� ������ J����� ��4�)� +��� ��� ����� �� � � ����� �.82 � ��� � ����� ����������� ����������� ������� �� ���������� O&L (�(#�OO&L (�(� ������� *�� � � �� ������������ ����� .������I� �������P&L (�(#� PP&L (�(� ������� *�� � � � ���������� ����� �57J� ��*���� +������I� �����

2������� � ��������� �� 0+56 /(C:

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"

Page 7: Glial cell line-derived neurotrophic factor modulates ischemia-induced tyrosine hydroxylase expression in rat hippocampus

%��������

���� G�� ���� �� �� % ������� ?� ��!!:) ���������� ����� ����� �������� ���������� ����� ���� ������������ ������� �� ���� ����������� ��� ������ ������" '���"� ���� C:B1(�

,�-��� ��A�� R��*� 2� �� .� ������ 2�.�� ?�-� � ��&�� .-������� .�'��.������� +� �� &����� ���� % G��9���-�� '� ��!!�) � ����� ��������������� ������������ ���������� ���������� �������� ���������������� ��� ������� ���������� ���� ��������� ����� ��� ���� �� � ������� ������ �" ������("� ��� �C:(B�C:!�

,��-� G�+�� J�������� A�� ������ ��� ;������ G�� 2��� ,�� J������� '����'���� ��� �� % ���� 6� ��!!#) 2������ ���� ����������� �������������� �� 0+56 �� ������������� ����������� �� � � ����� ������ ����� ���� CC!BC1��

, ���*��� ��� ,������� ��� 2������9������ A� % =���������� A� ��!!()��� ���� �� � � ����� ��������� �� ��������� *�� ����� �������������������� ������� ��� �������� ����� �" ����" )���("� ��� �!#B/(��

,*��-���� G�8�� &��� �-� ;���� ��� ,�A�� 2������ ;�A� % ,��-��� ;�����!!:) ���������������������� ����� ���� ������������ ������� �� ����������� ��� ������ ��� ������� ������������ ������� ������ ������������� 4� ������������ ������� ����� �*�" ����"� ���� �(1B��:�

,���,���� ��� ,�� ���� J�&�� ���� ��� '���� ��� �� % +������ ��2���!!#) 0+56 �� �� ���������3� �������� ���� � ������ ��� �������������� ����� ��� �B/(�

� ����� A�?�� ,�������� A�J�� 2����� ��+� % &��� �� ��!"4) ������� ������ ���� ������� �+ ����" �" �� "� ���� �4:(B�4:4�

� �� +�=� ��!"") ���������������� �����������> �������� �� � �����3�� ����� ����� ��� ��� �� ��� ���� ������� )�� � ������"� ��� 14#B14!�

� �� +�=� % '� ���� .�2� ��!!() � � ��� ��������� ����������� �� ��������� ���� ������� ���� � ����" ���" ������"� ��� �:�B�"/�

� ��&�������� +�&�� &��� N�� � ���� ?�� � ����� ?�&�� ��� ��2�� 2 ������ �� +������� ,�&� % , �� 2��� ��!!:) +���������� ������ ���������� ����������� �� 0+56 ���� � ������ ,������� ���� "C"B"1��

������ 8�� J���� ,���� &��� A�=�� 6���9��� &� % ,�-��� � ��!!") ������� ��������� ��������� �� ������� �������� ������ ����> '�� '������������ � ������� �" ������"� ��� :4C"B:41!�

����-��� 8�+�� R�*���� =�2� % 6����� ��'� ��!!:) 0+56 ������� ����������� ������� ������� �� ���� �������� ����������� ������ �� �������� )����� ���"� ��� /(:B/�(�

������������ 0�&� % &������ '���A� ��!"!) 8�������� ���� ���� �������� ��� � ���������� ������� ������ ������� &��(����" ���"� ��� �1CB/�(�

8������� ��� ����� ��� ��� ,�A� % 7���� &� ��!!#) 0���� ���� ������������������� �� ���� ���������� 3��� ������ ��� �������� �� �������������� �� ����� ���� ������� �������� �" ������" ���"� ��� /:4B/"1�

6����������������� ��� &��*��-� 0� % �������� 8�.� ��!!1) �;;� C/� � ���� ���� ������� ������ *�� ���� � ����� ������� ������� �������� ������ ����C ��� ��������� ��������-��������������� ��9���� �"-���" ��("� �� C(:4�BC(:41�

0�������� ��� ������9�� '�� ;������� �� % ;����������� J� ��!!1�) � ���������� � � ���� ������ 3��� ��") � � � ��������� ������ �� � ����� ,��" ������" ����"� ��� C#(�

0�������� ��� ;��-���� 2�0�� �������� 8� % ;������� �� ��!!1�) ������������� ��������� ������� ��������� �� � � ������� ��������� ���� � � � ��������� ������ �� � � ���� -��� ���" -���"� ��� 11#B1#/�

0�������� ��� .����� ��� ������9�� '�� ;������� �� % ,����� A�+� ��!!4) .����������� ���������� ������� �� ����� � � ��� �������������������� ������ �� � � ���� ����������� ��� �(C:B�(11�

0�������� ��� J������ ��� ������9�� '�� �������� 8� % ;������� �� ��!!1�)��������� ����������� ������ ����������� � � ��������� �������� � � ���> � ������� ��������� ������� ��� ����� ���� ������ ������-��� ���"� �� :�B:!�

������� �� &� ����� ��� .�������� 2�� 5������ ,�� A������ �� % ��������� �� ��!"#) ��� ������������ � �� �� ������ ��� ������������� ����� �� ������ � ������������� ������������ �" ���" -��� ���+ �����"� �� 1�CB1�!�

���-� .���� ?� ���� .�� ,���� '� % 0�������� 2�+� ��!"4) 2���������������������� �� ����� ���������� ������� ��� ���� ��� �����������������> ��������� ����������� ��������� �������� �� !:�B!:4�

��� ,�A�� ���� ��� ,*��-���� G�� ������ ;�� ����� A�� 2������ +��&��� &��6� � % 0�� ����� 0��� ��!!1) 0���� ���� ������������ ������� ������ �������� ������������ ������ � �������� ����������� ������ ������� ������" '���"� ���� �(:B����

������ ��� ��� ,�� .�������� ��� ,�-��� � .�� ������� 6� % 7���� &���!!1) 5����� � � ��������� ������ ������� ����� ���� ������������������� �� ���� ��������� '5� �� ������� � -������������������������ ������"� �� :!�B:!#�

G������ ��2�� ����� =���� .��� G�� G������ '� % 0�� � +�2� ��!!:)0+56 �������� ������� 4�7 +�> ���� ���������� ��� ��<�������� ������� ���� ����� �" ������"� ��� :���B:��"�

G�����*�� �� ���� �� ��� 2������� ?�� G��� 5�� ������� ?� % ���� G���!!") '������� ��� ���� ����� ������ �� ������ ���������� ����� ���������������� ������� �� ���� ���� ��������� ������ �������� ������������� �� ����� ,��.�� �� �1�:B�1//�

G���� ��� =���� � ��=� % .����� ,�G� ��!"4) � ���� ������� ���������������� ���������� ��� ���� ������� �������� �" ���" -��� ���+�����"� � C!#B1(1�

2������ 2�� G����� A�;� % &������ ,�8� ��!!:) ;�������� ����� ���������� �0,' �/!(!) ������� ��� ������������ ������������ ������������������ �� � � ������ ���� �������� ��� ����� &��(���"-�����(" -����"� �� :/:B:C#�

2������ +�� 2������ 0�� '����� �� 2� % '������� +��� ��!!#) ;���� �� ����������� ����� ������� ������� �� ���� ������� -����� ���� �����������9���� �� � � ���� -��� ���"� ��� �:/B�:"�

2���9�-�� �� 7-���� ?�� 6����� ?�� 5���� ���� G� % 5����� ?� ��!!!�)0���� ���� ������������ ������� �� ���� ������� ������� ������� ����������� ���� ��������� ������� ��� ���� �� ����� ����������� �� 41CB41:�

2���9�-�� �� ����-�� .�� 6����� ?�� . ���9�� G�� 5���� ���� G�� G�������� ��2�� F� ���� ��� 7-���� ?� % 5����� ?� ��!!!�) 5������������ ����� � �� ����������� ����������� ��1��� ����/�4������ ���1��C������ ����)BC�#�������������������� ���� ��� �� 4��#�� �����C�����9�����) ��������� ��J��#!)� � ��� ��� ���� ����� ������� '��� ,��"� �� "4!B":"�

5���� ���� G�� R�����-��� A�,� % &���� 2�A� ��!!/) J������������ ������ ������> ��������� *�� � ��� ������ ������ �" ���������" �*�" ����"���� �(�B�(!�

7��� +�� R��� ��� ,��9����� ��� 0����� .�� 0������ 8�� � ���� �� %2������� 8� ��!!:) +�������������� ������� ������� �� ;��/ �����$������� ����������� � � � ������ ;��-����I� �������� ������("/��"� ��� /(:B/�4�

7���� ���� '�=�� ����� &�A�� A ���� A�8�� &��� &��6� �� &�� &�� &� �����5�*���� ��&�� ;�������� +�2� % =���� .� ��!!#) +�������� ��������� ������� �� ��������� ��� ������������� ���� ���� ��0+56� ����� ���� C11BC14�

;������ 0� % =����� �� ��!"4) )�� ��� -��� �� ,������*�� �� �������/�� ���� �������� ;����� 5�* ?�-� �� "!�

;���������� =��� % ,�������� A�,� ��!:!) � ��* ���� ��������� ����� ������� ���� �� � � ������� ���9�� ���� ,��.�� ��� /4:B/:/�

'�� ����� +���� 7�������� � ��;�� A ����2��� ��� ����-��� .�� .���� &�% ���9�� 0� ��!!C) 8��� ����� ��� ����� ����� ��������� ������������������ � ����� ������� ����� ������� ��� �����<�������������� ��� ��������� ��3����� �" ������("� �� �"(�B�"(:�

.����� �� '�������� �� % ,��-����� �� ��!!#) 0���� ���� ������������������� �� ���� ��� �� ���������� ��*� ���� �C �������� ������������������ ������ ����������� ������ ��*��� �������� 4� ������������ ������� &��" ��� ��� " ,��" 0,�� �� "!C#B"!C!�

.*����� &�=� ��!"/) � � �������� � � ������� ��������� ���� ����������� ������> � ������� D�������� ��������� ������ ��������D��������� ����� �� � � ���� -��� ���" -���"� � C/�BC#C�

����� ��� &���<����� 8�� &��� &��6�� 7����� .�7�� ?���� +�� ��� ,�A� %7���� &� ��!!#) ;������� ��� ������ � � ������������ ����������������� �� 0+56 �� ����� ����� ���� CC#BCC!�

=���� ?�� &��� .��R�� � ��� ���&�� =�������� &�'� % ��� ,�A� ��!!:) 0�������� ������������ ������� �� ���� ������� ������� ��� ������������������ �� � � �������� ������ �" ������"� ��� 1C1�B1C1"�

=���� &�� 2����� 2�� ,������� &�� R �� � % ?���� A� ��!!1) �� ��� �� ���E����C�������� ����� ������ �� ������� ��� �������� ��������� ��������� ���� ���� � ���� ��� :C!B:#(�

?������ ?�� ����-�� ��� . ������ .� % =�������� .� ��!!1) ���������� +� ������� ������� ��� ����� �� ��� ������������ ���������� �������������� 3��� ���-�� �� ��� ��������� ������� -��� ���"� �� �#�B�#1�

?��� N�� 2�� ���� �� % &��9� 7��� ��!!#) /� ���� ������� �� ����� 0+56 � ������� ��� ����� ����� ��� ������� ����� ���� C1�BC11�

/(C" � 2���9�-� �� ��"

� /((( 8������ 5���������� ���������� ������� ������ �� ����������� ��� /(C/B/(C"