Produção deGlucose Oxidase

Glucose Oxidase

Fontes: • Aspergillus niger (principal);• Penicillium notatum;• Penicillium glaucum;• Penicillium amagasakiense;• Penicillium purpurogenum

• Obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da produção de gluconato

Glucose Oxidase

• Catalisa a reação:

Fig. 1. Representation of the GOD reaction (Witt et al., 2000)

Glucose Oxidase

• É produzida tanto no meio intracelular quanto no meio extracelular, e ambas contribuem para a produção de ácido glucônico.

Glucose Oxidase

• Enzima de grande interesse e importância para as indústrias alimentícias, farmacêuticas e em pesquisas científicas.

• É utilizada em análises clínicas como principal reagente para a determinação dos níveis de glicose sanguínea devido ao seu custo relativamente baixo e a sua boa estabilidade.

Glucose Oxidase

• Na indústria alimentícia, a GOD é empregada como antioxidante evitando alterações de cor e sabor dos alimentos devido à presença de O2.

• Tem sido usada, satisfatoriamente, para remover resíduos de glicose e oxigênio em alimentos, com o objetivo de aumentar a sua vida de prateleira.

Glucose Oxidase • Na indústria de vinho, seu papel é diminuir o

teor alcoólico, pois é capaz de remover um pouco da glicose, a qual posteriormente seria convertida em álcool.

• Estudos mostram que vinhos tratados com glicose oxidase têm um teor alcoólico 2% menor. Além disso, essa enzima possui efeito bactericida, sendo assim, a necessidade de conservantes é menor.

Glucose Oxidase

• Pode ser usada como anti-microbiano em produtos de higiene oral. A cavidade oral abriga várias espécies de estreptococos, como o Streptococcus mutans, que é um importante contribuinte para a cárie dentária. O H2O2 produzido pela glicose oxidase age como um útil bactericida.

“Up-stream” 1. Escolha do microorganismo: Aspergillus niger

2. Preparo dos meios: Meio de Ativação – Meio inclinado de PDA (Ágar Batata Dextrose)

- Infusão de 20 g de batata- Dextrose ou Glucose- Ágar- Água destilada

“Up-stream” Meio de Esporulação de Moyer et al.

- Infusão de 20 g de batata- Dextrose ou Glucose- Ágar- Água destilada

“Up-stream” Meio de Germinação de Moyer et al. – Meio de

Propagação

- Água de milho ou Peptona- Glucose- MgSO4

- KH2PO4

- (NH4)2HPO4

- Uréia- CaCO3- Cerveja- Água destilada

“Up-stream” Meio de Fermentação de Moyer et al. (pH 6,0)

- Glucose- CaCO3- Borato de sódio- MgSO4

- KH2PO4

- (NH4)2HPO4

- Uréia- Peptona

“Up-stream” 3. Preparo do Inóculo: • Ativação do Aspergillus niger em meio

inclinado de PDA esterilizado. Incubou-se a 28o C por 72 horas;

• Inoculou-se o Aspergillus niger ativado no meio de esporulação de Moyer (frasco de Roux) e incubou-se a 25 - 30oC por 5 a 7 dias;

“Up-stream” • Preparo da suspensão de esporos: foi

adicionado assepticamente ao frasco de Roux contendo os esporos, 20 ml de água deionizada estéril para ressuspender os esporos;

• Filtrar em funil de vidro com gaze adaptado a um Erlenmeyer, na capela e utilizando apenas materiais estéreis;

“Up-stream” • ??????????????

“Up-stream” • Realizou-se a contagem de esporos/mL

de filtrado em câmara de Neubauer;- Contagem de células em grande número

“Up-stream” • Determinou-se o volume da suspensão de

esporos a ser inoculado no meio de Moyer et al. para germinação:

“Up-stream” • O volume anteriormente calculado foi

inoculado no meio de germinação de Moyer et al., e incubados sob agitação (200 r.p.m.) por 48 horas;

• Transferiu-se a cultura para um frasco de 2 litros contendo 500 ml do meio, mantendo as condições de aeração e agitação até o dia seguinte;

“Up-stream” • Repetiu-se a operação até obtenção de

volume de inóculo suficiente para a produção em biorreator.

4. Produção em Biorreator: • O biorreator, os equipamentos auxiliares e

os materiais necessários foram devidamente preparados e esterilizados

- Manômetro- Tacômetro- Eletrodo + pHmetro- Bomba peristáltica- Manta elétrica- Coletor de amostra

“Up-Stream” • O meio de fermentação de Moyer et al. foi

adicionado ao biorreator e inoculado com o Aspergillus niger obtido na propagação com cerca de 10% do volume a ser trabalhado;

“Up-Stream” • Temperatura de 30oC• Agitação de 200 r.p.m• Aeração• pH inicial CaCO3 a 30% • Solução de Borato de sódio• v.v.m. :

“Up-Stream” 5. Amostragem:

– Coleta de 50 mL de amostra– Após homogeneização: Tempo zero– Intervalos de tempo (± 6 horas) – 4 dias

“Up-Stream” • Amostragem:

– As amostras coletadas eram identificadas (GO0 – GO17) e registrados o pH, temperatura, agitação e aeração correspondentes ao tempo da coleta;

“Up-Stream” • Amostragem:

– Filtrou-se as amostras através de gaze. O filtrado (enzima extracelular) era coletado em frasco rotulado e identificado e armazenado em congelador;

– Os micélios retidos foram lavados, retirou-se o excesso de água e transferiu-se para papel alumínio contendo folha de PVC onde foram embalados e levados para o congelador;

“Up-Stream” 6. Análise das amostras:

– O peso seco e a acidez total (ácido glucônico) foram determinados na produção de gluconato;

– De cada amostra coletada, determinou-se a [açúcar redutor], a atividade da enzima intracelular e extracelular e, o teor de proteínas;

– A partir das análises, calculou-se as atividades enzimáticas

“Up-Stream”

“Up-Stream”

“Up-Stream”

“Up-Stream”

“Up-Stream” • Término da produção:

– Tempo 105 (horas)

• Volume final no biorreator: – 8,9 L

• [Gráfico peso seco]

“Down-Stream” • A recuperação de enzimas ocorre através

das etapas de extração e purificação

• Na extração da enzima intracelular, usou-se areia (2x o peso micelial) para romper os micélios (método de cisalhamento) . Adicionou-se um tampão (6x o peso micelial) e triturou-se até obtenção de um material líquido;

“Down-Stream” • Transeriu-se o material líquido para um

tubo de centrífuga e centrifugou-se por 5 minutos a 1000 r.p.m.;

• O sobrenadante foi transferido para um tubo de hemólise = EXTRATO BRUTO.

Purificação de Enzimas

Purificação de Enzimas

Purificação de Enzimas • A pureza da enzima é determinada

através de eletroforese de proteínas

• Consiste na aplicação de um campo elétrico numa matriz sólida (gel de poliacrilamida) e baseia-se na migração das moléculas em relação a um campo elétrico, devido à sua carga.

Purificação de Enzimas • O gel funciona como uma peneira

molecular, permitindo a separação das macromoléculas por peso molecular

Biochemical Engineering Journal 40 (2008) 54–63

Joint effect of nitrogen and phosphorous on glucose oxidase production by Aspergillus

niger: Discussion of an experimental design with a risk of co-linearity

J. Mirón, J.A. V´azquez, Ma.P. González, M.A. Murado

Materiais e Métodos• Aspergillus niger CBS 554-65• Cada unidade do experimento foi

inoculada em uma solução de esporos até a concentração requerida pra se obter uma população inicial de 0,5 x 106 esporos/ml

• Temperatura: 30ºC• Agitação: 200rpm

Materiais e Métodos• Componentes básicos do meio:

- Glicose (120g/l)- Carbonato de cálcio (22,3g/l)- Sulfato de Magnésio hepta-hidratado (0,1g/l)

• Como fontes de nitrogênio foram usados:- Nitrato de Cálcio- Peptona

• Como fonte de fósforo:- Bifosfato de Potássio

Materiais e Métodos• As concentrações de nitrogênio e fósforo

foram realizadas da seguinte maneira:- Cominação de níveis iniciais de nitrogênio de 350. 650, 950 e 1259 mg/l com 30, 80, 130 e 180mg/l de fósforo- Concentração de 800 e 150mg/l de N e P, respectivamente

Resultados e Discussão• Resultado expresso em N2P e NP2

(parecem mais realísticos)

R2 ajustado = 1 - (ESS X ʋT/ TSS X ʋE)

Resultados e Discussão

Conclusão• A produção de Glicose Oxidase é

dependente da origem da força de nitrogênio;

• Fontes de nitrogênio inorgânico melhoram a produção de glicose oxidase, em relação a nitrogênio orgânico;

Conclusão• Na presença de nitrogênio orgânico, pouca

variância de resultado é observado com o aumento na concentração de fósforo;

• Na presença de nitrogênio inorgânico, a produção de glicose é optimizada quando há um aumento na concentração de fósforo.