gráficos señores )ernando y emilio cazorla

1 2

En la senda mencionada, la revista ha venido cumpliendo su objetivo primario, diferenciado de las revistas de las sociedades científicas e instituciones de salud que publican el resultado de los ensayos, investigaciones y novedades de sus miembros para sus propios especialistas y -más bien- dirigir su interés hacia los profesionales con menor acceso a los avances de la medicina, abocados a su rutina diaria en sus hospitales y consultorios, muchos de ellos en la periferia o en zonas alejadas y, por tanto, con escasas posibilidades de mantenerse al día -por problemas pecuniarios o de distancia, cuando no por la temática super especializada que los congresos abordan.

Es a ellos, a los médicos generales principalmente, aunque no exclusivamente, que la revista viene dirigiendo sus textos desde su fundación, priorizando simposios estructurados con meses de anticipación, que revisan enfermedades y problemas afines, temas vinculados a la patología y a las necesidades de salud del país, porque sabemos que ello redundará en su actualización permanente y, por ende, en la calidad de la prestación de sus servicios. Sin que por ello omita publicar trabajos originales, de revisión, comentarios médicos, perspectivas y otros temas de interés general.

Para garantizar su calidad, el Comité Editorial se preocupa por remitir los temas a publicar a la revisión por pares -peer revie ers- quienes aconsejan a los autores -de ser necesario- las ampliaciones o correcciones pertinentes, que además, ayudan a mejorar destrezas. A esos colegas que con diligencia y gentileza se brindan a revisar anónimamente los temas remitidos, les expresamos nuestro agradecimiento y gratitud.

En igual forma, agradecemos al Consejo Directivo de la undación habernos permitido acompañarlos a lograr el cometido de difundir ciencia a la comunidad médica nacional. A los directivos de la Asociación de Laboratorios armacéuticos del Per (ALA A PE) por su permanente y desinteresado apoyo durante cuatro décadas, asimismo, a todo el personal en las labores de apoyo, la Sra. Noemí yola inces así como a los editores

gráficos señores ernando y Emilio Cazorla igueroa.

Sin embargo, toda publicación no es posible en el tiempo sin la fidelidad de la lectoría, los anónimos leyentes que nutriéndose de los textos reconocen lo que ponemos a su disposición, y es por ellos por quienes el Cuerpo Editorial se re ne mensualmente a dirigir y gestionar la programación, revisión e impresión de los textos, actualmente los doctores olando Calderón, austo armendia, Melitón Arce, José Aliaga, uido Perona y los suscritos.

Un reconocimiento especial para los Editores Invitados, quienes recibiendo el encargo de convocar y desarrollar cada simposio, reuniendo a quienes a su criterio son idóneos para el tema a tratar, se preocupan por dirigirlo, es decir, en dar las pautas para su mejor consecución y primordialmente, porque su contenido esté en concordancia con el avance del conocimiento en la materia, antes de ponerlo a disposición del Cuerpo Editorial.

inalmente, y no por ello menos importante, es ocasión de rendir nuestro homenaje y agradecimiento a quienes participaron en el primer n mero de DIA N STIC , colegas que, sin conocer lo que vendría, creyeron en los objetivos que les presentamos, esencia de lo que significa la pedagogía científica en su más amplia dimensión.

ememoramos esa edición príncipe que abrió con un Homenaje a Daniel A. Carrión por el Dr. César

apata argas al cumplirse en 1 77 2 años de su holocausto y, seguidamente, el tema de fondo sobre Hipertensión arterial enfocada desde el ámbito

multidisciplinario que la enfermedad ha exigido siempre, más allá del cardiovascular, participando los profesores doctores: scar Situ, como Editor Invitado, Carlos Monge, Luis uiz, Amador Carcelén, Eduardo otuzzo, Armando idalón y José Calderón. A todos ellos les reiteramos una vez más nuestra gratitud de siempre.

Nuestro agradecimiento a todos ustedes.

Nelson Raúl Morales Sotoller o ro ara

1. Mejía A. Educación continua. Educ Med Salud, 1 6;20(1):43.

X O L

u es, 05 de m r o de 2018 08: 0:1 .m.

1 3

esumen

sal s er ana L. Aguaymanto es una planta oriunda del Per con presuntas propiedades anticancer genas. El ob etivo del estudio fue evaluar el potencial antiproliferativo del aguaymanto sobre l neas celulares de leucemia mieloide crónica K y fibroblastos de ri ón de mono VE . A los cultivos se les a adieron los tratamientos de aguaymanto , 1 , y g ml y cisplatino . , . , 1. y . g ml . e analizó el poder antiproliferativo mediante viabilidad celular conteo celular y ensayo M , Kruskall allis, p . y la apoptosis con genoto icidad celular mediante el promedio de n cleos da ados ensayo cometa, AN VA, p . . Los resultados mostraron ue el potencial antiproliferativo y genotó ico fueron dosis dependientes a la concentración del tratamiento y ue el aguaymanto mostró mayor efecto menor viabilidad celular y m s n cleos da ados en la l nea K ue en la VE . La concentración inhibitoria media del aguaymanto para las l neas VE y K fueron de . y . 1 g ml respectivamente y el ndice de selectividad fue 1. . Esto nos sugiere ue el aguaymanto tiene mayor potencial antiproliferativo sobre la l nea K ue sobre VE . Los resultados son satisfactorios y nos sugieren continuar estudios sobre las bondades medicinales del aguaymanto como fuente potencial de compuestos bioactivos terap uticos.

ala ras la e salis e u ianaL., cis latino otencial anti oli e ati o enoto ici a

1. ntroducción

En la medicina tradicional las plantas han sido utilizadas durante muchos siglos de forma intuitiva y empírica por sus presuntos beneficios, sin embargo poco es el interés que

se muestra por realizar investigaciones científicas que puedan 1comprobar sus propiedades naturales . Los extractos vegetales

se utilizan debido a que aparentemente poseen estructuras capaces de producir un efecto fisiológico que tendría más de un

2mecanismo de acción . Por todo lo expuesto sería muy

alia ioleta u a i ancilla a n ea ue as illa icenciol e to nesto e oto a o a a n lica iles alle os

a o ato io e en tica u ana aculta e iencias iol icas a o ato io e en tica aculta e ienciasiol icas alia ot ail co

Abstract

sal s er ana L. Aguaymanto is a native plant of Peru ith presumed anticancer properties. he aim of the study as evaluate the antiproliferative potential of aguaymanto on chronic myeloid leukemia cell lines K and monkey kidney fibroblasts VE . he treatments of aguaymanto , 1 , and g ml and cisplatin . , . , 1. and . g ml ere added to the cultures. he antiproliferative po er as analyzed by cell viability cell count and M assay, Kruskall allis, p . and apoptosis ith cellular genoto icity by the average of damaged nuclei comet assay, AN VA, p . . he results sho ed that the antiproliferative and genoto ic potential ere dose dependent to the concentration of the treatment and that the aguaymanto sho ed greater effect lo cell viability and more damaged nuclei on the K line than on the VE line. he mean inhibitory concentration of aguaymanto for the VE and K lines ere , and , 1 g ml respectively and the selectivity inde as 1, . his ould indicate that the aguaymanto has a greater antiproliferative potential on the K line than on the VE line. he results are satisfactory and suggests us continue studies on the medicinal benefits of aguaymanto as a potential source of therapeutic bioactive compounds.

e or s salis e u ianaL. cis latin anti oli e ati e otential cellula enoto icit

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88231 Revista Diagnostica Febrero.indd 7 12/03/18 9:56

1

necesario investigar y aislar los principios activos vegetales responsables de tales efectos con el objetivo de poder crear

3nuevos fármacos hechos en base a extractos vegetales .

El Per posee numerosas plantas con propiedades medicinales que en su mayoría no han sido estudiadas científicamente, una de estas es la salis e u iana L., especie nativa conocida como capulí y aguaymanto

,5perteneciente a la familia Solanaceae . El aguaymanto es usado empíricamente para tratar el cáncer y otras enfer-

,medades, como hepatitis, asma, malaria y dermatitis por sus presuntas propiedades antibacterianas, antimicóticas, antipiréticas y quimioterapéuticas.

Uno de los usos más comunes del aguaymanto es por su aparente potencial anticancerígeno, aunque existen muchos avances en el conocimiento, tratamiento y prevención de la patología, hasta ahora se continua buscando el anticancerígeno

8ideal . Los agentes anticancerígenos sintéticos presentan m ltiples efectos secundarios lo que es un problema constante en la terapia contra el cáncer, su limitación principal se encuentra en la toxicidad que presentan para células cancerígenas y no cancerígenas, en diferentes tipos de tejidos u

9órganos . Por todo lo antes expuesto, es necesario el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos contra este

10conjunto de enfermedades que afectan a tanta población ; los recursos naturales (algas, plantas, hongos, etc) siempre han jugado un papel importante en la obtención de fármacos, por ejemplo las plantas son una fuente importante de sustancias

11,12anticancerosas .

Actualmente, a nivel mundial la Administración de Alimentos y Medicamentos ( DA) de los Estados Unidos, cuenta con muchos fármacos anticancerígenos de los cuales aproximadamente el 62-67 % son de origen natural

12,13(semisintéticos o naturales) . Entonces podemos sugerir que las plantas medicinales son fuentes importantes de agentes quimioterapéuticos (vinblastina y el paclitaxel obtenidos a

,13,1partir at a ant us oseus y a us e i olia) . Además, los compuestos naturales presentan una gran diversidad de estructuras químicas, a diferencia de las pocas moléculas

15sintéticas .

En diversos estudios al analizar químicamente el extracto del fruto de aguaymanto se obtuvieron diversos componentes como el 2 -hidroxi itanolido, physalinas,

1 ,1phygrina, aempferol y glicósidos de quercentina , la 18,19,20mayoría presenta una fuerte actividad antioxidante .

El bioactivo mayoritario de salis e u iana L. son las physalinas (A, B, D y ) a las que se les ha atribuido efecto anticancerígeno sobre líneas celulares HA-22T (carcinoma hepatocelular), HeLa (adenocarcinoma de cérvix), APM1 40 (Leucemia linfoide aguda T), HL-60 (leucemia promielocítica aguda), K -1 (leucemia mieloide aguda), CT 1 (leucemia monocítica aguda) y KB-16 (cáncer nasofaríngeo); y los glicósidos los cuales han demostrado tener una actividad anticancerígena en líneas de leucemias, hepatomas, cáncer de

21 23cerviz y nasofaríngeos . Se postula que el extracto acuoso del fruto de aguaymanto es un potente agente antiproliferativo,

2y seg n Mendoza et al . act a por medio de la inducción de apoptosis , esto se puede evaluar mediante daños en el ADN.

Las rupturas y daños en la cadena del ADN a nivel 25celular pueden ser evidenciadas por el Ensayo Cometa . El

objetivo de la investigación fue medir el grado de antiproliferación de los metabolitos que se encuentran en el extracto acuoso del fruto de salis e u iana L. Aguaymanto mediante el ensayo de viabilidad celular y el

Ensayo Cometa.

. ormulación de b etivo

b etivo general

· Evaluar el potencial antiproliferativo del extracto acuoso del fruto de salis e u iana L. a diferentes concentraciones sobre la línea K 62 y E mediante la viabilidad celular y el promedio de n cleos dañados.

. Material y M todos

3.1 Material iológico

El presente trabajo fue del tipo experimental con corte longitudinal. Se trabajó como modelo biológico aguaymanto (extracto acuoso vegetal), seres humanos (Línea celular de leucemia mieloide crónica K 62 ) y mono (Línea celular de fibroblastos de riñón de mono E ).

3.2 Preparación del e tracto acuoso de sal s er ana L.

Los frutos de salis e u iana L. fueron recolecta- dos en la provincia de Carhuaz-Ancash, y utilizados para obtener un extracto acuoso, este procedimiento de extracción se realizó de acuerdo a la metodología de MSc. osa Lorenza

riondo ates y del MSc. ubén Lázaro aldivieso Izquierdo en el Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición (CIBN) de la acultad de Medicina Humana de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (comunicación personal). El extracto puro acuoso se utilizó para preparar cuatro concentraciones del extracto: 0 g ml, 100 g ml, 200 g ml y

2400 g ml seg n Areiza-Mazo .

3.3 ontroles

3.3.1 ontrol Positivo

Se utilizó el antineoplásico cisplatino como control debido a su amplio uso en el tratamiento contra diversos tipos de cáncer, a 4 diluciones (0.3 g ml, 0.6 g ml, 1.2 g ml, 2.

g ml).

X5 O L U O

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1 5

Las dosis fueron preparadas de acuerdo a uispe-2Mauricio .

3.3.2 ontrol Negativo

Se utilizó medio de cultivo PMI-1640 (Línea K 62) y D-MEM (Línea E ).

3.4 L neas celulares K y VE

Las líneas celulares K 62 y E fueron donadas gentilmente por el Dr. Abraham Jaime aisberg olach encargado del Laboratorio de Biología Celular y irología de los Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID), de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). Se trasladaron en frascos de cultivo celular al laboratorio de

enética de la acultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM para subcultivar en un plazo no mayor a 2 horas.

3. ultivo celular

La línea celular K 62 se resuspendió en ml de medio de cultivo PMI-1640 en un frasco plano para su monitoreo en el microscopio invertido hasta que alcanzaron confluencia luego de 72 h. La línea E tuvo una manipulación diferente, al ser una línea que crece en monocapa necesitó realizar un recambio de medio de cultivo cada vez que alcanzaba confluencia (aprox. 72 h) mediante lavados con solución de Han s y tripsina. El cultivo y mantenimiento celular se realizó en el laboratorio de enética de la acultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM de forma interdiaria hasta que finalizó el proyecto. Para ambas líneas celulares se aislaron 2 ml del cultivo celular y se repartió equitativamente en crioviales, y se incubaron a 37 C en atmósfera h meda, % de aire y % de C para los posteriores ensayos.2

3.6 onteo celular

Para la evaluación de iabilidad Celular mediante conteo celular se adicionó a los crioviales 200 l de las diluciones del extracto acuoso de aguaymanto, del cisplatino y de medio de cultivo PMI-1640 y se incubó por 4 horas (Tabla 1). Luego de 4 h de incubación se procedió a realizar un conteo celular con azul de tripano en la cámara de Neubauer para evidenciar células viables.

3.7 Ensayo colorim trico con M

Para la evaluación de iabilidad Celular mediante ensayo MTT se óadicion a los crioviales 200 l de las diluciones del extracto acuoso de aguaymanto, del cisplatino y de medio de cultivo PMI-1640 y se incub ó por 4 horas (Tabla 1). El ensayo colorimétrico con 3-(4, -dimetiltiazol-2-ilo)-2, -difeniltetrazol (MTT), mide la función metabólica celular cuando MTT es reducido a formazán por la enzima vital mitocondrial succinato deshidrogenasa. Se adicionó mg mL de MTT por criovial (4 h, 37 C, en oscuridad), se centrifugó cada criovial a 1 00 rpm por 10 minutos y se descartó el sobrenadante rápidamente por inversión.

En seguida, se adicionó DMS (dimetil sulfóxido) paradisolver los cristales de formazán. La cantidad de formazán-MTT es directamente proporcional al n mero de células viables y fue determinado usando la densidad óptica ( D) a

0 nm mediante el lector de ELISA. Con estos datos, mediante el análisis de regresión lineal, se obtuvo la concentración inhibitoria del crecimiento 0 (Ic 0).

3. Ensayo ometa

Para la evaluación de enotoxicidad Celular mediante el ensayo Cometa versión alcalina, se utilizó como solución de

28,29tinción el nitrato de plata con algunas variaciones . Para el ensayo Cometa se óadicion a los crioviales 200 l de las diluciones del extracto acuoso de aguaymanto, del cisplatino y de medio de cultivo PMI-1640 y se incub ó por 4 horas (Tabla 1).

Las láminas fueron preparadas con una suspensión de células precipitadas por centrifugación de los cultivos ya mencionados que fueron mezclados con 22 l de agarosa LMP al 1% (bajo punto de fusión), luego se colocó 7 l de esta mezcla en una lámina que contenía agarosa NMP al 1% (normal punto de fusión), se cubrió inmediatamente con un cubreobjetos y se refrigeraron por minutos. Luego se retiró el cubreobjetos de la lámina y se colocó 0 l de agarosa LMP al 1 %, se cubrió nuevamente con un cubreobjetos y se refrigeró por minutos adicionales.

Posterior a ello se colocaron las láminas en solución de lisis (10% de DMS , 1% de tritón -100, 2. M NaCl, 10 mM de Trizma base, 0.2 M Na H y 100 mM de EDTA) durante 20 a 22h. Posteriormente se realizó una electroforesis horizontal y se dejó reposar las láminas hasta cubrirlas completamente en el buffer de electroforesis (1 mM EDTA-300 mM de Na H) a pH 13 por 20 min. Luego de 20 minutos se inició la electroforesis (2 , 300 mA y 20 min).

Terminado el tiempo las láminas fueron sometidas al buffer de neutralización pH 7. (0,4 M tris) por minutos (2 lavados), se deshidrataron las láminas con etanol al 70% (10 minutos). inalmente para la tinción las láminas fueron lavadas con agua desionizada por 10 minutos antes de sumergirlas en la solución con Nitrato de plata; 34 ml de solución (0.2% v nitrato de amonio, 0.2% v nitrato de plata, 0.1 % v v

Extracto ac oso e Physalis peruviana L

mL

Co trol pos t oC splat o mL

00

200

00

0

2

2

0

0

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1

formaldehído y % v carbonato de sodio) y 66 ml de solución A ( % carbonato de sodio) durante 20 minutos, posteriormente fueron observadas en un microscopio óptico con un aumento de 10 , la migración del ADN se evaluó contabilizando el n mero de cometas por cada tratamiento y midiendo la longitud de su cola. Se prepararon 6 láminas por cada individuo y luego se contabilizaron 300 n cleos para su posterior análisis estadístico.

Terminado el tiempo las láminas fueron sometidas al buffer de neutralización pH 7. (0,4 M tris) por minutos (2 lavados), se deshidrataron las láminas con etanol al 70% (10 minutos). inalmente para la tinción las láminas fueron lavadas con agua desionizada por 10 minutos antes de sumergirlas en la solución con Nitrato de plata; 34 ml de solución (0.2% v nitrato de amonio, 0.2% v nitrato de plata, 0.1 % v v formaldehído y % v carbonato de sodio) y 66 ml de solución A ( % carbonato de sodio) durante 20 minutos, posteriormente fueron observadas en un microscopio óptico con un aumento de 10 , la migración del ADN se evaluó contabilizando el n mero de cometas por cada tratamiento y midiendo la longitud de su cola. Se prepararon 6 láminas por cada individuo y luego se contabilizaron 300 n cleos para su posterior análisis estadístico.

3. An lisis estad stico

Para el análisis estadístico de los datos obtenidos del ensayo de iabilidad Celular y MTT se utilizó el test Krus al allis y para los datos del ensayo Cometa se aplicó el test AN A.

4. esultados

4.1 Evaluación de la Viabilidad elular de la l nea K

4.1.1 Mediante onteo elular con azul de tripano

El conteo celular nos sirvió para determinar el promedio de células viables en cada tratamiento, utilizando azul de tripano para distinguir las células viables ( igura 1).

La tabla 2 nos muestra los resultados obtenidos luego del tratamiento de la línea K 62 a la acción antiproliferativa de la so luc ión acuosa de l aguaymanto a d i fe rentes concentraciones, al cisplatino y al control negativo (todos los

6datos se expresaron multiplicadas con 10 células por 1 ml de suspensión).

Los resultados muestran el n mero de células viables de diez réplicas de la línea K 62. Se realizó un análisis estadístico del Error estándar de la media entre los 10 casos a un nivel del %, p 0.0 , se halló que no habían diferencias significativas por lo que se pudieron obtener datos promedio representativos.

Con los datos de la tabla 2 se obtuvo la figura 2 donde se observa la variación de la viabilidad representada en

porcentajes del promedio de células de la línea K 62 expuesto a cada tratamiento de las diferentes dosis del extracto acuoso de

salis e u iana L. así como de los controles positivo y negativo.

En la gráfica se aprecia que el extracto acuoso ( ig. 2)de aguaymanto ( 0, 100, 200 y 400 g ml) y el cisplatino (0.3, 0.6, 1.2 y 2. g ml) indujeron efecto antiproliferativo en la línea K 62 y a medida que se aumenta la concentración para ambos el poder inhibitorio aumenta, por lo tanto se puede deducir que la viabilidad celular muestra un carácter dosis-dependiente de acuerdo a la concentración del tratamiento al que se sometió a la línea celular.

F ra L e 5 2 O observ d s 0X e m ros op o ver do. C u s de e 5 2 super or O fer or .

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Conteo celular de la l nea en la c mara de Neubauer sometido a a uaymanto alor x c lulas

Co ce trac

00 ml

200 ml

00 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

1. 5

1.32

1.29

1.

1.5

1.

1.

1.53

1.55

1. 9

1. 8

31.

1.

1. 8

1.

1.8

1. 5

1. 3

1.

1.58

1.

1.

1. 1

35.38

1.9

1.88

1.8

1.8

1.85

1.8

1.82

1. 9

1.

1.8

1.8

39.19

2.3

2.35

2.1

2.

2.23

2.3

2.35

2.28

2.2

2.3

2.292

8.82

.

.

.

. 5

.

. 8

.

.

. 9

.5

. 95

100.00

Conteo celular de la l nea en la c mara de Neubauer sometido a cisplatino alor x c lulas

Co ce trac

2 ml

2 ml

0 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

1. 2

1. 5

1. 9

1. 3

1.

1.

1.

1. 9

1. 8

1.

1. 2

3 . 8

1.9

1.89

1.8

1.8

1.88

1.91

1.8

1.8

1.88

1.89

1.88

39.9

2.18

2,15

2.1

2.1

2.2

2.21

2.19

2.18

2.15

2.1

2.1

.20

2.55

2.53

2.5

2.52

2.5

2.

2.51

2.55

2.5

2.55

2.5

5 .12

.

.

.

. 5

.

. 8

.

.

. 9

.5

.

100.00

1

F ra 2 b d d e u r de e 5 2 some d os r m e os e e Co eo e u r. L s b rr s represe e por e je de promed o de u s v b es de e 5 2 ob e do de 10 r p s o s d fere es dos s de e r o uoso de u m o 50, 100, 200 00

m sp o 0.3, 0. , 1.25 2.5 m , rus s, p 0.05.

00

0

0

0

0

0

0

0

20

0

0

0 50 0.3 100 0. 200 1.25 00 2.25

100 100

8.825 .12

39.19 39.9

31.

Extractoac oso e a a ma to

l c o es e c splat o

5.20

35.38 35. 8

4.1.2 Mediante el ensayo M

La abilidad Celular se determinó de forma indirecta con la absorbancia obtenida en el Lector de ELISA, los datos obtenidos se muestran en la tabla 3 por cada repetición del cultivo de la línea K 62 sometido a los diferentes tratamientos.

En la se muestra como var a el porcentaje de tabla 3 íviabilidad obtenido con el lector de ELISA, a las diferentes concentraciones del extracto acuoso de aguaymanto y cisplatino. Cuando hay un valor alto exi te mayor viabilidad scelular, la misma que disminuyendo a medida que se fueaumentó la concentración en los tratamientos.

Se observa que las siguientes dosis de aguaymanto (400 g ml) y cisplatino (2. g ml), se obtuvieron los valores

menores de Densidad ptica (D. .).

Se realizó un análisis estadístico del Error estándar de la media entre las 10 repeticiones a un nivel del %, p 0.0 , y mostró que no hay diferencias significativas entre cada réplica, por lo que se pudo obtener datos promedio. Con los datos de la tabla 3 se obtuvo la figura 3 donde se observa el crecimiento del promedio en porcentajes de los valores de densidad óptica a 4 0 nm.

En la gráfica e aprecia que el extracto acuoso de ( ig.3) saguaymanto ( 0, 100, 200 y 400 g ml) y el cisplatino (0.3, 0.6, 1.2 y 2. g ml) tienen carácter antiproliferativo en la línea K 62 y a medida que se aumenta la concentración para ambos el poder inhibitorio aumenta. Es decir, a medida que se aumenta la concentración del tratamiento el valor de la D. . disminuye, por lo tanto se puede deducir que la iabilidad Celular muestra un carácter dosis-dependiente de acuerdo a la concentración del tratamiento al que se sometió a la línea celular.

4.1.1.1 oncentración nhibitoria Media

Con los datos de la tabla 3 se halló la concentración inhibitoria media (IC 0) del extracto acuoso de aguaymanto en

la línea K 62, se aplicó el análisis de regresión lineal, con el que se obtiene una ecuación de la recta de -0.0014 0. 3 4; donde al reemplazar 0. se obtiene el valor (IC 0) que fue de 23 . 71 g ml y para la línea E (datos no mostrados) con ecuación de la recta -0.0014 0. 24 el IC 0 fue de

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1

formaldehído y % v carbonato de sodio) y 66 ml de solución A ( % carbonato de sodio) durante 20 minutos, posteriormente fueron observadas en un microscopio óptico con un aumento de 10 , la migración del ADN se evaluó contabilizando el n mero de cometas por cada tratamiento y midiendo la longitud de su cola. Se prepararon 6 láminas por cada individuo y luego se contabilizaron 300 n cleos para su posterior análisis estadístico.

Terminado el tiempo las láminas fueron sometidas al buffer de neutralización pH 7. (0,4 M tris) por minutos (2 lavados), se deshidrataron las láminas con etanol al 70% (10 minutos). inalmente para la tinción las láminas fueron lavadas con agua desionizada por 10 minutos antes de sumergirlas en la solución con Nitrato de plata; 34 ml de solución (0.2% v nitrato de amonio, 0.2% v nitrato de plata, 0.1 % v v formaldehído y % v carbonato de sodio) y 66 ml de solución A ( % carbonato de sodio) durante 20 minutos, posteriormente fueron observadas en un microscopio óptico con un aumento de 10 , la migración del ADN se evaluó contabilizando el n mero de cometas por cada tratamiento y midiendo la longitud de su cola. Se prepararon 6 láminas por cada individuo y luego se contabilizaron 300 n cleos para su posterior análisis estadístico.

3. An lisis estad stico

Para el análisis estadístico de los datos obtenidos del ensayo de iabilidad Celular y MTT se utilizó el test Krus al allis y para los datos del ensayo Cometa se aplicó el test AN A.

4. esultados

4.1 Evaluación de la Viabilidad elular de la l nea K

4.1.1 Mediante onteo elular con azul de tripano

El conteo celular nos sirvió para determinar el promedio de células viables en cada tratamiento, utilizando azul de tripano para distinguir las células viables ( igura 1).

La tabla 2 nos muestra los resultados obtenidos luego del tratamiento de la línea K 62 a la acción antiproliferativa de la so luc ión acuosa de l aguaymanto a d i fe rentes concentraciones, al cisplatino y al control negativo (todos los

6datos se expresaron multiplicadas con 10 células por 1 ml de suspensión).

Los resultados muestran el n mero de células viables de diez réplicas de la línea K 62. Se realizó un análisis estadístico del Error estándar de la media entre los 10 casos a un nivel del %, p 0.0 , se halló que no habían diferencias significativas por lo que se pudieron obtener datos promedio representativos.

Con los datos de la tabla 2 se obtuvo la figura 2 donde se observa la variación de la viabilidad representada en

porcentajes del promedio de células de la línea K 62 expuesto a cada tratamiento de las diferentes dosis del extracto acuoso de

salis e u iana L. así como de los controles positivo y negativo.

En la gráfica se aprecia que el extracto acuoso ( ig. 2)de aguaymanto ( 0, 100, 200 y 400 g ml) y el cisplatino (0.3, 0.6, 1.2 y 2. g ml) indujeron efecto antiproliferativo en la línea K 62 y a medida que se aumenta la concentración para ambos el poder inhibitorio aumenta, por lo tanto se puede deducir que la viabilidad celular muestra un carácter dosis-dependiente de acuerdo a la concentración del tratamiento al que se sometió a la línea celular.

F ra L e 5 2 O observ d s 0X e m ros op o ver do. C u s de e 5 2 super or O fer or .

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:5 .m.

Conteo celular de la l nea en la c mara de Neubauer sometido a a uaymanto alor x c lulas

Co ce trac

00 ml

200 ml

00 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

1. 5

1.32

1.29

1.

1.5

1.

1.

1.53

1.55

1. 9

1. 8

31.

1.

1. 8

1.

1.8

1. 5

1. 3

1.

1.58

1.

1.

1. 1

35.38

1.9

1.88

1.8

1.8

1.85

1.8

1.82

1. 9

1.

1.8

1.8

39.19

2.3

2.35

2.1

2.

2.23

2.3

2.35

2.28

2.2

2.3

2.292

8.82

.

.

.

. 5

.

. 8

.

.

. 9

.5

. 95

100.00

Conteo celular de la l nea en la c mara de Neubauer sometido a cisplatino alor x c lulas

Co ce trac

2 ml

2 ml

0 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

1. 2

1. 5

1. 9

1. 3

1.

1.

1.

1. 9

1. 8

1.

1. 2

3 . 8

1.9

1.89

1.8

1.8

1.88

1.91

1.8

1.8

1.88

1.89

1.88

39.9

2.18

2,15

2.1

2.1

2.2

2.21

2.19

2.18

2.15

2.1

2.1

.20

2.55

2.53

2.5

2.52

2.5

2.

2.51

2.55

2.5

2.55

2.5

5 .12

.

.

.

. 5

.

. 8

.

.

. 9

.5

.

100.00

1

F ra 2 b d d e u r de e 5 2 some d os r m e os e e Co eo e u r. L s b rr s represe e por e je de promed o de u s v b es de e 5 2 ob e do de 10 r p s o s d fere es dos s de e r o uoso de u m o 50, 100, 200 00

m sp o 0.3, 0. , 1.25 2.5 m , rus s, p 0.05.

00

0

0

0

0

0

0

0

20

0

0

0 50 0.3 100 0. 200 1.25 00 2.25

100 100

8.825 .12

39.19 39.9

31.



5.20

35.38 35. 8

4.1.2 Mediante el ensayo M

La abilidad Celular se determinó de forma indirecta con la absorbancia obtenida en el Lector de ELISA, los datos obtenidos se muestran en la tabla 3 por cada repetición del cultivo de la línea K 62 sometido a los diferentes tratamientos.

En la se muestra como var a el porcentaje de tabla 3 íviabilidad obtenido con el lector de ELISA, a las diferentes concentraciones del extracto acuoso de aguaymanto y cisplatino. Cuando hay un valor alto exi te mayor viabilidad scelular, la misma que disminuyendo a medida que se fueaumentó la concentración en los tratamientos.

Se observa que las siguientes dosis de aguaymanto (400 g ml) y cisplatino (2. g ml), se obtuvieron los valores

menores de Densidad ptica (D. .).

Se realizó un análisis estadístico del Error estándar de la media entre las 10 repeticiones a un nivel del %, p 0.0 , y mostró que no hay diferencias significativas entre cada réplica, por lo que se pudo obtener datos promedio. Con los datos de la tabla 3 se obtuvo la figura 3 donde se observa el crecimiento del promedio en porcentajes de los valores de densidad óptica a 4 0 nm.

En la gráfica e aprecia que el extracto acuoso de ( ig.3) saguaymanto ( 0, 100, 200 y 400 g ml) y el cisplatino (0.3, 0.6, 1.2 y 2. g ml) tienen carácter antiproliferativo en la línea K 62 y a medida que se aumenta la concentración para ambos el poder inhibitorio aumenta. Es decir, a medida que se aumenta la concentración del tratamiento el valor de la D. . disminuye, por lo tanto se puede deducir que la iabilidad Celular muestra un carácter dosis-dependiente de acuerdo a la concentración del tratamiento al que se sometió a la línea celular.

4.1.1.1 oncentración nhibitoria Media

Con los datos de la tabla 3 se halló la concentración inhibitoria media (IC 0) del extracto acuoso de aguaymanto en

la línea K 62, se aplicó el análisis de regresión lineal, con el que se obtiene una ecuación de la recta de -0.0014 0. 3 4; donde al reemplazar 0. se obtiene el valor (IC 0) que fue de 23 . 71 g ml y para la línea E (datos no mostrados) con ecuación de la recta -0.0014 0. 24 el IC 0 fue de

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:55 .m.


1 8

4.1.1.2 ndice de electividad

El ndice de Selectividad (IS) del aguaymanto se halló utilizando los valores de IC 0 302. 7 g ml) e No cancerígena ( E )

IC 0 23 . 71 g ml, el resultado de la división de Cancerígena (K 62)

estos parámetros fue el IS 1.264; como resultó mayor que 1 nos indica que el extracto acuoso de aguaymanto presenta un efecto antiproliferativo superior en células tumorales humanas de leucemia (K 62) que en células no transformadas ( E ). El IS del cisplatino resultó 0.622 (Microsoft ffice Excel 2010).

4.1.3 Mediante el ensayo ometa

Para evaluar la genotoxicidad celular se contabilizaronlos promedios de los n cleos dañados de las células de la línea K 62 sometidas a los diferentes tratamientos (extracto acuoso de aguaymanto, cisplatino y control negativo).

El patrón de clasificación consideró niveles (Collins et al. en 1 ): rado 0 o células no dañadas sin cola, ( ig. 4A); grado 1 o células ligeramente dañadas, con cola menor al tamaño de la cabeza ( ig. 4B), grado 2 o células dañadas, con cola igual al tamaño de la cabeza ( ig. 4C), grado 3 o células fuertemente dañadas, con cola mayor al tamaño de la cabeza ( ig. 4D), y grado 4 o células en apoptosis ( ig. 4E). En la tabla 4. se muestra el porcentaje de n cleos dañados, a las diferentes concentraciones del extracto acuoso de aguaymanto, cisplatino y control negativo.

Los n cleos dañados van aumentando a medida que se aumentó la concentración en los tratamientos. Se realizó un análisis estadístico del Error estándar de la media entre las repeticiones a un nivel del %, p 0.0 , y mostró que no hay diferencias significativas, por lo cual se obtener datos pudieronpromedio. Los resultados muestran además que existe genotoxicidad dosis-dependiente medida por la migración de la cola del cometa en el extracto acuoso de aguaymanto.

F ra b d d Ce u r de e 5 2 some d os r m e os e e e s o . L s b rr s mues r e ve de de s d d p

.O. promed o e por e je 90 m, med d por e e or de L ue os represe v b d d Ce u r de e 5 2 ob e d de

10 r p s o s d fere es dos s de e r o uoso de u m o

50, 100, 200 00 m sp o 0.3, 0. , 1.25 2.5 m , russ, p 0.05.

0 50 0.3 100 0. 200 1.25 00 2.25

20

0.2

100 10000

0

0

0

20

0

82. 8 8. 0

59.99

.52

0.88

.8

3 .2



orc

eta

e

e

es

a

pt

ca L

mea

2

302. 7 g ml. Como un dato adicional también se halló el IC 0 del cisplatino para la línea E y K 62 que fueron de 1.3 y 2.17 g ml respectivamente (Tabla 3). Para este análisis, se utilizó Microsoft ffice Excel 2010.

Densidad óptica de la l nea sometido a a uaymanto en el ensayo MTT

Co ce trac

00 ml

200 ml

00 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

0.80

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0. 8

0.

0. 0

0.80

0.85

0.80

0.80

0.81

3 .2

1.10

1.20

1.15

1.1

1.10

1.20

1.15

1.01

1.03

1.10

1.12

.52

1. 0

1. 1

1.

1.39

1. 2

1. 1

1. 2

1. 3

1. 0

1. 2

1. 1

59.99

1. 5

1.

1.

1. 0

1,

1. 5

1.

1. 8

1. 0

1. 3

1.

0.2

2.3

2.35

2.3

2.3

2.3

2.30

2.35

2.3

2.3

2.3

2.3

100.00

Densidad óptica de la l nea sometido acisplatino en el ensayo MTT

Co ce trac

2 ml

2 ml

0 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

p

p

p 8

p 9

p 10

romed o o

romed o e por e je

1.15

1.12

1.12

1.15

1.13

1.10

1.13

1.1

1.10

1.1

1.13

.8

1.

1. 0

1. 5

1.

1. 0

1. 3

1.

1. 5

1. 5

1. 3

1.

0.88

1.8

1.8

1.8

1.88

1.80

1.85

1.85

1.8

1.8

1.88

1.8

8. 0

1.9

1.90

1.90

1.98

1.9

1.89

1.95

1.95

1.98

1.9

1.9

82. 8

1.15

1.12

1.12

1.15

1.13

1.10

1.13

1.1

1.10

1.1

1.13

.8

alores de densidad óptica en el ensayo MIT

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:5 .m.

1 9

Con los datos de la tabla 4 se obtuvo el promedio de los n cleos dañados ( ig. ). En la gráfica se observó que el extracto acuoso de aguaymanto y el cisplatino a las diferentes concentraciones tienen carácter genotóxico. A medida que se incrementó la concentración, aumentó el promedio de n cleos dañados; es decir el daño genotóxico tiene un carácter dosis-dependiente a la concentración de los tratamientos.

En la tabla 4 se aprecia el grado de daño por cada tratamiento tanto para aguaymanto y cisplatino. Con los datos de la tabla , se obtuvieron las figuras 6 y 7 que muestran el patrón de n cleos dañados para el aguaymanto y cisplatino, para ambos se observaron n cleos dañados del nivel 3 y 4.

Los datos muestran que existen diferencias significativas en el n mero de n cleos dañados entre las concentraciones del extracto acuoso, cisplatino y del control negativo (test paramétrico AN A, p 0.0 ).

. Discusión

La medicina tradicional siempre ha usado a las plantas por sus presuntas propiedades quimioterapéuticas, antibióticas,

,30antipiréticas, inmunomoduladoras, antif ngicas, etc . Incluso los recursos naturales han sido usados en la obtención de fármacos tales como el taxol, la camptotecina, vincristina,

F ra r de s f de d o e o o p r e e s o Come . C u s o r do 0 . C u o d o eve

100 m r do 1 . C C u s o d o 00 m r do 2 . C u fuer eme e d d 00 m r do 3 . E C u e pop os s r do .

C

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:5 .m.


180

F ra eos d dos e u s de e 5 2 some d os r m e os e e e s o Come . L s b rr s mues r e por e je

de promed o de eos d dos p r os d fere es r m e os, os eos d dos represe e d o e o o de e 5 2

ob e d de 5 r p s o s d fere es dos s de e r o uoso de

u m o 50, 100, 200 00 m sp o 0.3, 0. , 1.25 2.5

m , rus s, p 0.05.

F ra C s f de d o e o o de e 5 2 some d u m o e e e s o Come . e pre d fere es r dos de

d o e o o p r s d fere es o e r o es de e r o uoso de u m o, s e do dos s 50 m o e r de

e r o o d o m s eve ve es 0, 1 2 m e r s ue s dem s dos s super ores 100, 200 00 prese d os m s severos ve es 3 .

Promedio de n cleos da ados de la l nea sometidos a a uaymanto en el ensayo Cometa

Co ce trac

00 ml

200 ml

00 ml

0 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

romed o

200

180

1

199

190

181

150

1 8

15

150

1 5

1

100

112

105

110

108

85

80

5

0

85

0

30

35

0

38

32

35

romed o e por e je 5.25 3 .00 21.25 1 . 5 9

Co ce trac

0 ml

0 ml

2 ml

2 ml

ratam e to

p 1

p 2

p 3

p

p 5

180

185

183

180

1 9

1 0

1 5

150

1 3

1 0

8

8

85

80

8

0

8

30

35

0

38

30

Promedio de n cleos da ados de la l nea sometidos a cisplatino en el ensayo Cometa

o

Clasificación de los n cleos da ados de la l nea en el ensayo Cometa

Promedio de n cleos da ados de la l nea sometidos a a uaymanto en el ensayo Cometa campo

Extractoac oso e

a a ma to

a o

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0

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300

0 m

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0

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300

300

300

300

Extractoac oso e

a a ma to

a o

el0

Co a o

el2

119

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1

33

22

2.5 m

1.25 m

0. m

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2 5

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0

9

5

35 0

el

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0

0

otal

300

0 m

el

33

0

0

0

0

300

300

300

300


Co ce tracml

0

0

0

2

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0

0 50 0.3 100 0. 200 1.25 00 2.25

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3

21

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19.00


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200

0

00

0

0

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00 00 100 50 0

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e

cle

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aa

os

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am

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3

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111

0

12

151

055

193

22

2 5

122

5035

paclitaxel y vinblastina, que son fármacos quimioterapéuticos 31,13derivados principalmente a partir de plantas superiores .

En el presente estudio se evaluó el potencial antiproliferativo del extracto acuoso de frutos de salis

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:58 .m.

181

F ra C s f de d o e o o de e 5 2 some d sp o e e e s o Come . e pre d fere es r dos de d o e o o p r s d fere es d u o es de sp o, s e do dos s

0.3 m o e r o d o m s eve ve es 0, 1 2 m e r s ue s dem s dos s super ores 0. , 1.25 2.5 prese d os m s

severos ve es 3 .

Co ce tracml

0

el 0

33

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119

15

215

233

2 5

1

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535

00

2 0

200

0

00

0

02.5 1.25 0. 0.3

el el el 2 el

Cla

scac

e

cle

os

aa

os

csp

lat

o

e u iana L. para inhibir el porcentaje de crecimiento celular en líneas de leucemia mieloide crónica (K 62), sugiriendo la presencia de compuestos bioactivos anticancerígenos, como los encontrados por Chiang et al. (1 2) en varios extractos acuosos, alcohólicos, etanólicos y esteroides vegetales de especies del género salis, todos demostraron tener actividad antiproliferativa in i o contra numerosos tipos de células cancerosas, incluyendo: leucemia, pulmón, colon, cuello uterino, hepatoma, melanomas y células no cancerosas incluyendo líneas de fibroblastos de ratón y células de riñón de

21 23mono .

.1 Viabilidad elular

Seg n los resultados obtenidos se determinó que la línea K 62 fue la más sensible a las cuatro concentraciones de los extractos de aguaymanto comparada con la línea E . Para la dosis menor del extracto de aguaymanto ( 0 g ml) los resultados de viabilidad celular fueron los valores más altos y a medida que se aumentó la concentración los valores de viabilidad celular fueron disminuyendo, siendo para la dosis mayor (400 g ml) los valores menores. La línea K 62 se comportó de forma muy similar en el ensayo MTT donde la viabilidad celular fue calculada en datos de densidad óptica (4 0 nm), para la dosis menor del extracto de aguaymanto ( 0

g ml) los datos obtenidos de densidad óptica fueron los más altos y a medida que se aumentó la concentración los valores de viabilidad celular fueron disminuyendo, siendo para la dosis mayor (400 g ml) los valores menores. Estos hallazgos coinciden con Areiza-Mazo et al., (2013) quienes trabajaron

2

con extracto acuoso del fruto de aguaymanto sobre cáncer de colon, sus resultados mostraron que el efecto antiproliferativo se incrementó en forma dependiente de la dosis del extracto (2 , 0, 100, 200 y 400 g ml) con viabilidad de 41, 1, 62. , 6 y %.

Los resultados obtenidos por el ensayo MTT también mostraron comportamientos similares a los de Areiza-Mazo , 2

la D. . ( 40 nm) varió para las dosis de 2 -400 g ml en un rango de 1.2 y 0.2 , disminuyendo el valor de la D. . cuando se

aumentó la concentración del extracto. Al igual que Areiza-Mazo , el efecto antiproliferativo es dosis-dependiente a la 2

concentración del extracto, otra concordancia que los grados es de mayor efecto antiproliferativo fueron las concentraciones de 200 y 400 g ml y que mostraron los valores más bajos de viabilidad celular y D. . en el conteo celular y en el ensayo MTT. En otro estudio realizado por uispe-Mauricio , et al(200 ) con extractos etanólicos de tallos y hojas de 2 )

aguaymanto los porcentajes de viabilidad celular en la línea K 62 se reducen al aumentar la concentración, de 41.3 % (0.

g ml), 3 % (3. 1 g ml), 1 % (1 .63 g ml), -24.6 % (62. g ml).

En el estudio de avala et al., (2006) , que usaron extractos etanólicos de tallos y hojas de aguaymanto sobre la línea K 62, se mostró viabilidad celular de 7.36 % (0.

g ml), 47 % (2 g ml), 23 % (7. g ml), -3 % (31.3 g ml) y -11. 1 % (12 g ml). Se describe un comportamiento dosis-dependiente del efecto antiproliferativo del aguaymanto con respecto a la concentración al igual que en nuestros resultados.

El cisplatino es un fármaco utilizado ampliamente contra diversos tipos de cáncer, en los resultados obtenidos mostró un efecto antiproliferativo dependiente a la concentración (0.3-2. g ml) y tuvo mayor efecto antiproliferativo en la línea E comparado con la línea K 62. Estos hallazgos coinciden con uispe-Mauricio et al.,

2(200 ) cuyos resultados mostraron que el efecto antiproliferativo del cisplatino se incrementó en forma dependiente de la concentración (0.04-2. g ml), otra concordancia es que la dilución con mayor efecto fue de 2.

g ml. Estos resultados también concuerdan con los reportados por avala ., en el 2006et al y Areiza-Mazo et al.,

(2013 cuyas investigaciones usan como controles positivos 2 ,

antineoplásicos comerciales que indujeron mayor efecto en células no cancerígenas que en cancerígenas.

En investigaciones que utilizan extractos vegetales se acostumbra obtener el IC 0, que es la concentración a la cual una sustancia puede inhibir el 0 % de la población celular, con estos valores se puede hallar un parámetro más que es el ndice de selectividad (IS) que nos indica si la sustancia estudiada podría tener preferencia en alg n nivel de antiproliferación

33sobre células cancerígenas . Debido a que el cisplatino provoca notables efectos adversos sobre las personas que padecen cáncer, resulta necesaria la b squeda de nuevos agentes terapéuticos con propiedades antitumorales que no sean tan nocivos con las células no cancerígenas. Hay diversos estudios que evidencian que salis e u iana L. posee un carácter selectivo hacia células cancerígenas y podría ser una fuente de compuestos bioactivos capaces de inhibir o detener la proliferación celular mediante inducción de apoptosis, esta propiedad podría brindarnos un posible nuevo agente quimioterapéutico y quimiopreventivo para el tratamiento del

,2 ,2cáncer humano . Los valores de Concentración Inhibitoria Media (IC 0) del extracto acuoso de aguaymanto encontrados en la investigación sobre la línea E y en la línea K 62 fueron de 302. 7 y de 23 . 71 g ml respectivamente. El ndice de Selectividad (IS) fue de 1.264 (mayor que 1), los

X5 O L U O

u es, 12 de m r o de 2018 09:21:59 .m.


182

valores concuerdan con los descritos previamente por otros autores para los extractos de aguaymanto sobre líneas

,2cancerígenas y sobre células no cancerígenas .

En un estudio realizado por avala et al. (2006) los resultados mostraron que para células no cancerígenas (fibroblastos de ratón) los extractos de tallos y hojas presentaron IC 0 de 2.67 y 4. g ml respectivamente y para las células de la línea K 62 fueron 2.1 y 2.42 g ml respectivamente; al igual que en el presente estudio, el IC 0 para la línea K 62 fue menor que en células no cancerígenas ( E ). Con estos valores los IS ( ndice de selectividad) de los extractos de tallos y hojas alcanzaron valores de 1.1 y 2.1 y en nuestros resultados de 1.74 coincidiendo en superar la unidad para ambos casos y en estar dentro del rango de la referencia . tro estudio realizado por uispe-Mauricio et al., mostraron que los valores de IC 0 de los extractos de 2

tallos y hojas en la línea K 62 fueron de 0.02 y 0.03 g ml respectivamente, y los IC 0 de los extractos de tallos y hojas en células no cancerígenas (epitelio de riñón) fueron de 4. y 6.2

g ml respectivamente; al igual que en el presente estudio para la línea K 62 el IC 0 fue mucho menor que en las células no cancerígenas. Con estos valores los IS ( ndice de selectividad) de aguaymanto alcanzaron valores de 206 y 246 respectivamente en la línea K 62 y en nuestros resultados de 1.74 coincidiendo en superar la unidad para ambos casos.

Los valores de Concentración Inhibitoria Media (IC 0) del cisplatino mostrados en la investigación sobre las líneas

E y K 62 fueron de 1.3 y 2.17 g ml respectivamente, el ndice de Selectividad (IS) fue de 0.622.

Ambos valores concuerdan con los valores descritos previamente por otros autores para el cisplatino sobre líneas cancerígenas y sobre células no cancerígenas, ya que al ser menor de la unidad (IS) no presenta una selectividad marcada y dañaría por igual o más a células normales comparadas con células de cáncer. Estos resultados coinciden con avala et al., (2006) que utilizó el antineoplásico - U contra líneas K 62 y obtuvo un IS de 0.032. tra investigación nos proporciona un IS para cisplatino de 7.3 . En todos los casos mencionados el

2

IS del control positivo es menor que el del aguaymanto al igual que en nuestros resultados. Esto demostraría, el buen perfil antitumoral de los extractos de aguaymanto, superando ampliamente a los antineoplásicos mencionados, los cuales, forman parte de estudios, manejo y tratamiento de carcinomas en el mercado mundial. Los extractos acuosos del aguaymanto exhibieron un efecto mayor sobre la línea K 62 comparado al de la línea E , estos resultados son consistentes, con la presencia de sustancias presentes mayormente polares, ya que las fracciones sólidas aisladas mostraron solubilidad en los solventes usados .

Los resultados de las pruebas de viabilidad celular mostraron que los extractos acuosos de aguaymanto inhiben de alguna forma la progresión del ciclo celular, siendo la línea K 62, la más sensible a su efecto antiproliferativo, contrariamente para el cisplatino la más sensible fue la línea

E . Esto explicaría los efectos adversos que mayormente

ejerce en las personas que lo consumen, la razón por la que el aguaymanto y el cisplatino han presentado esos efectos podría ser por las diferencias estructurales presentadas en su composición química al ser el cisplatino un fármaco sintético

9,2 ,3presenta mayores efectos adversos .

Aunque estas observaciones deben repetirse, los datos preliminares nos permiten especular que el aguaymanto tendría componentes que causarían la detención del ciclo celular, lo cual es muy interesante teniendo en cuenta que las moléculas candidatas a fármacos anticancerígenos deben presentar un bajo índice de efectos adversos en células no transformadas. Con la prueba Krus al- allis se compararon los resultados de la línea

E con la línea K 62 para cada tratamiento, los resultados nos indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (aguaymanto) y el control (cisplatino); en ambos linajes.

.2 enoto icidad celular

En la actualidad la capacidad de ciertas sustancias de origen vegetal con potencial genotóxico han tenido gran impacto en la comunidad científica; muchos autores han demostrado que esta propiedad en las plantas es capaz de detener la proliferación celular mediante inducción de

35,3apoptosis .

Desde 1 3 se publicaron los primeros estudios empleando ensayos para la detección de apoptosis cuantificando las células altamente dañadas, el ensayo de

3electroforesis alcalina de células individuales o Cometa es una prueba que muestra hasta el % del ADN migrado cuando

25ocurre un daño .

En el presente estudio, para evidenciar el daño genotóxico, se utilizó el ensayo Cometa para observar si es que existiera migración del ADN cuando es fragmentado

25(fenómeno solo ocurre en necrosis o apoptosis) .

Entre las ventajas del ensayo Cometa, incluye la aplicabilidad a varios tejidos y o tipos de células especiales, la alta sensibilidad en la detección de niveles bajos de daño al ADN, y el requerimiento de un n mero pequeño de células por

38muestra, entre otros . Los resultados obtenidos mediante el ensayo Cometa al exponer a las células al extracto acuoso de

salis e u iana L. y cisplatino indican tanto de forma cualitativa como cuantitativa que existen diferencias significativas con el control negativo; es así que, al clasificar el daño en cuatro niveles: leve, moderado, medio y alto, se observó que el promedio de n cleos de nivel alto se incrementó a medida que aumentaban las dosis del extracto y del cisplatino ( igura 6 y 7).

En esta investigación, mediante el ensayo Cometa versión alcalina descrita por se

0Singh et al en 1 ,demuestra claramente que la línea K 62 sometida a una alta concentración de extracto acuoso de aguaymanto (400 g ml) y cisplatino (2. g ml) sufre quiebres en las hebras de ADN,

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encontrándose un 23.11 % con daño severo (tipo 3 y 4) sometidas a aguaymanto y 21. % con daño severo (tipo 3 y 4) sometidas a cisplatino, sin embargo las células sometidas a una concentración de 100 g ml no presentaron daño severo solo 31.67% de daño basal muy leve (tipo 1 y 2) y 2% de células sin daño (tipo 0).

Esto podría deberse a unas glicoproteínas denominadas physalinas (physalina ) o esteroides del tipo itanólidos presentes en el aguaymanto, que se han reportado con actividad

21,22antiproliferativa , ambos componentes producirían la activación de la apoptosis mediante los receptores T AIL-

2D 4 -D y la caspasa-3 y detendría el ciclo celular en la fase 2 M que conducirían a la desestabilización celular, así como el desenrollado del ADN, lo que podría ser un posible

39, 0mecanismo que provocaría su genotoxicidad .

Los resultados obtenidos coinciden con los obtenidos por en

1et al., 2010 que utilizó a hidro- itanólidos purificado de salis e u iana L. sobre hepatocarcinoma y evaluándolo para evidenciar la inducción de apoptosis mediante ensayo Cometa. De igual forma al aumentar la concentración se aumentó el nivel de daño en los n cleos de las

39células. En otra investigación con salis an ulata, se usó extracto de raíces sobre linfocitos humanos, de la misma forma la genotoxicidad mostró carácter dosis dependiente aunque a bajas concentraciones solo provocó daños leves.

Los resultados obtenidos son promisorios y resaltan el potencial medicinal de este fruto incaico, será necesario continuar estudios sobre los diferentes beneficios y propiedades anticancerígenas de salis e u iana L. a fin de aislar sus componentes principales (physalinas, itanólidos, etc.) como una fuente potencial con aplicación quimiopre- ventiva y quimioprotectora en cáncer humano.

ra e entos

Los autores agradecen a la undación Instituto Hipólito Unanue, a la Dra. Mariela lores achin del Hospital Nacional Edgardo ebagliati Martins, a la Mg. Susana Mónica utiérrez Moreno, al Mg. ernando Merino afael, a la MSc. lga Hilda Bracamonte uevara, al Dr. Misael uevara Paredes de la

acultad de Ciencias Biológicas y a Dilmer Armando uincho osales de la acultad de dontología.

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DIA N S ICO Vol. ( ) Octubre Diciembre 2017 uemaduras pediátricas Huby Vidaurre, MP.

uemaduras pediátricas en el Perú

a a el ila u i au e

AVANCES EN CIR A PLÁS ICA REPARADORA

i u ano l stico el e e tenci n Inte al al aciente ue a o el Instituto acional e alu el i o an o a i a e

1. ntroducción

Las lesiones por quemadura son una de las injurias más devastadoras que un ser humano pueda sufrir. El daño que ocasionan pone en riesgo la vida y la posibilidad de desarrollarse plenamente, especialmente si la quemadura ocurre durante la niñez. Desde la etapa aguda, en la que ocurren drásticos cambios hemodinámicos que ponen en gran riesgo la vida de la víctima, hasta la etapa en que el proceso de cicatrización compromete el aspecto estético y funcional de la piel afectada, las víctimas de quemaduras tienen un largo y doloroso camino que recorrer.

Aunque en general, y debido a los avances en resucitación hidroelectrolítica, uso de antibióticos, terapias ventilatorias, nutrición y tratamiento de las heridas, la mortalidad por quemaduras ha disminuido, esta se mantiene

1 3entre el 3 y el % . El % de las muertes por quemadura ocurren durante las primeras 72 horas post injuria, lo que significa que estas son debidas al shoc por quemadura .

Los niños tienen estructuras y proporciones diferentes que los adultos. Por ejemplo, la piel de un niño es más delgada y las lesiones térmicas penetran con mayor facilidad, la temperatura se pierde en forma más rápida y la evaporación es mayor. La relación cabeza cuerpo de un niño es mayor que la de un adulto. A medida que el niño crece, la cabeza va disminuyendo de tamaño y los miembros inferiores van aumentando. Es muy importante saber reconocer estas diferencias al manejar niños con quemaduras.

esumen

Las lesiones por uemadura son una de las in urias m s devastadoras ue un ser humano pueda sufrir. Ponen en riesgo la vida, y en el caso de ocurrir en ni os, implica la posibilidad comprometer su desarrollo y de de ar secuelas ue re uerir n a os de tratamientos uir rgicos complementarios, terapias f sicas y psicológicas. La prevención sigue siendo el me or tratamiento de las uemaduras. e presentan los principales mecanismos como ocurren las uemaduras en los ni os atendidos en una nidad de uemados Pedi tricos ue es referente en el Per , y el mane o inicial recomendado.

Abstract

urn in uries are devastating and put in risk the life of their victims. hen they happen at short age, they may compromise the normal development, and many reconstructive surgeries throughout the life may be re uired, beside physical and psychological therapy. Prevention is still the better treatment. Here e present the initial treatment recommended and the main circumstances and agents causing burns in children treated at a Peruvian hildren s urn

nit that is a nation ide reference center.

No existe a n la medicina que borre por completo las cicatrices de una quemadura. Por lo que a n desde nuestra posición de médicos debemos reconocer que el mejor tratamiento para las quemaduras es la prevención.

En el presente artículo se describen los principales mecanismos y condiciones en que ocurren las quemaduras pediátricas en el Pe , su fisiopatología, y recomendaciones para el manejo de emergencia.

. Epidemiolog a

Seg n la rganización Mundial de la Salud ( MS), en el año 2004 cerca de 11 millones de personas en todo el mundo

5sufrieron quemaduras que necesitaron atención médica . Anualmente alrededor de 1 0,000 personas de todo el mundo mueren a causa de quemaduras, y la mayoría de estas muertes

5ocurren en países de ingresos bajos y medianos . Las quemaduras que no son fatales son causa importante de morbilidad, incluyendo hospitalización prolongada, desfiguramiento y discapacidad, lo que resulta en rechazo y

5,estigmatización . En el Per , las estadísticas sobre quemaduras pediátricas son escasas, sin embargo, se sabe que entre los años 1 y 2012, en la Unidad de uemados del Instituto Nacional de Salud del Niño de Breña (INSN Breña), la primera unidad para tratamiento de niños quemados creada en el Per , se produjo un promedio de 300 ingresos anuales . Desde su creación en el año 2013, el Eje de Atención Integral al Paciente uemado del Instituto Nacional de Salud del Niño

F O UC EL ULO E U CULO L GL G C

X O O C U L C U U L C

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gráficos señores )ernando y emilio cazorla

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