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8/18/2019 GUIA+TRABAJO+PRACTICO+FINAL+2016

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICASBIO 226E AÑO 2016

TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de diagnóstico molecular para la detección de mutaciones o

polimorfismos, se basan en los cambios que genera un cambio nucleotídico en las

propiedades físico químicas de la molécula de DNA. Los cambios nucleotídicos,

deleciones e inserciones alteran la estructura primaria del DNA. Estos cambios

pueden alterar las propiedades de apareamiento complementario, su tamaño, generar

o eliminar sitios de corte de enzimas de restricción, siendo todas estas alteraciones

reflejadas finalmente en su movilidad electroforética.

OBJETIVO GENERAL

Familiarizar a los alumnos con técnicas básicas de diagnóstico genético, como son el

PCR, el uso de enzimas de restricción y la técnica de heterodobletes (HDX), en

conjunto con electroforesis.

Muestras problema: Usted dispondrá de la muestra de una paciente con cáncer de

mama hereditario y dos familiares. Mediante el uso de electroforesis, deberá detectar

mutaciones en los genes BRCA1, BRCA2, usando enzimas de restricción y la técnica de

heterodobletes.


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I. DIGESTIÓN CON ENZIMA DE RESTRICCIÓN: DETECCION DIRECTA DE UNAMUTACIÓN QUE ALTERA UN SITIO DE RESTRICCIÓN.

Las enzimas de restricción (ER) son endonucleasas que reconocen secuencias

específicas del DNA. Existen distintos tipos de ER, según sea el tipo de secuencia

conocida y el lugar de corte. El uso de ER en la detección de mutaciones ha sido

ampliamente difundido en el diagnóstico molecular. Es importante destacar que para

utilizar esta metodología el cambio en el DNA debe ser conocido previamente al igual

que el patrón de digestión que se obtendrá.

OBJETIVO: Detectar mutaciones y polimorfismos conocidos que hacen perder o ganarsitios de restricción.

PROCEDIMIENTO: Usando la técnica de PCR se amplifica el fragmento seleccionado,luego el producto de PCR se incuba en presencia del enzima de interés y finalmente se

el producto de la digestión se resuelve mediante electroforesis en gel de agarosa.

Con esta técnica se analizarán muestras de pacientes con cáncer de mama que

presentan mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2. Para esto se le entregarán 6tubos de los miembros de una familia cuyo DNA ha sido tratado con dos ERdistintas (en tubos distintos) según los siguientes protocolos:

A. Detección de una mutación presente en el gen BRCA1 con enzima BstNI . Amortiguador 10X (enzima restricción BstNI ) 5 lBSA (100 mg/ml) 0,5 lEnzima BstNI (10.000 U/ ml) 0,5 l

H2O 33 lproducto de PCR 20 lVolumen total. 50 l

Incubar en baño termorregulado a 60ºC por 4 horas.


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B. Detección de la variante alélica presente en el gen BRCA2 con enzima MaeIII .

Amortiguador 10X (enzima restricciónMaeIII ) 5 l

Enzima MaeIII (10.000 U / ml) 0,1 lH2O 24,9 lProducto de PCR 20 lVolumen total. 50 l

Incubar en baño termorregulado a 55ºC por 4 horas.

C. Electroforesis en gel de NuSieve agarosa al 2,5%.

Agregue 1 l de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de la digestión

por ER. Cuidadosamente cargue todo el volumen de cada muestra en losbolsillos del gel utilizando una micropipeta.

Tapar la cámara horizontal y conectar a la fuente de poder verificando la

polaridad.

Seleccionar el voltaje en 90 V y el tiempo de acuerdo al tamaño del fragmento

de DNA que se está analizando (1 hora).


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PROTOCOLO.

A. Se le entregarán tubos que contienen las muestras de la paciente con cáncermama, y sus familiares en las cuales ya se ha amplificado partes de los genes a

estudiar.

B. Prepare las muestras a cargar en el gel de la siguiente manera:

Alicuotar el producto de PCR de cada muestra por separado (preparadopreviamente).

Agregar 2,2 µl de amortiguador HMA 10X a cada muestra.

Desnaturar las muestras en baño María por 5 minutos a 95ºC.

Dejar enfriar lentamente en el baño hasta que la temperatura del agua llegue a

37ºC.

Agregar 5 µl de solución de carga 10X y cargar las cantidades como se lo

indique su ayudante.

C. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los geles han sido preparados previamente, continuando usted con los siguientes

pasos:

Limpiar los bolsillos con pipeta Pasteur y amortiguador, antes de cargar lasmuestras preparadas.

Tapar la cámara vertical y conectar a la fuente de poder verificando la

polaridad (positivo y negativo).


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Seleccionar el voltaje en 90 V y el tiempo de acuerdo al tamaño del fragmento

de DNA que se está analizando (1,5 hora).

6. Tinción del gel.

En esta etapa pida ayuda a su ayudante:

Una vez terminada la electroforesis, desmontar los vidrios de la cámara.

Separar los vidrios con cuidado para no romper el gel.

Depositar el gel en una cubeta forrada con papel aluminio y agregar una

solución de tinción con el componente GelRed® 3X, en TBE 1X.

Dejar incubando en la solución por 10 minutos a oscuras y posteriormente

observar el gel en un transiluminador UV.


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III. Análisis de secuencias de DNA La secuenciación de DNA consiste en la síntesis enzimática de hebras de DNA en

presencia de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs), los cuales actúan comoterminadores de la elongación de la cadena de DNA naciente. Los ddNTPs

son análogos de los desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) que participan

normalmente en la síntesis de DNA, pero se diferencian de éstos en que carecen del

grupo hidroxilo en la posición 3’ (Figura 1). Un ddNTP puede ser incorporado a una

cadena de DNA naciente mediante la formación de un enlace fosfodiéster entre su

grupo hidroxilo-5’ y el hidroxilo-3’ del último dNTP de la cadena, pero impide la

unión del próximo dNTP, provocando así la terminación prematura de la síntesis de

la nueva cadena de DNA.

A _

B

_

Figura 1: A. Estructura de un desoxinucleótido trifosfato (dNTP). B. Estructura de undidesoxinucleótido trifosfato (ddNTP).

En esta técnica se utiliza un partidor marcado en su extremo 5’ el cual se une a la

hebra de DNA que se desea secuenciar. El partidor es elongado por la DNA

Polimerasa en cuatro reacciones separadas que contienen los cuatro dNTPs

normales y, además uno de los cuatro ddNTPs en una menor concentración.

Una molécula de ddNTP puede ser incorporada al azar en cualquiera

de las posiciones correspondientes a su dNTP análogo, y cuando esto ocurre,

se detiene la elongación de la cadena. De esta forma, cada una de las cuatroreacciones produce una mezcla de cadenas de DNA terminadas prematuramente

y de distinta longitud, con un extremo 5’ común (determinado por la unión del

partidor a una región específica de la hebra de DNA molde) y un extremo 3’

variable, que depende de la posición en la que fue incorporado el ddNTP. Los

fragmentos resultantes que pueden variar en solo un nucleótido, pueden ser

separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturante y

la secuencia puede ser leída luego de exponer el gel a una película

autorradiográfica.


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A. Las 4 reacciones de terminación de la cadena se realizan en un mismo tubo,con cada uno de los 4 ddNTPs marcados con distintos fluoróforos. En el

secuenciador automático, las bandas del gel de electroforesis son atravesadaspor un láser que excita la marca fluorescente, la luz emitida es detectada por un

fotomultiplicador, el cual está conectado a un computador que colecta y analizalos datos.

B. Electroferograma de una secuencia automática. La secuencia es representadapor una serie de picos de distintos colores, cada uno correspondiente a la

posición de un nucleótido.

Procedimiento:Usted recibirá un electroferograma correspondiente a la mutación encontrada en la

familia analizada por usted. Lea cuidadosamente la secuencia de DNA anotando los

cambios nucleotídicos encontrados y comparando con la secuencia patrón.

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