1

Gyvųjų organizmų architektūra: baltymai

Dr. Zita Naučienė

Baltymai yra gausiausia biologinių makromolekulių klasė randama visose ląstelėse.

Baltymų įvairovė yra labai didelė, nei viena makromolekulių klasė negali lygintis su

baltymais pagal atliekamų funkcijų gausumą.

Baltymai (proteinai) didelės molekulinės masės organinės medžiagos, sudarytos iš

aminorūgščių, sujungtų peptidiniu ryšiu. Baltymo pavadinimas yra kilęs iš vokiečių kalbos

žodžio eiweiss, kuris reiškia kiaušinio baltymas. Kitas naudojamas baltymo vardas proteinas

yra kilęs iš graikų kalbos žodžio protos, reiškiančio - pirminis, svarbiausias.

Baltymai ląstelėse atlieka labai daug įvairių funkcijų. Pagrindinės yra šios:

1. katalizinė - tai yra viena svarbiausių baltymų funkcijų. Baltymai fermentai

katalizuoja ląstelėje vykstančias chemines reakcijas, todėl jos vyksta labai dideliais

greičiais ir švelniose sąlygose.

2. pernašos - baltymai organizme perneša įvairias medžiagas, nuo elektronų iki

makromolekulių. Hemoglobinas transportuoja deguonį iš plaučių į audinius,

žmogaus serumo albuminas perneša riebalų rūgštis kraujuje. Labai svarbi pernašos

baltymų klasė yra membranose lokalizuoti baltymai - nešikliai ir kanalai.

3. struktūrinė - baltymai susijungę su lipidais sudaro biologines membranas.

Pagrindinis jungiamojo audinio baltymas yra kolagenas, plaukai, nagai taip pat yra

baltymai.

4. hormoninė- jie reguliuoja medžiagų apykaitą. Pvz. insulinas mažina cukraus

koncentraciją kraujyje, somatotropinis hormonas reguliuoja augimą.

5. apsauginė - organizme sintetinami antikūnai apsaugo jį nuo bakterijų, pašalinių

baltymų. Virusinė infekcija žmogaus organizme iššaukia baltymo interferono

sintezę, kuris stabdo tolesnį virusų dauginimąsi.

6. energetinė - oksiduojantis baltymuose esančioms aminorūgštims, išsiskyrusi

energija panaudojama organizmo energetiniams poreikiams tenkinti.

7. motorinė - raumenys yra sudaryti iš aktino ir miozino, jų pagalba cheminė

energija yra paverčiama mechanine. Bakterijų baltymas flagelinas reikalingas jų

judėjimui.

8. toksinai - choleros, botulizmo, difterijos, gangrenos toksinai yra baltymai.

2

9. infekcinė medžiaga – baltymas prionas atsakingas už neurodegeneratyvinių ligų

išsivystymą tiek žmogaus, tiek gyvulių organizmuose.

10. receptorinė - baltymai receptoriai, išsidėstę ant membranų paviršiaus, sąveikauja

su hormonais, neuromediatoriais, šviesa ir kitomis medžiagomis ir perduoda

signalą per membraną.

11. reguliatorinė - baltymai gali prisijungti prie nukleorūgščių, kitų baltymų ir keisti

jų biologinį aktyvumą.

12. atsarginė maisto medžiaga - pieno kazeinas, kiaušinio baltymai yra medžiagos,

kuriose sukauptos organizmo vystymuisi reikalingos energetinės ir statybinės

medžiagos.

13. egzotiniai baltymai - antifrizinis baltymas pažemina šiaurėje plaukiojančių žuvų

kraujo užšalimo temperatūrą, baltymas monelinas yra kelis tūkstančius kartų

saldesnis už cukrų, jūrų kriauklės išskiria baltymus, kurie priklijuoja jas prie

įvairių paviršių.

Baltymų sudėtis

Baltymai, kurie sudaryti tiktai iš aminorūgščių, vadinami paprastaisiais baltymais arba

proteinais. Tačiau dažnai į baltymų sudėtį įeina įvairios organinės ar neorganinės

medžiagos. Tokie baltymai vadinami sudėtiniais baltymais arba proteidais. Sudėtiniai

baltymai gali sudaryti makromolekulines struktūras, dalyvauti įvairiose reakcijose. Sudėtinių

baltymų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

Baltymai labai skiriasi pagal molekulės dydį ir molekulinę masę. Citochrome c yra 104

aminorūgštys, kurios sudaro vieną polipeptidinę grandinę. Fermentas glutamino sintetazė

sudaryta iš dvylikos atskirų baltyminių subvienetų ir jo molekulinė masė siekia 620000.

Žinduolių raumenų baltymas titinas vienoje polipeptidinėje grandinėje turi beveik 27000

aminorūgščių.

Baltymų struktūra Baltymų bendrus bruožus lemia cheminė struktūra - tai makromolekulės, sudarytos iš

aminorūgščių, sujungtų peptidiniu -CO-NH- ryšiu. Nepriklausomai nuo organizmo rūšies ar

ląstelės tipo, visi baltymai sudaryti iš tų pačių 20-ties aminorūgščių, kurios (panašiai kaip 25

abecėlės raidės gali sudaryti daugybę skirtingų žodžių, sakinių ar knygų) besijungdamos

tarpusavyje skirtinga tvarka ir kiekiu sudaro begalinę įvairovę baltyminių molekulių.

3

Skiriami keturi baltymų struktūrinės sandaros lygiai, kurių kiekvienas turi savo ypatybes.

Visi baltymai yra linijiniai aminorūgščių polimerai, kurių seka nereguliari, tačiau savita

(specifinė). Aminorūgščių išsidėstymas polipeptidinėje grandinėje vadinamas baltymo

pirmine seka arba pirmine struktūra (1 pav, a). Unikali kiekvieno baltymo pirminė seka

koduojama genų DNR. Teoriškai iš 20 skirtingų monomerų galima sudaryti 20n skirtingų

polipeptidų, kur n yra aminorūgščių skaičius grandinėje. Daugelis polipeptidų sudaryti iš

daugiau nei 100 aminorūgščių, o kai kurių molekulėse jų yra virš 1000. Akivaizdu, kad

baltymų sudaromų pirminių sekų įvairovė yra astronominė. Tuo paaiškinama didžiulė

baltymų ir jų atliekamų biologinių funkcijų įvairovė.

Aukštesni baltymų struktūros lygmenys, kuriuos lemia pirminė seka, pavaizduoti 1 pav.

Pav.1. Baltymų struktūros lygiai.

Pirminė (a), antrinė (b), tretinė (c) ir ketvirtinė (d) baltymo struktūra

Sekantis baltymo struktūros lygis - antrinė struktūra (Pav. 1, b), yra polipeptidinės

grandinės išsidėstymas erdvėje. Tretinė struktūra yra antrinės struktūros elementų

išsidėstymas erdvėje vienas kito atžvilgiu (Pav. 1, c). Tretinė struktūra (sąlygota antrinės ir

pirminės) labai svarbi biologiniam baltymų aktyvumui pasireikšti. Kadangi šia struktūra

užtikrina didelis skaičius silpnų sąveikų, ji labai jautri įvairiems aplinkos poveikiams.

Susidarant tretinei struktūrai, kai kurių baltymų molekulėse tarp Cys gali susidaryti

kovalentiniai 4 disulfidiniai tilteliai. Jie gali būti suardomi redukuojant, tuomet polipeptidinės

grandinės fragmentų išsidėstymas vienas kito atžvilgiu keisis. Disulfidinių tiltelių padėtys

priklauso nuo Cys užimamos padėties grandinėje.

Ketvirtinė struktūra būdinga baltymams, sudarytiems iš daugiau nei vienos polipeptidinės

grandinės (Pav. 1, d). Tokie baltymai vadinami oligomeriniais.

4

Antrinė baltymų struktūra

Tam tikros polipeptidinio ryšio savybės lemia polipeptidinės grandinės išsidėstymą

erdvėje (konformaciją). Žinomi dvi pagrindinės antrinės baltymų struktūros atmainos - α-

spiralė ir β-klostės.

1951 m. Amerikos mokslininkai Polingas ir Kori, įvertindami peptidinio ryšio savybes

(cheminių ryšių ilgiai, valentinių kampų dydžiai,vandenilinių ryšių ilgiai) bei rentgeno

struktūrinės analizės duomenis, pasiūlė antrinės baltymų struktūros modelį. Šie mokslininkai

baltymų struktūrą pradėjo tirti, analizuodami rentgeno spindulių difrakciją paprastų peptidų

(di- ir tripeptidų) kristaluose. Taip jie nustatė, kad peptidinė grupė baltyminiuose dariniuose

yra dalinai konjunguota, ryšys C-N gali būti viengubas ir dvigubas, peptidinė grupė gali

egzistuoti dviejose formose - neutralioje ir polinėje (Pav. 2,a). Jie pastebėjo, kad peptidinė

grupė yra plokščia ir nelanksti. Kadangi peptidinėje grupėje ryšys tarp C ir N yra dalinai

dvigubas, laisvas sukimasis apie ryšį tarp karbonilo grupės anglies imino grupės N atomų

negalimas (šie ryšiai Pav. 2. pavaizduoti plokštumoje). Peptidinėje grupėje (žr. Pav. 2, c)

ryšio C-N ilgis 1,32 Å (t.y. tarpinė reikšmė tarp C-N viengubo ryšio (1,49 Å) ir C=N

dvigubo ryšio (1,27 Å). Tai rodo, kad ryšys C-N peptidinėje grupėje dalinai (40%) dvigubas.

Dėl konjugavimo C=O ryšis tampa dalinai viengubas, ir todėl pailgėja: normaliai karbonilinė

grupėje grupėje ryšio ilgis 1,21 Å, o peptidinėje grupėje - 1,24 Å.

Pav. 2. Konjuguoti ryšiai tarp atomų, sudarančių peptidinę grupę (a); Cα atomo ryšiai (b); peptidinė

grandinė kaip plokštumų, kurias jungia lankstus fragmentas su išsikišusia šonine grupe, seka (c).

Taigi, visa peptidinė grupė yra dalinai konjuguota, jos sudaryme dalyvauja π elektronai,

todėl ją sudarantys atomai išsidėsto vienoje plokštumoje (tai vadinama koplanarumo

5

principu). Jų sudaromos plokštumos atžvilgiu imino grupės H atomas ir karbonilinės grupės

O užima trans padėtį. Todėl peptidinė grandinė gali būti vaizduojama, kaip seka nelanksčių

plokštumų, kurias skiria metileninė grupė su pakaitu R: CHR. Grandinėje sukimasis galimas

tik apie Cα atomo sudaromus ryšius, todėl kampai tarp šio atomo ryšių sutartinai žymimi φ

(fi) N-Cα ryšiui ir ψ (psai) Cα–C ryšiui (Pav. 2, b). Teoriškai jie gali įgauti bet kokią reikšmę

nuo –180o iki +180o, tačiau realiai tai neįmanoma, nes greta esantys atomai gali užimti tik

tam tikrą padėtį erdvėje, netrukdydami joje išsidėstyti kitiems atomams pvz., peptidinių

grupių sudaromos plokštumos negali persidengti). Kiekviena peptidinė grupė sudaro du

vandenilinius ryšius, kurių ilgis lygus 2,8 Å (Kiekvienos peptidinės grupės deguonis ir

vandenilis gali sudaryti du vandenilinius ryšius su kitų grupių vandenilio ir deguonies

atomais).

Pav. 3. Dešinio sukimo α-spiralės susidaro, peptidinių grupių plokštumoms išsidėstant lygiagrečiai

spiralės ašiai (a); reguliarūs vandeniliniai ryšiai tarp vijų sutvirtina spiralės struktūrą (b); α-spiralės

vaizdas “iš viršaus” (c).

Pagal šiuos principus L.Polingas (L.Pauling) ir R. Kori (R.Corey) pasiūlė taip vadinamąjį

α-spiralės modelį (Pav. 3). Pagal jį, baltymo išsidėstymui palankiausia struktūra, kurioje

polipeptidinė grandinė erdvėje susisuka į spiralę, sukimasis vyksta pagal laikrodžio rodyklę,

iš kairės į dešinę. Vienas α-spiralės žingsnis, t.y. atstumas tarp vijų lygus 5,4 Å. Viename

žingsnyje telpa 3,6 aminorūgštys - reiškia struktūra atsikartoja (identiškumo periodas) kas 5

žingsnius arba fragmentą iš 18 aminorūgščių. Cilindro, kuriame išsidėsto visi C atomai

6

diametras lygus 10,1 Å. Spiralę stabilizuoja vandeniliniai ryšiai, kuriuos kiekviena peptidinė

grupė sudaro su kita, nuo jos grandinėje ketvirta iš eilės peptidine grupe. Iš viršaus α-spiralė

atrodo lyg cilindro karkasas iš polipeptidinės grandinės, vidus tuščias, o į išorę nukreiptos

aminorūgščių šoninės grupės.

Polingas pasiūlė ir taip vadinamąją β klostytą struktūrą. Šiuo atveju polipeptidinė

grandinė nėra susisukusi į spiralę, bet yra ištempta, o vandeniliniai ryšiai susidaro ne tarp

grupių esančių toje pačioje polipeptidinėje grandinėje, tačiau tarp skirtingose polipeptidinėse

grandinėse esančių peptidinės grupės karbonilo ir imino atomų. Tokios polipeptidinės

grandinės gali išsidėstyti lygiagrečiai arba antilygiagrečiai (Pav.4). α- spiralė ir β- klostė yra

plačiausiai paplitusios antrinės struktūros įvairių tipų baltymuose. Be jų, dar sutinkami β

linkiai ar β kilpos. Jos būna tose polipeptidinės grandinės vietose, kur ji staigiai keičia savo

kryptį, dažnai net į priešingą. Linkiai, esant β-konformacijai, yra polipeptidinės grandinės,

kuri 180o kampu keičia kryptį, galuose. Tokį linkį dažnai sudaro 4 aminorūgštys, Pirmosios

aminorūgšties linkyje peptidinė grupė sudaro vandenilinį ryšį su ketvirtosios aminorūgšties

peptidine grupe. Šiuose linkiuse labai dažnai sutinkamos glicino ir prolino aminorūgštys.

(a) (b)

Pav. 4. β-klostyta struktūra gali susidaryti tarp antilygiagrečiai (a) ir lygiagrečiai (b) išsidėsčiųsių

polipeptidinių grandinių – pirmu atveju šalia yra gretimų grandinių C ir N-galai, antru – C-galas yra

greta kitos grandinės C-galo.

7

Kai kurie svarbūs struktūriniu požiūriu fibriliniai baltymai sudaro spiralinę antrinę

struktūrą, tačiau tai kitoks spiralės tipas, nei α- spiralė. Kolagenas yra fibrilinis baltymas,

sudarantis per 25% visų baltymų žinduolių organizmuose. Tris susipynusios kolageno

grandinės sudaro molekulę, vadinamą tropokolagenu, kurio molekulinė masė yra apie 285

kD. Tiriant kolageno aminorūgščių sudėtį, pasirodė, kad baltymo molekulėje yra apie 1000

aminorūgščių, ir jų tarpe labai daug glicino bei prolino. Kolageno molekulėje randamos dvi

kituose baltymuose labai retai sutinkamos aminorūgštys 4-hidroksiprolinas Hyp (I) ir 5-

hidroksilizinas(II). Kolagene yra 35% Gly, 11% Ala, 21% Pro ir Hyp.

N

OH

COOH H2N-CH2-CH-CH2-CH2-C-COOH

OH NH2

(I) (II) Vykstant kolageno sintezei, į polipeptidinę grandinę įjungiamos aminorūgštys prolinas ir

lizinas. Prolino hidroksilinimą baltymo molekulėje katalizuoja fermentas prolilo hidroksilazė,

į kurio aktyvų centrą įeina Fe2+jonas. Fermento aktyvumui reikalinga askorbo rūgštis, kuri

palaiko aktyviame centre geležį redukuotame būvyje. Todėl sergant skorbutu, sutrinka

kolageno sintezė, tuo pačiu – jungiamojo audinio funkcijos.

Elektroninės mikroskopijos ir rentgeno struktūrinės analizės duomenimis parodyta, kad

tropokolageno molekulė yra pailgo stulpelio (kurio ilgis 3000 Å ir skersmuo 15 Å) formos.

Ši molekulė yra vienas iš ilgiausių žinomų baltymų. Kiekviena iš trijų polipeptidinių

grandinių sudaro spiralę kuri skiriasi nuo klasikinės α-spiralės. Polipeptidinės grandinės

sukasi viena apie kitą (dešinio sukimo spiralė), taip susidaro trigubos superspiralės struktūra.

Grandinės tarpusavyje sudaro vandenilinius ryšius ir išsidėsto viena kitos atžvilgiu taip, kad

tarpuose atsiduria Gly (turintis mažiausią R), tai leidžia spiralėms susipakuoti glaudžiausiu

būdu. Kolageno skaidulos stabilizuojamos ir kovalentinių ryšių, kurie susidaro tarp skirtingų

tropologeno molekulių lizino ir hidroksilizino grupių. Taip sutvirtinta triguba superspiralė

suteikia kolagenui ypatingą mechaninį tvirtumą. Tropokolageno molekulės tvarkingai

išsidėstydamos sudaro kolageno skaidulas. Viena 1 mm skersmens kolageno skaidula gali

išlaikyti 10 kg svorį.

Keratinai yra baltymų, kuriems būdinga panaši sudėtis ir biologinė funkcija, grupė. Šią

grupę sudaro α-keratinai irβ-keratinai.

α-keratinai yra pagrindiniai plaukų, nagų bei gyvūnų odos baltymai. Jie įeina į citoskeleto

elementų (tarpinių filamentų) sudėtį. Plaukų α-keratino molekulės yra ilgos (apie 300

aminorūgščių ilgio) α-spiralės, kurios po dvi susisuka į kairiojo sukimo superspiralę. Tkią

8

savybę šioms spiralėms suteikia tai, kad jų sudėtyje kas ketvirta (t.y., esanti kiekviename

spiralės žingsnyje) aminorūgštis hidrofobinė, jų šoninės grupės sulimpa tarpusavyje ir tvirtai

sulipina dvi grandines. Tokią struktūrą sutvirtina įvairus kiekis disulfidinių tiltelių (jų daug

nagų keratine, mažiau – plaukų keratine). Plaukų “cheminis garbanavimas” pagrįstas

disulfidinių tiltelių suardymu (redukuojant) ir jų susidarymu kitose padėtyse (vėl

oksiduojant).

β-keratinai įeina į paukščių plunksnas ir roplių odą, jie sudaryti pagrinde iš β-klostytos

struktūros.

Tretinė baltymų struktūra (globuliniai baltymai)

Ilga polipeptidinė grandinė, kuriai būdinga tam tikra antrinė struktūra, erdvėje susisuka į

kompaktišką globulę. Šis baltymo molekulės antrinės struktūros elementų išsidėstymas

erdvėje vadinamas tretine baltymo struktūra. Polipeptidinė grandinė erdvėje sudaro struktūrą,

kurios vidinė energija yra minimali, aminorūgščių šoninės grupės tarpusavyje ar su vandeniu

sudaro daugiausiai galimų ryšių. Baltymai, turintys tą pačią aminorūgščių seką, įgauna tą

pačią erdvinę struktūrą, t.y., baltymo konformaciją nulemia aminorūgščių pirminė seka.

Tretinė struktūra dažniausiai lemia baltymo funkcijas. Pavz., aktyviame fermento centre

aminorūgščių šoniniai radikalai, esantys skirtingose polipeptidinės grandinės vietose, suartėja

erdvėje ir kartu dalyvauja katalizėje.

Tretinę struktūrą palaiko įvairūs cheminiai ryšiai tarp aminorūgščių šoninių radikalų.

Dažniausiai tai silpni nekovalentiniai ryšiai, kurie lengvai suyra, pakitus temperatūrai, terpės

pH, joninei jėgai. Šis antrinės ir tretinės struktūros suardymas vadinamas denatūracija.

Tretinę struktūrą stabilizuoja ir kovalentiniai disulfidiniai ryšai, susidarantys tarp dviejų

cisteino molekulių, esančių toje pačioje polipeptidinėje grandinėje. Tretinę struktūrą

stabilizuoja šie nekovalentiniai ryšiai:

1) hidrofobinė sąveika tarp nepoliarinių aminorūgščių (Leu, Ile, Phe, Ala) šoninių

radikalų,

2) elektrostatinė sąveika tarp aminorūgščių turinčių priešingą krūvį, pvz. tarp Lys ir Glu,

Arg ir Asp,

3) vandeniliniai ryšiai tarp aminorūgščių šoninių radikalų, pvz. Ser ar Thr -OH ir Asp ar

Glu CO,

4) vandeniliniai ryšiai tarp aminorūgščių šoninių grupių ir polipeptidinės grandinės

peptidinės grupės CO ir NH,

5) vandeniliniai ryšiai tarp peptidinės grupės CO ir NH, susidarant β-klostytai struktūrai,

9

6) sąveika tarp aminorūgščių šoninių grupių ir kofaktorių.

Tiriant daugelio baltymo globulėje esančių aminorūgščių išsidėstymą, buvo pastebėta, kad

• nepolinių aminorūgščių Met, Val, Leu, Ile, Phe šoninės grupės paprastai nukreiptos į

baltymo molekulės vidų ir nekontaktuoja su vandeniu. Hidrofobinė sąveika tarp šių grupių

didele dalimi lemia baltymo tretinės struktūros stabilumą.

• aminorūgščių Lys, Arg, His, Asp, Glu įkrautos grupės išsidėsto baltymo paviršiuje ir su

vandeniu sudaro vandenilinius ryšius. Būdamos baltymo molekulės viduje, jos dažniausiai

atlieka specifines chemines funkcijas - įeina į fermento aktyvų centrą, suriša metalo jonus,

kofermentus.

• polinės aminorūgštys Tyr, Ser, Thr, Asn, Gln paprastai būna baltymo molekulės

išorėje, tačiau gali būti sutinkamos ir molekulės viduje. Jos tarpusavyje sudaro vandenilinius

ryšius.

Tretinės struktūros sudėtyje sutinkami pagrindiniai antrinės struktūros elementai - α

spiralė, β-klostytos struktūros, kilpos, linkiai, superantrinės struktūros elementai.

Baltymų domenai

Taigi, tretinę struktūra lemia kovalentiniai disulfidiniai ryšiai, vandeniliniai ryšiai,

elektrostatinė sąveika tarp šoninių radikalų įkrautų funkcinių grupių, van der Vaalso sąveika,

taip pat labai svarbi hidrofobinė sąveika. Skirtumas tarp antrinės ir tretinės struktūrų yra gana

santykinis, skiriamos tarpinės formos, taip vadinamos viršantrinės struktūros: motyvai ir

domenai. Motyvas - struktūra, sudaryta iš keleto antrinės struktūros elementų ir turinti

būdingą erdvinį išsidėstymą. Domenai - sudaryti iš motyvų - kai kuriems baltymams

būdingos tam tikros stabilios struktūros (kurios gali daug kartų pasikartoti molekulėje). Tai

dažnai būna kompaktinė sritis (sudaryta iš 40-400 amino rūgščių), kuri išsiskiria bendroje

grandinėje, kaip atskiras elementas, turintis stabilią tretinę struktūrą. Tai diskretiški,

nepriklausomai susisukantys baltymų tretinės struktūros funkciniai ir struktūriniai elementai.

Baltymų judrumas

Baltymo molekulėje yra organizuotos ir neorganizuotos struktūros. Labai svarbu

pažymėti, kad šios organizuotos ir tvarkingos struktūros juda ir dažnai labai greitai. Vyksta

momentinės osciliacijos apie vieną, labai stabilią konformaciją. Baltymai yra dinaminės

struktūros. Judėti gali atskiri atomai, aminorūgščių šoniniai radikalai, net atskiri domenai.

Atomų vibracijos vyksta labai greitai (10-15-10-11 s) ir nedideliais atstumas (~0,05nm).

10

Atomų grupės ar domenai juda žymiai lėčiau ir didesniais atstumais. Dideli konformaciniai

pakitimai vyksta reaguojant antigenui su antikūnu, fermentui su substratu, receptoriui su

ligandu. Judėjimo greitis gali būti 10-9-10-3s ir grupės gali judėti per kelis nm.

Ketvirtinė baltymų struktūra

Gamtoje sutinkama daug oligomerinių baltymų sudarytų iš kelių polipeptidinių grandinių,

vadinamų subvienetais, sujungtų nekovalentiniais ryšiais. Šių subvienetų erdvinis

išsidėstymas vadinamas baltymo ketvirtine struktūra. Dauguma baltymų, kurių molekulinė

masė >100kDa sudaryti iš vieno ar skirtingų tipų subvienetų. Ketvirtinę struktųrą palaiko

vandeniliniai, elektrostatiniai, hidrofobiniai ryšiai. Subvienetus lengva atskirti vienus nuo

kitų pakeitus tirpalo pH ar joninę jėgą.

Fermentų sąveika ir metabolinis tuneliavimas

Vienas iš baltymų tarpusavio sąveikos pavyzdžių yra fermentų tarpusavio sąveika.

Medžiagų tiesioginis perdavimas ferment-fermentiniu kanalu nuo vieno aktyvaus centro į

kitą vadinamas tuneliavimas. Jos neišeina į supančią erdvę ir nepasiskisto pusiausvyroje su

analogiškom molekulėm bendrame erdvės skyriaus tūryje. Angliškų terminų gausa

(channeling, coupling, processivity, direct transfer, vectorial transfer) tam pačiam reiškiniui

aprašyti būdinga pradiniam tyrimo etapui, kuomet dar nesusiformavusi vieninga

terminologija. Tuneliavimas ląstelei naudingas ląstelės t\“tirpiklio” kiekį. Juk daugybė

metaboliniuose keliuose vaizduojamų metabolitų turi būti ištirpę tame pačiame tirpiklyje,

vandenyje, kurio kiekis yra ribotas.

Tuneliavimas gali vykti keliais būdais: kovalentiškai jungiant tarpinius metabolitus

aktyviuose fermentų centruose (1); nejungiant jų kovalentiškai (2).

Atitinkamai, tuneliavimas gali būti įvairiaus laipsnio - kietas (angl. k. - tight) arba pilnas,

kuomet tarpiniai metabolitai visai nepasirodo tunelio išorėje, būdingas mechanizmui (1) ir

laidus (angsl. k. - leaky) arba nepilnas, kai metabolitai tam tikru laipsniu išeina iš tunelio,

būdingas mech. (2).

Kietas tuneliavimas naudingas, kai tarpiniai tam tikros fermentų sekos produktai nėra

reikalingi (naudojami) kitose sekose. Pvz., tarpiniai baltymo sintezės produktai yra nebaigti

beprasmiai baltymai. Jie jungiami kovalentiškai, nes svarbu, kad į ląstelę patektų tik galutinis

produktas. Tačiau glikolizės tarpiniai produktai G6P ir DHAP reikalingi ir kituose keliuose,

todėl labiau pagrįstas laidus tuneliavimas. Riebalų rūgščių β-oksidacijos tarpiniai produktai

ilgos grandinės acil-KoA stipriai inhibuoja daugelį mitochondrijų fermentų. Juos svarbu

tuneliuoti kietai, kad nepasireikštų žalingas poveikis.

11

Viename ląstelės erdvės skyriuje esantys nuoseklios fermentų sekos nariai tarpusavyje

sudaro kompleksus ar bent išsidėsto erdvėje neatsitiktine tvarka. Kai kuriose sekose nustatyti

stabilūs multifermentiniai kompleksai: du labai panašūs α-ketorūgščių oksidacijos

kompleksai (piruvato dehidrogenazė ir 2-oksiglutarato dehidrogenazė), riebalų rūgščių

sintezės kompleksas. Baltymų ar fermentų kompleksai angliškai vadinami įvairiai - protein

machines, clusters, supramolecular complexes, aggregates, metabolons. Multifunkciniai

baltymai yra ribinis fermentų aktyvumo suliejimo atvejis, kuomet vienoje polipeptidinėje

grandineje yra keli domenai, pasižymintis skirtingų fermentų aktyvumu. Toks pavyzdys yra

Neurospora Crassa kompleksas AROM (shikimo rūgšties kelias), kurio vienoje

polipeptidineje grandineje yra penki fermentiniai aktyvumai. Kituose mikroorganizmuose,

pvz., E.coli Lys, Met, Thr ir Ile sintezės iš L-Asp kelias reakcijas atlieka vienas polipeptidas

- tetrameras α4, kurio kiekvieno subvieneto N-gale yra domenas su asparto kinazės

aktyvumu, o C-gale - homoserino dehidrogenazės domenas. Aukštesniųjų organizmų

ląstelėse tris pirmąsias pirimidinų biosintezės stadijas katalizuoja fermentų kompleksas

karbamoilfosfato sintazė, aspartat-karbamoilo transferazė ir dihidroorotazė, kurie greičiausiai

yra vienoje polipeptidinėje grandinėje.

Be tokių lengvai nustatomų tvirtų sąveikų, galima savita sąveika tarp fermentų, kurie

tradiciškai laikomi tirpiais. Pvz., žiuželinių pirmuonių Tripanosoma brucei, tripanosoma

cruzi ir Critidia fasciculata citoplazmoje glikolizės fermentai sukaupti specifinėje

peroksisomoje, vadinamoje glikosoma. Šie kraujuje parazituojantys organizmai visą energiją

gauna glikolizės būdu, ir glikosoma užtikrina pakankamai didelį jos greitį. Fermentų

tarpusavio sąveika glikosomoje tokia stipri, kad kompleksas išlieka, net pašalinus membraną.

Kitais atvejais tirpūs fermentai nėra jungiami membraninių struktūrų, tačiau tarp jų

egzistuoja įvairaus stiprumo dinaminė sąveika

Apibendrinant, galima abejoti, ar apskritai ląstelėje įmanoma laisva fermento būsena.

Sąveika su polimerinėmis molekulėmis gali keisti fermentų kinetines savybes - pvz.,

susirišimas su DNR aktyvina nukleorūgščių metabolizmo fermentus. Kai kurie fermentai yra

dinaminėje pusiausvyroje tarp surištos ir laisvos būsenų, toks reiškinys vadinamas jų būsenos

dviprasmiškumu (angl. k. - ambiquity). Pusiausvyra tarp tokių formų reguliuojama. Savo

ruožtu, tokia dinaminė asociacija arba dinaminis tuneliavimas svarbus reguliaciniu požiūriu.

Pvz., heksokinazės susirišimas su mitochondrijų membrana keičia jos kinetines savybes

(didina Km), o padidėjus gliukozės koncentracijai citozolyje heksokinazės sąveika su

mitochondrijomis suyra.

12

Tuneliavimo privalumai

Viduląstelinės difuzijos greičiai nėra pakankami gyvybinių procesų užtikrinimui, todėl

tuneliavimas yra labai svarbus. Kokie yra multifermentinių kompleksų egzistavimo, arba

tuneliavimo teikiami privalumai?

1) Suartinimo efektas. Tuneliavimo dėka bendras sistemos veikimo greitis žymiai

padidėja, nes:

a) substratai tiesiogiai perduodami nuo vieno fermento aktyvaus centro į kitą.

b) substrato koncentracija antrojo aktyvaus centro aplinkoje yra žymiai didesnė, nei tuo

atveju, jei jie pasiskirstytų po visą citozolio tūrį (bulk phase), taigi, aukšta substrato

koncentracija pasiekiama nedidelio kiekio substrato molekulių sąskaita (5 pav.).

(a) (b)

5 pav. Tarpiniam metabolitui išeinant į aplinką, jis tolygiai pasiskirsto, joje ištirpdamas (a) todėl

aplinkoje susidaro mažesnė substrato sekančiam fermentui koncentracija, nei tuo atveju (b), kai

metabolites aplinkoje nepasirodo ir visas jo kiekis yra “tarpfermentiniame tunelyje”.

c) sumažėja tarpinių metabolitų difuzijos laikas. Kai praskiestame tirpale matuojamas

sistemos iš kelių atskirai veikiančių fermentų bendras greitis paprastai būtinas tam

tikras laikas stacionariai būsenai pasiekti. Šis laikas mažėja ir net visai išnyksta,

jeigu, didinant fermentų koncentracija tirpale, fermentai sudaro kompleksus. Tada

tarpiniai metabolitai perduodami tiesiogiai iš vieno aktyvaus centro į kitą.

d) taupomas ląstelės tirpiklis (H2O);

e) tarpiniai metabolitai apsaugomi nuo terpės poveikio ar joje esančių degraduojančių

fermentų (fosfatazių, hidrolazių) poveikio;

f) ląstelė apsaugoma nuo žalingo kai kurių metabolitų poveikio (aldehidų, ilgos

grandinės acil-KoA).

Dėl heksokinazės sąveikos su mitochondrijomis sintezuotas ATP greičiau “patenka”

heksokinazei, nei pridėtas iš išorės, o ADP greičiau “grąžinamas” mitochondrijoms. Mažėja

13

galimybė, kad oksidacinis fosforilinimas bus inhibuotas ATP. ATP panaudojamas

“nesusimaišęs” su citozoline ATP sankaupa.

2. Papildomos reguliacinės galimybės, kurias suteikia sąveika tarp nuoseklios fermentų

sekos narių. Tai gali būti alosterinio pobūdžio reguliacija, kai efektoriaus susirišimas su

vienu iš sekos fermentų veikia kitus fermentus (koordinuota reguliacija). Fermentų sąveikos

metu gali būti palankiai keičiama kitų fermentų konformacija ir kinetines savybes. Įdomus

fermentų tarpusavio sąveikos pavyzdys yra laisvai triptofano sintazei būdingas triptofano

hidrolazinis aktyvumas, kuris inhibuojamas, jai susirišus su kitais fermentais.

Kadangi baltymų koncentracija ląstelėje ir jos erdvės skyriuose tokia didelė, sąveikaudami

tarpusavyje, jie suteikia ląstelei supramolekulinės struktūros bruožų, matomų elektroniniu

mikroskopu.. Šiuos ląstelės struktūros bruožus lemia baltymų sąveika. Galima sakyti, kad

fermentų ir kitų baltymų tarpusavio sąveika lemia aukštesnį ląstelės struktūrinės

organizacijos lygį.

Matematinis baltymų struktūros modeliavimas

Kritinė baltymų savybė yra gebėjimas įgauti teisingą erdvinę struktūrą, kuri nulemia baltymo

funkcijas. Dauguma ligų, kaip pavyzdžiui Alzheimer’io liga, yra susijusių su neteisingą erdvinę

struktūrą turinčiais baltymais [1]. Baltymo struktūros identifikavimas yra svarbus žingsnis bandant

paaiškinti jo biologinę funkciją ir įtaką sveikatai. Struktūros nustatymas yra sunki užduotis,

reikalaujanti daug laiko ir lėšų. Todėl mokslininkai ėmėsi nuspėti baltymo struktūrą remiantis jo

seka, pasitelkdami kompiuterių pagalbą.

Tradiciškai baltymų erdvinė struktūra nustatoma naudojantis Rentgeno-struktūrine analize arba

branduolio magnetinio rezonanso metodu (BMR). Pirmasis metodas paprastai nesuteikia

informacijos apie vandenilio atomų padėtį, juo naudojantis negalima patikimai atskirti azotą nuo

deguonies ar nuo anglies. Tai reiškia, kad naudojantis Rentgeno struktūrine analize asparto rūgšties,

glutamino ir treonino šoninių grandinių atomų cheminė sudėtis nustatoma nepatikimai ir yra

nuspėjama pagal baltyminę aplinką, supančią šias amino rūgštis. BMR metodo trūkumą sudaro tai,

kad šiuo metodu galima tirti baltymus nedidesnius nei 30 kD. Nustatant baltymo struktūrą svarbus

matas yra skiriamoji geba (angl. – resolution), kuris nusako nustatytos struktūros detalumą, kokybę.

Skiriamoji geba išreiškiama angstremais (Å), kuriais matuojamas atstumas. Kuo mažesnė jo

reikšmė, tuo aukštesnė skiriamoji geba. Baltymo struktūra yra nustatoma pagrindinai skiriamosios

gebos intervale tarp 1.7 Å ir 3.5 Å. Reikšmės žemesnės nei 2.0 Å nurodo aukštą skiriamąją gebą.

14

Pavyzdžiui, kai skiriamoji geba yra 5.0 Å, bendras baltymo susilankstymas yra aiškus, tačiau

nesuteikta jokios informacijos apie tikslesnį amino rūgščių išsidėstymą. Esant 2.5 Å skiriamajai

gebai nustatomas tikslesnis atomų išsidėstymas, įskaitant amino rūgščių šoninių grandinių

išsidėstymą. 1.2 Å skiriamoji geba nurodo aukštos kokybės struktūros nustatymą, kuris suteikia

informacijos ne tik apie tikslų amino rūgščių išsidėstymą, bet ir nusako kai kurių vandenilio atomų

buvimo vietą.

Baltymo pirminė amino rūgščių seka yra pagrindinis veiksnys, nulemiantis jo galutinę

struktūrą. Šiuo metu dėka genų sekvenavimo kartu sparčiai gausėja informacijos apie baltymų,

kuriuos koduoja tie genai, amino rūgščių sekas. Nors eksperimentinis tretinės baltymų struktūros

nustatymas tampa vis efektyvesnis, žinomų sekų skaičius vis dar žymiai didesnis nei žinomų

struktūrų. Matematinis baltymų struktūros modeliavimas turėtų šį skaičių sulyginti. Taikomi keturi

būdai antrinės baltymų struktūros spėjimui:

1. Empiriniai statistiniai metodai, naudojantys žinomų erdvinių struktūrų parametrus.

2. Metodai, paremti fizikocheminėmis amino rūgščių savybėmis, tokiomis kaip dydis, grupių

išsidėstymas, hidrofobiškumas, krūvis, vandenilinių ryšių sudarymo galimybė ir panašiai.

3. Metodai paremti spėjimo algoritmais, kurie naudoja žinomas homologiškų baltymų struktūras

nustatant antrinę norimo baltymo struktūrą.

4. Molekulinės mechanikos metodai, naudojantys jėgų lauko parametrus modeliuojant ir nustatant

antrinę struktūrą.

Teigiama, kad baltymai, kurių amino rūgščių sekos atitinka bent 30 %, turės tą patį erdvinį

susilankstymą ir greičiausiai atliks panašias funkcijas [2]. Todėl baltymų homologija yra svarbi

savybė identifikuojant giminingus baltymus su vienodu erdviniu susilankstymu. Taigi, tiriamo

baltymo seka gali būti palyginama su žinoma homologiško baltymo erdvine struktūra taikant vieną

iš dviejų pagrindinių strategijų. Pirmu metodu, tiriamo baltymo seka yra palyginama su žinomos

erdvinės struktūros baltymais modeliais. Kiekvienas iš šių palyginimų turi jam priskirtą reikšmių

rinkinį. Reikšmių rinkiniai yra klasifikuojami ir išrenkama geriausia reikšmė. Pagal šią geriausią

reikšmę tiriamai sekai ir priskiriama erdvinė struktūra. Antru metodu tiriamo baltymo seka

sutapatinama su žinoma baltymo struktūra ir skaičiuojama tiriamo baltymo sekos energija. Šis

metodas naudojamas kai nerandama esminių panašumų tarp tiriamo baltymo sekos ir žinomos

struktūros baltymų sekos.

Žinomas baltymų struktūras galima rasti internetinėse duomenų bazėse. Egzistuoja dviejų tipų

duomenų bazės: pirminės (archyvinės) ir antrinės. Pirminėse duomenų bazėse galima rasti

eksperimentinius rezultatus ir šiek tiek interpretacijos, pavyzdžiui DNR, RNR ar baltymų sekas.

15

Antrinėse duomenų bazėse surenkama išanalizuota informacija. Išskiriamos trys jungtinės duomenų

bazių paieškos sistemos – Entrez, EBI ir DBGet.

Svarbus baltymų struktūros ir funkcijų suvokimui yra kompiuterinės grafikos taikymas

biomolekulių vaizdavimui ir manipuliavimui. Kompiuterio pagalba gaunamas baltymų struktūros

vaizdas atskleidžia santykinį daugumos ar net visų atomų makromolekulėje išsidėstymą. Sukurtas

vaizdas taip pat atskleidžia baltymo fizikines, chemines ir elektrines savybes ir suteikia

įsivaizdavimą apie jo funkcijas organizme. Egzistuoja trys molekulių grafinio vaizdavimo lygiai:

1D formulė arba struktūrinė formulė (1 paveikslas); 2D cheminė struktūra (2 paveikslas); 3D

molekulinė struktūra (3 paveikslas). Tipiškai duomenys makromolekulių erdvinės struktūros failų

įrašuose yra atomų koordinatės (x, y, z), taip pat duomenys apie ryšių ilgius bei ryšių tipus

kiekvienai įmanomai sujungtų atomų porai. Šiuo aprašo būdu paremtas Baltymų duomenų banko

(PDB – Protein Data Bank) failo formatas, aprašantis biomolekulių erdvines struktūras. Baltymų

duomenų banke (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/) galima rasti įvairiausių laisvai prieinamų

baltymų, nukleorūgščių ir kitų biologinių makromolekulių struktūrų. Kitas būdas, paremtas

standartiniu amino rūgščių likučių žodynu, apimančiu visus biomakromolekulių atomus ir ryšius,

taikomas tokių duomenų bazių įrašuose kaip Molekulinio modeliavimo duomenų bazė (MMDB –

Molecular Modeling Database).

Jau dabar yra nemažai sukurtų kompiuterinių programų, leidžiančių turimus duomenis

analizuoti ir taikyti juos tolimesniem tyrimams. Tokių programų panaudojimas turi nemažai

privalumų, svarbiausios iš jų yra laiko ir pinigų taupymas. Dalis šių programų ne tik palengvina

tyrimus, tačiau gali būti panaudotos mokymo tikslais. Pavyzdžiui, naudojantis įvairiomis

programomis galima vaizdžiai pademonstruoti baltymų struktūrą, sukonstruoti baltymą,

sumodeliuoti sąveika tarp baltymo ir ligando. Tokiu būdu, matematinis baltymų struktūros

modeliavimas padėtų geriau įsivaizduoti ir suvokti baltymų savybes, jų funkcijas, veikimo

mechanizmus.

Baltymų raiška

Baltymų raiška, dar vadinama genų raiška, – tai procesas, kurio metu genuose esanti

informacija paverčiama į baltymų struktūras ir funkcijas. Baltymų raiška yra daugiapakopis

procesas, kuris prasideda tanskripcija, transliacija, toliau seka pagaminto baltymo erdvinės

struktūros įgavimas, po-transliacinė modifikacija ir nukreipimas į paskirties vietą. Baltymo kiekis,

kurį gamina ląstelė priklauso nuo audinio tipo, organizmo išsivystymo stadijos ir ląstelės

metabolinės bei fiziologinės būsenos.

16

Netiesiogiai tam tikro baltymo raiška gali būti įvertinama taikant DNR mikrokomplekto

technologiją, kuri leidžia grubiai nustatyti skirtingų mRNR koncentraciją ląstelėje. DNR

mikrokomplektas – mikroskopinių DNR taškelių, prisitvirtinusių prie kieto paviršiaus, rinkinys.

Tačiau daugumos baltymų ekspresija yra reguliuojama po transkripcijos, todėl mRNR

koncentracijos padidėjimas ne visuomet reiškia padidėjusią baltymų raišką. Polimerazinė

grandininė reakcija (PGR) yra tikslesnis metodas baltymų raiškos nustatymui. Polimerazinė

grandininė reakcija (PGR) – tai greitas specifinio DNR segmento padauginimas (amplifikavimas) in

vitro. Šis metodas leidžia iš turimos DNR paprastos fermentinės reakcijos metu susintetinti didelius

kiekius DNR fragmentų. Po PGR seka padaugintų DNR fragmentų analizė gelyje, kuriame lyginami

tiriami DNR fragmentai su žinomo dydžio fragmentais.

Baltymų raiška gali būti kontroliuojama įvairiuose lygiuose:

1. Chromosomų aktyvaciją ar deaktyvacija.

2. Transkripcijos iniciacijos kontrolė.

3. RNR transporto kontrolė.

4. MRNR degradacijos kontrolė.

5. Transliacijos iniciacijos kontrolė.

6. Po-transliacinė modifikacija.

Baltymų paskirties vieta ir funkcijos dažnai būna užkoduotos amino rūgščių sekoje. Baltymo

paskirties vietą taip pat apsprendžia ir po-transliacinės modifikacijos, o tiksliam funkcijos atlikimui

reikalingas teisingos erdvinės struktūros įgavimas. Biomakromolekulių struktūros-funkcijos sąryšio

supratimui svarbūs makromolekulių ir jų ligandų ar substratų sąveikos tyrimai. Šie tyrimai suteikia

nemažai informacijos apie makromolekulių atliekama funkciją. Dauguma fiziologinių procesų yra

efektoriaus sąveikos su biomakromolekule pasekmė. Tiriant fermentų funkcijas, jų sąveikos su

substratais mechanizmus, remiamasi fermentinės kinetikos teorija. Matuojant klasikinių fermentinių

reakcijų greičius, galima rankiniu būdu apskaičiuoti reakcijos greitį žinant pradines fermento ir

substrato koncentracijas, bei atitinkamų konstantų reikšmes. Tačiau skaičiuojant sudėtingesnių

sistemų procesus reikalinga kompiuterio pagalba. DynaFit yra kompiuterinė programa skirta

statistinei analizei ir pusiausvyrinių ligando surišimo duomenų modeliavimui. Programa atlieka

ligando-receptoriaus surišimo ir fermentinės kinetikos duomenų analizę taikant netiesinę mažųjų

kvadratų regresiją.

Tokios programos kaip AutoDock, DOCK, Gold ir kitos yra naudojamos

makromolekulių ir ligandų, fermentų ir substratų sąveikos modeliavimui. AutoDock programa

skirta nuspėjimui kaip maža molekulė – efektorius – rišasi su žinomos struktūros receptoriumi.

Modeliavimo metu yra randamas sąveikos tarp substrato ir makromolekulės energijos minimumas.

17

AutoDock programa naudoja Baltymų duomenų banko failo formatą, aprašantį makromolekulių

struktūras. Ligando struktūras galima taip pat surasti įvairiose duomenų bazėse arba sumodeliuoti

reikiamos molekulės-ligando struktūrą, pasinaudojant tam skirtomis programomis. Sąveikos

skaičiavimų rezultatas yra įvairūs ligando išsidėstymo variantai, kurių kiekvienam yra priskirta

atitinkama energetinė reikšmė. Žemiausia energija pasižymintis išsidėstymo variantas yra

priimamas kaip labiausiai tikėtinas. Specialių molekulinių grafinių programų pagalba įmanomas

sumodeliuotos sąveikos vizualizavimas, kas palengvina gautų modeliavimo rezultatų analizę.

Naujausi proteomikos metodai

Proteomika apima ne tik baltymų identifikaciją ir įvertinimą, bet ir jų lokalizacijos,

modifikacijos, sąveikos, funkcijos nustatymą. Proteomika nagrinėja baltymus, kurie yra koduojami

organizmo ar ląstelės genų. Pilnas rinkinys baltymų, kuriuos gali sintetinti organizmas, yra

vadinamas proteomu. Proteomas yra žymiai didesnis už genomą, kadangi vienas genas gali būti

atsakingas už kelių baltymų sintezę. Baltymų įvairovę nulemia po-transliacinės modifikacijos ir

daugybė kitų faktorių.

Vienas naujausių proteomikos technologijų taikymas yra susijęs su vaistų kūrimo ir tobulinimo

procesais. Proteomika leidžia įvertinti naujų cheminių preparatų terapeutinį arba toksinį poveikį

tikrinant baltymų atsaką žmogaus audinių kultūroje, naujai paimtuose žmogaus audinių mėginiuose

ar fiziologiniuose skysčiuose. Tokiu būdu sudaroma galimybė sėkmingai atrinkti farmacinius

preparatus ankstyvoje jų kūrimo etape, identifikuoti terapeutiškai naudingus junginius baltymų

lygyje ir pašalinti toksinius. Baltymų tyrimo procesas apima baltymų išgavimą iš audinių ir jų saugų

laikymą. Išskirtų baltymų identifikavimui taikomas jų atskyrimas naudojantis dvikrypte

elektroforeze. Šis metodas leidžia atskirti baltymus pagal jų izoelektrinį tašką ir kartu pagal jų masę.

Taip pat baltymų atskyrimui yra naudojamas HPLC metodas. Šio metodo trūkumas yra baltymo

dydis, kuris gali būti tiriamas (<20 000 Da), ir labai hidrofobinių peptidų netirpumas. Toliau

atskirtų peptidų frakcijos tiriamos mass-spektroskopijos metodu ir yra sudaromi taip vadinami

peptidų žemėlapiai. Lyginant ligos atveju pažeistų peptidų žemėlapį su kontrolinio mėginio peptidų

žemėlapiu galima sėkmingai nustatyti su liga susijusius baltymų markerius. Vienas naujausių

baltymų atskyrimo metodų yra baltymų čipų (ProteinChip) panaudojimas. Tai metalinės plokštelės,

ant kurių išdėstytos įvairaus giminingumo terpės.

Baltymo amino rūgščių sekos nustatymas apima keletą žingsnių:

1. Atskiros polipeptidinės grandinės atskyrimas ir išgryninimas iš baltymo turinčio subvienetus.

2. Vidumolekulinių disulfidinių ryšių skėlimas.

18

3. Išgrynintos polipeptidinės grandinės amino rūgščių sudėties nustatymas.

4. N- ir C-galinių amino rūgščių analizė.

5. Specifinis polipeptidinės grandinės skėlimas į mažesnius fragmentus, šių fragmentų gryninimas.

6. Peptidinių fragmentų sekos analizė.

7. 5 ir 6 žingsnių kartojimas naudojantis skirtingais skėlimo metodais. Sudaromas skirtingų ir

persidengiančių peptidinių fragmentų rinkinys, analizuojama jų seka.

8. Visos baltymo amino rūgščių sekos atkūrimas iš sekų persidengiančiuose fragmentuose.

9. Disulfidinių ryšių vietos nustatymas.

Praktinis darbas

Lina Rimkutė

Pažintis su bioinformatikos taikymu baltymų struktūrai ir sąveikoms tirti, vyks kompiuterių

klasėje.

1. Pažintis su jungtinėmis duomenų bazių paieškos sistemomis. (Trukmė 20 min.)

Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), EBI (Europos Bioinformatikos Institutas)

(http://www.ebi.ac.uk/) bei DBGet (http://www.genome.ad.jp/dbget/), suteikia priėjimą prie DNR,

baltymų sekų, genomo ir chromosomų kartografinių duomenų, erdvinių molekulinių struktūrų.

Reikiamų duomenų paiešką galima vykdyti pagal autoriaus vardą, žurnalo pavadinimą,

identifikacinį numerį (pvz., baltymo, geno ar cheminės medžiagos pavadinimas) ir kita, suvedant

reikiamą raktinį žodį į paieškos laukelį. taip pat suteikia priėjimą prie įvairiausių duomenų.

Užduotis: surasti baltymo (žmogaus albumino) seką iš kiekvienos duomenų bazių paieškos

sistemos – Entrez, EBI, DBGet – ir palyginti jų įrašus.

2. Pažintis su baltymų amino rūgščių sekos palyginimo programa (Trukmė 10 min.)

BLAST (The Basic Local Alignment Search) yra programa skirta baltymų homologijų, sekų

panašumų nustatymui. BLAST veikimas paremtas tiriamosios sekos palyginimu su žinomomis

sekomis įvairiose duomenų bazėse.

Užduotis: atlikti sekų panašumo tyrimą baltymo, kurio seka:

MSQDENIVKAVEESAEPAQVILGEDGKPLSKKALKKLQKEQEKQRKKEERALQLEAEREAREKKAA

AEDT

AKDNYGKLPLIQSRDSDRTGQKRVKFVDLDEAKDSDKEVLFRARVHNTRQQGATLAFLTLRQQASL

IQGL

19

VKANKEGTISKNMVKWAGSLNLESIVLVRGIVKKVDEPIKSATVQNLEIHITKIYTISETPEALPI

LLED

ASRSEAEAEAAGLPVVNLDTRLDYRVIDLRTVTNQAIFRIQAGVCELFREYLATKKFTEVHTPKLL

GAPS

EGGSSVFEVTYFKGKAYLAQSPQFNKQQLIVADFERVYEIGPVFRAENSNTHRHMTEFTGLDMEMA

FEEH

YHEVLDTLSELFVFIFSELPKRFAHEIELVRKQYPVEEFKLPKDGKMVRLTYKEGIEMLRAAGKEI

GDFE

DLSTENEKFLGKLVRDKYDTDFYILDKFPLEIRPFYTMPDPANPKYSNSYDFFMRGEEILSGAQRI

HDHA

LLQERMKAHGLSPEDPGLKDYCDGFSYGCPPHAGGGIGLERVVMFYLDLKNIRRASLFPRDPKRLR

PCGV

PSFPPNLSARVVGGEDARPHSWPWQISLQYLKDDTWRHTCGGTLIASNFVLTAAHCISNTWTYRVA

VGKN

NLEVEDEEGSLFVGVDTIHVHKRWNALLLRNDIALIKLAEHVELSDTIQVACLPEKDSLLPKDYPC

YVTG

WGRLWTNGPIADKLQQGLQPVVDHATCSRIDWWGFRVKKTMVCAGGDGVISACNGDSGGPLNCQLE

NGSW

EVFGIVSFGSRRGCNTRKKPVVYTRVSAYIDWINEKMQL

• Interneto adreso laukelyje įvesti www.expasy.ch/tools

• Skyrelyje “Similarity searches” surasti programą BLAST Network service on ExPASy ir

paspausti ant užrašo BLAST.

• Atsidariusiame dokumente, į programos lauką nukopijuoti užduotyje pateiktą baltymo seką.

Paspausti Run BLAST.

• Išnagrinėti gautus rezultatus.

3. Pažintis su cheminių struktūrų piešimo programa ISIS/Draw. (Trukmė 15 min.)

Užduotis: nupiešti cheminę struktūrą (gliciną) naudojantis ISIS/Draw programa. Peržiūrėti

nupieštą struktūrą trimatėj erdvėje naudojantis WebLabViewerPro4 grafine programa.

1. Atidaryti ISIS/Draw programą. Atsidariusiame lange kairėje ir viršuje yra mygtukų juostos.

Kairėje esantys mygtukai skirti molekulių paišymui ir peržiūrėjimui. Viršuje esantys

20

mygtukai atidaro kai kurių molekulių pavyzdžius. Dažniausiai naudojami mygtukai:

2. Paspausti Single Bond mygtuką ir nupiešti keturių anglies atomų grandinę, sujungtų

viengubu ryšiu. Paspauskit ant trečio anglies atomo, kad pridėti dar vieną anglies atomą.

3. Dabar kelis anglies atomus keisime į kitus atomus. Paspauskite Atom mygtuką. Dabar

spustelkite ant galinio dešinio anglies atomo. Atsiras langelis, į kurį reikia įrašyti NH2 ir

paspausti Enter. Pridėtą anglies atomą pakeiskit į deguonį “O”, galinį kairį anglies atomą – į

OH.

4. Pasirinkus mygtuką Single Bond paspausti ant viengubo ryšio, jungiančio anglies atomą su

deguonimi: viengubas ryšys tampa dvigubu.

5. Išsaugoti nupieštą molekulę.

6. Atidaryti WebLabViewerPro4 programą. Per File → Open susirasti ir atidaryti išsaugotą

failą.

4. Pažintis su internetine baltymų duomenų baze ir molekuline grafine programa (Trukmė 15

min.)

PDB paieškos laukelyje galima suvesti visą reikiamos molekulės pavadinimą arba indeksą,

pvz., 1LYZ, kuris žymi vištos kiaušinio baltymą lizocimą. Pirmasis simbolis nurodo versijos

numerį. Jeigu indeksas prasideda simboliu 0, tai reiškia, kad įrašas yra grynai bibliografinis. pdb

failas yra tekstinis failas su paaiškinamąja antrašte ir atomų koordinačių rinkiniu. PDB formatas

apima informaciją apie struktūros nustatymą, bibliografijos nuorodas, atomų koordinates. Dauguma

molekulinių grafinių programinių įrangų ar kitos kompiuterinės analizės programos nuskaito PDB

formato failus, turinčius išplėtimus .pdb arba .ent.

Užduotis: surasti PDB 3D baltymo struktūrą ir naudojantis WebLabViewerPro4 grafine

programa išmokti vizualizuoti ir manipuliuoti.

1. Interneto adreso laukelyje įvesti http://www.rcsb.org/pdb/

2. Paieškos laukelyje įvesti indeksą 1LYZ. Atsidariusio dokumento lange paspausti

Download/Display File. Lentelėje Download the Structure File pasirinkti PDB none formatą.

Atsidariusiame dialogo lange spausti Save.

3. Atidaryti WebLabViewerPro4 programą. Per File → Open susirasti ir atidaryti išsaugotą failą.

21

Paveikslai

Pav. 1. Arginino struktūrinė formulė

N

ON

NN

Pav. 2. Arginino 2D cheminė struktūra

Pav. 3. Arginino 3D struktūros vaizdavimas

Literatūros sąrašas

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/molecularmod.html

2. C.S. Tsai “An Introduction to Compiutational Biochemistry”, 2002, A John Wiley & Sons, Inc.

3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/molecularmod.html

4. A. Fiser, A. Sali “Comparitive protein structure modeling”, Pels Family Center for

Biochemistry and Structural Biology The Rockefeller University

5. S.Vajda, I.A.Vakser, M.J.E. Sternberg, J. Janin “Modeling of Protein Interactions in Genomes”,

2002, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 47: 444-446

6. . H. Garret C. M. Grisham. Biochemistry. Saunders College Publishing. NY. 1995.

7. Ovadi J, Srere PA.Macromolecular compartmentation and channeling. Int Rev Cytol.

2000;192. p. 255-80.

8. V. Mildažienė, J. Kadziauskas, R. Jaugelavičius, V. Laurinavičius, Z. Naučienė, D.

Bironaitė. Struktūrinė Biochemija. VDU 1999..

NH2 CNH

NH

(CH2)2 CH2 CHNH2

COOH