hemoglobinopatias abordagem laboratorial - … · 1 hemoglobinopatias abordagem laboratorial duas...

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HEMOGLOBINOPATIASHEMOGLOBINOPATIAS

Abordagem LaboratorialAbordagem Laboratorial

� duas subunidades

tipo α e duas tipo

não-α

� quatro grupos heme

(grupo prostético)

Representação da estrutura de uma molécula de hemoglobina.

HemoglobinaHemoglobina

Grupo heme

Cadeia ββββ

Cadeia αααα

Cadeia ββββ

Cadeia αααα

Ferro (Fe2+)

Glóbulo Vermelho

hemeheme

αααααααα

A hemoglobina é uma metaloproteína globular tetramérica.

2

Estadio de

desenvolvimento Embriónico Fetal Adulto

Hb Gower I

( ζ2ε2 )

Hb A

( α2β2 )

Hb Gower II

( α2ε2 )

Hemoglobinas

Hb Portland

( ζ2γ2 )

Hb F

( α2 G ou Aγ2 )

Hb A2

( α2δ2 )

Hemoglobinas humanas na vida adulta

percentagemcadeiasHemoglobina

< 1 % da Hb totalα2γ2HbHb FF

2 a 3,0 % da Hb totalα2δ2HbHb AA22

96 a 98 % da Hb totalα2β2HbHb AA

Hemoglobinas humanas nos diferentes períodos do desenvolvimento

As hemoglobinopatias resultam de mutações que afectam os genes responsáveis pela síntese das cadeias de globina da hemoglobina.

�Qualitativas:dão origem a variantes estruturais das

hemoglobinas (ex: Hb S, Hb C, Hb D)

�Quantitativas: diminuição ou ausência de

síntese de umauma ou mais cadeias de globina-

talassemias

HemoglobinopatiasHemoglobinopatias

3

As hemoglobinopatias são transmitidas à descendência segundo um padrão autossómicorecessivo

Portadores2 em 4 (50%)

Doente1 em 4 (25%)

Normal1 em 4 (25%)

As hemoglobinopatias constituem as alterações monogénicasmais comuns.

Em 1995, estimativas da OMS, indicaram que cerca de 6% da população mundial é portadora de uma hemoglobinopatia.

O sector de hemoglobinopatias da ULR:

� Rastreios - identificação de portadores

� Detecção de casais em risco

� Confirmação de diagnóstico

� Participação em programas externos de avaliação da

Qualidade ( NEQAS e PNAEQ)

� Colaboração em projectos de investigação

� Formação e ensino

4

Metodologias utilizadas na caracterização analítica do fenótipo:

��TTéécnicas cnicas electroforelectroforééticasticas: :

Focagem isoelFocagem isoelééctrica em gel de poliacrilamidactrica em gel de poliacrilamida

��Estudos funcionais da Estudos funcionais da HbHb

Teste de solubilidade da Teste de solubilidade da HbSHbS

Teste de estabilidade Teste de estabilidade -- Teste do Teste do isopropanolisopropanol

Pesquisa de corpos de inclusão de Pesquisa de corpos de inclusão de HbHb HH

Estudos de afinidade para o OEstudos de afinidade para o O22

��TTéécnicas cnicas cromatogrcromatográáficasficas::

HPLC de troca HPLC de troca caticatióónicanica

HPLC de fase reversa das cadeias de HPLC de fase reversa das cadeias de globinaglobina

Focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida

HbHb SS

Método com boa resolução

Detecção variantes de Hb raras

A focagem isoeléctrica é uma técnica de electroforese em gel

de poliacrilamida, a potência constante e em gradiente estável

de pH, e que permite a separação de proteínas de acordo com

o seu ponto isoeléctrico.

Permite detectar

HbHb D D PunjabPunjab

Separação Hb A da Hb F

HbHb EE

HbHb LeporeLepore

HbHb CC

5

Focagem isoelFocagem isoelééctrica em gel de poliacrilamidactrica em gel de poliacrilamida

Hb E

CSFA

CSFA

Hb C

Hb D

CSFA

CSFA

Hb S Hb Lepore

CSFA

ÉÉ um mum méétodo de escolha para quantificar fractodo de escolha para quantificar fracçções normais e fracões normais e fracçções ões ananóómalas:malas:

�� QuantificaQuantificaçção relativa ão relativa dos nnííveis de veis de HbHb AA22

� Quantificação relativa dos níveis de Hb F

� Quantificação relativa de variantes estruturais da Hb

� Identificação presuntiva de variantes de Hb

intervalos de tempos de retenção previamente

estabelecidos: Hb S, Hb D, Hb C, Hb E.

HbHb AA22

(%)(%)

HPLC de troca catiónica

É uma técnica cromatográfica que separa as hemoglobinas com base na sua carga global e no seu comportamento ácido-base.

HbHb S S

(%)(%)

6

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa - RP-HPLC

Representação do equipamento HPLC

Leone et al (1985) e Wacjman et al (2002)

Coluna LiChrospher 100 RP-8 (Merck) : partículas de sílica, ligadas através de grupos silanol a

cadeias hidrocarbonadas (C8)

Separação em Gradiente:75min., fluxo 0,7 mL/min

� Fase móvel

4,230,019,646,275

7,830,031,231,00

H2O desionizada (mL)

NaCL 0,155M

pH 2,7(mL)

Metanol (mL)

Acetonitrilo(mL)

Tempo(min)

�Detector UV : 215 nm

�� Fase estacionária

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa

Mecanismo de retenção envolve:

� Interacções hidrofóbicas entre as cadeias hidrocarbonadas fase estacionária com as regiões de baixa polaridade do soluto

� A separação das cadeias de globina é baseada essencialmente na sua diferença de hidrofobicidade.

7

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa

� Identificação presuntiva de variantes estruturais da hemoglobina -tempos de retenção relativos -TRR

� Identificação do tipo de cadeia globínica variante (αααα ou não-αααα)

� Detectar variantes de hemoglobina neutras

� Quantificação das variantes estruturais

� Avaliar, na presença de níveis de Hb F

aumentados, as cadeias G γ, A γI, AγT da Hb F min25 30 35 40 45 50 55 60 65

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

VWD1 A, Wavelength=215 nm (GLOBINAS\7AGOS092.D)

26

.73

3

35

.98

4

37

.32

9

40

.51

7

43

.65

2

45

.74

0

48

.51

3

50

.77

5

54

.24

4

57

.89

6

63

.75

7

65

.18

4

67

.47

8

HPLC fase reversa das cadeias de HPLC fase reversa das cadeias de globinaglobina

heme

ββββ

δδδδ

αααα

AγγγγΙΙΙΙ

Estudos de afinidade da hemoglobina para o O2

Sistema automático que permite determinar a curva de dissociação do O2 da oxihemoglobina.

Hemox Analyzer

A curva de dissociaA curva de dissociaçção da ão da oxihemoglobinaoxihemoglobinarelaciona a % de hemoglobina saturada com relaciona a % de hemoglobina saturada com oxigoxigéénio com a pressão parcial de Onio com a pressão parcial de O22 em contacto com o sangue.

8

VGM < 80 flHGM < 27 pg(Fe/CTFFe) x 100>16%

Hb A2 ↑↑↑↑Hb F N ou ↑↑↑↑

Suspeita portador ααααtalassémia

Hb A2 N ou ↓↓↓↓Hb F N

Eritrograma comíndices eritrocitários

Focagem isoeléctrica

Hb A2 ↓↓↓↓Hb F ↑↑↑↑

Portador βtalassémia

Quantificação da Hb A2HPLC troca catiónica

+Quantificação da Hb FHPLC troca catiónica

Suspeita δβδβδβδβtalassémia

Banda FIEzona HbS Banda FIE

Teste solubilidade-HbS+

HPLC troca catiónica

HPLC troca catiónica

TS = positivo

Identificação presuntiva HbS

Estudo cadeias e globina RP-HPLC

Biologia molecular

DG

Fluxograma do diagnóstico laboratorial

Se HGM<25pg Suspeita portador α0

talassémia

(estudos familiares e estudo do cônjuge )


TRR de acordo

com HbS


TS = negativo

Identificação presuntiva HbD

cadeia cadeia αα ou ou ββ

Identificação presuntiva, HbC, HbE

Identificação presuntiva HbLepore

++++

Portador de β-talassemia

Cromatografia de troca catiónica

% Hb A2=4,3

%Hb A2=5,1

Hb=12,6 g/dL

G.V.=6,21x1012/L

Ht=0,386 L/L

VGM=62,2 fLHGM=20,3 pg

CHGM=32,6 g/dLRDW=16,4%

Hemograma Focagem Isoeléctrica

CSFA

Sexo masculino

adulto

caucasiano

con

tro

loco

ntr

olo

%Hb A2= 5,4

9

Portador de de HbHb SS

Hb=12,4 g/dLG.V.=4,52x1012/L Hct=0,379 L/LVGM=83,9 fLHGM=27,5 pgCHGM=32,7g/dL

RDW=13,7%

Hemograma

Focagem Focagem IsoelIsoelééctricactrica

Sexo feminino

33 anos

Teste de solubilidade:

Positivo

% Hb S = 33,8

Hb S

CSFA

controlocontrolo

Focagem Isoeléctrica

Cromatografia de troca catiónica

“janela”S/C37,5%

Hb S

Hb=13,2g/dLG.V.=4,07x1012/L

Hct=0,399 L/LVGM=98,1 fLHGM=32,5pg

CHGM=33,1 g/dLRDW=12,3%

Hemograma

Cromatografia

Hb D= 37,0%

Focagem IsoelIsoelééctricactrica

Hb D

C

SFA

Teste de solubilidade:

Negativo

HPLC troca catiónica da hemoglobinaHPLC fase reversa das cadeias de globina

Heme

β

δ

α

βD

-Punja

b

TRR= tr βx / tr β

Área αααα = 370,025Área não αααα = 378,854

Variante Hb cadeia ββββ

Hb D-Punjab = 40,9%

Portador de Hb DSexo feminino

adulto

con

tro

loco

ntr

olo

10

Hb=14,5 g/dLG.V.=5,61x1012/L

Hct=0,418 L/L

VGM=74,5 fLHGM=25,2 pgCHGM=33,8 g/dLRDW=13,3%

Hemograma Focagem Isoeléctrica

% % HbHb E=29,8E=29,8

CSFA

Hb EHeme

ββββ

δδδδ

αααα

ββββE

TRR= tr ββββx / tr ββββ

Área αααα = 399,354 Área não αααα = 396,737

Variante Hb cadeia ββββ

Hb E = 23,0%

Sexo masculino

44 anosPortador de Hb E

con

tro

loco

ntr

olo

HPLC troca HPLC troca caticatióónicanica da hemoglobinada hemoglobina

HbHb E E eluielui na na ““janela janela

““HbHb AA22

HPLC fase reversa das cadeias de HPLC fase reversa das cadeias de globinaglobina

Cromatografia

Variantes de hemoglobina raras e neutras

Métodos usados para a detecção de variantes de Hb:

� Focagem isoeléctrica ou electroforese

� HPLC de troca catiónica

Estas técnicas não detectam variantes neutras.

A cromatografia liquida de alta eficiência de fase

reversa pode ser usada para detectar e quantificar ,

este tipo de variantes, que diferem apenas na sua

hidrofobicidade.

11


Hb Malmö /Hb PalmelaSexo masculino

14 anos

Eritrocitose

Focagem IsoeléctricaHb= 17.2 g/dLG.V.= 5,36x1012/L

Hct= 0,503 L/L

VGM= 93.9 fLHGM= 32.1 pgCHGM= 34.2 g/dL

RDW= 12.4%

Hemograma

C

S

F

A

con

tro

loco

ntr

olo

Hb Malmö

Cadeia beta variante47.5%

Cadeia alfa variante 20.6%

heme

ββββββββX

δδδδ

αααα

ααααx

HPLC fase reversa das cadeias de globina

Biologia molecular Biologia molecular DGDG

HbHb MalmMalmöö

Hb Malmö /Hb Palmela

A mutaA mutaçção no ão no codãocodão 15 (GCC15 (GCC>GTC) do gene alfa 1 causa a substitui>GTC) do gene alfa 1 causa a substituiçção ão da da alaninaalanina por por valinavalina na posina posiçção correspondente na cadeia alfa ão correspondente na cadeia alfa globinaglobina

�� Estudos familiares: pai e irmão ,Estudos familiares: pai e irmão ,heterozigheterozigóóticosticos para para HbHb PalmelaPalmela--

fenfenóótipostipos hematolhematolóógicos normaisgicos normais

�� EritrocitoseEritrocitose: : HbHb MalmMalmöö (afinidade para o O(afinidade para o O22 aumentada)aumentada)

�� HbHb Palmela: substituiPalmela: substituiçção da ão da alaninaalanina por por valinavalina

AminoAminoáácidos com cadeias laterais cidos com cadeias laterais alifalifááticasticas de de tamanho similar que não parecem alterar a tamanho similar que não parecem alterar a geometria da regiãogeometria da região

Variante de hemoglobina assintomVariante de hemoglobina assintomáática:tica:

AlaninaValina

12

Hb Loves Park

14.1RDW (%)

33.3MCHC(g/dL)

24.9MCH (pg)

74.9MCV (fL)

0.277Hct (L/L)

9.2Hb (g/dL)

3.70RBC(×1012/L)

M/2 anosSexo/ idade Área αααα = 321,221

Área não αααα = 310,098

Variante Hb cadeia ββββ48.4%

anemia microcítica, hipocrómica


HPLC fase reversa das cadeias de globina

heme

ββββXββββA

δ

α

Biologia molecular DG


Hb Loves Park

�� Leucina Leucina →→ fenilalaninafenilalanina -- posiposiçção 68 da cadeia ão 68 da cadeia ββ globglobíínicanica

�� São ambos aminoSão ambos aminoáácidos hidrofcidos hidrofóóbicos bicos

(substitui(substituiçção de um ão de um aaaa por outro com uma por outro com uma

cadeia lateral igualmente neutra)cadeia lateral igualmente neutra)

Cadeia lateral maior dimensãoCadeia lateral maior dimensão

�� FenilalaninaFenilalanina

PosiPosiçção ão internainterna-- bolsabolsa hemeheme

difdifíícil deteccil detecççãoão

Diminuição da afinidade para O2

13

PNCH - Janeiro – Julho 2009

312,7104820Total

7,7113Leiria

8,915169Alentejo

27,161225Algarve

36,527413Lisboa

Nº casais em risco

% rastreios positivosTotal rastreios positivosNº de rastreiosARS

413

225

169

1327

61

1513

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Lisboa Algarve Alentejo Leiria ARS

Nº am

ost

ras

Nº total rastreios

Nº rastreios positivos

Casais em risco

CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

1,3

17,3

4,75,8

9,3

3,07,7

1,2

0,4

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0


% d

e ca

sos

% Outras var Hb

% Port Hb S

% Port b tal27

61

15

13

39

8

2421

51 2 1

0

10

20

30

40

50

60


Nº

de

caso

s

Total rastreios positivos

Port b tal

Port Hb S

Outras var Hb

PNCH - Janeiro – Julho 2009

CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias ––PNCH PNCH –– Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009 CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

0,546,1506,15012,7108820Total

7,71000,007,7113Leiria

1,223,054,788,915169Alentejo

0,419,32117,33927,161225Algarve

005,8241,336,527413Lisboa

%

Outras

var Hb

Outras var

Hb% Port Hb SPort Hb S% Port β talPort β tal

%

rastreios

positivos

Total

rastreios

positivos

Nº de

rastreiosARS

14

Hemoglobinopatias - Janeiro – Julho 2009CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias ––PNCH PNCH –– Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009 CasuCasuíística de portadores de hemoglobinopatias stica de portadores de hemoglobinopatias --PNCHPNCH-- Janeiro Janeiro -- Julho 2009Julho 2009

Variantes de hemoglobina: Variantes de hemoglobina: HbHb C,HbC,Hb D, D, HbHb LeporeLepore, , HbHb LisbonLisbon, ,

HbHb NN--BaltimoreBaltimore, , HbHb MalmMalmöö, , HbHb Porto AlegrePorto Alegre

187

6153 57

3421

1524

0

50

100

150

200

Utentes- INSA INSA (DG , CGMJM) Hospitais Lab Privados

Nº de

amost

ras

Nº Total de rastreios

Nº rastreios positivos

7,5

19,7

3,8

19,38,6

11,5

20,8

8,8

2,1

3,3

3,8

14,0

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

Utentes- INSA INSA (DG; IJM) Hospitais Lab Privados%

de

caso

s

% Port b tal % Port Hb S %outras var Hb

694,54,54,54,51610,910,910,910,93910,910,910,910,93926,394358Total 114,088,8519,31142,12457Lab Privados 283,8220,8113,8228,31553Hospitais 13,3211,5719,71234,42161INSA (DG; IJM) 392,148,6167,51418,234187Utentes- INSA Alfa tal%outras var Hbtotal outras varHb% Port HbSPort HbS% Port b tal Port b tal% PositivosNº rastreios positivo Nº Total de rastreios

Perspectivas futuras: referência

� Acreditação de ensaios – NP EN ISO15189 / 15195

� Utilização de materiais de referência, doseamento Hb A2

�� UtilizaUtilizaçção da ão da espectrometria de massa (LCMSMS):de massa (LCMSMS):

MMéétodo de referência doseamento da HbAtodo de referência doseamento da HbA22

15

Agradecimentos:

Departamento de PromoDepartamento de Promoçção da Saão da Saúúde e Doende e Doençças Cras Cróónicas nicas

Departamento de GenDepartamento de Genééticatica

hemoglobinopatias abordagem laboratorial - … · 1 hemoglobinopatias abordagem laboratorial duas...

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