06.06.2016

1

Hemoglobinopatiermolekylær basis og diagnostikk

Runa Marie GrimholtForsker, bioingeniør med spesialistgodkjenning

Enhet for blodcelleforskning, Avdeling for medisinsk biokjemi

Oslo UniversitetssykehusBioingeniørkongressen 1.‐3. juni 2016, Oslo

37

Hemoglobin

38

Typer hemoglobin

HbA 2α 2β 97 %HbA2 2α 2δ 2‐3 %HbF 2α 2γ <1 %

HbA

HbA2HbF

06.06.2016

2

Syntese av globinkjeder

39

Globingenene

40

HBA2 HBA1

HBBHBD

Chr 16

Chr 11

06.06.2016

3

Hemoglobinopati

41

Thalassemi ‐ Hemoglobinvariant

Hemoglobinsykdommer forårsaket av mutasjoner i globingenene

Thalassemi

Delesjoner eller sekvensvarianter i genet eller i genets reguleringsområder som gir nedsatt syntese av

• α‐ globinkjeder → α‐thalassemi

• β‐ globinkjeder → β‐thalassemi

Hemoglobinvariant

Sekvensvarianter i globinkjeden som fører til endring av aminosyre.

→ syntese av globinkjeder med endret struktur

Utbredelse

• De hyppigste monogene sykdommene i verden

– Ca 24 % av verdens befolkning 

• Vanligst i land hvor malaria er eller har vært utbredt

42

06.06.2016

4

Alvorlighetsgrad

43

Thalassemi

44

Hb MCH MCV RBC

06.06.2016

5

Beta‐thalassemi

45

Beta+: Redusert syntese          Beta0: Ingen syntese

Beta‐thalassemi

46

Beta‐thalassemia minor (beta+ eller beta0)Beta‐thalassemia major

06.06.2016

6

Alfa‐thalassemi

47

Alfa‐thalassemi

48

Alfa‐thalassemi (ett‐gens)Alfa‐thalassemi (to‐gens)Alfa‐thalassemi (HbH‐sykdom)Alfa‐thalassemi (Hb Barts hydrops fetalis)

06.06.2016

7

Utredning

49

Medisinsk biokjemi, OUS

Standard utredning

Hematologi, ferritin og CRP

Gap‐PCRAlfa‐thalassemi

HPLCBioRad Variant II

Utredning

50

Medisinsk biokjemi, OUS

Utvidet utredning

DNA sekvenseringHBA, HBB og HBD

KopinummeranalyseAlfa‐ og beta‐globingen cluster

06.06.2016

8

Sekvensering

51

52

Real‐time kvantitative PCRΔΔCq‐metoden 

Kopinummeranalyse

Pasient Kontroll Kalibrator Kontroll

06.06.2016

9

Utredning beta‐thalassemi

53

HbA2α 2β

HbA22α 2δ

Eksempel 1

54

Hematologiske og biokjemiske analyser

RBC  5,5 x10^12/L ↑ (3,9‐5,3 x10^12/L)

Hb 10,5 g/dL ↓  (11,7‐15,3   g/dL)

MCH 20,7 pg ↓  (27‐33 pg)

Ferritin 57 µg/L (15‐200 μg/L)

CRP >0,6 mg/L ↑  (<4 mg/L)

Gap‐PCR Negativ

06.06.2016

10

Hemoglobintyping

55

Beta‐thalassemi minor

BioRad Variant II

Utredning av alfa‐thalassemi

56

Alfa‐thalassemi gap‐PCR HbH ved HPLC

06.06.2016

11

Sekvensvarianter

57

Startkodon

SpleisesetetPromotor

IntronMissens variant

Nonsens variant Stoppkodon

Poly A setetLeserammeskift

Eksempel 2

58

Hematologiske og biokjemiske analyser

RBC  6.90 x10^12/L ↑ (4,3‐5,7 x10^12/L)

Hb 11.9 g/dL ↓  (13,4‐17,0 g/dL)

MCH 17.2 pg ↓  (27‐33 pg)

Ferritin 146 µg/L (25‐300 μg/L)

CRP 10.2 mg/L ↑  (<4 mg/L)

06.06.2016

12

Hemoglobintyping

59

BioRad Variant II

Ikke beta‐thalassemi

Resultat gap‐PCR

60

Fusjonsgen

HBA2 HBA1

Resultat: Heterozygot 3.7 kb delesjon

Meget lett alfa‐thalassemi

06.06.2016

13

Utredning alfa‐thalassemi

61

Hematologiske og biokjemiske analyser

RBC  6.90 x10^12/L ↑ (4,3‐5,7 x10^12/L)

Hb 11.9 g/dL ↓  (13,4‐17,0 g/dL)

MCH 17.2 pg ↓  (27‐33 pg)

Ferritin 146 µg/L (25‐300 μg/L)

CRP 10.2 mg/L ↑  (<4 mg/L)

Kopinummeranalyse alfa‐globingenene

62

HBA1

HBA3.7

HBA2

HS‐40

Patient sample Control sample Control sample Calibrator

06.06.2016

14

Sekvensering av alfa‐globingenene

63

HBA2 HBA1

HBA2:c.*94A>G• Poly A signal

Polyadenylering

64

06.06.2016

15

Sekvensering av alfa‐globingenene

65

HBA2 HBA1

HBA2:c.*94A>G• Poly A signal

HBA1:c.*46C>A• mRNA degradation?

Oppsummering

66

Mann fra PalestinaMikrocytær anemi (Hb 11,9 og MCH 17,2)Erytrocytose (RBC 6,9)Genotype: αTα/‐α3,7

Kan vi forklare pasientens hematologiske forandringer???

HBA2 HBA1

?

06.06.2016

16

Utredning alfa‐thalassemi

67

Hematologiske og biokjemiske analyser

RBC  6.90 x10^12/L ↑ (4,3‐5,7 x10^12/L)

Hb 11.9 g/dL ↓  (13,4‐17,0 g/dL)

MCH 17.2 pg ↓  (27‐33 pg)

Ferritin 146 µg/L (25‐300 μg/L)

CRP 10.2 mg/L ↑  (<4 mg/L)

68