herramientas para las tÉcnicas moleculares enzimas (endonucleasas) de restricciÓn sondas de adn
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HERRAMIENTAS PARA LAS TÉCNICAS MOLECULARES
ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN
SONDAS DE ADN
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ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN
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DEFINICIÓN
• La denominación se debe a que las bacterias las emplean para destruir el ADN viral capaz de penetrar a la célula, y por lo tanto restringen el potencial de crecimiento de los virus.
• El propio ADN de la bacteria se encuentra protegido de ataques nucleolíticos por metilación de los sitios susceptibles sobre las bases (protegidas por Enzimas De Modificación).
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• En otras palabras actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.
• Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.
• Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
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• La mayor parte de secuencias de DNA, que son reconocidas por estas enzimas son PALÍNDROMOS (Es decir, ambas cadenas de DNA poseen la misma secuencia de bases en ambos sentidos)
• Estas enzimas de origen bacteriano, reconocen secuencias específicas en el ADN e hidrolizan el enlace pentosa-fosfato (fosfodiéster), produciendo así un corte en la molécula de ADN.
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• El esqueleto pentosa-fosfato se rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases equivalentes en la otra hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en cada hebra y al cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes: Cohesivos o Romos.
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• Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen una mezcla de fragmentos de distinto tamaño.
• Los fragmentos obtenidos se pueden separar por electroforesis.
• Después se tiñen con un colorante y se obtiene un patrón de bandas.
• Cada banda corresponde a un tamaño medido en pares de bases.
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FACTORES DE IMPORTANCIA• Pureza del DNA (otros agentes inactivan a las
endonucleasas)• Temperatura y pH• DNAsas (degradan el ADN en presencia Mg2+)• Contaminantes con carga (-)• DNA contaminado con otro DNA• Grados de metilación• Tipo de molécula de DNA (debe tener accesible a
la secuencia reconocida por la enzima)• Buffer adecuado
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NOMENCLATURA
Eco RI E = género Escherichiaco = especie coliR = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada
de esta cepa
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CLASIFICACIÓNTIPO ILas actividades de modificación (ruptura de ADN no metilado)
y las de restricción están producidas por un complejo multiproteico.
• Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías
• La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento y en lugares inespecíficos
• La restricción requiere de ATP
• La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupo metilo
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Tipo II•Poseen sólo actividad de restricción (ruptura)•Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no formas complejos multiproteicos.•No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg2+.•La metilasa usa SAM como donador de metilos.•Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.•La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G•La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente.
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Tipo III•Poseen actividad de restricción (ruptura) y modificación (mutilación)
•Cortan fuera de la secuencia que reconocen.
•Son ATP-dependientes.
Las de más utilidad en los métodos de manipulación del ADN, son las del Tipo II, debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura, todas las enzimas de restricción comerciales son de esta categoría.
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APLICACIONES• Diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas
con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o delecciones de fragmentos.
• Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte.
• Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.
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SONDAS DE ADN
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• Las sondas de ADN se pueden utilizar de manera semejante a los anticuerpos, como herramientas sensibles y específicas para detectar, localizar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos específicos en muestras clínicas.
• La especificidad y la sensibilidad de las técnicas basadas en sondas de ADN permiten detectar especies o cepas de un agente infeccioso, incluso en ausencia de proliferación o replicación.
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• Las sondas de ADN se sintetizan a través de métodos químicos o bien se obtienen por clonación de fragmentos genómicos específicos o de un genoma vírico completo en vectores bacterianos.
• Las copias de ADN de los virus de ARN se fabrican por medio de una transcriptasa inversa retro-vírica y luego se clonan en estos vectores.
• Tras llevar a cabo tratamientos químicos o térmicos para «fundir» (separar) las cadenas de ADN de la muestra, se agrega la sonda de ADN y se permite su hibridación (unión) a la secuencia idéntica o casi idéntica de la muestra
• La aplicación de una sonda de ADN marcada con biotina permite emplear un nucleótido fluorescente o una molécula de avidina o estreptavidina, marcada enzimáticamente para detectar ácidos nucleicos víricos en una célula de manera similar a la localización de un antígeno por inmuno-fluorescencia indirecta o enzimo-inmunoanálisis.
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• Las sondas de ADN son capaces de detectar secuencias genéticas específicas en muestras tisulares de biopsia fijadas y permeabilizadas por hibridación in situ.
• Actualmente se dispone en los comercios de un gran número de sondas víricas y de equipos de reactivos para detectar partículas víricas.
• Se pueden detectar secuencias de ácidos nucleicos específicos en extractos de una muestra clínica aplicando un pequeño volumen del extracto en un filtro de nitrocelulosa (transferencia puntual) y después aplicando una sonda de ADN vírico específico marcado sobre el filtro.