hibridación de ácidos nucleicos
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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
BIOTECNOLOGÍA MÉDICA
Ing. Cinthia Córdova Barrios
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Introducción
PATOLOGÍA
MOLECULAR
INGENIERÍA
GENÉTICA
BIOLOGÍA
MOLECULAR
Bases moleculares
Métodos de ensayo
Aplicaciones
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Introducción
DNA dúplex desnaturalizado
Renaturalización de dos cadenas sencillas de DNA (bases complementarias)
Híbridos DNA-DNA, RNA-RNA y DNA-RNA
La hibridación se basa en el proceso de renaturalización
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Desnaturalizacíón:
DESNATURALIZACIÓN
Rotura de los puentes de hidrógeno entre pares de bases.
Interacciones hidrófobicas entre bases apiladas.
Genera la pérdida de la conformación tridimensional o duplohelicoidal, determinando la
separación de las hebras y una conformación al azar o de ovillo. *RNA
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Agentes Desnaturalizantes
Desnaturalizantes
Temperatura
Ácidos y bases
Agentes químicos
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Agentes Desnaturalizantes
Temperatura
• Es el más representativo.
• Se debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice.
Ácidos y bases
• Valores de pH alejados de la neutralidad (apareaminento)
• Condiciones ácidas: Ruptura de la estructura primaria (enlaces y separación de bases.)
• Condiciones alcalinas: desnaturalización.*
Agentes químicos
• Moléculas polares con grupos amino y carbonilo.
• Frecuentes: urea, formamida, formaldehído.
• Compiten en la formación de enlaces puente de hidrógeno. *
La desnaturalización es reversible o irreversible (recuperación)
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Efecto de la temperatura
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Influencia de la desnaturalización sobre las
propiedades del DNA
Influencia en las propiedades
Viscosidad
Absorción ultravioleta
Rotación óptica.
Densidad de flotación.
Permiten diferenciar el DNA de doble hebra y el de hebra
sencilla.
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Influencia de la desnaturalización sobre las
propiedades del DNA
INFLUENCIA SOBRE LA VISCOSIDAD (Rigidez y forma*)
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Influencia de la desnaturalización sobre las
propiedades del DNA
INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIÓN (dobles enlaces*)
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Influencia de la desnaturalización sobre las
propiedades del DNA
INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA
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Curvas de desnaturalización
Carácter
sigmoidalRepresenta
Interacción
cooperativa
Característic
a propia
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Curvas de desnaturalización
Temperatura
de fusión, Tm
Curvas de
fusión
Estabilidad
estructural.
Tm y el
contenido de
bases
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Curvas de desnaturalización
EvoluciónDogma
central
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Curvas de desnaturalización y
renaturalización
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Hibridación de ácidos nucleicos
Introducción
La renaturalización depende de la complementariedad de secuencia de las hebras. Lo más probable es su reasociación formando los
dúplex originales.
Formación de moléculas dúplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (especie o ácido nucleico). Hibridación
La estabilidad del híbrido depende de la proporción de bases complementarias y mayor longitud de las secuencias apareadas.
La hibridación puede tener un carácter artificial (homo y hetero), pero complementario.
La hibridación relaciona el grado de herencia evolutiva o conexión (homología, pe)
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Hibridación de ácidos nucleicos
Principio básico:
Secu
enci
a dia
na En uno de los
fragmentos, obtenidos por enzimas de restricción, de la muestra de DNA.
Sonda Fragmento
corto de DNA, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia diana, marcado de forma que permita su detección.
Especificidad de la interacción entre base complementarias
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Hibridación de ácidos nucleicos
Principio básico:
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Hibridación de ácidos nucleicos
Factores que influyen:
Factores
Concentración de ácido nucleico.
Número de copias de la secuencia diana.
Concentración y tamaño de la sonda.
Temperatura.
Tiempo de hibridación.
Características del medio de reacción.
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Hibridación de ácidos nucleicos
Rigor de la hibridación:
DEFINICIÓN
Grado de especificidad en el
apareamiento conseguido en los
híbridos
Capacidad de reconocimiento mutuo de dos
secuencias
Apareamiento completo entre sonda
y diana.
CONTROL
Esencial
No alto, que impida la unión estable de la sonda a su diana
No bajo, que permita la hibridación
inespecífica de la sonda. Falso positivo
DEPENDE
Temperatura y tiempo de renaturalización
Composición de bases
Ambiente químico: Presencia de cationes y desnaturalizantes.
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Hibridación de ácidos nucleicos
Rigor de la hibridación:
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Hibridación de ácidos nucleicos
Métodos de ensayos
MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN
En fase líquida
En soporte sólido
In situ
DNA CON SECUENCIA
DIANA
SONDA MARCADA
HIBRIDACIÓN
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Hibridación en fase líquida
Método inicialmente empleado
Muestra de DNA o RNA en disolución con la sonda.
Cinética rápida
Técnica cuantitativa..
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Hibridación en fase líquida
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Hibridación en soporte sólido
Ensayo más simple.
Permite procesar varias muestras simultáneamente.
Cinética lenta.
Fácil control de la hibridación.
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Hibridación en soporte sólido
Identificar en colonias bacterianas el gen en forma de plásmido recombinante
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Hibridación en soporte sólido: DOT-BLOT Y
SLOT-BLOT
Ensayo más simple y común
Emplea muestras de ácido nucleico sin purificar.
Muestra se aplica gota a gota. Dot blot.
Muestra en manchas alargadas sobre un papel filtro. Slot blot
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Hibridación en soporte sólido: DOT-BLOT Y
SLOT-BLOT
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Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN
BLOT
Técnica simple y fácil.
Detecta fragmentos de DNA (ER) separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte sólido o filtro.
Detección
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HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO:
SOUTHERN
Separación electroforética
Desnaturalización
Transferencia
Hibridación
Detección
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Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN
BLOT
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Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN
BLOT
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Hibridación en soporte sólido: NORTHERN
BLOT
Técnica simple y fácil.
Detecta fragmentos de RNA separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte sólido o filtro.
Detección
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Hibridación in situT
isula
r Se realiza sobre cortes de tejido (fijados con formalina, parafina o congelados)células intactas, núcleos aislados.
Detección: autorradiografía o microscopía de fluorescencia.
Detecta virus patógenos.
Diagnósticos de células cancerosas.
Expresión genética
In s
itu c
rom
osó
mic
a Se realiza en preparaciones fijadas en porta de cromosomas metafásicos.
La secuencia de DNA se trata con enzimas proteolíticas y se desnaturaliza el DNA.
Hibridación con la sonda.
Detección con sondas marcadas con fluorescencia(FISH).
Diagnóstico de cromosomopatías, genes tumorales, virología, trasplantes, cariotipo molecular (pintado de cromosomas)
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Transferencia WESTERN BLOT
No existe hibridación
Detecta proteínas separadas por electroforesis en SDS-PAGE
Transferencia a un soporte sólido o filtro.
Detección: anticuerpo marcado o proteína ligante.
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Transferencia WESTERN BLOT