1

High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin

报告人：陈思

时间： 2013.05.25

2

简介1. 疟疾

是一种由疟原虫造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病

2. 疟原虫

恶性疟原虫具有复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是唯一的选择。而抗药疟原虫突变系的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。 据 WTO 统计， 2010 年有 2 亿疟疾病例，并导致 655000 人死亡。

3. 青蒿素

一种由我国学者在 20 世纪 70 年代初从 Artemisia annua L （菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（ C-15倍半萜），通过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望”。

3

简介

4. 青蒿素工艺路径人工全化学合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。

世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低 (0.1%-1%  w/w), 且受地域性种植影响较大。

用酵母生产青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素

本文使用了半化学合成法来生产青蒿素。

研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的：

焦磷酸法呢酯（ FPP ）

Amorphadiene （合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料 ）

青蒿酸

青蒿素

青蒿素天然合成路径

由于酵母也可以合成 FPP ，所以我们所需要做的只是将 FPP到 Amorphadiene 再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

5

酵母内代谢途径ERG9 ：编码鲨烯合成酶，将 2 分子 FPP 合成鲨烯，最终获得固醇

CYP71AV1 ：控制一种细胞色素 P450 合成的酶

CPR1 ：与 CYP71AV1 对应的还原酶的表达基因

6

主要工作

开发了一种利用纯态氧（ singlet oxygen ）将青蒿酸转化为青蒿素的有效、可行的化学合成途径

2

本文证实了青蒿酸在酵母体内全生物合成途径，并发现了一种植物脱氢酶和另一种细胞色素（ CYB5 ）

1

7

酵母内代谢途径ERG9 ：编码鲨烯合成酶，将 2 分子 FPP 合成鲨烯，最终获得固醇

CYP71AV1 ：控制一种细胞色素 P450 合成的酶

CPR1 ：与 CYP71AV1 对应的还原酶的表达基因

8

Amorphadiene合成青蒿酸途径

1. 已有文献指出细胞色素 b5 与细胞色素P450 酶作用会增强细胞色素 P450 酶的反应速率。本文鉴定出一种细胞色素 b5 的cDNA, 从而获得编码细胞色素 b5 的基因CYB5 。

2. 近期分离出了青蒿醛脱氢酶的 cDNA, 并将其对应的基因 ALDH1 在酵母体内表达

3. 检测到一种脱氢酶，对其纯化分析，并通过 ESTs 、序列分析等获得基因 ADH1

9

生物合成青蒿酸菌株改造：

Y337 （原始菌株， PMET3-ERG9 ）

Y1516

（ PCTR3-ERG9 ）

将控制ERG9 基因表达的启动子 PMET3 替换为 PCTR3

Y285

（ PMET3-ERG9 ）

导入表达CYP71AV1 和CPR1 基因的高拷贝质粒

Y301

（ PCTR3-ERG9 ）

导入表达CYP71AV1 和CPR1 基因的高拷贝质粒

将控制ERG9 基因表达的启动子 PMET3 替换为 PCTR3

10

结果

Y337 产 amorphadiene12g/L

Y285 产青蒿酸 3.3g/L+ amorphadiene 0.3g/L+ 青蒿酸乙酯 0.18g/L （不产青蒿醛）

Y285 产量少，且生长能力显著变差，猜测是由细胞色素 P450 氧化amorphadiene ，或青蒿酸的积累引起的

11

生物合成青蒿酸菌株改造：

Y657

（ PCTR3-ERG9 ）

插入弱启动子 GAL3控制 CPR1 的表达，并将其整合到基因组DNA 上

Y692

（ PCTR3-ERG9 ）

将受强启动子 GAL7 控制的 CYB5 基因整合到染色体

导入 ALDH1 基因

Y1368

（ PCTR3-ERG9 ）

Y1283

（ PCTR3-ERG9 ）

Y1284

（ PCTR3-ERG9 ）

敲除 GAL80 基因

Y301

（ PCTR3-ERG9 ）

导入ALDH1 基因

Y973

（ PCTR3-ERG9 ）

导入 ADH1基因

12

结果

Y657 较 Y285 （或 Y301 ，是将 Y285 启动子 PMET3 替换为 PCTR3 ）细胞生长能力增强，但青蒿酸产量降低

尽管降低 CPR1 的表达水平降低了青蒿酸的产量，总的倍半萜烯类物质产量仍很高，说明低 CPR1 表达量增加细胞的生存能力，但减少了 amorphadiene 氧化物的生成速率

13

结果

对比 Y657 和 Y692 ，发现 Y692 的青蒿素、青蒿醛的产量均较高，总倍半萜烯类产物的产量增加了 40% ，说明 CYB5 基因的表达会提高青蒿素产率

对比 Y692 和 Y1368, 说明 ALDH1 基因的表达显著地增加了青蒿酸的产量，并且检测不到产物青蒿醛，且菌株的生存能力显著增加，产量是菌株 Y285 的两倍多。

对比 Y1368 和 Y1283 ，青蒿酸产量增加了 18% ，说明 ADH1 基因的表达能增加目的产物产量

14

添加 IMP

表达 ALDH1 基因的菌株以胞外晶体沉淀的形式生产青蒿酸，沉淀在初期发酵时便能观察到，这对使得多相发酵样品中产品的精确测量变得复杂。为了克服由青蒿酸结晶沉淀带来的困难，我们利用萃取发酵溶解沉淀的现象，在十四酸异丙酯（ IMP) 环境中培养菌体。

15

结果

添加 10% 的 IPM ，使得所有菌株的生存能力显著加强

16

结果

添加 10% 的 IPM ，使得所有菌株的生存能力显著加强。同时，对Y285 、 Y301 、 Y657 和 Y692 菌株（缺乏 ALDH1 和 ADH1 基因）而言，添加IPM 会导致中间产物的析出。而对有 ALDH1 和 ADH1 基因的菌株，添加 IPM 会提高青蒿酸的产量

17

化学途径1.the reduction of the D11(13) double bond.

2. the esterification of the carboxylic acid.

3. an ‘ene-type’ reaction of the C4–C5 double bond with singlet oxygen.

4. the allylic hydroperoxide undergoes an acid-catalysed Hock fragmentation and rearrangement to afford a ringopened keto-aldehyde enol