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Los inhibidores de la HMG-COA reductasa regulan la síntesis del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) inducido por la angiotensina ll. ¿Un efecto adicional vasoprotector?

HMG-COA reductase inhibitors regulate angíotensin ll-induced connective tissue growth factor synthesis. An additional vasoprotective effect?

Rupérez M., Blanco-Colio L., Sánchez-López E, Esteban V., Rodríguez-Vita J., Egido J., Ruiz-Ortega M.

RESUMEN

La AngII participa en el acúmulo de matriz extracelular en la pared va\cular, proce\o que ocurre en sltuaclones patoló:lca\ como la hlper- ttmión arterIal y la atcro\clero\l\ El factor de creclmlento conecttvo tt- \ular (CTGF) está tmphcado en proce\os de fibro\ls A\í. se han de\crl- to nIvele\ elevados de CTGF en placas de ateroma humana\ y tra\ mfarto agudo de mlocardlo en la\ zonas de fibrosl\ Los InhIbIdores de la HMG- COA (3-htdrox~-3-met~lglutünl coenzuna A) reductasa (e\tatmaa) han demostrado ser benehclo\os en el tratamenta de dIvena\ enfermedades cardiovaxulares E\to\ efecto\ \on debldos d la regulación del colesterol y a accIones celulares, como la mtublclón de la isoprendaclón de pro- teínas y cambloa en los mveles de actlvaclón de proteínas G. Nuestro obJetlvo fue estudiar la poalble relación entre loa InhIbIdores de la ISO- premlaclón protetca y las acctoneî de la AngII en el daño vaxular, u- vesngando en células de múxulo IIFO vascular (CMLV) FU efecto sobre la modulación del CTGF En CMLV, la AnglI. a través del receptor AT,. Induce la exprestón y <íntesIs del CTGF (Northern y We%ern blot). La mcubaclón con un ollgonucleotldo annsenttdo de CTGF, que bloquea IU producción endógena, dl\mmuyó la +xe\ls de fibronectma InducIda por AngII, lo que qugtere que el CTGF es un mediador de la fibrosl\ causa da por AngII. La premcubación de las CMLV con atorvastatina o \m- vastatma (IO-’ mol/L a 10m9 mol/L) mhlbló de forma dosla dependiente la producción de CTGF causada por AnglI, efecto que fue revertIdo por el mevalonato y por metabohtos mtermedtartos. La Angll, vía AT,, ac- tiva Ia5 proteína5 Rho. El bloqueo de RhoA, mediante transfecctones tran- sttortas con un vector dommante negativo de RhoA, mhibló la produc- clón de CTGF causada por AngII InhIbIdores de la proteína qumasa de Rho (Y-27632 y fasudd) dlsmmuyeron de fornxa dosis dependiente la pro- ducclón de CTGF InducIda por AnglI.

Conclusiones: En CMLV, la AngII, medtante la unión a receptore AT, y acnvaclón de proteína\ qumasas (como la quinasa de Rh”). regula la producción de CTGF. Las e\tatmas. a través de la mhilxclón de ISO- prenoldes y modulando la acttvtdad de las proteínas Rho, InhIben la pro- ducclón de CTGF causada por AngII. Nuestros resultados sugleren que alguno\ de loî efecto5 beneficIoso\ de las estatinaî pueden \er atrIbuIdo\ a sus acciones celulares sobre la regulación de las respuestas de la AngII en el daño vaacular, exphcando efecto\ protectores mdependlente\ de la regulación del colesterol.

Los inhibidores de la HMG-COA reductasa regulan la síntesis del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) inducido por la angiotensina II. ¿Un efecto adtcional vasoprotector? Rupérez M, Blanco-Colio L, Sánchez-López E, Esteban V, Rodríguez-Vita J, Egido J, Ruiz-Ortega M Iwestignciórz Cndiovrrvc~tlnr, 2004; 7: 60-80

ABSTRACT

Angtotemm II (AnglI) participate\ in the development of fibro\t\ du- rmg vaxular damage, mcludmg hypertenslon and athero\cleroal\ Con- nectivc tl\\ue growth factor (CTGF) ha\ been dc\crlbed u\ a novel fl- brotx medlator Elevated CTGF level\ have been reported tn human atherosclerotlc plaques and after myocardlal mfarcnon. The 3.hydroxy- 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-COA) reductaae mhlbltor\ (\tatm\) have shown beneficIaI eftects tn the treatment ot cardtovascular dlaease\ a\ hpld-lowenng drugs. Recent studles suggeat choleaterol-mdependent acttons \uch ag mhilxnon of prenylatlon and acnvauon of G protem5. Our ann was to mvesngate whether HMG-COA reductaîe mhtbttorc could modulate AngII responses, mveangatmg m vascular amooth muscle cell\ (VSMCs) the effect on CTGF expre$\!on. Result\. m growth-arre\ted VSMC\. AngII, via AT, receptor, mduced CTGF mRNA expresslon (Northern blot) and protem producnon (We\tern blot). A CTGF ann\en- se oltgonucleottde decreaîed Angll-tnduced fibronectm \yntheFi\. \ug- gestmg that CTGF could be a medlator of Rbrogenx effects of AngII Pretreatment of VSMC\ wnh HMG-COA reductaFe mhlbnors (\nnva\ta- tin and atorvastatm: IO-’ mol/l to IO-” mol/l) time- and dose-dependently mhlbned AngII-mduced CTGF producnon The mhlbltlon ot CTGF ex- presalon was prevented when cella were mcubated wnh mevalonate and other tsoprenolds. AngII actIvate\ Rho protemî vla ATI Overexpre%lon of domnxant neganve vector of RhoA suppressed CTGF mductlon by An- gII. Inhibttor\ of Rho kinase (Y-27632 and fasudll) do\e-dependently decreased AnglI-mduced CTGF production.

ConcIusions: In VSMC\, AnglI, vla AT, receptor and acnvauon of kmase\ ($uch as Rho kmase), regulateî CTGF producnon. Our data \ug- ge\t that statms. through tsoprenotd mhlbitton and therefore mhlbmon of Rho protems, regulate AngII-mduced CTGF producnon These data aug- geît that some of the beneficIaI actiom of rtatm\ could be due to modulation of AngII-medlated vascular damage, accounting for choleîterol- mdependent protecnve effects.

HMG-COA reductase inhibitors regulate angiotensin II-induced connective tissue growth factor synthesis. An additional vasoprotective effect? Rupérez M, Blanco-Colio L, Sánchez-López E, Esteban V, Rodríguez-Vita J, Egido J, Ruiz-Ortega M hwestigctciór~ C~rr-rliovnscular; 2004; 7: 60-80

Correspondencia / correspondence: M. Ruiz-Ortega Laboratorio de Patología Vascular y Renal Fundación Jiménez Díaz Avda. Reyes Católicos, 2 28040 Madrid Email: [email protected]

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Angll, estatinas y datio vascular Angiotensin II, statins and vascular damage

INTRODUCCIÓN INTRODUCTION

El estudio del papel del sistema retina angiotensina (SRA) y de su péptido efector, la angiotensina II (Angll) en la progresión de las enfermedades cardiovasculares (aterosclerosis, hipertensión y remodelamiento cardiaco) es un campo de in- vestigación muy activo en biomedicina (1). La Angll es una verdadera citoquina, capaz de regular el crecimiento celular y los procesos inflamatorios y fibróticos (2-4). Se ha demostrado que fármacos que bloquean su acción (inhibidores del enzima de conversión de angiotensina, iECAs, y antagonistas de los receptores AT,) mejoran la evolución clínica de estos pacientes (5). Otro tratamiento con resultados beneficiosos en estas patologías es el empleo de los inhibidores de la HMG-COA (3-h¡- droxi-3-metilglutaril coenzyma A) reductasa (tam- bién denominados estatinas). Los ensayos clíni- cos han mostrado que estos fármacos disminuyen la incidencia de episodios coronarios agudos y mejoran la supervivencia (6,7). Los inhibidores de la HMG-COA reductasa actúan inhibiendo la enzima limitante en el metabolismo del colesterol, disminuyendo la síntesis hepática de lipoproteínas de baja densidad (LDL). Además de su eficacia como agentes reductores del colesterol, las estatinas actúan a escala intracelular, inhibiendo la pro- liferación, migración y señales intracelulares de las células de músculo liso vascular (CMLV) (8,9). Algunos de estos efectos celulares son debidos, al menos en parte, a la inhibición de la isopreni- lación y a modificaciones postraduccionales de las proteínas, que regulan su actividad y localización en la membrana. Entre las proteínas diana de estas inhibiciones destaca la supetfamilia de prote- ínas G pequeñas, que incluyen las proteínas Ras, Rho, Rac y Cdc42. Estas GTPasas intracelulares

Abreviaturas:

Angiotensina II: Angll. Receptores de tipo 1 de angiotensina: AT,. Receptores de tipo 2 de angiotensina: AT,. Células de músculo liso vascular: CMLV. Enzima de conversión de angiotensina: ECA. Estatinas: inhibidores de la HMG-COA (3.hidroxi-3-me-

tilglutaril coenzyma A) reductasa. Ester de forbol miristato acetato: PMA. Factor de crecimiento de tejido conectivo: CTGF. Factor de crecimiento transformante: TGF-13. Farnesilpirofosfato: FPP. Fibronectina: FN. Geranilgeranilpirofosfato: GGPP. Sistema renina angiotensina: SRA.

The study of the role of the renin-angiotensin system IRAS) and its effector peptide, angiotensin II (Anglll, in the progression of cardiovascular diseases fatherosclerosis, hypertension and cardiac remodeling) constitutes a very active field for research in biomedicine (1). Angll is a true cytokine, capable of regulating cell growth and inflammatory and fibrotíc processes (2-4). It has been shown that drugs blocking its action (angiotensin-converting enzyme inhibitors -ACEls- and AT, receptor antagonists) improve the clinical course of these diseases (51. Another treatment with beneficial effects in patíents with these conditions is represented by the HMG-COA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase inhibitors (also called statinsl. Clinical trials have shown these drugs to decrease the incidence of acute coronary events and to improve survival(6, 7). Statins act by inhibiting the rate-limiting enzyme ín cholesterol metabolism, thus decreasing the synthesís of low density lipoproteins (LDL) in the liver. In addítion to their efficacy as cholesterol-lowering drugs, statins act at intracellular level, inhibiting vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferatíon, migration and intracellular signals (8, 9). Some of these cellular effects are at least pattly due to inhibition of isoprenylation and post-translational changes in proteins, regulating their activity and location in the membrane. The target proteins of these inhibitions patticularly include the superfamily of small G proteins, including the proteins Ras, Rho, Rac and Cdc42. These intracellular

Abbreviatons:

Angiotensin converting enzyme: ACE. Angiotensin II: Angll. Angiotensin type 1 receptors: AT,. Angiotensin type 2 receptors: AT,. Connective tissue growth factor: CTGF. Famesylpyrophosphate: FPP. Fibronectin: FN. Geranylgeranylpyrophosphate: GGPP. Phorbol myristate acetate ester: PMA. Renin-angiotensin system: RAS. Statins: HMG-COA (3.hydroxy-3-methylglutaryl co-

enzyme Al reductase inhibitors. Transforming growth factor: TGF-/3. Vascular smooth muscle cells: VSMCs.

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M. Rupérez, L. Blanco-Colio, E. Sánchez-López, et al.

tienen un papel regulador importante en la trans- misión de señales desde la membrana celular ha- cia el núcleo. Cuando se activan las proteínas Ras estimulan una cascada de proteínas serina-treo- ninaquinasa que conduce a un aumento en la transcripción de algunos genes. Las proteínas Rho están implicadas en la regulación de diversas funciones celulares, como cambios en el citoesqueleto de actina (contracción, movilidad, adhesión), activación de factores de transcripción, progresión del ciclo celular, apoptosis y transformaciones celulares (10).

El acúmulo de la matriz extracelular en el sistema cardiovascular desempeña un papel muy importante en el desarrollo de la hipertrofia vascular y ventricular y de la insuficiencia cardíaca. La hipertensión provoca cambios estructurales en las arterias que incluyen el aumento del depósito de colágenos, la destrucción de las fibras elásticas y la hipertrofia de CMLV (1). Este aumento de la matriz extracelular se ha atribuido a efectos hemodi- námicos asociados con el estrés mecánico y a factores como Angll y TGF-13 (1). Recientemente se ha descrito un nuevo y potente factor profibróti- co: el factor de crecimiento conectivo tisular (CTGF). Este factor es miembro de la familia CCN (CYRGI, CTGF y NOV) de genes de respuesta tempranos (ll), y ha sido implicado en el desarrollo de varias patologías asociadas a fibrosis, como escleroder- mia, queloides y otros desórdenes de la piel, desarrollo de tumores y enfermedades pulmonares y renales (Il, 12). El CTGF es un factor de crecimiento ubicuo que regula la proliferación de fibroblastos, la adhesión celular, la angiogénesis y la estimulación de la producción de matriz extracelular (1 I-13). Su importancia en el daño vascular ha sido demostrada al observar que su expre- sión está aumentada en lesiones ateroscleróticas (13) y en infarto de miocardio (14). El CTGF regula el crecimiento, la migración y la producción de matriz extracelular en CMLV (12, 15). Por otro lado, la sobreexpresión de CTGF induce apoptosis de CMLV (161, las principales células productoras de matriz extracelular.

Recientemente se están realizando terapias combinadas con inhibidores de la HMG-COA reductasa y fármacos que bloquean la Angll. Nues- tro objetivo ha sido estudiar la posible relación entre los inhibidores de la isoprenilación proteica y las acciones de la angiotensina ll en el daño vascular, estudiando en concreto su efecto sobre la modulación del CTGF. El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en estos procesos puede ayudar a comprender la patología cardiovascular y a mejorar las estrategias tera- péuticas.

GTPases play a significant regulating role in signa1 transmission from the cell membrane to the nucleus. Activated Ras proteins stimulate a cascade of serine-treonine kinase proteins leading to an increased transcription of some genes. The Rho proteins are implicated in the regulation of different cell functions, such as changes in the actin cytoskeleton (contraction, mobility, adhesion), activation of transcription factors, cell cycle progression, and apoptosis and cell transformations (70).

Extracellular matrix accumulation in the cardiovascular system plays a very important role in the development of vascular and ventricular hypertrophy, and heart failure. Hypertension causes structural changes in the arteries, including an increased collagen deposít, destruction of elastic fibers, and hypertrophy of VSMCs (7). This increase in extracellular matrix has been attributed to hemodynamic effects associated with mechanical stress and factors such as Angll and TGF-l3 (7). A new and potent profibrotic factor has recently been repotted: the connective tissue growth factor (CTGF). This factor is a member of the CCN family (CYR67, CTGF and NOV) of early response genes (7 7), and has been implicated in the development of different conditions associated to fibrosis, such as scleroderma, keloids and other skin disorders, the development of tumors and lung and kidney diseases (7 7, 72). CTGF is an ubiquitous growth factor that regulates fibroblast proliferation, cell adhesion, angiogenesis and stimulation of extracellular matrix production (7 7- 73). Its significance in vascular damage has been shown by the fact that CTGF expression is increased in atherosclerotic lesions (73) and in myocardial infarction (741. CTGF regulates the growth, migration and production of extracellular matrix in VSMCs 172, 75). On the other hand, CTGF over-expression induces the apoptosis of VSMCs (761, the main cell producing extracellular matrix.

Combined therapies with HMG-COA reductase and Angll blockers have recently been introduced. Our purpose was to study the potential relationship between protein isoprenylation inhibítors and angiotensin ll actions in relation to vascular damage, specifically evaluating the effect on CTGF modulation. Knowledge of the molecular mechanisms implicated in these processes may help to understand cardiovascular disease and improve treatment strategies.

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Angll, estatinas y dario vascular Angiotensin II, statins and vascular damage

MÉTODOS METHODS

Cultivos celulares

El cultivo de CMLV se realizó a partir de aortas de ratas Wistar mediante digestión con colagena- sa (17). Las células se cultivaron en medio DMEM con 10% STF y se usaron entre los pases segun- do y séptimo. Las CMLV se caracterizaron por mi- croscopia de contraste de fase, tinción positiva para cc-actina y tinción negativa para el antígeno relacionado con el factor VIII.

Reactivos y anticuerpos

Todos los reactivos para cultivo celular se obtuvieron de Gibco BRL (Paisley, Scotland, UK). El Losar-tan (antagonista del receptor AT,) fue dona- do por MSD (Madrid, España) y el inhibidor Y- 27632 es de Tocris (UK). Los isótopos radiactivos se obtuvieron de Amersham (Buckinghamshire, UK). Los anticuerpos frente a CTGF son de Torrey Pines (San Diego, USA) y el resto de DAKO. Los anticuerpos secundarios conjugados con HRPO o FITC son de The Binding Site Inc (Birmingham, UK). Los inhibidores de señales intracelulares son de Calbiochem. El resto de los compuestos quí- micos empleados provienen de Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). Ninguno de los reactivos utilizados fue tóxico a las dosis empleadas (datos no mostrados). En algunos experimentos se utilizan metabolitos intermedios de la ruta del colesterol (mevalonato, geranilgeranilpirofosfato 0 farnesilpirofosfato).

Cell cultures

VSMC culture was petformed using Wistar rat aortas with collagenase digestion (17). The cells were cultured in DMEM medium with 10% FCS, and were harvested between the second and seventh passages. The VSMCs were characterized using phase contrast microscopy, positive staining for a-actin, and negative staining for factor VIII related antigen.

Reagen ts and an tibodies

All reagents for cell culture were obtained from Gibco BRL (Paisley, Scotland, UK). Losattan (an AT, receptor antagonist) was donated by MSD (Madrid, Spain), and the Y-27632 inhibitor was supplied by Tocris (UK). The radioactive isotopes were obtained from Amersham (Buckinghamshire, UK). The antibodies against CTGF were from Torre y Pines (San Diego, USA), and the rest from DAKO. The secondary antibodíes conjugated with HRPO or FITC were obtaíned from The Binding Site, Inc (Birmingham, UK). The intracellular signa1 inhibitors were from Calbiochem. All other chemicals used were obtained from Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). None of the reagents were toxic at the doses used (data not shown). In some experiments, intermediate metabolites in the cholesterol pathwa y were used (mevalonate, geran ylgeran ylp yrophosphate or farnesylpyrophosphate).

Determinación de proteínas Protein determination

Los niveles de proteínas se estudiaron por in- munocitoquímica y/o Western blot empleando anticuerpos específicos. Para inmunocitoquímica, las células se cultivaron en placas de ocho poci- llos, se fijaron con metanol:acetona a -20 “C y con 3% paraformaldehído, y se permebilizaron tra- tando con 0,5% Tritón-X100. Para Western blot, las proteínas se separaron por SDS-PAGE electroforesis al 12% en condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de difluorido de poli- vinilideno. Las muestras se incubaron primero durante una hora a temperatura ambiente en tam- pón de bloqueo (0,l mmol/L NaCI, 0,Ol mmol/L Tris pH 7,5, O,l% Tween-20 y 5% leche semides- natada) y después durante 18 horas a 4 “C con el anticuerpo primario correspondiente en el mis-

Protein levels were determined by immunocytochemistty and/or Western blot using specific antibodies. For immunocytochemistty, the cells were cultured in 8-well plates, fixed with methanol: acetone at -20°C and 3% paraformaldeh yde, and permeatedby treatment with 0.5% Triton-X100. For Western blot, proteins were separated by 12% SDS-PAGE electrophoresis under reducing conditions and transferred to polyvin ylidene difluoride membranes. The samples were first incubated for one hour at room temperature in blocking buffer (0.1 mmol/l NaCI, 0.01 mmol/ Tris pH 7.5, 0.1% Tween-20 and 5% semi-skimmed milk), and then for 18 hours at

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mo tampón. Tras lavarlas, se realizó la detección incubando durante una hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa, y se reveló empleando técnicas de quimioluminiscencia de ECL (Amershan Pharma- cia Biotech, Buckinghamshire, UK). La especifici- dad de los anticuerpos se realizó por ensayos de bloqueo con péptido control (Western) o incubando las células sin el anticuerpo primario (in- munocitoquímica).

4 “C with the corresponding primaty antibody in the same buffer. After washing, detection was carried out by incubation for one hour at room temperature with a peroxidase-labeled secondary antibody, followed by development with ECL chemoluminiscence techniques (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UKI. Antibody specificity was established by blocking tests with control peptide (Western blotl, or incubating the cells without the primary antibody (immunocytochemistry).

Expresión génica Gene expression

El RNA total se aisló por el método del Trizo1 (Gibco). Los niveles del mRNA del CTGF se estudiaron por Northern blot (18). La calidad del RNA se determinó por electroforesis en geles del 1% agarosa-formaldehído y tinción con bromuro de etidio. Los cebadores usados fueron: CTGF (sentido: 5’-GAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGG -3’, antisentido 5’-ATGTCTCCGTACATCTTCCTGTAGT -3’) y G3PDH (sentido: 5’-AATGCATCCTGCAC- CACCAA-3’, antisentido: 5’-GTAGCCATAlTCAlT- GTCATA-3’1, que dan lugar a productos de 378 pb y 515 pb, por PCR (un minuto a 94”, dos minutos a 63”/54 “C y un minuto a 68”; 25 ciclos) respectivamente. Para los estudios de Northern blot las membranas fueron prehibridadas durante cuatro horas a 42 “C (50% formamida, 1% SDS, 5x SSC, Ix Denhardt, 0,25 mg/ml DNA y 50 mmol/L fosfa- to sódico pH 6,5), y la hibridación se realizó a 42 “C durante la noche con 20% sulfato de dextrano y a-i3’Pl-sonda desnaturalizada. Las membranas se lavaron con 2x SSC, O,l% SDS. Los resultados se expresan como unidades arbitrarias de densi- tometrado relativas a la G3PDH.

Total RNA was isolated by the Trizo1 method (Gibco). CTGF mRNA levels were evaluated by Northern blot (18). RNA quality was assessed by electrophoresis in 1% agarose-formaldeh yde gels and staining with ethidium bromide. The primers used were: CTGF (sense: 5’-GAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGG-3: antisense 5’-ATGTCTCCGTACATCTTGTAGT-3) and G3PDH (sense: r-AATGCATCCTGCACCACCA-AS; antisense: 5’-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3’), gíving rise to 378 bp and 515 bp products by PCR (ene minute at 94 “C, two minutes at 63 OC/54 “C, and one minute at 68 “C; 25 cycles), respectively. For the Northern blot studies, the membranes were pre-h ybridized for four hours at 42 “C (50% formamide, 1% SOS, 5x SSC, Ix Denhardt, 0.25 mg/ml DNA and 50 mmol/ sodium phosphate pH 6.51, and hybrídization was performed at 42°C with 20% dextran sulfate and a-f2PI-denatured probe overnight. The membranes were washed with 2x SSC, 0.1% SDS. The results are expressed as arbitrary densitometry units relative to G3PDH.

Transfecciones transitorias Transíent transfections

Las células fueron transfectadas de forma transitoria con Fugene 6 (Roche, Base1 Switzerland) en presencia de los diferentes vectores de expresión; pcDNA-N19RhoA: dominante negativo de RhoA, pcDNA-Q63LhoA: constitutivo de RhoA, pcDNA- wtRhoA: forma salvaje de RhoA, pcDNA3B: vec- tpr vacío (donados amablemente por el doctor Angel Pascual del Instituto de Investigaciones Bio- médicas, Madrid). Después de la transfección, las células se mantuvieron 24 horas sin suero antes de ser estimuladas.

The cells were transiently transfected with Fugene 6 (Roche, Basel, Swítzerland) in the presente of different expressíon vectors; pcDNA-NlSRhoa: negative domínant of RhoA, pcDNA-Q63LhoA: constitutive form of RhoA, pcDNA-wtRhoA: wild form of RhoA, pcDNA3B: e,mpty vector (kindly donated by doctor Angel Pascual, of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Madrid, Spain). Following transfection, the cells were maintained for 24 hours without serum before stimulation.

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Angll, estatinas y daño vascular Angiotensin II, statins and vascular damage

Análisis estadístico y valoración de los resultados

Las películas de autoradiografía fueron esca- neadas usando el densitómetro GS-800 Calibrated Densitometer (Quantity One, BioRad, ). Los datos se expresan en unidades arbitrarias de densito- metrado como incremento respecto al control (n- veces) de media k error estándar de la media (EEM) o como resultado representativo de varios experimentos. El análisis de significación se rea- lizó empleando el programa GraphPad Instat (GraphPad Software, San Diego, USA). Las po- blaciones se compararon utilizando el test de Wilcoxon y el de Student-Newman-Keuls, consi- derando diferencias significativas cuando p < 0,05.

RESULTADOS

La angiotensina ll aumenta la expresión génica y la síntesis proteica de CTGF en células de músculo liso vascular

En primer lugar, investigamos si la Angll era capaz de regular la expresión y síntesis de CTGF en CMLV. Las células, en fase de reposo, se estimularon con IO-’ mol/L Angll durante l-24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, el RNA se aisló y se analizó la expresión génica de CTGF por Northern blot. Como controles positivos de la in- ducción del CTGF se emplearon TGF-C3 (1 ng/mL) y el ester de forbol PMA (IO-’ mol/L). Las CMLV en reposo presentaron niveles muy bajos de ex- presión de CTGF (Figura IA). El tratamiento con Angll aumentó los niveles del mRNA de CTGF con una respuesta muy rápida, máxima a las tres horas y disminuyó, aunque sin alcanzar niveles control, a las seis horas (Figura IB). La estimulación con Angll a tiempos más largos (18 y 24 horas) también aumentó la expresión génica del CTGF. Esta cinética es similar a la observada en respuesta al TGF-13, aunque la respuesta del TGF-13 es mayor a tiempos más cortos.

Para determinar si el aumento en la expresión génica del CTGF se correspondía con un aumen- to en su producción proteica realizamos estudios de Western blot, utilizando un anticuerpo que re- conoce los aminoacidos 247-260 del CTGF. En CMLV quiescentes se observó en la fracción celular, pero no en la fracción liberada al sobrenadante, la expresión de una única banda de unos 38kDa correspondiente al peso molecular aparente del CTGF (Figura 2A). La estimulación con Angll durante 24 horas causó un aumento en los niveles

Statistical analysis and assessment of the results

Autoradiographic films were scanned using a GS-800 Calibrated Densitometer (Quality One, BioRadl. The data are expressed in arbitrary densitometry uníts as increase over the control fn-fold) in the mean 2 standard error of the mean (SEnll), oras a representative res& of severa/ experiments. Statistical significance was evaluated using the GraphPad Instat program (GraphPad Software, San Diego, USA). The populations were compared using the Wilcoxon test and the Student-Newman-Keuls test, considering as signíficant a value of p < 0.05.

RESULTS -

Angiotensin II increases gene expression and protein synthesis of CTGF in VSMCs

In the present study we first evaluated whether Angll was able to regulate the expression and synthesis of CTGF in VSMCs. Growth-arrested cells were stimulated with 1p7 mol/L Angll for 1 to 24 hours. Following incubation, RNA was isolated and genic expression of CTGF was assessed by Northern blot. TGF-13 (1 ng/ml) and phorbol myristate acetate ester (PMAl (lp7 mal/) were used as positive CTGF induction controls. Resting VSMCs showed very low levels of CTGF expression (Figure IA). Treatment with Angll increased the levels of CTGF mRNA, with a very rapid response that reached a maximum at three hours and decreased at six hours but did not return to control levels (Figure IB). Stimulation with Angll for longer time periods (18 and 24 hours) likewise increased gene expression of CTGF. These kinetics are similar to those seen in response to TGF-13, though the response to TGF-B was greater afier shotter time períods.

In order to determine whether an increased genic expression of CTGF was associated to an increased protein synthesis, Western blot studies were conducted using an antibody that recognizes amino acids 247-260 of CTGF. In quiescent VSMCs, expression of a single band of approximately 38 kDa, corresponding to the apparent molecular weight of CTGF, was seen in the cellular fraction, but not in the fraction released into the supernatant (Figure ZA). Stímulation with Angll for 24 hours resulted in

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Figura 1. La Angll aumenta la expresión génica del CTGF en células de músculo liso vascular. Las células en reposo fueron tratadas con Angll IO-’ mol/L desde l-24 horas. El TGF-13 (1 ng/mL) y el PMA (IO-’ mol/L) fueron utilizados como controles positivos. La figura A muestra un Northern blot representativo de ocho realizados, donde se puede observar que las CMLV en estado de reposo expresan constitutivamente el mRNA del CTGF, correspondiente a una banda de 2,4 Kb, y en respuesta a la estimulación con Angll se induce una sobreexpresión de este gen. La figura B muestra los valores de las medias + EEM. * p < 0,05 VS control. Las barras negras representan los valores de Angll, las blancas de TGF-13 y las rayadas de PMA. Los valores del mRNA del CTGF, obtenidos por análisis densitométrico, se expresan como la relación CTGF/GBPDH en n-veces respecto al incremento del control.

A B . II > : t ‘1. ia I . .- -- - - -.

Figure 1. Angll »Icreases the geníc expression of CTGF ín VSMCs. Resting cells were treated with Angll lû7 mol/l for 1 to 24 hours. TGF-B (1 ng/ml) and PMA (1p7 mal/) were used as positive controls. A. The figure shows a representative Northern blot of the eight tests petformed, showing that resting VSMCs constitutively express CTGF mRNA, corresponding to a 2.4 Kb band, and that overexpression of this gene is induced in response to stimulation with Angll. Figure B shows the means + SEM. * p < 0.05 VS control. The black bars represent the values of Angll, while the white bars correspond to TGF-8 and the stri- ped bars to PMA. The CTGF mRNA values, obtained by densitometric analysis, are expressed as the CTGF/G3PDH ratio in n-fold compared to the control increase.

de CTGF en la fracción celular, similares a los cau- sados por el TGF-13 y PMA (Figura 2A). Además, indujo la liberación de CTGF al medio extracelular (Figura 2A). Este aumento en la producción de CTGF (celular y soluble) sólo se observó después de 24 horas, y se mantuvo elevado hasta las 72 horas (Figura 2B). Mediante immunocitoquímica hemos localizado la tinción para CTGF. Las CMLV en reposo apenas presentan tinción frente a CTGF, pero al tratarlas con Angll o 10% STF (control positivo) durante 48 horas se observó un claro aumen- to de la tinción a nivel citoplasmático (Figura 2C), lo que confirma el aumento en la producción de CTGF causado por la Angll. Como control negativo de la técnica, algunas muestras se incubaron en ausencia de anticuerpo primario (no mostrado).

Los receptores AT, están implicados en la regulación de CTGF causada por angiotensina II en células de músculo liso vascular

En estudios previos hemos demostrado que las CMLV, en nuestras condiciones de cultivo, expresan los receptores AT, y AT, (17). El siguiente

an increase in CTGF levels in the cellular fraction similar to that caused by TGF-l3 and PMA (Figure 2A). CTGF release into the extracellular medium was also induced (Figure 2A). The increase on CTGF production (cellular and soluble) was only seen after 24 hours, and was sustained for 72 hours (Figure 2B). CTGF staining was detected by immunohistochemistry. Resting VSMCs barely showed CTGF staining, but after treating them with Angll or 10% FCS (positive control) for 48 hours, a clear increase in staining was noted at cytoplasmic level (Figure 2C), confirming the increase in CTGF production caused by Angll. As negative control for the technique, some samples were incubated in the absence of primary antibody (not shown).

AT, receptors are implicated in CTGF regulatíon caused by angiotensin II in VSMCs

In earlier studies we have shown that VSMCs, under our culture conditions, express AT, and AT, receptors (17). The next objective was to determine the type of receptor involved

66 INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004, val. 7, n.’ 1


Figura 2. La Angll aumenta la producción de CTGF citosólica y liberada al sobrenadante, en células de músculo liso vascular. Las células quiescentes fueron tratadas con Angll 1w7 mol/L desde 3 a 72 horas y se analizó la producción de CTGF por Western blot. Se observó una banda de alrededor de 40 kDa, correspondiente al tamaño molecular del CTGF. La Angll aumenta la producción de CTGF celular (fracción citosólica) y soluble (liberada al sobrenadante) después de 24, pero no de seis horas de tratamiento. La figura A muestra un Western blot representativo de cinco realizados, la tubulina se utilizó como control de carga. B. Los resultados de la producción del CTGF se obtuvieron por análisis densitométrico y se expresan como la relación CTGF/ tubulina en n-veces respecto al incremento sobre control. Las barras negras representan los valores de Angll y las blancas de TGF-13. * p c 0,05 vs control. C. Localización del CTGF por inmunocitoquímica. Las células en reposo no expresan CTGF, sin embargo, al tratarlas durante 48 horas con Angll o 10% STF se observa un claro aumento de la tinción citoplasmática.

B

Figure 2. Angll increases the production of cytosoli and supernatant-released CTGF in VSMCs. Quiescent cells were treated with Angll 1O-7 mol/l for 3 to 72 hours, and CTGF production was analyzed by Western blot. A band of approximately 40 kDa was seen, corresponding to the molecular size of CTGF. Angll increases the production of cellular (cytosolic fraction) and soluble CTGF (released into the supernatant) after 24 hours, but not after six hours of treatment. Figure A is a representative Western blot of the five tests petformed; tubulin was used as loading control. B. The results of CTGFpro- duction were obtained by densitometric analysis, and are expressed as the CTGF/ubulin ratio in n-fold compared to the control increase. The black bars represent the values of Angll, while the white bars correspond to TGF-13. * p < 0.05 VS control. C. Localization of CTGF by immunocytochemistty. Resting cells do not express CTGF, but after treating them for 48 hours with Angll or 10% FCS, a marked increase in cytoplasmic staining was seen.

objetivo fue determinar el tipo de receptor implicado en la inducción de CTGF mediante el empleo farmacológico de antagonistas no peptídicos es- pecíficos para cada subtipo de receptor. Los antagonistas del receptor AT, son bifenilimidazoles, representados por losartan, mientras que los del AT, son tetrahidroimidazopiridinas, como PD123319. Las células vasculares, en estado de reposo, fueron preincubadas durante 30 minutos con los an-

in CTGF induction, based on the pharmacological use of non-peptide antagonists specific for each receptor subtype. The AT, receptor antagonists are biphenylimidazoles, represented by losartan, while the AT, receptor antagonists are tetrahydroimidazopyridines such as PD123379. The vascular cells, under resting conditions, were preincubated for 30 minutes with the AT, (losartan) and AT, antagonists (PD1233791



tagonistas AT, (losartan) y AT, (PD1233191 (lO$ mol/L y lOe5 mol/L, respectivamente), y posteriormente se estimularon con Ic mol/L Angll durante 24 horas. A ambos tiempos, el antagonista AT, causó una disminución significativa de la expre- sión del mRNA del CTGF inducida por la Angll, mientras que el antagonista AT, no tuvo efecto (Fi- gura 3A). La síntesis de CTGF inducida tras 24 horas de tratamiento con Angll sólo fue inhibida por el antagonista AT,, pero no por el AT, (Figura 3B). Ninguno de estos antagonistas por sí mismo afec- tó significativamente la expresión de CTGF en cé- lulas control (datos no mostrados).

Los inhibidores de la HMG-COA reductasa disminuyen la producción de CTGF causada por Angll

Para determinar si las estatinas pueden regular las respuestas de la Angll, las CMLV fueron pretratadas durante una hora con dos estatinas: atorvastatina y simvastatina (1t7 mol/L to lOmg mol/L). La atorvastatina causó una inhibición, de forma dosis dependiente, de la producción de CTGF inducida por Angll (Figura 4). Un efecto inhibitorio similar se observó con las simvastatina, indican-

(106 mol/l and 1@ mal/, respectively), and subsequently stimulated with lû7 mol/l Angll for 24 hours. At both timepoints, the AT, antagonist caused a significant decrease in CTGF mRNA expression induced by Angll, while the AT, antagonist had no effect (Figure 3A). CTGF synthesis induced after 24 hours of treatment with Angll was inhibited by the AT, antagonist but not by the AT, antagonist (Figure 36). Neither of these antagonists alone significantly affected CTGF expression in control cells (data not shown).

HMG-COA reductase inhibitors decrease angiotensin Il-induced CTGF productíon

In order to determine whether statins are able to regulate Angll responses, VSMCs were pretreated for one hour with two statins: atorvastatin and simvastatin (IU-’ mal/ to lPg mol/l). Atorvastatin caused a dose-dependent inhibition of Angll-induced CTGF production (Figure 4). A similar inhibitory effect was seen with simvastatin, suggesting of a class effect of these agents in the regulation of CTGF. In control cells, statins, at the doses

Figura 3. El CTGF está regulado por los receptores AT, en células de músculo liso vascular. Las células fueron pretratadas durante 30 minutos con IO+ mol/L losartan (antagonista AT,) o IO5 mol/L PD123319 (antagonista AT,), y después estimuladas con Ir7 mol/L Angll durante 24 horas. La figura A muestra un Northern blot representativo y B muestra un Western blot representativo de seis realizados.

CTGF

L mRNA de CTGF n.. .

(n-veces)

CTGFmRN.4 l

(“-fdd,

*

Produccvm de CTGF/ a CTGF,xod”c,,on

Figure 3. CTGF is regulated by AT, receptors in VSMCs. The cells were pretreated for 30 minutes with lo-6 ml/ losartan (AT, antagonist) or 1P5 mal/ PD123319 (AT, antagonist), and subsequently stimulated with 1P7 mol/l Angll for 24 hours. Figure A shows a representative Northern blot, while B shows a representative Western blot of the six tests performed.

INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004, VO¡. 7, n o 1 68


Figura 4. Efecto de inhibidores de la HMG-COA reductasa en la producción de CTGF inducida por Angll. Las CMLV fueron preincubadas con dos estatinas: la atorvastatina (A) y simvastatina (BI (1Od mol/L a lOe9 mol/L) y posteriormente estimuladas con Angll (IO-’ mol/L) durante 24 y 48 horas. Algunas células fueron preincubadas con mevalonato y de otros metabolitos de la ruta del colesterol; el geranilgeranilpirofosfato (GGPP) y el farnesilpirofosfato (FPP) (16” mol/L). La figura muestra un Western blot representativo de tres. Como control de carga se utilizó el rojo ponceau (Al y la tubulina (B).

A B

Figure 4. Effect of HMG-COA reductase inhibitors on Angll-induced CTGF production. VSMCs were preincubated with two statins: atorvastatin (A) and simvastatin (B) (Ie mol/l to 1cg mol/l), and subsequently stimulated with Angll (1W7 mol/l) for 24 and 48 hours. Some cells were preincubated with mevalonate and other metabolites of the cholesterol pathway: geranylgeranylpyrophosphate (GGPP) and farnesylpyrophosphate (FPP) (1p5 mol/l). The figure shows a representative Western blot of the three tests performed. Ponceau red (Al and tubulin (B) were used as loading control.

do un efecto de clase de estos agentes en la re- gulación del CTGF. En células control, las estatinas, a las dosis estudiadas, no modificaron los niveles proteicos del CTGF ni indujeron apoptosis (no mostrado). Evaluamos el efecto del mevalonato, el metabolito directo de la HMG-COA reductasa, para demostrar que el efecto de las estatinas es debido a la inhibición de esta enzima. En presencia de L-mevalonato (10m4 mol/L) el efecto inhibitorio se revirtió. También determinamos el papel de los isoprenoides geranilgeranilpirofosfato (GGPP) y farnesilpirofosfato (FPP) en la regulación del CTGF. El cotratamiento de las células con GGPP (5 x 10m5 mol/L) completamente revirtió la induc- ción de CTGF causada por Angll, mientras que el FPP sólo causó una ligera disminución, lo que su- giere que proteínas geranilgeraniladas regulan la producción de CTGF.

Las proteínas G pequeñas participan en la producción de CTGF inducida por Angll

Diferentes receptores acoplados a proteínas G, incluidos los AT,, activan el sistema p2lras y Rho/quinasa Rho (19, 20). Hemos evaluado el papel de las proteínas Rho en la síntesis de CTGF inducida por Angll, mediante varias estrategias: 1) el uso de inhibidor de la actividad GTPasa de Rho,

studied, did not modify the protein levels of CTGF or induce apoptosis (not shown). We evaluated the effect of mevalonate, the direct metabolite of HMG-COA reductase, to show that the efect of statins is due to inhibition of this enzyme. In the presente of L-mevalonate (IO4 mol/l), the inhibitory effect was reversed. We also determined the role of the isoprenoids geranylgeranylpyrophosphate (GGPP) and farnesylpyrophosphate (FPPI in CTGF regulation. Co-treatment of the cells with GGPP (5 x 1O5 mol/l) completely reversed CTGF induction caused by Angll, while FPP only caused a slight decrease, which suggests that geranylgeranylated proteins regulate CTGF production.

Small G proteins participate in angiotensin II induced CTGF production

Different receptors coupled to G proteins, including AT, receptors, activate the p2lras and Rho/Rho kinase system (19, 20). We evaluated the role of Rho proteins in CTGF synthesis induced by Angll by severa/ approaches: 1) the use of an inhibitor of Rho GTPase activity; 2) the use of transient transfections of expression vectors that overexpress different



2) el empleo de transfecciones transitorias de vectores de expresión, que sobreexpresan diferentes formas mutadas de las proteína RhoA, como el dominante negativo y el constitutivamente activo, lo que conduce a su bloqueo o a su activación, 3) y el uso de inhibidores de la proteína quinasa de Rho.

En CMLV utilizamos la exoenzima C3 de Clos- ticfium botulinum, que es un inhibidor de la actividad GTPasa de Rho. La preincubación de CMLV con la exoenzima C3 durante 48 horas, tiempo necesario para inhibir la actividad GTPasa, dismi- nuyó la producción de CTGF causada por Angll (Figura 5). El bloqueo de RhoA, mediante transfecciones transitorias con un vector dominante negativo de RhoA (NI9 RhoA), inhibió la producción de CTGF causada por Angll (Figura 6). En las cé- lulas transfectadas con el vector constitutivo de RhoA (Q63L-RhoA) se observó un aumento en la producción de CTGF. Como controles del experi- mento se utilizaron el vector wi/d type (forma salvaje) de RhoA y el vacío que no aumentaron la síntesis de CTGF. Además, en las células transfectadas con el vector vacío y estimuladas con Angll existió un aumento en la producción de CTGF (Figura 6). Los inhibidores de la proteína quinasa de Rho, la cual transmite la señalización me- diada por Rho: el Y-27632 y el fasudil, disminuye- ron de forma dosis dependiente la producción de CTGF inducida por Angll (Figura 71, demostrando la participación de las proteínas Rho en la regula- ción de CTGF.

Estos resultados sugieren que la Angll a través del receptor AT, y mediante la activación de Rho y de la proteína quinasa de Rho regula la síntesis de CTGF.

El CTGF es un mediador de la fibrosis causada por la Angll

El CTGF es capaz de inducir la expresión de proteínas de matriz extracelular, como colágeno

Figura 5. Papel de las proteínas G pe- queñas (Rho) en la producción de CTGF inducida por Angll. Las CMLV fueron con preincubadas con la exoenzima C3 (5 pg/mL) durante 48 horas, y se estimularon con Angll (IO-’ mol/L) durante otras 24 horas. La figura muestra un Western blot representativo de tres realizados.

mutated forms of the RhoA protein, such as the dominant negative and the constitutively active forms, leading to its blockade or activation; and 3) the use of inhibitors of the Rho kinase.

In VS/VKs, the exoenzyme C3 of Clostridium botulinum, which is an inhibitor of Rho GTPase activity, was used. Preincubation of VSMCs with exoenzyme C3 for 48 hours, the time required to inhibit GTPase activity, decreased the production of CTGF induced by Angll (Figure 5). RhoA blockade by transient transfections with a negative dominant vector of RhoA (NI9 RhoA) inhibited Angll-induced CTGF production (Figure 6). In the cells transfected with the constitutive vector of RhoA (Q63L-RhoA), an increased CTGF production was seen. As controls for the experiment, the wild type vector of RhoA and the empty vector were used, and did not increase CTGF production. Moreover, in cells transfected with the empty vector and stimulated with Angll, CTGF production was increased (Figure 6). The inhibitors of the Rho protein kinase, which transmits signaling mediated by Rho, i.e., Y-27632 and fasudil, dose-dependently decreased Angll-induced CTGF production (Figure 7), which shows the involvement of Rho proteins in CTGF regulation.

These results suggest that Angll, through the AT, receptor, and by means of the activation of Rho and Rho kinase, regulates CTGF synthesis.

CTGF mediates fibrosis caused by angiotensin II

CTGF is able to induce the expression of extracellular matrix proteins, such as type I collagen, fibronectin and a5 integrin (ll). CTGF has also been reported to be a mediator of fibrosis caused by TGF-13 (21). Our last objective was to assess whether CTGF was

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P sF SS Figure 5. Role of small G proteins (Rho) in Angll-índuced CTGF production. VSMCs were preincubated with exoenzyme C3 (5 pg/ml) for 48 hours, and stimulated with Angll(1~7mol/ll for another 24 hours. The figure shows a representative Western blot of the three tests performed.

70 INVESTIGACION CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n ’ 1

Angll, estatinas y daño vascular Angiotensin Il, statins and vascular damage

Figura 6. La Angll vía RhoA regula la producción de CTGF. Las CMLV fueron transfectadas de forma transitoria con los diferentes vectores de ex- presión: NlSRhoA: dominante negativo de RhoA, wtRhoa: wilt type de RhoA, Q63L-RhoA: constitutivo de RhoA, 38: vector vacío, durante 24 horas y se estimularon con Angll (Ir7 mol/L) durante otras 24 horas. La figura muestra un Western blot representativo de cinco realizados.

Figura 7. Los inhibidores de la proteína quinasa de Rho disminuyen la producción de CTGF inducida por Angll. Las CMLV fueron preincubadas con Y- 27632 (A) o fasudil (B) y posteriormente estimuladas con Angll (lOe7 mol/L) durante 24 horas. La figura muestra un Western blot representativo de tres. Como control de carga se utilizó la tubulina.

Figure 6. Angll via RhoA regulates CTGF production th-

s 4

rough RhoA. VSMCs were + transiently transfected with dif-

E < 0 0 4, 0 i= e . .

CTGF [G L!~.LdL~] golf

hours, and were then stimula- Tubulina I

T”b”h -rrmlD~-~~-~, ted with Angll ( lû7 mol/l) for another 24 hours. The figure

- shows a representative Wes- tern blot of the five tests per-

A

tipo 1, fibronectina e integrina cx5 (11). Además se ha descrito que es un mediador de la fibrosis causada por TGF-B (21). Nuestro último objetivo fue evaluar si el CTGF estaba implicado en la fibrosis causada por la Angll, utilizando un oligonucleotido antisentido de CTGF, construido por 16 bases derivadas del sitio de inicio de la transcripción, que contiene el sitio de inicio ATG y cuya secuencia es 5’-TACTGGCGGCGGTCAT-‘3. La incubación en presencia del oligonucleotido antisentido de CTGF (20 pg/mL), ariadido directamente al medio sin re-

Figure 7. Rho protein kinase inhibitors decrease Angll-induced CTGF production. VSMCs were preincubated with Y-27632 (A) or fasudil (B), and subsequently stimulated with Angll (lû’ mol/U for 24 hours. The figure shows a representative Western blot of the three tests performed. Tubulin was used as loading control.

involved in fibrosis caused by Angll by using an antisense oligonucleotide of CTGF composed of 16 bases derived from the transcription starting site, which contains the ATG starting site and whose sequence is 5’- TACTGGCGGCGGTCAT-‘3. Incubation in the presente of the antisense oligonucleotide of CTGF (í’O pg/ml), directly added to the medium without transfection reagents, reduced Angll-induced fibronectin synthesis (Figure 8). The antisense oligonucleotide of CTGF was also

INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; WI 7, n.’ 1 71


Figura 8. A. El CTGF participa en la inducción de fibronectina causada por la Angll. Las célu- las fueron estimuladas con Angll (IO-’ mol/L) durante 48 horas. Para neutralizar el CTGF se empleó un oligonucleótido antisentido. Como control negativo se utilizó el oligonucle- ótido sentido de CTGF y como control positivo de producción de FN se empleó 10% STF. B. Papel del CTGF en la inducción de CTGF causada por la Angll. Las células fueron estimuladas durante 24 horas. Las figuras muestran un Western blot (A) y una RT-PCR (B) representati- vos de tres realizados (panel superior) y los valores de las medias + EEM obtenidos por análisis densitométrico se muestran en el panel inferior.

l

activos de transfección, disminuyó la síntesis de fibronectina inducida por Angll (Figura 8). Además, hemos observado que el oligonucleotido antisentido de CTGF disminuyó la expresión génica de CTGF inducido por la Angll (Figura 8).

DISCUSIÓN

El CTGF es un mediador de la fibrosis vascular inducida por Angll

En este trabajo hemos demostrado que en CMLV la Angll, mediante su unión a los recepto-

figure 8. A. CTGF is mvolved N, tibronectin induction caused by Angll. The cells were stímula- ted with Angll (lû’ moVI) for 48 hours. An antisense oligonucleotide was used to neutralize CTGF. The CTGF sense oligonucleotide was used as negative control, while 10% FCS was used as positive control for FN production. B. Role of CTGF in CTGF induction caused by Angll. The cells were stimulated for 24 hours . The figures show a Western blot (A) and a RT-PCR (B) representative of the three performed (top panel); the means 2 SEM obtained by densitometric analysis are shown in the lower panel.

seen to decrease the gene expression of CTGF induced by Angll (Figure 8).

DISCUSSION

CTGF mediates angiotensin Il-induced vascular fibrosis

This study has demostrated that Angll, by binding to AT, receptors, increases CTGF expression and synthesis in VSMCs, with a

72 INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n.O 1

Angll, estatinas y daño vascular Angiotensin Il, statins and vascular damage

Figura 9. Hipótesis: las estatinas, vía proteínas Rho, regulan la producción de CTGF inducida por Angll. La Angll vía AT, y activación de diversas señales intracelulares como proteínas como Rho, regula la expresión y síntesis de CTGF. En este trabajo hemos demostrado que la inhibición de las proteínas Rho (transfecciones de vector dominante negativo y uso del inhibidor de la quinasa de Rho) disminuye la producción de CTGF causada por Angll. Además, el CTGF participa en la acu- mulación de la matriz extracelular causada por la Angll. Las estatinas actúan a nivel intracelular inhibiendo la ruta de síntesis del colesterol y la producción de mevalonato y otros metabolitos implicados en la isoprenilación de proteínas. Las estatinas inhiben las respuestas celulares causadas por la Angll (producción de CTGF) al inhibir la activación de proteínas Rho.

\ _ ‘,

2 I AT, 1 ‘7 \

Acetil-CoA / Acetyl COA

HMG-COA reductasa / HMG-COA reductase

Mevaionato / Mevalonate

Farn&il-PP / Farnesyl-PP

Geranil-GPP / Geranyl-GPP

Coleziterol / Cholesterol

Señales intracelulares

activated by AT,

Regulación de la matriz extracelular / Extracellular matrix

Síntesis de proteínas / Protein synthesis

Figure 9, Hypothesis: statins, through Rho proteins, regulate Angll-induced CTGF production. Angll, through AT, and activation of various intracellular signals such as Rho, proteins, regulates CJGF expression and synthesis. Jhis study has shown that inhibition of Rho proteins (transfections of dominant negative vector and use of Rho kinase inhibitor) decre- ases Angll-induced CTGF production. Moreover, CTGF is involved in the accumulation of extracellular matrix caused by Angll. Statins act at an intracellular leve/ by inhibiting the cholesterol pathway and the production of mevalonate and other metabolites implicated in protein prenylation. Statins inhibit the cellular responses caused by Angll (CTGF production) by inhibiting Rho protein activation.

res AT,, aumenta la expresión y síntesis de CTGF, presentando una respuesta similar a la descrita con potentes inductores del CTGF, como TGF-13 y PMA (Il). Además, hemos observado que el bloqueo del CTGF, mediante oligonucleotidos antisentido, inhibe la producción de fibronectina inducida por la Angll. Todos estos datos demuestran que el CTGF es un mediador de la fibrosis inducida por Angll. Se ha descrito un aumento de la Angll local en diversas situaciones de daño vascular, como en placas ateroscleróticas humanas (22). En estas lesiones se ha demostrado la presencia de CTGF, localizado principalmente en CMLV y en algunas células endoteliales, situadas

response similar to that reported with potent CTGF inducers, such as TGF-13 and PMA (ll). We also noted that CTGF blockade using antisense oligonucleotides inhibits Angll-induced fibronectin production. All these data show that CTGF is a mediator of Angll-induced fibrosis. An increase in local Angll has been reported in different situations of vascular damage, such as in human atherosclerotic plaques (22). In these lesions the presente of CTGF has been demonstrated, mainly in the VSMCs and in some endothelial cells, located in areas with an accumulation of extracellular matrix and fibrosis ( 13). In the

INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004: WI. 7, no 1 73


en áreas con acúmulo de matriz extracelular y fibrosis (13). En corazones de pacientes con isque- mia cardíaca y de ratas sometidas a infarto de miocardio se ha descrito un aumento de CTGF (14). La hipertensión es un factor de riesgo en el desarrollo de enfermedades coronarias y arteriosclerosis (1). En un modelo de hipertensión en ratas inducido por ciclosporina (CsAl y dieta alta en so- dio, la expresión de CTGF está elevada en arterias epicardicas, correlacionada con una elevación en la presión sanguínea (23). El estrés mecánico puede ser responsable del aumento de CTGF en los animales hipertensos, ya que el estiramiento me- cánico cíclico induce CTGF, aumenta la produc- ción de Angll en el medio de cultivo y la produc- ción de matriz extracelular (18, 24). Sin embargo, en el modelo de CsA el antagonista AT, sólo dis- minuyó de forma parcial la presión sanguínea y el desarrollo de la hipertrofia ventricular izquier- da, mientras que normalizó la expresión cardíaca de CTGF (23). El tratamiento con fármacos que bloquean el SRA ha demostrado efectos beneficiosos en diversas patologías cardiovasculares, independientemente de la presencia de hiperten- sión. Nuestros datos sugieren que los efectos beneficios del bloqueo del SRA podrían atribuirse al bloqueo de las acciones directas de la Angll sobre las células diana del daño vascular, en concreto a su efecto en la sobreexpresión de CTGF y de matriz extracelular que se observa en estas enfermedades.

Las estatinas regulan la producción de CTGF causada por Angll

En este trabajo hemos observado que dos estatinas, atorvastatina y simvastatina, disminuyen de forma dosis dependiente la producción de CTGF inducida por Angll. Estudios en modelos experimentales han demostrado que los inhibidores de la HMG-COA reductasa son beneficiosos en el tratamiento de diversas enfermedades cardiovasculares, disminuyendo, entre otros parámetros, la fibrosis (25). En modelos de aterosclerosis se ha demostrado que estos fármacos disminuyen la formación de neoíntima y fibrosis y estabilizan las placas ateroscleróticas (26, 27). En un modelo de infarto de miocardio en ratas se ha observado que la fluvastatina atenúa la hipertrofia de miocitos y la fibrosis intersticial, asociado a una disminución en la actividad de metaloproteinasas (26). Estudios in vitre también demuestran que las estatinas son capaces de regular la matriz extracelular. En célu- las mesangiales tratadas con suero, glucosa o LDL, las estatinas disminuyen la expresión de proteí-

hearts of patients with cardiac ischemia and rats subjected to myocardial infarction, increased CTGF levels have been reported (14). Hypertension is a risk factor for the development of coronary díscase and arteriosclerosis (1). In a rat model of hypertension induced by cyclosporine (CsA) and a high sodium diet, CTGF expression is increased in epicardial arteries, in correlation to a rise in blood pressure (231. Mechanical stress can be responsible for the increase in CTGF in hypertensive animals, since cyclic mechanical stretching induces CTGF and increases Angll production in culture medium and the production of extracellular matrix (18, 24). However, in the CsA model, the AT, antagonist only partially decreased blood pressure and the development of left ventricular hypertrophy, while the cardiac expression of CTGF normalized (23). Treatment with drugs that block the RAS has been shown to have beneficial effects in various cardiovascular diseases, regardless of the presente of hypertension. Our data suggest that the beneficial effects of RAS blockade could be attríbuted to blockade of the direct actions of Angll upon the target cells for vascular damage, and specifically to its effect on the overexpression of CTGF and extracellular matrix seen in these diseases.

Statins regulate CTGFprodmtion caused by angiotensín II

This study showed that two statins, atorvastatín and simvastatin, dose-dependently decrease Angll-induced CTGF production. Studies in experimental models have shown HMG-COA reductase inhibitors to be beneficial in the treatment of various cardiovascular diseases by decreasing fibrosis, among other parameters 125). In models of atherosclerosis, these drugs have been shown to reduce fibrosis and neointima formation, and to stabilize the atherosclerotic plaques (26, 27). In a myocardial infarction model in rats, fluvastatin has been shown to attenuate myocyte hypertrophy and interstitial fibrosis, effects associated to a decreased metalloproteinase activity (26). In vitro studies also demonstrate that statins are able to regulate the extracellular matrix. In mesangial cells treated with serum, glucose or LDL, statins reduce the expression of extracellular matrix proteins (28-30). However, in VSMCs they only regulate the mRNA of

74 INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR, 2004; val. 7, n.” 1

Angll, estatinas y daiio vascular Angiotensin II, statins and vascular damage

nas de matriz extracelular (28-30). Sin embargo, en CMLV sólo regulan el mRNA de proteínas de matriz extracelular a concentraciones tóxicas (31). En relación a las respuestas de Angll, las estatinas inhiben la expresión de c-Fos y c-Jun y la síntesis de proteínas (32, 33). En un modelo de daño cardiaco mediado por Angll, la cerivastatina atenuó la hipertrofia cardíaca y la fibrosis (reduciendo los niveles de fibronectina, laminina y colágeno tipo 1) (34). Nuestros datos demuestran que las estatinas disminuyen la producción de CTGF inducida por Angll, sugiriendo una proteína diana de la ac- ción de las estatinas. La relación entre inhibidores de la HMG-COA reductasa y CTGF se ha observado en otros tipos celulares. Así, en células mesangiales y fibroblastos renales, varias estatinas inhiben la inducción del mRNA del CTGF causado por TGF-13 (35, 361, lo que explicaría los efectos beneficiosos observados en enfermedades renales, donde las estatinas son capaces de prevenir la glomeruloesclerosis y la fibrosis intersticial (30). Estos datos demuestran que la inhibición de la HMG-COA reductasa regula la producción de CTGF, mostrando un posible mecanismo implicado en la disminución de la fibrosis causada por las estatinas. Diferentes ensayos clínicos han demostrado que las estatinas ejercen efectos beneficiosos sobre la morbilidad y mortalidad cardiovascular. Sin embargo, los beneficios clínicos observados tras el tratamiento con estos fármacos parecen ser mayores a los esperables en relación con la dis- minución de colesterol, sugiriendo que las estatinas poseen efectos independientes de la dismi- nución de colesterol. En este trabajo hemos observado efectos celulares directos (regulación de CTGF) que apoyan esta hipótesis.

La relación potencial entre fármacos bloquean- tes de la Angll y estatinas se ha sugerido recientemente (37). En ratas dobles transgénicas para los genes de la reina y angiotensinógeno el tratamiento con cerivastatina disminuye el daño causado por la Angll (38). Nuestros datos demuestran que las estatinas regulan de forma directa la respuesta de Angll en CMLV, al ser capaces de inhibir la producción de CTGF. Todas estas evidencias demuestran la existencia de una interacción directa entre los inhibidores de la HMG-COA reductasa y las señales intracelulares activadas por la Angll, lo que podría tener importantes implicacio- nes terapéuticas. Por otro lado, la hipercoleste- rolemia está asociada a niveles elevados del receptor AT,, lo que implica una mayor respuesta biológica a Angll, hecho con importantes conse- cuencias en la patogenia de la aterosclerosis e hi- pertensión. Además, las estatinas disminuyen los niveles de AT, (39). Nuestros datos apoyan la nue-

extracellular matrix proteins at toxic concentrations (31). As regards Angll responses, statins inhibit the expression of c-Fos and c-Jun, and protein synthesis (32, 33). In a model of Angll-mediated cardiac damage, cerivastatin attenuated cardiac h ypertroph y and fibrosis - reducing the levels of fibronectin, laminin and type I collagen (341. Our data show that statins decrease Angll-induced CTGF production, suggesting the existence of a target protein for statin action. The relationship between HMG-COA reductase inhibitors and CTGF has been seen in other cell types. Thus, in mesangial cells and renal fibroblasts, severa1 statins inhibit the TGF-B-mediated induction of CTGF mRNA (35, 36/, which would account for the beneficial effects seen in kidney diseases, where statins are able to prevent glomerulosclerosis and interstitial fibrosis (301. These data show that HMG-COA reductase inhibition regulates CTGF production, pointing to a possible mechanism implicated in the reduction of fibrosis caused by statins. Different clinical trials have shown statins to have beneficial effects on cardiovascular morbidity and mortal@. However, the clinical benefits seen after treatment with these drugs seem to be greater than expected in relation to cholesterol reduction, suggesting that statins have effects independent of cholesterol reduction. In this study we have found direct cellular effects (CTGF regulation) that support this hypothesis.

The potential relationship between Angll blocking drugs and statins has recently been suggested (37). In double transgenic rats for the renin and angiotensinogen genes, treatment with cerivastatin decreased the damage caused by Angll(38). Our data show that statins directly regulate Angll response in VSMCs, as they are capable of inhibiting CTGF production. All this evidente points to the existence of a direct interaction between HMG-COA reductase inhibitors and intracellular signals activated by Angll, which could have significant therapeutic implications. On the other hand, hypercholesterolemia is associated to increased AT, receptor levels, which implies a greater biological response to Angll; this has significant consequences for the pathogenesis of atherosclerosis and hypertension. Moreover, statins decrease AT, levels (39). Our results support the novel idea of the use of combined therapies of RAS blockers and statins, which could have an increased beneficial effect in certain cardiovascular diseases.

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M. Rupérez, L. Blanco-Colio, E. Sánchez-López, et al

va idea del empleo de terapias combinadas de blo- queantes del SRA y estatinas, que podrían tener un efecto beneficioso mayor en algunas patolo- gías cardiovasculares.

Mecanismos intracelulares implicados en los efectos de las estatinas

La inhibición de la HMG-COA reductasa no só- lo provoca una deprivación de mevalonato, sino también de una gran variedad de isoprenoides de la ruta de síntesis del colesterol, como dolicol, ubi- quinona, el farnesil pirofosfato (FPP) y el gerenil- geranil pirofosfato (GGPP) (8). El FPP y el GGPP son utilizados para la modificación postraduccio- nal de diferentes proteínas, incluidas las láminas nucleares, la subunidad g de las proteínas G he- terotriméricas y las proteínas G pequeñas como Ras y las relacionadas con ella (como Rac, Rab y Rho, entre otras) (40). Las proteínas G pequeñas están implicadas en diferentes funciones celulares como la regulación de la expresión génica, or- ganización del citoesqueleto celular, tráfico de membranas en el interior de la célula, prolifera- ción, diferenciación y muerte celular programada o apoptosis (41, 42). La unión del isoprenoide a estas proteínas es necesaria para su anclaje a la membrana plasmática y su correcta funcionalidad. Previamente hemos demostrado que en CMLV el tratamiento con las estatinas, atorvastatina y simvastatina regula la localización celular de las pro- teínas Ras y Rho, ya que impide su anclaje a la membrana celular, proceso necesario para que estas proteínas sean funcionales (43, 44). En este estudio hemos visto que el efecto de la atorvastatina y la simvastatina sobre el CTGF producido por la Angll fue revertido por el mevalonato y GGPP, y en menor medida por FPP. Diversos estudios han demostrado que las estatinas son capaces de inhibir la isoprenilación de las proteínas Ras, inhiben la ruta AP-IiFias y disminuyen la proliferación celular. En CMLV hemos observado que la atorvastatina disminuye la activación de los factores de transcripción AP-1 y NF-KB y la inducción de ci- toquinas causada por la Angll (45). Este efecto se revirtió en presencia de diferentes compuestos de la ruta de síntesis del colesterol como el mevalonato y los isoprenoides FPP y GGPP. Además, la manumicina A, un inhibidor de la isoprenilación proteica, también disminuyó la actividad de NF- KB inducida por Angll y TNF-a, indicando que los isoprenoides participan en la activación de este factor de transcripción (45). Otros factores de trans- cripción también se regulan con estatinas. El tratamiento con diferentes estatinas puede modular

Intracellolar mechanisms implicated in statin effects

Inhibition of HMG-COA reductase not only causes deprivation of mevalonate, but also of a great variety of isoprenoids of the cholesterol synthetic pathway, such as dolichol, ubiquinone, farnesylpyrophosphate (FPP) and gerenylgeranylpyrophosphate (GGPP) (8). FPP and GGPP are used for the post-translational modification of different proteins, including nuclear laminins, the subunit g of heterotrimeric G proteins and small G proteins such as Ras and those related to it fsuch as Rac, Rab and Rho, among others) (40). The small G proteins are involved in different cellular functions such as regulation of gene expression, organization of cell cytoskeleton, membrane traffic within the cell, cell proliferation and differentiation, and pro- grammed cell death or apoptosis (4 1, 42). Isoprenoid binding to these proteins is necessary for their anchoring to the plasma membrane and adequate function. We have previously shown that in VSMCs, treatment with statins atorvastatin and simvastatin regulates the cellular localization of Ras and Rho proteins by preventing their anchoring to the cell membrane, a process required for these proteins to be functional(43, 44). In this study we have seen that the effect of atorvastatin and simvastatin on CTGF produced by Angll was reversed by mevalonate and GGPP, and to a lesser extent by FPP. Different studies have shown that statins are able to inhibit Ras protein prenylation, inhibit the AP-l/Ras pathway and decrease cell proliferation. In VSMCs, it was seen that atorvastatin reduces activation of the transcríption factors AP-1 and NF-~6, and cytokine induction caused by Angll(45). This effect was reversed in the presente of different components of the cholesterol synthesis pathway, such as mevalonate and the isoprenoids FPP and GGPP. In addition, manumycin A, a protein isoprenylation inhibitor, also decreased NF-KB activity induced by Angll and TNF-l3, suggesting that isoprenoids are involved in the activation of this transcription factor (45). Other transcription factors are also regulated by statins. Treatment with different statíns can modulate the expression of different proin flammatory cytokines such as IL- IB, IL-6 and COX- by increasing PPARcl in endothelial cells (46). Our data support the idea that HMG-COA reductase inhibitors are directly involved in intracellular signaling mechanisms

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Angll, estatinas y dario vascular Angiotensin II, statins and vascular damage

la expresión de diferentes citocinas proinflamato- rias como la IL-l& la IL-6 y la COX-2, mediante el incremento del PPAR£I en células endoteliales (46). Nuestros datos apoyan la idea de que los inhibidores de la HMG-COA reductasa participan de forma directa en mecanismos de señalización intracelular implicados en la isoprenilación de proteínas de bajo peso molecular las cuales que juegan un papel clave en la transducción de señales al núcleo.

La Angll regula CTGF vía proteínas Rho

Los receptores AT, están acoplados a proteí- nas G y se ha descrito que activan las proteínas Ras, estimulan la formación de Ras-GTP e indu- cen la localización de Ras y Rho en la membrana celular. La Angll aumenta p21 Ras, Racl, Rho Ay el sistema Rho/quinasa Rho (19, 47, 48). Estas pro- teínas regulan diversas funciones celulares y procesos de daño vascular, como activación de pla- quetas, transmigración de leucocitos, formación de neoíntima e hipertrofia cardíaca (10, 41, 42). Estos datos muestran similitudes entre los mecanismos de actuación de Angll y proteínas Ras/Rho y sugieren que estas proteínas podrían mediar algunas acciones de la Angll.

Recientemente se ha descrito que las proteí- nas Rho participan en la vasoconstricción y la hipertrofia inducida por Angll en cardiomiocitos y CMLV (33, 47, 49). Otras repuestas inducidas por Angll también están mediadas por las proteínas Rho, como la expresión de MCP-1 (50) y la reor- ganización de actina (51). En células mesangiales, las proteínas Rho son esenciales para la expresión, basal e inducida por LPS y TGF-13, del CTGF (52). En este trabajo hemos visto que el empleo de inhibidores de la quinasa de Rho (Y-27632 y fasudil) en CMLV disminuyó la producción de CTGF causada por Angll. El bloqueo de RhoA mediante transfecciones transitorias con un vector dominante negativo de RhoA inhibió el CTGF inducido por Angll. Además, en las células transfectadas con el vector constitutivo de RhoA se observó un aumento en la producción de CTGF. Estos datos demuestran que la activación de las proteínas Rho está implicada en la síntesis de CTGF inducida por Angll. La inhibición de Rho y por lo tanto de su quinasa, la Rho quinasa, es un posible mecanismo que puede mediar los llamados efectos pleio- trópicos de las estatinas en la pared vascular da- do que cambios en Rho afectan al transporte intracelular, la estabilidad del RNA mensajero de algunos genes y la transcripción génica (9). Como se ha comentado anteriormente, las estatinas disminuyen el CTGF causado por Angll, los datos an-

implicated in the prenylation of low molecular weight proteins that play a key role in signa/ transduction to the cell nucleus.

Angiotensín II regdates CTGF via Rho proteins

AT, receptors are coupled to G proteins, and have been reported to activate Ras proteins, stimulate Ras-GTP formation, and induce Ras and Rho localization to the cell membrane. Angll increases p21 Ras, Racl, Rho A and the Rho/Rho kinase system (19, 47, 48). These proteins regulate various cell functions and vascular damage processes, such as platelet activation, leukocyte transmigration, neointimal formation and cardiac hypertrophy (10, 41, 42). These data show similarities between the mechanisms of action of Angll and Ras/Rho proteins, and suggest that these proteins could mediate some of the actions of Angll.

It has recently been reported that Rho proteins are involved in Angll-induced vasoconstriction and hypertrophy in cardiomyocytes and VSMCs 133, 47, 49). Other responses induced by Angll are also mediated by Rho proteins, such as MCP- 1 expression (50) and actin reorganization (51). In mesangial cells, Rho proteins are essential for CTGF expression. both basal and induced by LPS and TGF-/3 (52). In this study we have observed that the use of Rho kinase inhibitors (Y-27632 and fasudill in VSMCs decreased Angll-mediated CTGF production. RhoA blockade by transient transfections with a Rho negative dominant vector inhibited Angll-induced CTGF. Moreover, in cells transfected with the Rho constitutive vector, an increase was seen in CTGF production. These data show that activation of Rho proteins is implicated in Angll-induced CTGF synthesis. Inhíbítion of Rho, and therefore of its kinase (Rho kinase), is a potential mechanism that could mediate the so-called pleiotropic effects of statins on the vascular Wall, since changes in Rho affect intracellular transpori, the stability of mRNA of some genes, and gene transcription 191. As discussed above, statins decrease Angll-induced CTGF, and the above data support the hypothesis that these compounds regulate CTGF by interfering with RhoA isoprenylation.

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teriores apoyan la hipótesis de que estos compuestos regulan el CTGF al interferir en la isopre- nilación de Rho A.

Varios estudios experimentales han demostrado que la inhibición de proteínas Rho provoca desorganización del citoesqueleto e inducción del sistema fibrinolítico (10, 40). En un modelo hiper- tensión en ratas causado por administración de L- NAME, el inhibidor de la quinasa de Rho (Y-276321, disminuyó la inflamación vascular, la expresión de MCP-1 y TGF-13, y la progresión de la aterosclerosis (531, como también ocurrió en un modelo de aterosclerosis en cerdos 1541. Resultados similares en prevención del remodelamiento vascular se han observado con fasudil, otro inhibidor de la quinasa de Rho (55). En este modelo se había descrito previamente que las estatinas mejoraban el daño vascular sin modificar los niveles lipídieos, mostrando efectos independientes del colesterol (56). Por otro lado, un posible mecanismo que po- dría explicar los cambios vasculares en la hiper- tensión es el aumento del sistema Rho/quinasa de Rho que provoca vasoconstricción (57). Estos resultados sugieren que el daño vascular inducido por Angll está mediado por la activación de pro- teínas Rho, y sugieren que el empleo de tratamien- tos que inhiben su activación, como estatinas o inhibidores de la actividad de Rho, es una buena elección como estrategia terapéutica en enfermedades asociadas a un aumento de producción de Angll, independientemente de la presencia de hi- pertensión.

En resumen, nuestros datos demuestran que los inhibidores de la HMG-COA reductasa a través de la inhibición de la síntesis de isoprenoides y mediante la regulación de la actividad de las pro- teínas Rho regulan la producción de CTGF causada por Angll. Nuestros resultados sugieren que los efectos beneficiosos de estos fármacos pueden ser atribuidos a sus acciones celulares, regu- lando efectos patológicos de la Angll en el daño vascular, y apoyan el empleo de la terapia com- binada, de fármacos que modulan la generación de Angll y estatinas, demostrando un mecanismo molecular que podría explicar estos efectos beneficiosos.

Severa/ experimental studies have shown that inhibition of Rho proteins causes disorganization of the cytoskeleton and induction of the fibrinolytic system (10, 40). In a rat model of h ypertension produced by administering L-NAME, the Rho kinase inhibitor (Y-27632) decreased vascular inflammation, MCP- 1 and TGF-r3 expression, and progression of atherosclerosis (531 in a way similar to the results obtained in a model of atherosclerosis in swine 1541. Similar results in the prevention of vascular remodeling have also been found with fasudil, another Rho kinase inhibitor (55). In this model, it had previously been reported that statins improved vascular damage without modifying lipíd levels, showed cholesterol-independent effects 156). On the other hand, a possible mechanism that could explain the vascular changes in hypertension is the increase in the Rho/Rho kinase system, causing vasoconstriction (57). These results suggest that the vascular damage induced by Angll ís mediated by Rho protein activation, and that the use of treatments that inhibit such activation, such as statins or Rho activity inhibitors, is a good choice as a therapeutic approach in diseases assocíated with increased Angll production, regardless of the presente of hypertension.

To summarize, our results demonstrate that HMG-COA reductase inhibitors, through inhibition of isoprenoíd synthesis and by regulating Rho protein activity, regulate Angll-induced CTGF productíon. Our results suggest that the beneficial effects of these drugs may be attributed to their cellular actions, with regulation of pathological Angll effects in vascular damage, and support the use of combined therapy wíth drugs that modulate Angll generation and statins. Our data demonstrate molecular mechanism that could explain these beneficial effects.

Agradecimientos Acknowledgements

This study was supported by grants from Este trabajo ha sido financiado por una ayuda the Autonomous Community of Madrid

de la Comunidad Autónoma de Madrid (08.4/0017/ (08.4/00 17/2000), the Fondo de Investigación 20001, del Fondo de Investigación Sanitaria Fis Sanitaria (FIS) (01/3130), and the Fundación (01/3130), y de la Fundación MAPFRE Medicina. MAPFRE Medicina. M. R., V. E. and J. R-V are M. R., V. E. y J. R-V son becarios del FIS. FIS scholarship holders.

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