„hplc-analytik von kohlenhydraten und ethanol an ... · ‐ zucker sind i.d.r. neutral/nicht...

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1 „HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an Beispielen von Weinen und Alkopops “ Manfred Gey a.D. (Hochschule Zittau/Görlitz) 10. Knauer-HPLC-Work-Shop 2018: FZ Dresden-Rossendorf M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018

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Page 1: „HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an ... · ‐ Zucker sind i.d.R. neutral/nicht ionisch ‐ Durch starke Basen Überführung in Oxianionen möglich ‐ Dann Trennung

1

„HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an Beispielen von Weinen und

Alkopops “

Manfred Gey a.D.  (Hochschule Zittau/Görlitz)

10. Knauer-HPLC-Work-Shop 2018: FZ Dresden-Rossendorf

M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018

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2M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018

1. Ausgangspunkt und Einführung2. Problematik der LC‐Trennung und Detektion von Kohlenhydraten3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für KH/EtOH

3.1 „Historische“ Zuckertrennung3.2 Aminophasen3.3 HPAEC‐PAD3.4 Ligandenaustausch‐LC

4. Ergebnisse der Wein‐ und  Alkopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol4.2 Weingenuss versus Alkohol‐Abusus

5. Kleines Resümee

Schwerpunkte

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‐ Zucker sind ernährungsphysiologisch wichtig (Energiehaushalt)‐ Andererseits sind Zucker oft Ursachen/“Mithelfer“ bei der 

Entstehung von Erkrankungen (Diabetes, Lactoseintoleranz u.a.)‐ Glycane/Zuckersequenzen spielen eine wichtige Rolle in Glyco‐

proteinen bei biochemischen Reaktionen/Zell‐Zell‐Erkennung‐ Getränke mit hohem Zuckergehalt/Süßspeisen sind oft (Teil )‐

Ursachen für Übergewicht bereits bei Kindern und Jugendlichen‐ Bei Verzehr von Lebensmitteln/Getränken  sind vor allem hohe

Zuckergehalte zu beachten!‐ Alkopops und süße Weine sind kritisch und ggf. zu meiden!‐ Analytische Methoden/HPLC sind sehr gut geeignet, monomere

und dimere Kohlenhydrate sowie den Ethanolgehaltin diesen Produkten zu bestimmen.

‐ HPLC‐Trennmechanismen basierend  auf LEC und HPAEC‐PADsind dafür sehr gut geeignet  

1. Ausgangspunkt und Einführung

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2. Problematik der LC‐Trennung und KH‐Detektion

‐ Hexosen (Glucose, Galactose,  Mannose) annähernd gleicheStrukturen – identische Molekulargewichte

‐ Zucker sind i.d.R. neutral/nicht ionisch‐ Durch starke Basen Überführung in Oxianionen möglich‐ Dann Trennung durch Ionenaustausch (IEC) gegeben

‐ Mono‐/dimere Kohlenhydrat‐Strukturen besitzen i.d.R. keinechromophoren Gruppen

‐ UV/VIS  und Fluoreszenz wenig geeignet‐ RI‐Detektion möglich – wenig sensitiv‐ PAD  ist relativ speziell (Equipment/Detektor)‐ MS nicht immer vorhanden

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C

C

OH

OHKohlenhydrat

HO

HOB OH

Borsäure

C

C

O

OB

OH

OHH2O

Anionischer Zucker-Borat-Komplex

3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.1 „Historische“ Zuckertrennung

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nach D. Scott, in "Modern Practice of Liquid Chromatography", J.J. Kirkland ed.

Anionenaustauscher : Aminex A-27,10 µm;Säule : 150 cm x 6,2 mm,Gradientenelution mit Boratpuffer,je 1 µMol jedes Zuckers,

3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.1 „Historische“ Zuckertrennung

Zeit in Stunden!

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3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.2 Aminophasen

03 2 1

Zeit (min)

1

2

4

5

3

2 Rhamnose3 Glucose4 Cellobiose

5 Raffinose

Glassäule:  100 x 3,8 mm i.D.stat. Phase:  Silasorb NH2, dp = 5 µmmobile Phase: ACN/Wasser 75:25 V/VFlussrate:  1,7 ml/minVordruck:  8 MPaDetektion:  RI, 5 x 10‐5 I.I.U.Inj.‐volumen:  20 µl.

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3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.3 HPAEC‐PAD

8

dp = 5 µm SO3

Partikel der stationärenPhase auf Styren-Divinyl-benzen-Basis (S-DVB)

sulfoniert

dp = 0,1 µm

Latexpartikel

+ NaOHpH = 12-13

High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection

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3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.3 HPAEC‐PAD

9

High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection

1

2

3

456

7

0 10 20 30 40 50

Zeit (min)

PA

D-R

esp

on

se

1234567

FucoseGalNAcGlcNAcGalactoseGlucoseMannoseNANA

Säule: 250 • 4 mm i.D.,stationäre Phase: CarboPak PA 100,mobile Phase: 21 mmol/l NaOH,Flussrate: 1,0 ml/min,Detektion: PAD (E1= 50 mV, E2= 650 mV, E3= ‐950 mV, t1= 300 ms, t2= 60 ms, t3= 60 ms),Injektionsvolumen: 20 µl.

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3. Ausgewählte für Zucker3.3 HPAEC‐PAD

10

High pH anion‐exchange chromatography ‐ pulsed amperometric detection

0 10 20 30 40

504030

25

20

15

10

Zeit (min)

Chromatogramm von (1→4)‐a‐D‐Glycanen (kurzkettige Amylose EX‐1).Peak 1–50:  DP 1 ... DP 50,Säule: 250 • 4 mm i.D.,stationäre Phase: HPIC‐AS6,mobile Phase: A: 150 mM NaOH undB: A + 500 mM NaAc (Gradienten‐Programm I), Flussrate: 1,0 ml/min,Detektion: PAD (E1= 100 mV, E2= 600 mV, E3= ‐800 mV, t1= 300 ms, t2= 120 ms, t3= 300 ms,Empfindlichkeit: 10 K nAInjektionsvolumen: 50 µl.

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3. Ausgewählte LC‐Trennsysteme für Zucker3.4 Ligandenaustausch‐LC

S-DVB

S-DVB

SO3-

SO3-

Ca2+H2OH2O

H2O hydrophile WW

OH-Glucose

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Chromatographische

Bedingungen:

Säule: Polyspher CHCA

mobile Phase: Wasser

Flussrate: 0,4 ml/min

Druck: 5,2 Mpa

1 Glucose

2 Fructose

3 Glycerin

4 Ethanol

5 sec. Butanol als innerer Standard

Time

30 min

2 X

10

-6 R

IU

Start

1

2

3

4

5Ligandenaustauschchromatographie

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Sample preparation?: is very easy!

- 100 µl wine in 10 ml deionized or bidestilled water (1:100 V/V)

- or 10 µl wine in 1 ml water, - or 1µl wine in 100 µl water,

- Injection of 20 µl of such a sample solution in to a HPLC apparatus.

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4. Ergebnisse der Wein‐ und  Alcopop‐Analytik

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Trockner Rotwein

Glc:   1,4 g/lFru:   2,5 g/l 

4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte

Süßer Weißwein

Glc:   23,6 g/lFru:   25,3 g/l 

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte

Moselwein

Glc:   6,4   g/lFru:   36,6 g/l 

Süßer Weißwein

Glc:   24,1 g/lFru:   24,3 g/l 

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte

Barcardi Alcopop

Glc:   49,1 g/lFru:   51,1 g/l EtOH:  9,8 %

Lemon Alcopop

Glc:   24,4 g/lFru:   24,5 g/l EtOH:  2,5 %

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Alcopops

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.1 Problematik der Zuckergehalte

„Rote  Johanna“ (Likör)Glc:   88,8 g/lFru:   83,3 g/l EtOH:  17,8 %

„Stephanie‐Likör“Glc:   75,6 g/lFru:   92,5 g/l EtOH:  4,9 %

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Abbau‐Vorgang: im Zytoplasma

H3C CH2 OHDehydrogenierung(Zytoplasma)

Ethanol Alkohol-dehydrogenase

H3C CO

H

Acetaldehyd

NAD+

NADH + H+

Acetaldehyd-dehydrogenase

NAD+ + H2O

NADH + H+

H3C CO

O

Acetat

H+

(Metabolisierung findet in der Leber und im GIT statt)

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol

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H3C CH2 OHMEOS(EndoplasmatischesRetikulum)

Ethanol

H3C CO

H

Acetaldehyd

NADP+NADPH + H+

O2 2 H2O

H3C CO

O

Acetat

H+

NADP+NADPH + H+

O2 H2O

MEOS: mikrosomales ethanol oxidierendes System

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol

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4. Ergebnisse der Wein‐ und Alcopop‐Analytik4.3 Weingenuss  versus Alkohol‐Abusus

Formel nach Widmar:M: Masse des getrunkenen Alkohols [g]Km: Körpermasse [kg]r: Reduktionsfaktor, Männer: 0,7/Frauen: 0,6c: BAK in [ 0/00 ]  , Blutalkoholkonzentration in Promille

M = Km  . c . r  c  = M / c  . r 

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Fall‐1:M: 80 g  (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,

100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 110 [kg]r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7

c: BAK in [ 0/00] ? ,

c  = M / Km  . r  =  80 g / 110 kg . 0,7c =  80 g  /  77 g   [0/00 ]  =  1,04   Promille

in vino

veritas

Ein „Gedanken‐Experiment“!?

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Fall‐2:M: 80 g  (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,

100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 60 [kg]r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6

c: BAK in [ 0/00] ? ,

c  = M / Km  . r  =  80 g / 60 kg . 0,7c =  80 g  /  36 g   [0/00 ]  =  2,22   Promille

in vino

veritas

Ein „Gedanken‐Experiment“!?

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Fall‐2:  “Normal‐Typ”M: 80 g  (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,

100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 60 [kg]r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6c: 2,22  Promille

Alkohol‐Abbau: 0,15 Promille/Stunde:Die Frau ist nach 15 Stunden “clean”.

in vino

veritas

Ein „Gedanken‐Experiment“!?

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Fall‐1: “MEOS‐Typ”M: 80 g  (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol,

100 ml Alkohol = 80 g Alhohol)Km: 110 [kg]r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7c: 1,04  Promille

Alkohol‐Abbau: 0,35 Promille/Stunde:Der Mann ist in 3 Stunden “clean”.

in vino

veritas

Ein „Gedanken‐Experiment“!?

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26M. Gey: HPLC of carbohydrates & ethanol 14.03.2018

‐ LEC ist für einfache Zuckertrennungen von Weinen und Alcopos gut  geeignet.

‐ HPAEC‐PAD und MS sind für sensitive Zuckerbestimmungen prädestiniert.

‐ Vorsicht vor Alcopops , süßen Weinen und „Zucker‐Likören“!

Bevorzugen Sie trockene Weine!

„In vino veritas“ – Vielen Dank!

5. Ein kleines Resümee

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