huy nh quang
TRANSCRIPT
1. PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HUỲNH QUANG
1.1. Nguyên lý đo phổ huỳnh quang
Huỳnh quang là sự hồi phục bức xạ của điện tử từ mức kích thích xuống mức cơ
bản.
Khi hấp thụ bức xạ, phân tử chuyển dời từ mức năng lượng cơ bản lên mức năng
lượng cao hơn. Nếu phân tử hấp thụ ánh sáng trong vùng nhìn thấy hoặc vùng tử ngoại
thì năng lượng hấp thụ sẽ ứng với các mức điện tử, như vậy sẽ có chuyển dời điện tử
trong phân tử từ quỹ đạo này sang quỹ đạo khác. Sau khi hấp thụ ánh sáng, điện tử nhảy
từ trạng thái cơ bản lên các trạng thái kích thích đơn cao hơn S1, S2… Từ trạng thái kích
thích, điện tử trở về trạng thái cơ bản bằng các con đường khác nhau: hồi phục không bức
xạ và hồi phục bức xạ.
Hình 1. Sơ đồ sự chuyển dời quang học của các phân tử màu
Khi hấp thụ bức xạ, phân tử chuyển dời từ mức năng lượng cơ bản S 0 lên mức
năng lượng cao hơn S1 (hình 1). Nếu phân tử hấp thụ ánh sáng trong vùng nhìn thấy hoặc
vùng tử ngoại thì năng lượng hấp thụ sẽ ứng với các mức điện tử, như vậy sẽ có chuyển
dời điện tử trong phân tử từ quỹ đạo này sang quỹ đạo khác. Sau khi hấp thụ ánh sáng,
điện tử nhảy từ trạng thái cơ bản lên các trạng thái kích thích đơn cao hơn S1. Từ trạng
thái kích thích, điện tử trở về trạng thái cơ bản bằng các con đường khác nhau: hồi phục
không bức xạ và hồi phục bức xạ. Huỳnh quang là sự hồi phục bức xạ của điện tử từ mức
kích thích xuống mức cơ bản.
Hiệu suất lượng tử của một chất huỳnh quang là tỉ lệ số photon phát ra trên số
photon được hấp thụ (tức là khả năng sinh ra photon của một phân tử sau khi hấp thụ
photon hay xác suất hồi phục bức xạ của phân tử) :
QYf = [số photon bức xạ]/[số photon hấp thụ] (1)
Phổ huỳnh quang là hàm phân bố năng lượng bức xạ của chất huỳnh quang theo
tần số hay bước sóng. Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần và cấu trúc của các
tâm bức xạ và các tác nhân bên ngoài. Phổ huỳnh quang có một số đặc điểm sau:
Phổ huỳnh quang luôn có tần số bé hơn tần số của ánh sáng kích thích.
Nghĩa là năng lượng huỳnh quang nhỏ hơn năng lượng dùng để kích thích huỳnh quang.
Tần số huỳnh quang trong trường hợp này gọi là tần số Stoke.
Dạng phổ huỳnh quang không phụ thuộc vào năng lượng ánh sáng kích
thích, vì sau khi kích thích chỉ cần một thời gian rất ngắn , sự phân bố các phân tử trên
các trạng thái kích thích sẽ tuân theo phân bố Boltzman.
Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào các tạp chất nằm trong mẫu. Những tạp
chất này ảnh hưởng lớn đến phổ huỳnh quang và trong nhiều trường hợp làm tắt ánh sáng
huỳnh quang. Những chất này gọi là những chất tắt.
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ I0 song song vào một môi trường
vật chất có bề dày l (cm) và nồng độ C (mol/l), chùm tia này sẽ bị môi trường hấp thụ và
truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này bị giảm theo quy luật
Beer-Lamber:
ln (I0/I)= elC (2)
hay ln (I0/I) = Kn
Trong đó: K- là hệ số hấp thụ
n- số mol chất nghiên cứu đặt trên đường đi của bức xạ
Đại lượng ln(I0/I) gọi là mật độ quang (D) hay độ hấp thụ (A), e là hệ số hấp thụ
mol có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất hấp thụ bằng một đơn
vị và độ dày chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ e hay còn gọi là hệ số tắt chỉ
phụ thuộc vào chất hấp thụ và bước sóng bức xạ bị hấp thụ.
Nếu cường độ ánh sáng kích thích Iex được biết như là mật độ kích thích (số
photon tới trong 1 đơn vị diện tích trong 1 đơn vị thời gian- cm-2s-1), thì vận tốc hấp thụ
của một phân tử được xác định bằng công thức sau (Mathieu và Stryer, 1986):
AR(photon/s) = Iexe (3)
Trong đó = (3.8 x 10-21molL-1cm3), là một hệ số mà khi nhân với e thì sẽ được
thiết diện hấp thụ của đơn phân tử = e .
Như vậy số photon được bức xạ từ một phân tử trong khoảng thời gian t sẽ bằng
vận tốc hấp thụ nhân với hiệu suất lượng tử QYf nhân với thời gian t. Và như vậy, cường
độ huỳnh quang FIsample của một mẫu có một tập hợp phân tử sẽ là
FIsample = AR.QYf.t.V.C.Na (4)
Trong đó V là thể tích của mẫu đo. C là nồng độ phân tử và N a là số Avogadro.
Phối hợp hai công thức (3) và (4), ta có
FIsample = ( Iexe). QYf.t.V.C.Na = B.C (5)
Đặt B = ( Iexe). QYf.t.V. Na
Công thức (5) cho ta thấy cường độ huỳnh quang của mẫu đo tỉ lệ thuận với nồng
độ phân tử có trong mẫu. Nếu ta có đồ thị FIsample = ax (a là hệ số, x là trục hoành), biết a
ta có thể suy ra nồng độ tâm mầu ứng với các giá trị cường độ huỳnh quang.
Dựa vào công thức (5), ta có thể xây dựng đường cường độ huỳnh quang ứng với
từng nồng độ vi khuẩn cho trước (được đánh dấu bằng một loại tâm mầu và đo trên một
thiết bị với điều kiện đo không đổi) làm đường chuẩn. Ta có thể suy ra nồng độ vi khuẩn
có trong mẫu xét nghiệm bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của mẫu (được đánh
dẫu cùng một loại chất và đo trên cùng một thiết bị đo trong cùng một điều kiện đo) với
đường chuẩn.
Thời gian tắt dần huỳnh quang τ (hay thời gian sống phát quang): thời gian
sống phát quang là thời gian trung bình của một phân tử ở trên trạng thái kích thích trước
khi hồi phục phát xạ một photon. Sự phát huỳnh quang biểu diễn theo động học:
[S1] = [S1]0. e-t/ (1.3)
Trong đó: [S1] là số các phân tử tồn tại ở trạng thái kích thích tại thời điểm t.
[S1]0 là số phân tử được kích thích lúc ban đầu. là thời gian sống huỳnh quang còn được
gọi là thời gian để cường độ huỳnh quang suy giảm đi e lần.
2.1.1. Phép đo phổ huỳnh quang
Huỳnh quang là sự hồi phục bức xạ của điện tử từ mức kích thích xuống mức cơ
bản. Khi hấp thụ bức xạ, phân tử chuyển dời từ mức năng lượng cơ bản lên mức năng
lượng cao hơn. Nếu phân tử hấp thụ ánh sáng trong vùng nhìn thấy hoặc vùng tử ngoại
thì năng lượng hấp thụ sẽ ứng với các mức điện tử, như vậy sẽ có chuyển dời điện tử
trong phân tử từ quỹ đạo này sang quỹ đạo khác. Sau khi hấp thụ ánh sáng, điện tử nhảy
từ trạng thái cơ bản S0 lên các trạng thái kích thích đơn cao hơn S1, S2… Từ trạng thái
kích thích, điện tử trở về trạng thái cơ bản bằng các con đường khác nhau: hồi phục
không bức xạ và hồi phục bức xạ.
Hình 2.10. Sơ đồ chuyển dời quang học của các phân tử
Phổ huỳnh quang là hàm phân bố năng lượng bức xạ của chất huỳnh quang theo tần
số hay bước sóng. Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần và cấu trúc của các tâm bức
xạ và các tác nhân bên ngoài. Phổ huỳnh quang có một số đặc điểm sau:
(1) Phổ huỳnh quang luôn có tần số bé hơn tần số của ánh sáng kích thích. Nghĩa
là năng lượng huỳnh quang nhỏ hơn năng lượng dùng để kích thích huỳnh quang. Tần số
huỳnh quang trong trường hợp này gọi là tần số Stoke.
(2) Dạng phổ huỳnh quang không phụ thuộc vào năng lượng ánh sáng kích thích
vì sau khi kích thích chỉ cần một thời gian rất ngắn, sự phân bố các phân tử trên các trạng
thái kích thích sẽ tuân theo phân bố Boltzmann.
(3) Phổ huỳnh quang phụ thuộc vào các tạp chất nằm trong mẫu. Những tạp chất
này ảnh hưởng lớn đến phổ huỳnh quang và trong nhiều trường hợp làm tắt ánh sáng
huỳnh quang. Những chất này gọi là chất tắt.
Sơ đồ khối hệ đo huỳnh quang:
Hình 2.11 mô tả sơ đồ hệ đo huỳnh quang: Tín hiệu kích thích từ nguồn sáng được
chiếu lên mẫu để kích thích các điện tử từ trạng thái cơ bản lên các trạng thái kích thích.
Tín hiệu huỳnh quang được phân tích qua máy đơn sắc và thu nhận tín hiệu qua đầu thu
để biến đổi thành tín hiệu đưa ra xử lý. Một photodiode được đặt trước mẫu để theo dõi
sự thay đổi công suất nguồn sáng kích thích.
Phổ huỳnh quang của các mẫu được đo trên phổ kế huỳnh quang FL-22Jobin-
Yvon (USA) nguồn kích thích là laser He-Cd với bước sóng kích thích là 442 nm tại
nhiệt độ phòng (hình 2.12) và phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse, nguồn kích là đèn
Xenon (hình 2.13).
Hình 2.11. Sơ đồ khối của phép đo quang huỳnh quang.
Hình 2.12. Sơ đồ nguyên lý hệ đo quang phổ nhãn hiệu FL-22Jobin-Yvon
Nguồn sáng
Đèn Xê-nôn
Máy đơn sắc
Cửa sậpKính lọcTấm chia chùm
Tấm phân cựcRef - Cell
Môđun quang họcMáy đơn sắc
Buồng đựng mẫu
Điều khiển
máy đơn sắc
Máy tính
Hiển thị
Hình 2.13. Cấu hình chi tiết của một máy phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse
1.2. Hệ đo phổ huỳnh quang
Nguyên tắc của phép đo phổ huỳnh quang theo sơ đồ khối của hệ đo huỳnh quang
(hình 2). Ánh sáng từ nguồn kích thích (có thể là đèn hoặc laser) được chiếu tới mẫu. Tín
hiệu huỳnh quang từ mẫu phát ra đi qua hai thấu kính hội tụ L1, L2 sau đó hội tụ máy đơn
sắc. Máy đơn sắc sẽ phân tích tín hiệu phát ra từ mẫu, cuối cùng là đưa vào đầu thu và tín
hiệu nhận được từ mẫu sẽ được máy tính ghi lại.
Hình 2. Sơ đồ khối hệ đo huỳnh quang.
Để đo được tín hiệu huỳnh quang ta cố định một giá trị bước sóng kích thích (ex
= const). Phổ huỳnh quang thu được biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang
phát ra từ mẫu vào bước sóng.
Các mẫu đo huỳnh quang được thực hiện trên phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse
tại Trung tâm Điện tử Lượng tử, Viện Vật lý.
Hình 3. Ảnh phổ kế huỳnh quang Carry Eclipse
1.1 Sơ lược về hiện tượng huỳnh quang
Khi ánh sáng chiếu vào một vật, sự hấp thụ tạo ra trạng thái không cân bằng. Phân
tử hoặc nguyên tử làm tiêu hao năng lượng dôi ra theo những con đường sau:
Hình 1. Các cơ chế tiêu hao năng lượng của nguyên tử, phân tử [35].
Các điện tử ở trạng thái cơ bản sẽ hấp thụ năng lượng để chuyển lên các trạng thái
điện tử kích thích, từ trạng thái điện tử kích thích, sự phục hồi của điện tử về các trạng
thái điện tử cơ bản sẽ làm bức xạ ra ánh sáng. Hiện tương này được gọi là sự phát quang
của vật chất khi được kích thích. Dựa trên bản chất của trạng thái kích thích, sự phát
quang có thể được chia làm 2 dạng: huỳnh quang và lân quang.
Huỳnh quang là bức xạ ánh sáng từ các trạng thái kích thích đơn (spin bằng 0) hay
là sự hồi phục bức xạ của vật chất từ trạng thái kích thích điện tử. Khoảng thời gian để
điện tử hồi phục từ trạng thái kích thích về trạng thái cơ bản hay còn gọi là thời gian sống
huỳnh quang thường vào cỡ ns.
Trong khi đó lân quang là bức xạ ánh sáng từ các trạng thái kích thích bộ ba (spin
bằng 1).Và khác với thời gian sống huỳnh quang thường rất ngắn, thời gian sống lân
quang điển hình có thể rất lâu từ ms đến s. Thậm chí một số chất có thể phát lân quang
đến vài phút khi các điện tử hồi phục về mức cơ bản rất chậm [38].
Các dịch chuyển điện tử trong nguyên tử tuân theo nguyên lý Frank – Kodon theo
đó vì chuyển động của điện tử nhanh hơn rất nhiều chuyển động của hạt nhân, dịch
chuyển điện tử sẽ thuận lợi hơn nếu cấu trúc hạt nhân của các trạng thái đầu và cuối
tương tự nhau. Nói cách khác: Đối với dịch chuyển điện tử, dịch chuyển sẽ xảy ra theo
chiều thẳng đứng trong giản đồ năng lượng theo khoảng cách. Theo Cơ học lượng tử
Nguyên lý Frank-Condon sẽ là: dịch chuyển điện tử chỉ xảy ra khi các hàm sóng của các
mức dao động của các trạng thái điện tử liên quan chồng chéo nhau [35]. Thí dụ:
Hình 2. Giản đồ các mức năng lượng dịch chuyển của điện tử
Vị trí 1: Phân tử truyền năng lượng dao động dư cho môi trường để hồi phục về
trạng thái cơ bản, tức là ở khoảng cách liên kết cân bằng của hạt nhân.
Vị trí 2: Điện tử dịch chuyển thẳng đứng trong giản đồ E theo R cho tới khi nó gặp
đường cong năng lượng của trạng thái kích thích (hay là gặp được năng lượng thích
hợp). Xác xuất của dịch chuyển đó được tính bằng sự chồng chéo của các hàm sóng dao
động của trạng thái đó với hàm sóng dao động ở điểm không của trạng thái cơ bản (tích
phân FC).
Vị trí 3: Các phân tử truyền năng lượng dao động vượt trội ra môi trường xung
quanh (nhiệt) cho tới khi chúng đạt tới mức dao động ở điểm 0 của trạng thái kích thích.
Quá trình này nhanh hơn bất kì quá trình nào hồi phục trực tiếp xuống trạng thái cơ bản.
Vị trí 4: Sự phát xạ đưa phân tử về trạng thái cơ bản. Ở đây nguyên lí FC cũng được
áp dụng nên quá trình hồi phục theo phương thẳng đứng.
Quá trình dịch chuyển điện tử trong hiện tượng hấp thụ và bức xạ ánh sáng thường
được minh họa một cách trực quan bởi giản đồ Jablonski.
Hình 3. Giản đồ Jablonski
Các quá trình có thể diễn ra là:
So + h S1 Hấp thụ
S1 So + h' Huỳnh quang
S1 So + nhiệt Chuyển đổi nội (IC)
S1 T1 + nhiệt Dịch chuyển giữa các hệ (ISC)
T1 So + hLân quang
T1 So + nhiệt Dịch chuyển giữa các hệ
Trong đó IC (internal conversion) và ISC (intersystem conversion) là các quá trình
không bức xạ, huỳnh quang và lân quang là các quá trình phục hồi bức xạ. ISC và IC và
lân quang là các chuyển mức bị cấm spin vì S 0. Mặc dù vậy, chúng vẫn có thể xảy ra
nhờ vào tương tác của spin điện tử với spin hạt nhân do đó số lượng tử không phải là số
lượng tử thuần. Lực dao động của chúng phụ thuộc vào hạt nhân, vì vậy một vài phân tử
có vận tốc ISC và lân quang cao trong khi chúng thường thấp đối với các phân tử khác
[35].
1.2 Các đặc trưng của bức xạ huỳnh quang
Sự dịch Stokes
Từ giản đồ Jablonski, ta nhận thấy rằng năng lượng bức xạ thường nhỏ hơn so với
năng lượng hấp thụ. Phổ huỳnh quang của một chất thường dịch về phía sóng dài so với
phổ hấp thụ của chính chất đó. Hiện tượng này được phát hiện bởi G.G Stokes từ năm
1852 và được gọi là sự dịch Stokes. Nguyên nhân của sự dịch Stokes có thể được lý giải
do sự dịch chuyển nội của các điện tử kích thích hoặc là do sự sắp xếp lại các điện tử theo
phân bố Boltzmann [15].
Sự không phụ thuộc của phổ huỳnh quang vào bước sóng kích thích và hiện
tượng đối xứng gương.
Một tính chất chung nữa của phổ huỳnh quang là nó không phụ thuộc vào bước
sóng kích thích. Khi sự kích thích đưa điện tử lên các mức năng lượng và dao động cao
hơn, điện tử sẽ nhanh chóng bị đưa về mức dao động thấp nhất của trạng thái S1. Sự phục
hồi này chỉ xảy ra trong khoảng s và ví thế phổ bức xạ thường không phụ thuộc vào
bước sóng kích thích [15].
Trong đa số các trường hợp các chất thường xảy ra sự đối xứng về vị trí đỉnh phổ
hấp thụ và bức xạ. Đây là kết quả của hai quá trình dịch chuyển: thuận (điện tử từ trạng
thái cơ bản lên các mức dao động của trạng thái kích thích ) và ngược (điện tử phục hồi
từ trạng thái kích thích về các mức dao động của trạng thái cơ bản. Hình 4 mô tả sự đối
xứng gương của phổ hấp thụ và bức xạ của chất anthracence, 0,1,2 là các mức năng
lượng dao động.
Hình 4. Sự đối xứng gương giữa phổ hấp thụ và bức xạ của Anthracence [15].
Tuy nhiên sự đối xứng gương giữa phổ hấp thụ và bức xạ không phải lúc nào cũng
được thỏa mãn. Hình 5 mô tả sự không đối xứng gương giữa phổ hấp thụ và phổ bức xạ
mà ở đó phổ hấp thụ của chất phụ thuộc vào pH của môi trường [15].
Hình 5. Sự bất đối xứng gương giữa phổ hấp thụ của HPTS trong môi trường có pH khác
nhau [15].
Chất được sử dụng là 1-hydroxylpyrene-3,6,8-trisulfonate (HPTS) trong môi trường
nước. Với pH thấp, hằng số phân ly của nhóm hydroxyl ( ) giảm đi ở trạng thái kích
thích và do vậy nó bị ion hóa (nhận thêm proton) khiến cho phổ hấp thụ là rất khác. Với
pH cao hơn (13.0) thì sự đối xứng gương lại được thiết lập [15],[38].
Thời gian sống huỳnh quang và hiệu suất lượng tử
Thời gian sống huỳnh quang (lifetime fluorescence) và hiệu suất lượng tử (quantum
effiency) là hai đặc trưng quan trọng nhất của một hệ huỳnh quang [15].
Hình 6. Sơ đồ đơn giản minh họa thời gian sống và hiệu suất lượng tử [15].
Gọi là khả năng suy giảm bức xạ bức xạ còn là khả năng suy giảm không bức
xạ của chất huỳnh quang, khi đó hiệu suất lượng tử được xác định bởi công thức:
Còn thời gian sống huỳnh quang hay thời gian tồn tại của điện tử ở trạng thái kích
thích chính là khoảng thời gian điện tử từ trạng thái kích thích hồi phục về trạng thái cơ
bản:
Trên thực tế từ phổ huỳnh quang ta cũng có thể xác định được thời gian sống huỳnh
quang thông qua việc xác đinh cường độ bằng phương pháp đo theo miền thời gian (time-
domain technique)
Với là cường độ huỳnh quang tại t = 0 (đỉnh phổ huỳnh quang). Khi đó thời gian
sống huỳnh quang chính là khoảng thời gian mà cường độ giảm e lần so với giá trị ban
đầu [15],[38].
Dập tắt huỳnh quang (Fluorescence quenching)
Trong một số trường hợp cường độ huỳnh quang có thể suy giảm rất nhanh. Hiện
tượng này được gọi là sự dập tắt và có thể bị gây ra bởi các cơ chế khác nhau. Một trong
số đó là sự dập tắt do va chạm, xảy ra khi các phân tử huỳnh quang ở trạng thái kích thích
tiếp xúc với một vài phân tử khác trong dung dịch (gọi là tác nhân dập tắt). Sự suy giảm
huỳnh quang do va chạm có thể biểu diễn bằng phương trình Stern-Volmer:
Trong đó K là hằng số tắt Stern-Volmer đặc trưng cho phản ứng của chất huỳnh
quang với các tác nhân dập tắt, là hằng số dập tắt 2 phân tử (biomolecular), là thời
gian sống và là nồng độ dập tắt.
Tính dị hướng của bức xạ huỳnh quang (Fluorescence Anisotropy)
Các phép đo tính dị hướng được thực hiện theo nguyên lý của sự kích thích chọn lọc
của các chất huỳnh quang bởi ánh sáng phân cực.Các chất huỳnh quang thường ưu tiên
hấp thụ các photon có vector điện song song với moment chuyển dời của chất. Moment
này có tính chất định hướng với trục của phân tử, vì thế trong các dung dịch đẳng hướng,
chất huỳnh quang được định hướng một cách ngẫu nhiên.
Tính dị hướng ( ) và sự phân cực P của bức xạ huỳnh quang được xác định theo
công thức sau :
Với lần lượt là các thành phần song song và vuông góc của bức xạ phân cực
thu được trong trường hợp mẫu vật được kích thích bởi ánh sáng phân cực thẳng.
1.3 Hệ đo huỳnh quang
Các phép đo huỳnh quang là hết sức đa dạng, tùy theo mục đích cần nghiên cứu mà
người ta xây dựng các hệ đo huỳnh quang riêng, có những hệ hết sức đơn giản nhưng
cũng có những hệ đo là khá phức tạp. Về cơ bản, một hệ đo huỳnh quang bao gồm nguồn
sáng kích thích, mẫu kích thích, thiết bị tán sắc, đầu thu, thiết bị xử lý tín hiệu và bộ phận
hiển thị. Sơ đồ của một hệ đo huỳnh quang nói chung được chỉ ra sau đây.
1.3.1 Nguồn sáng kích thích
Nguồn
kích thích
MẫuThiết bị
tán sắcĐầu thu
Xử lý
tín hiệu
Hiển thị
Hình 7. Sơ đồ bố trí chung của hệ đo huỳnh quang
Nguồn sáng là một bộ phận quan trọng, không thể thiếu trong các phép đo huỳnh
quang. Nguồn sáng cung cấp điều kiện để kích thích nguyên tử, phân tử của các chất. Có
nhiều loại nguồn sáng để đáp ứng các yêu cầu khác nhau trong nghiên cứu. Chúng khác
nhau về cường độ phát sáng, phổ ánh sáng phát ra và chế độ phát liên tục hoặc xung.
Dưới đây là một vài nguồn sáng thông dụng.
Đèn (lamp)
Đèn là một loại nguồn sáng thông dụng, đã được con người biết đến từ rất lâu.
Ngoài tác dụng chiếu sáng, đôi khi đèn còn được sử dụng như là nguồn kích thích cho
các phép đo huỳnh quang. Có thể kể tên một số loại đèn như sau:
Đèn Xenon: có thể hoạt động theo chế độ phát xung hoặc liên tục với cường độ
mạnh trong một vùng phổ rộng (tử ngoại đến hồng ngoại gần).
Đèn thủy ngân: phát bức xạ đơn sắc (phổ vạch) với cường độ khá mạnh trong vùng
khả kiến và tử ngoại.
Đèn flash: phát ánh sáng dạng xung trong một vùng phổ liên tục khá rộng. Độ rộng
các xung cỡ hoặc .
Laser
Laser (light amplification by stimulated emission of radiation) là nguồn sáng trong
đó bức xạ cưỡng bức được khuếch đại và phát ra với sự định hướng cao. Đặc tính của
chùm laser là ánh sáng kết hợp, có tính định hướng cao trong không gian, độ đơn sắc rất
lớn, cường độ tập trung mạnh vào một vùng phổ rất hẹp của bức xạ. Với các đặc tính như
vậy mà laser dần dần trở thành nguồn sáng chủ đạo, thay thế các nguồn sáng truyền thống
trong quang phổ. Căn cứ vào chế độ phát của laser, ta có thể phân loại một số laser thông
dụng như sau:
Laser Vùng phổ bức xạ Chế độ hoạt động
Laser khí CO2
Liên tục hoặc xung
.
Bảng 01: phân loại một số nguồn laser kích thích.
Laser khí ion
Argon
; ;
; ;
; ; ;
;
Liên tục
Laser khí He –
NeLiên tục
Laser khí He –
CdLiên tục
Laser mầu (với nhiều chất màu khác
nhau)
Có thể liên tục hoặc
xung .
Laser bán dẫn
Ga/As/GaAlAs
InGaAsP/lnP
Có thể liên tục hoặc
xung .
Laser rắn Ti –
Sapphiare
Có thể liên tục hoặc
xung .
Laser rắn Rubi Xung .
Laser rắn
Nd:YAG
Có thể liên tục hoặc
xung .
Laser sợiCó thể liên tục hoặc
xung .
1.3.2 Thiết bị tán sắc
Để có thể quan sát được sự thay đổi về cường độ của bức xạ huỳnh quang theo bước
sóng, ta cần phải sử dụng đến các thiết bị tán sắc như lăng kính, cách tử. So sánh giữa
lăng kính và cách tử ta thấy lăng kính có khả năng phân giải cao hơn nhưng lại không
tuyến tính với bước sóng, trong khi đó cách tử lại có độ phân giải là tuyến tính với bước
sóng. Vì vậy, cách tử ngày càng được sử dụng phổ biến hơn. Ngày nay, người ta thường
kết hợp thiết bị tán sắc với bộ môtơ bước (motor step) để có thể tự động hóa phép đo.
Điều này khiến cho kết quả thu được là chính xác hơn, hạn chế sai số do thao tác trong
khi thực nghiệm.
Hình 8. Các thiết bị tán sắc: lăng kính (trái) và cách tử (phải)
1.3.3 Đầu thu
Sau khi ra khỏi thiết bị tán sắc, tín hiệu ánh sáng sẽ được biến đổi thành tín hiệu
điện thông qua đầu thu (detector) để phục vụ cho việc thu thập và xử lí sau đó. Một số
đặc trưng cơ bản của đầu thu gồm: độ nhạy (tỷ số tín hiệu lối ra trên tín hiệu lối vào),
hiệu suất lượng tử (tỷ số yếu tố tín hiệu cơ bản sinh ra bởi đầu thu và số photon tới), thời
gian đáp ứng (thời gian cần thiết để tín hiệu lối ra tăng lên khi có tín hiệu đập tới đầu
thu), vùng tuyến tính (phạm vi tín hiệu lối vào trong đó tín hiệu lối ra là một hàm tuyến
tính của tín hiệu lối vào), ồn nhiễu. Người ta thường phân loại đầu thu theo kiểu đơn kênh
và đa kênh.
Đầu thu đơn kênh
Có hai loại đầu thu điển hình, được sử dụng rộng rãi hiện nay là photodiode (PD) và
ống nhân quang điện (photomultiplier tube – PMT).
Photodiode (PD) là một loại đầu thu bán dẫn hoạt động dựa trên tính quang dẫn của
lớp chuyển tiếp p – n (hình 09).
Bình thường khi không có điện áp ngược đặt vào hai đầu của PD, ở lớp chuyển tiếp
p – n xuất hiện hai dòng Ikt và Ic có cường độ bằng nhau nhưng ngược chiều. Trong đó, Ikt
là dòng khuếch tán của các hạt dẫn cơ bản (những hạt sinh ra do sự ion hóa tạp chất) và Ic
là dòng cuốn của các hạt dẫn không cơ bản (những hạt sinh ra do kích thích). Khi đặt vào
hai đầu của PD một phân áp ngược đủ lớn sao cho dòng Ikt bị triệt tiêu thì khi đó dòng Ic
đóng vai trò chủ đạo và chỉ phụ thuộc vào cường độ sáng chiếu vào.
Ống nhân quang điện (Photomultiplier tube – PMT) cũng hoạt động dựa trên hiệu
ứng quang điện như PD nhưng được bổ sung thêm cơ chế khuếch đại tín hiệu nhờ việc bố
trí các dynode (tầng khuếch đại) bên trong PMT. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của
ống nhân quang điện PMT được chỉ ra trong hình 10.
Khi có một xung huỳnh quang đập vào photocathode, do dùng nguồn cao thế tạo ra
điện trường, các electron phát ra từ photocathode sẽ được gia tốc đến dynode đầu tiên D1,
tại đó xảy ra sự phát xạ electron thứ cấp rồi toàn bộ chùm electron lại được gia tốc đến
dynode D2, ở D2 sự phát xạ electron lại xảy ra làm cho chùm electron phát ra được nhân
lên rất nhiều lần so với chùm electron ra khỏi D1. Quá trình cứ như vậy được tiếp diễn ở
các dynode tiếp theo làm cho chùm electron cuối cùng đập vào anode được khuếch đại
lên rất nhiều lần so với ban đầu.
Hình 09. Lớp chuyển tiếp p – n của photodiode
Thông thường độ khuếch đại hiệu dụng của PMT có thể đạt được từ đến
lần. Phát xạ thứ cấp tại các dynode là rất nhanh, khoảng thời gian từ lúc photocathode
phát ra electron đầu tiên đến khi chùm electron thứ cấp đập vào anode chỉ cỡ vài ,
tương ứng với xung phát ra ở anode cũng là cực ngắn.
Đầu thu đa kênh
Trong cách thu phổ truyền thống, đầu thu đơn kênh được đặt ở mặt phẳng khe lối ra
của thiết bị tán sắc, bằng cách quay lăng kính hoặc cách tử để chọn bước sóng ta sẽ thu
được toàn bộ phổ tín hiệu. Hệ tán sắc và đầu thu như vậy được gọi là máy thu phổ đơn
kênh. Trong máy thu phổ đa kênh, cách tử hoặc lăng kính sẽ được giữ cố định, khe lối ra
và đầu thu đơn được thay thế bởi một đầu thu đa kênh cho phép thu được ngay toàn bộ
phổ. Dưới đây là một vài loại đầu thu đa kênh phổ biến hiện nay.
Mạng photodiode (Photodiode array – PDA): mạng tuyến tính các photodiode
riêng lẻ được chế tạo nhờ công nghệ mạch tích phân (hình 11). Vùng nhạy quang của mỗi
photodiode (pixel) có kích thước điển hình là rộng (hẹp để có được độ phân giải
phổ cao) và cao (lớn để thu được nhiều tín hiệu). Dòng quang điện sinh ra từ
mỗi pixel được nạp vào các tụ điện riêng rẽ và khi đọc PDA, các tụ điện sẽ lần lượt
phóng điện vào mạch điện của chip, thông tin được lấy ra theo trình tự nhất định. Số pixel
có thể có là: 128, 256, 512, 1024.
Hình 10. Nguyên tắc hoạt động của ống nhân quang điện
CCD: là một hệ cảm biến quang hai chiều, được chế tạo theo công nghệ mạch tích
phân để làm thành một “chip” bán dẫn. Mạng hai chiều này có cấu trúc điện tử khác với
PDA, kích thước điển hình của mỗi pixel là được xếp thành 256 hàng và
1024 cột. Khi đọc, tín hiệu (dưới dạng điện tích) được chuyển dịch tuần tự sang chốt lối
ra. Ưu điểm của CCD là có độ ồn đọc rất thấp do đó có độ nhạy rất cao (gấp 100 lần độ
nhạy của PDA).
Streak camera: là một thiết bị hai chiều, cho phép đồng thời dò hàng chục kênh ánh
sáng khác nhau. Streak camera cho phép đo các tín hiệu sáng cực nhanh, cho thông tin về
cường độ sáng theo thời gian hoặc theo bước sóng. Trong phép đo quang phổ phân giải
thời gian, streak camera được đặt sau khe máy, nhận tín hiệu bằng photocathode. Hình
dưới đây mô tả cấu tạo và nguyên lý hoạt động của Streak camera.
Hình 11. Photodiode array
Hình 12. Bộ cảm biến CCD
Nhờ hiệu ứng quang điện, các điện tử quang điện được rạo ra tỷ lệ với cường độ ánh
sáng tới. Các điện tử này được gia tốc khi đi qua hai bản cực quét và bị lệch đi những góc
khác nhau tương ứng với thời gian đến. Một tấm vi kênh (Microchannel plate – MCP) đặt
ngay sau sẽ nhận các điện tử được gia tốc này và nhân số điện tử lên hàng nghìn lần trước
khi bắn phá vào màn phosphor và được hiển thị bằng máy tính. Trên màn hình quan sát,
ảnh phosphor ứng với tín hiệu đến trước thì sẽ nằm ở vị trí trên cùng, những ảnh khác kế
tiếp được sắp đặt theo thứ tự từ trên xuống dưới. Độ sáng của ảnh phosphor tỷ lệ với
cường độ tương ứng của ánh sáng tới. Streak camera hiện là thiết bị cho phép đo trực tiếp
toàn bộ phổ tín hiệu ánh sáng nhanh với độ phân giải tốt nhất hiện nay.
1.3.4 Thu thập và xử lý số liệu
Các thiết bị thu thập và xử lý số liệu có nhiệm vụ ghi nhận lại các tín hiệu điện sau
khi đi ra khỏi đầu thu và xử lý chúng trước khi hiển thị ra ngoài. Trước kia người ta hay
sử dụng máy tự ghi còn ngày nay, với sự phát triển của điện tử học, đặc biệt là sự ra đời
của máy vi tính, dữ liệu thu được từ các phép đo sẽ được số hóa để thuận tiện cho quá
trình lưu trữ và xử lý. Kết hợp với các quá trình tự động hóa, thu thập và xử lý số liệu
ngày càng được diễn ra nhanh hơn và với độ chính xác cao hơn.
Ánh sáng tới
Photocathode
Lưới gia tốcMCP Màn phosphore
Không gian
Thời gianĐiện cực quét
Hình 13. Nguyên tắc hoạt động của streak camera
1.4 Các phương pháp đo suy giảm huỳnh quang
Có năm thông số đặc trưng của một phổ huỳnh quang là cường độ phụ thuộc theo
bước sóng ( ), độ bán rộng phổ ( ), vị trí đỉnh phổ , thời gian sống phát
quang () và độ phân cực (P).Tùy theo mục đích cần xác định thông số nào mà phép đo
huỳnh quang có thể được chia thành hai dạng: huỳnh quang trạng thái dừng (Steady-State
Fluorescence) và huỳnh quang suy giảm theo thời gian (Fluorescence Decay). Trong đó,
huỳnh quang trạng thái dừng là phép đo cường độ huỳnh quang trung bình theo thời gian.
Phổ huỳnh quang trạng thái dừng biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ huỳnh quang theo
bước sóng bởi vậy ta có thể xác định được các thông số như cường độ, độ bán rộng phổ,
vị trí đỉnh phổ, độ phân cực. Huỳnh quang trạng thái dừng thường được thực hiện với
một nguồn sáng liên tục để kích thích mẫu. Dạng thứ hai của phép đo huỳnh quang là
huỳnh quang suy giảm theo thời gian được thực hiện khi cần xác định sự suy giảm của
cường độ bức xạ huỳnh quang theo thời gian nhằm xác định thời gian sống phát quang
của chất phân tích và theo dõi các quá trình động học. Ở đó, mẫu thường được kích thích
bởi nguồn sáng xung mà độ rộng của xung phải thỏa mãn điều kiện là ngắn hơn so với
thời gian suy giảm (thường vào khoảng 10 lần). Phổ suy giảm cường độ có thể ghi nhận
được bởi hệ đầu thu tốc độ cao [38].
Như đã đề cập ở trên, các phép đo suy giảm huỳnh quang được chia thành hai dạng:
đo cường độ huỳnh quang theo bước sóng ( ) để xác định các thông số như ,
, và P của phổ huỳnh quang; đo cường độ huỳnh quang theo thời gian ( ) để
xác định thời gian sống phát quang và theo dõi các quá trình động học. Có hai kỹ thuật
chính được sử dụng rộng rãi trong các phép đo suy giảm huỳnh quang là kỹ thuật đo theo
miền tần số (frequency-domain technique) và đo theo miền thời gian (time-domain
technique) [3],[4],[15].
Kỹ thuật đo theo miền thời gian ghi lại cường độ của tín hiệu như là một hàm của
thời gian, trong khi đó kỹ thuật đo theo miền tần số ghi lại sự biến đổi của pha và cường
độ như là một hàm của tần số (hoặc là một hàm của bước sóng). Về mặt lý thuyết 2
phương pháp này là tương đương với nhau và được liên hệ thông qua biến đổi Fourier.
Tuy nhiên trên thực tế sự tương đương này chỉ có tính chất tương đối do có sự khác nhau
của các thiết bị trong hệ đo của mỗi phương pháp.
1.4.1 Kỹ thuật đo theo miền tần số (Phương pháp dịch pha)
Kỹ thuật đo theo miền tần số còn gọi là phương pháp dịch pha [4]. Trong kỹ thuật
này mẫu được kích thích bởi ánh sáng điều biến dạng sin ở tần số mà cường độ của nó
xác định bởi:
(1)
Trong đó là hai hệ số đặc trưng cho mức độ điều biến của ánh sáng kích thích,
là cường độ trung bình, là biên độ đỉnh của ánh sáng kích thích.
Hình 14. Phương pháp đo suy giảm huỳnh quang theo miền tần số hay phương pháp dịch
pha [4],[15].
Do sự điều biến của ánh sáng kích thích, bức xạ huỳnh quang phát ra cũng được
điều biến ở cùng tần số nhưng bị dịch đi một góc . Cường độ của nó được xác định bởi:
(2)
Ta có quy luật suy giảm huỳnh quang được xác định bởi biểu thức:
(3)
Thay (1),(2) vào (3) ta được:
1cos( ) sin( ) sin
dNB t A B t a b t
dt
Đồng nhất 2 vế của phương trình trên ta được hệ:
Giải hệ trên ta xác định được góc pha giữa ánh sáng kích thích và ánh sáng huỳnh
quang:
(5)
Đặt (6)
được gọi là hệ số điều biến, đặc trưng cho sự sai khác của bức xạ huỳnh quang so
với ánh sáng kích thích về cường độ và mức độ điều biến. Các hệ số được xác
định từ hình 14 [4].
Góc pha giữa bức xạ huỳnh quang và ánh sáng kích thích là do sự tồn tại của điện
tử ở các trạng thái kích thích trong một thời gian nhất định. Từ phổ so sánh ta sẽ xác định
được hệ số m theo công thức (6) từ đó suy ra góc pha chênh lệch nhờ công thức (5) rồi
tính được thời gian sống huỳnh quang và xác định được quy luật suy giảm
huỳnh quang của mẫu.
Hình 15. Sơ đồ khối hệ đo thời gian sống huỳnh quang theo phương pháp dịch pha
1.4.2 Kỹ thuật đo theo miền thời gian (Phương pháp xung)
Hình 16. Phương pháp đo suy giảm huỳnh quang theo miền thời gian [15]
Trong phương pháp đo theo miền thời gian, mẫu cần đo được kích thích bởi xung
ánh sáng và độ rộng xung kích thích càng nhỏ hơn thời gian suy giảm huỳnh quang của
mẫu thì càng tốt. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo thời gian I(t) sẽ được đo lại còn
thời gian suy giảm huỳnh quang sẽ được xác định thông qua đồ thị của hàm logI(t),
chính là thời điểm mà cường độ huỳnh quang giảm e lần so với cường độ huỳnh quang
tại thời điểm t = 0.
Các phép đo thời gian sống phát quang bị ảnh hưởng khá nhiều bởi độ rộng của
xung sáng kích thích. Bên cạnh đó do thời gian sống phát quang thường rất ngắn (có thể
đến femto giây) nên các đầu thu phải có độ khuếch đại hiệu dụng khá cao cùng với thời
gian đáp ứng đủ ngắn mà trong điều kiện thực tế hiện nay, các hệ đầu thu là hoàn toàn
chưa thỏa mãn được. Để khắc phục những khó khăn về mặt thiết bị này, người ta đã sử
dụng các nguồn sáng có độ lặp lại cao và các kỹ thuật đo chuyên biệt để chuyển một phép
đo thời gian sống phát quang nhanh về một phép đo chậm sao cho các hệ thiết bị điện tử
hiện có có thể đáp ứng được nhưng vẫn thu được các thông tin chính xác của phổ huỳnh
quang của mẫu.
Trong các phép đo theo miền thời gian, phổ suy giảm theo thời gian sẽ được khôi
phục lại thông qua một trong hai phương pháp: phương pháp lấy mẫu xung (pulse
sampling method) và phương pháp đếm photon (photon counting method).
1.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu xung
Kỹ thuật lấy mẫu xung (kỹ thuật Boxcar) là một kỹ thuật điện tử đã được phát triển
khá lâu. Kỹ thuật này sử dụng nguồn sáng phát xung có độ lặp lại cao và thực hiện phép
đo theo kiểu dịch cổng – lấy mẫu. Nguyên lý của kỹ thuật này là dùng một cổng thời gian
có độ rộng nhỏ so với xung cần đo nhằm mở mạch điện tử đo để lấy mẫu của tín hiệu cần
đo tại thời điểm đó, như vậy cho phép đo cường độ huỳnh quang trung bình tại những
thời điểm nhất định sau khi tắt xung kích thích rồi. Bằng cách dịch cổng này và lấy mẫu
theo thời gian của xung đo, toàn bộ phổ suy giảm huỳnh quang theo thời gian sẽ được
khôi phục lại. Như vậy kỹ thuật dịch cổng-lấy mẫu cho phép tách độ phân giải thời gian
của đầu thu độc lập với thời gian của xung tín hiệu. Độ phân giải thời gian của phép đo
phụ thuộc vào độ rộng của cổng thời gian và thời gian truyền xung tín hiệu trong đầu thu.
Sơ đồ nguyên lý của một hệ đo thời gian sống huỳnh quang theo phương pháp lấy mẫu
xung sử dụng nguồn sáng là một đèn LED được chỉ ra trong hình dưới đây [30].
Một mạch dao động (oscillator) được sử dụng để tạo ra các dao động điện, sau đó
các dao động này được gửi đồng thời đến máy phát xung cho LED và bộ tạo cổng trễ số
(Digital delay gate generator – DGG). Bộ tạo xung làm LED phát sáng và kích thích mẫu
phát ra ánh sáng huỳnh quang. Ở cùng thời điểm, xung đồng bộ với xung LED sẽ tác
động vào bộ tạo cổng trễ số DGG cho xuất hiện ở lối ra một cổng thời gian (time gate) trễ
một khoảng nhất định (delay) so với xung LED kích thích và một xung cao thế đồng bộ
với cổng thời gian.
Xung cao thế được đưa vào một mạch stripline. Mạch stripline làm nhiệm vụ cấp
nguồn nuôi cho các dynode bên trong ống nhân quang điện (photomultiplier tube –
PMT). Bởi vậy, chỉ khi có tác động của stripline (có xung cao thế gửi đến) thì ống nhân
quang điện mới hoạt động và tín hiệu huỳnh quang mới được ghi nhận. Do cấu tạo của
mạch, thời điểm PMT hoạt động, hay nói cách khác là thời điểm cường độ huỳnh quang
được đo là hoàn toàn xác định được. Giá trị đo được (tín hiệu tương tự) sẽ được chuyển
vào bộ chuyển đổi tương tự - số (analog to digital converter – ADC ). ADC ngoài chức
năng chuyển đổi còn thực hiện quét thời gian trễ dịch cổng theo toàn bộ xung huỳnh
quang. Tại mỗi điểm thời gian trễ, tín hiệu huỳnh quang được thu nhận và biến đổi thành
tín hiệu số lưu trong bộ nhớ của máy tính. Sau khi quá trình quét và lấy mẫu hoàn tất,
máy tính sẽ khôi phục lại toàn bộ dạng xung huỳnh quang theo thời gian [31].
Một lợi thế của kỹ thuật lấy mẫu xung là việc sử dụng xung LED có giá thành khá
rẻ và độ rộng của xung kích thích là hoàn toàn có thể thay đổi được do đó đáp ứng tốt cho
một số lượng lớn các chất huỳnh quang. Kết của cuối cùng có thể thu được khá nhanh do
việc xác định cường độ huỳnh quang một cách trực tiếp. Đặc biệt, với việc sử dụng phần
mềm điều khiển độ trễ ở lối ra của DGG, việc quét thời gian phi tuyến là hoàn toàn có thể
Hình 17. Sơ đồ khối hệ đo thời gian sống huỳnh quang bằng phương pháp lấy mẫu
xung [31].
áp dụng. Khi đó, phổ huỳnh quang suy giảm theo thời gian được biểu diễn dưới dạng
hàm logarith cho phép dễ dàng nghiên cứu đặc điểm huỳnh quang của mẫu. Trong trường
hợp bình thường, phổ huỳnh quang theo thang logarith sẽ là một đường đơn tuyến tính.
Nếu nó có dạng phức tạp thì khi đó hiện tượng huỳnh quang ghi nhận được thực chất là
bao gồm nhiều quá trình hồi phục của điện tử từ các trạng thái điện tử kích thích [31],
[38].
Hạn chế của phương pháp này là phạm vi ứng dụng của nó. Lấy mẫu xung chỉ thích
hợp trong trường hợp tín hiệu là nhanh và không yếu lắm. Với các tín hiệu vừa nhanh,
vừa yếu thì lại cần phải dùng đến các phương pháp khác như là đếm đơn photon trùng
hợp thời gian sẽ được trình bày sau đây.
1.4.2.2 Các phương pháp đếm photon
Khác với các phương pháp đo analog như phương pháp lấy mẫu xung, phương pháp
dịch pha… đếm photon không đo cường độ ánh sáng từ mẫu một cách trực tiếp mà thông
qua việc đếm số lượng photon theo thời gian các đặc trưng như cường độ, thời gian sống,
độ rộng xung… sẽ được xác định. Có 3 kỹ thuật đếm photon phổ biến là:
Đếm photon trạng thái dừng (Steady-State Photon Counting)
Đếm photon cổng (Gated Photon Counting)
Đếm đơn photon trùng hợp thời gian (Time-Correlated Single Photon
Counting)
Trong phần này chúng ta sẽ tìm hiểu về 2 phương pháp đếm photon trạng thái dừng
và phương pháp đếm photon cổng, phương pháp đếm đơn photon trùng hợp thời gian –
đối tượng chính của khóa luận – sẽ được trình bày riêng, chi tiết hơn ở phần tiếp theo.
a. Đếm photon trạng thái dừng
Đây là kỹ thuật đếm photon đơn giản nhất, hệ đếm photon trạng thái dừng chỉ gồm:
Đầu thu (Detector), bộ chọn ngưỡng (Discriminator) và bộ đếm (Counter). Người ta có
thể đặt trước lối vào của bộ chọn ngưỡng một bộ tiền khuếch đại (pre-amplifier) để có thể
thu được toàn bộ các xung tín hiệu [3],[4].
Hình 18. Đếm photon trạng thái dừng [3]
Trên hình 18 ta có thể thấy các xung đơn photon có cường độ dao động một cách
ngẫu nhiên do sự ảnh hưởng của cường độ xung kích thích và các nhiễu nền bao gồm
nhiễu khuếch đại và dòng tối trong detector, nhiễu từ ánh sáng nền của môi trường đo,
các nhiễu điện tử trong bộ khuếch đại. Bộ chọn ngưỡng có tác dụng tách các xung đơn
photon ra khỏi nhiễu nền bằng cách tạo ra một thế ngưỡng có thể điều chỉnh được. Thế
ngưỡng này được chọn sao cho nó lớn hơn nền nhiều nhưng lại nhỏ hơn biên độ cực đại
của xung đơn photon nhận được từ đầu thu. Khi một xung đơn photon đi qua được bộ
chọn ngưỡng, bộ chọn ngưỡng sẽ phát ra một xung xác định mức logic và khoảng thời
gian xảy ra. Xung ra từ bộ chọn ngưỡng sẽ được đếm bởi bộ đếm đặt phía sau . Phổ thu
được chính là hàm cường độ huỳnh quang theo bước sóng [3].
Mặc dù có thiết kế đơn giản và khả năng phân giải thời gian kém nhưng hệ đếm
photon trạng thái dừng có ưu điểm là khả năng triệt nhiễu nền, nhiễu khuếch đại của đầu
thu [3],[4].
b. Đếm photon cổng
Nhằm khắc phục những hạn chế của kỹ thuật đếm photon trạng thái dừng để tăng độ
phân giải thời gian của quá trình đếm photon, người ta thêm một cổng logic vào giữa bộ
chọn ngưỡng và bộ đếm [3].
Hình 19. Sơ đồ nguyên lý của phương pháp đếm photon cổng [3]
Bộ chọn ngưỡng tách các xung photon ra khỏi nền nhiễu, các xung ra từ bộ chọn
ngưỡng được gửi tới một cổng logic, chỉ những xung nào nằm trong xung cổng mới được
đếm. Xung cổng thường là các trigger ngoài tạo bởi photodiode nhận tín hiệu từ nguồn
laser kích thích. Thông thường bộ tạo xung cổng và bộ tạo trễ được dùng để điều khiển
độ rộng và độ trễ của các xung cổng. Các photon chỉ được đếm tại những khoảng thời
gian ngắn và xác định trong thời gian của xung cổng [3].
Hình 20. Sự kết hợp giữa gate và bộ đếm cấp 1, chỉ những xung photon có sườn nằm trong
xung gate mới được đếm [3].
Trong thực tế cổng sẽ kết hợp với bộ đếm cấp 1 trigger JK flip-flop, bộ trigger JK
flip-flop này sẽ thay đổi trạng thái của bộ đếm khi có xung trigger cổng tác động. Vì vậy
bộ đếm chỉ hoạt động khi xung đến nằm trong xung cổng, chính điều này đã tạo ra tính
chất nổi bật của đếm photon cổng: độ phân giải thời gian của đếm photon cổng tốt hơn
thời gian đáp ứng đơn photon của đầu thu [3].
Nhờ vào các mạch ECL (emitter coupled logic) độ rộng của các xung cổng có thể
ngắn tới 500 ps, khi đó kỹ thuật đếm photon cổng trở nên đặc biệt hữu dụng để đo cường
độ của các tín hiệu yếu nhưng có độ lặp lại cao trong một khoảng thời gian nhất định. Các
cổng logic còn có chức năng loại bỏ các nhiễu nền từ đầu thu trong những thời điểm
không có tín hiệu hoặc dùng để phân biệt các quá trình rất nhanh và rất chậm so với nhau,
ví dụ giữa tán xạ Raman và huỳnh quang, hoặc giữa huỳnh quang với lân quang [3],[4].
Hình 21. Sử dụng các cổng logic để loại bỏ nhiễu nền giữa 2 xung tín hiệu (trái), loại tín
hiệu huỳnh quang trong phép đo Raman (giữa) và loại tín hiệu Raman trong phép đo huỳnh
quang (phải) [3].
Các bộ chọn ngưỡng, bộ tạo xung cổng và bộ đếm có thể làm việc với tốc độ tới 1
GHz nên tốc độ của hệ đếm photon cổng theo lý thuyết là rất cao, tuy nhiên tốc độ này lại
bị giới hạn bởi đầu thu. Với các PMT tốc độ cao, tốc độ đếm có thể lên tới vài trăm MHz
[3].
Kỹ thuật đếm photon cổng không những được dùng để xác định cường độ mà cả
dạng phổ của tín hiệu lặp lại. Sau một số lớn các phép đo, dạng phổ của tín hiệu sẽ được
dựng lại bằng cách quét thời gian trễ của xung cổng.
Hình 22. Dựng lại dạng phổ của tín hiệu bằng cách quét cổng [3].
Kỹ thuật này về nguyên lý là tương đương với kỹ thuật lấy mẫu xung (Boxcar
technique) trong phương pháp đo analog. Tuy vậy, so với kỹ thuật Boxcar thì phương
pháp đếm photon cổng có độ phân giải thời gian, độ ổn đinh và tỷ số tín hiệu trên nhiễu
SNR cao hơn nhiều [3].
Hiệu suất đếm photon trong phép đo thời gian sống huỳnh quang về mặt lý thuyết
có thể đạt tới 100% bằng cách sử dụng hệ đếm photon cổng với kiến trúc đa cổng. Kỹ
thuật này đếm các xung photon trực tiếp từ các đầu thu tốc độ cao bằng cách sử dụng các
cổng và bộ đếm mắc song song với nhau [3],[4].
Mỗi cổng được điều khiển thông qua bộ tạo trễ và bộ tạo xung cổng riêng biệt. Nếu
đường cong suy giảm huỳnh quang nằm hoàn toàn trong các xung cổng liên tiếp thì toàn
bộ photon đến đầu thu trong một xung đều được đếm do đó hiệu suất đếm có thể đạt tới
gần 100%. Với các PMT thông dụng trong kỹ thuật đếm photon, tốc độ đếm có thể lên tới
100 MHz và trung bình vài chục MHz [3].
Hình 23. Kỹ thuật đếm photon cổng sử dụng nhiều cổng song song [3].
Kỹ thuật đếm photon đa cổng đã trở thành một kỹ thuật chuẩn để chụp ảnh thời gian
sống huỳnh quang FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) trong kính hiển vi quét laser
(laser scanning microscope) [3],[4].
Bảng dưới đây mô tả vắn tắt các phương pháp đo suy giảm huỳnh quang đã điểm
qua ở trên. Mỗi một phép đo sẽ thích hợp cho từng trường hợp tín hiệu có đặc điểm khác
nhau và các thiết bị được sử dụng cũng như cách bố trí hệ đo sẽ là khác nhau.
Bảng 2: Các phương pháp đo suy giảm huỳnh quang cơ bản
Kỹ thuật đo Đặc trưng của tín hiệu Nguồn sáng sử dụng
Tách sóng đồng bộYếu, lẫn nhiễu Liên tục
Đếm photonRất yếu
Xung, có tần số lặp lại
cao
Sử dụng photodiode và
dao động kýMạnh, nhanh cỡ ns Xung
Đo dịch phaKhông yếu lắm, không
nhanh lắm, cỡ nsLiên tục
Lấy mẫu xungKhông yếu, nhanh cỡ
ns-psXung ns, ps, fs
Đếm photon dịch cổngYếu, nhanh cỡ ns-ps Xung ngắn ps-fs
Đếm đơn photon trùng
hợp thời gianRất yếu, nhanh cỡ ns-ps
Xung ngắn ps-fs có tần
số lặp lại cao
c. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đếm photon
So với các phép đo theo chế độ đo analog, phương pháp đếm photon có những ưu
điểm đáng chú ý như sau:
Hình 24. Một xung đơn photon từ PMT R5900 (1ns/div) [4].
Đếm photon không bị ảnh hưởng bởi các nhiễu khuếch đại (amplitude jitter hay
gain noise ). Hình 24 mô tả một xung đơn photon với một lượng đáng kể xung nhiễu
khuếch đại từ PMT R5900. Nhiễu khuếch đại là hệ quả từ các quá trình khuếch đại ngẫu
nhiên trong PMT và nhiễu này có mặt trong mọi detector có độ khuếch đại cao. Ở chế độ
đo analog, nhiễu khuếch đại là không thể loại bỏ và có đóng góp vào nhiễu tổng của phép
đo, trong khi đó đếm photon không bị ảnh hưởng bởi các nhiễu điện tử, nhiễu khuếch đại
chừng nào cường độ của xung nhiễu còn nhỏ hơn xung ánh sáng và ngưỡng dưới của bộ
chọn ngưỡng (Lower Level Discriminator) hoặc cao hơn xung photon và ngưỡng trên của
bộ chọn ngưỡng (Upper Level Discriminator) [4],[26]. Do đó đếm photon có tỷ lệ tín
hiệu trên nhiễu SNR cao hơn nhiều so với chế độ đo analog [3],[4],[25].
Hệ thống đếm photon có độ ổn định cao hơn. Phần lớn các PMT đều cần hoạt động
ở điện thế cao, một sự thay đổi nhỏ trong điện thế cung cấp cho PMT không ảnh hưởng
đến kết quả đo của hệ đếm photon nhưng lại ảnh hưởng tới các hệ đo theo chế độ analog
bởi nó gây ra sự thay đổi cường độ xung tín hiệu [25].
Đếm photon không bị ảnh hưởng bởi hằng số thời gian RC – vốn có mặt trong mọi
hệ thống điện tử tương tự có chứa điện trở và tụ điện. Các hệ thống điện tử tương tự dựa
vào hằng số thời gian RC để giảm nhiễu nhưng điều này lại làm giảm độ chính xác của
phép đo. Một mạch RC chỉ phóng 67% điện lượng của nó trong 1 chu kỳ bằng hằng số
thời gian, nghĩa là sau một chu kỳ bằng hằng số thời gian vẫn còn 33% tín hiệu được
chứa trong mạch, do đó làm giảm độ chính xác của phép đo [4],[25].
Độ chính xác của đếm photon cao hơn các hệ đo analog, khả năng phát hiện photon
của hệ đếm photon dựa trên PMT hoặc dải truyền qua của bộ khuếch đại đầu tiên có thể
lên tới 3-4 triệu lần đếm /s. Trong khi đó khả năng đáp ứng của hệ đo analog thường dựa
vào phạm vi hoạt động của ADC, nhưng một ADC 12-bit cũng chỉ có thể tạo ra
mức điện áp khác nhau. Với hệ đếm photon con số này là từ 0–3 triệu, nghĩa
là những thay đổi nhỏ của tín hiệu quang sẽ được phân giải rõ ràng hơn [25].
Một tính chất đặc trưng chỉ có ở các hệ đếm photon là khả năng xác định chính xác
thời gian tới của xung ánh sáng. Băng thông của hệ thống đếm photon chỉ phụ thuộc vào
khoảng thời gian truyền của xung tín hiệu trong detector và khoảng thời gian này thường
nhỏ hơn độ rộng của xung đơn photon. Với cùng một detector thì các hệ thống đếm
photon có độ phân giải thời gian tốt hơn bất kỳ một hệ đo analog nào [4].
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm như đã nêu trên nhưng phương pháp đếm photon vẫn
có những nhược điểm thuộc về bản chất như không đo được ánh sáng với cường độ cao,
các thiết bị trong hệ đếm photon thường phức tạp đắt tiền, vận hành khó hơn các hệ đo
analog. Ngược lại các hệ đo analog lại có khả năng làm việc với ánh sáng cường độ cao
cùng các thiết bị rẻ tiền dễ chế tạo [25]. Do đó tùy điều kiện, mục đích thí nghiệm và đối
tượng thí nghiệm mà người ta lựa chọn phương pháp thích hợp. Với đối tượng thí nghiệm
là các mẫu phát quang với cường độ yếu và nhanh như huỳnh quang femto, nghiên cứu
về quang phổ Raman… thì đếm photon cho kết quả chính xác và đầy đủ nhất [3],[4].
1.5 Phương pháp đếm đơn photon trùng hợp thời gian
1.5.1 Nguyên lý cơ bản của phương pháp đếm đơn photon trùng hợp thời gian
Bình thường các mẫu sau khi được kích thích thì dạng phổ huỳnh quang theo thời
gian của nó hoàn toàn có thể quan sát được trên dao động ký, tuy nhiên trong trường hợp
tín hiệu quá nhanh và yếu thì vấn đề lại hoàn toàn khác.
Hình 25. Tín hiệu huỳnh quang thu được trên dao động ký khi kích thích mẫu với nguồn
sáng có độ lặp lại cao 80 MHz.
a. Chuỗi xung kích thích với tần số lặp lại 80 MHz.
b. Phổ huỳnh quang theo lý thuyết.
c. Phổ thu được thực tế trên màn hình dao động ký.
Có thể thấy rằng dạng phổ thu được trên dao động ký hoàn toàn khác với lý thuyết,
nó chỉ bao gồm các xung phân bố một cách ngẫu nhiên theo thời gian.
Phương pháp đếm đơn photon trùng hợp thời gian được phát triển lần đầu tiên vào
những năm 1970 nhằm đo suy giảm huỳnh quang của các chất (từ 10 ps đến ms) [3],[4],
[15],[24]. Kể từ đó đến nay phương pháp này đã có sự phát triển vượt bậc trong việc hoàn
thiện các thiết bị đo trong hệ đo TCSPC nhằm ứng dụng trong các phép đo phức tạp với
tín hiệu rất nhanh, rất yếu và có độ lặp lại cao, nhưng các nguyên lý cơ bản của phương
pháp đếm đơn photon trùng hợp thời gian nói chung vẫn không thay đổi.
TCSPC hoạt động trên cơ sở phát hiện đơn photon trong từng chu kỳ tín hiệu của
ánh sáng kích thích, đo thời gian phát hiện photon và dựng lại dạng xung từ các tín hiệu
đo trong các khoảng thời gian độc lập với nhau [3],[4],[15]. Điều kiện cơ bản của phép
đo TCSPC là tín hiệu mẫu phải rất nhanh, có độ lặp lại cao và đủ yếu sao cho mỗi chu kỳ
của tín hiệu không có nhiều hơn 1 photon được phát hiện. Dựa trên khả năng đáp ứng của
các thiết bị trong hệ TCSPC hiện nay thì mức phát hiện tối ưu cần đạt là 1 photon trên
100 xung kích thích [15].
Hình 26 mô tả nguyên lý chung của một hệ đo TCSPC, trong mỗi chu kỳ tín hiệu
chỉ có 1 xung đơn photon được phân bố một cách ngẫu nhiên, có nhiều chu kỳ tín hiệu
thậm chí còn không có xung photon nào. Khi một photon được phát hiện thì thời gian
tương ứng khi phát hiện đơn photon trong chu kỳ tín hiệu sẽ được đo lại. Sự kiện này sẽ
được ghi trong bộ nhớ có địa chỉ tương ứng với thời gian phát hiện photon, các photon
trong các chu kỳ tín hiệu khác nhau nhưng nếu có cùng thời gian phát hiện thì được xếp
vào cùng một kênh thời gian theo cơ chế cộng dồn.
Hình 26. Nguyên lý của phương pháp đếm photon trùng hợp thời gian [3].
Sau rất nhiều chu kỳ tín hiệu xung huỳnh quang sẽ được tổng hợp xây dựng lại
trong bộ nhớ và hiển thị ra màn hình [3],[4],[15]. Trong trường hợp đếm tốc độ cao thì
các kênh thời gian cũng phải được điều chỉnh ngắn hơn để thỏa mãn điều kiện mỗi chu
kỳ tín hiệu chỉ phát hiện được không quá 1 một photon [15]. Với nguyên lý như vậy mà
kỹ thuật TCSPC có khả năng ghi nhận những tín hiệu ánh sáng rất nhanh và rất yếu.
Để đáp ứng được nguyên lý hoạt động nói trên, các hệ TCSPC được trang bị những
công cụ hết sức đặc thù như bộ chọn ngưỡng phân phần không đổi CFD (Constant
Fraction Discriminator) và bộ biến đổi thời gian biên độ TAC (Time to Amplitude
Converter), bộ phân tích đa kênh MCA (Multichannel Analyzer)…
Hình 27. Sơ đồ khối của một hệ đếm đơn photon trùng hợp thời gian.
Đầu đo thường là các PMT cung cấp các xung đơn photon từ nguồn sáng có độ lặp
lại cao, tín hiệu đi vào bộ chọn ngưỡng bao gồm cả các nhiễu khuếch đại do quá trình
khuếch đại ngẫu nhiên trong đầu thu. Đối với các bộ chọn ngưỡng thông thường thì tín
hiệu vào sẽ được đi qua nếu sườn lên của tín hiệu vào đạt tới ngưỡng đã được đặt trước,
do đó thậm chí với các bộ chọn ngưỡng có tốc độ cao thì các xung nhiễu khuếch đại vẫn
có thể được cho qua nếu sườn lên của xung đó đạt tới ngưỡng được đặt trước của bộ chọn
ngưỡng. Để khắc phục điều này trong hệ TCSPC người ta sử dụng các bộ chọn ngưỡng
đặc biệt gọi là bộ chọn ngưỡng phân phần không đổi CFD với khả năng chọn được
ngưỡng theo cả thời gian và cường độ. Các xung ra từ CFD tạo thành các xung vào Start,
Stop cho bộ biến đổi thời gian cường độ TAC. Bộ biến đổi thời gian cường độ có nhiệm
vụ tạo ra một điện thế tỷ lệ với khoảng thời gian giữa 2 xung Start, Stop, chẳng hạn bằng
cách nạp và phóng điện trên tụ điện, điện thế cuối cùng trên tụ tỷ lệ với khoảng thời gian
giữa 2 xung Start, Stop. Bộ biến đổi thời gian cường độ TAC hoạt động dựa trên nguyên
lý trên với độ chính xác rất cao, có thể phân giải các khoảng thời gian cỡ ps một cách rất
rõ ràng. Tín hiệu từ TAC sẽ được chuyển tới bộ biến đổi tương tự-số ADC, các ADC
trong hệ TCSPC phải làm việc với độ chính xác rất cao vì phải phân giải hàng nghìn kênh
tín hiệu thời gian từ TAC với độ rộng kênh thời gian rất nhỏ [3],[4],[15]. Tín hiệu số từ
đầu ra của ADC tương đương với thời gian phát hiện đơn photon được đưa đến bộ xử lý
tín hiệu đa kênh MCA để thực hiện chức năng gán giá trị thời gian đo được vào bộ nhớ.
Quá trình này được lặp lại sau nhiều chu kỳ tín hiệu kích thích thì một biểu đồ biểu diễn
cường độ huỳnh quang theo thời gian sẽ được tổng hợp và hiển thị [3]. Chi tiết về cấu tạo
và nguyên lý hoạt động của các thiết bị trong hệ đo TCSPC sẽ được xem xét kỹ trong
chương 2.
Thoạt nhìn nguyên lý của phép đo TCSPC có vẻ phức tạp, nhưng nhờ thế mà
phương pháp này mới có được những đặc điểm mà không có một phương pháp đo quang
nào có được.