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Hygienemonitoring mit dem BAX®-Kit Listeria spp.

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Gliederung

Einleitung• Das BAX®-PCR System• Das PCR-Protokoll

Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA

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Die BAX®- PCR

BAX®-Kits

+

BAX® -System

4

BAX®-PCR- Testkits

Verfügbare Tests:

SalmonellaListeria monocytogenesListeria monocytogenes 24 hGenus ListeriaGenus Listeria 24 hCronobacter (Enterobacter) sakazakiiE. coli O157:H7 Hefen und SchimmelpilzeStaphylococcus aureus Real-Time

Campylobacter jejuni/coli/lari Real-Time

Genus Listeria Hygienemonitoring Reverse Transkriptase

Jedes Kit enthält 96 Tests:• PCR Reaktionsgefäße mit

alle PCR-Reagenzien• Protease und Lysis-Puffer

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Vorteile der BAX®-PCR

Einfache, unkomplizierte Durchführung

Wenige manuelle Arbeitsschritte (< 1 min/Probe)

Automatische Auswertung

Kürzere Analysezeiten

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Probenmaterial

Lebensmittel

Fleisch/Fisch

Schokolade

Aromen

Milch und Milchprodukte

Gewürze

Feinkost

Getreide

u. a. Lebensmittel

Sonstige Proben

Umgebungsproben

Futtermittel

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Gliederung

Einleitung• Das BAX®-PCR System• Das PCR-Protokoll

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BAX®- Protokoll (Kultur + PCR)

Probe PCRDetektion +

AnalyseZelllyseAnreicherung

2 Pipettierschritte

1. 2.

Lyophisierte Reagenzien

Keine DNA-Aufreinigung nötig

DNA-PolymerasePrimerNukleotideSupplementeFluoreszenzfarbstoff / SondeInterne PositivkontrolleKein Mastermix erforderlich sehr geringes Kontaminationsrisiko

• Komplett automatische Detektion und Analyse• Ja/Nein-Antwort zur Anwesenheit des Keims• Paralellanalyse Salmonella, E. coli, E. sakazakii, L. monocytogenes

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Anr

eich

erun

gA

usst

reic

hen

Bes

tätig

enProbe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser)

Bebrütung:18±2 h bei 37°C

0,1 ml Kultur in 10 ml RVS-Bouillon

24±3 h bei 41,5 °C

1 ml Kultur in 10 ml Mkttn-Bouillon

24±3 h bei 37°C

XLD-Medium +

festes Medium nach Wahl

24±3 h bei 37 °C

charakteristische Kolonien von jeder Platte auf Nähragar

24±3 h bei 37 °C

Bioch. Bestätigung 4– 24h Serologische Bestätigung

Interpretation der Ergebnisse

nach 3 bis 5 Tagen

Nachweis von Salmonellen DIN EN ISO 6579:2003 Horizontales Verfahren

10

Anr

eich

erun

gB

AX®

-PC

R

Ergebnisse

nach ~ 23 Stunden

Nachweis von Salmonellen aus Fleischproben mit der BAX® PCR:

Einfache Probenbearbeitung da keine DNA-Extraktion erforderlich ist

Probe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser)

Bebrütung: 18±2 h bei 37°C

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Anr

eich

erun

gA

usst

reic

hen

Bes

tätig

enProbe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser)

Bebrütung: 24±3 h bei 30°C

Ausstreichen auf Listerien-Agar nach Ottaviani und Agosti (Oxoid CM 1084)

und ein zweites festes Medium nach Wahl

Bebrütung 24 -48 h bei 37 °C

Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSYEA

18 - 24 h bei 37 °C

Nachweis von L. monocytogenes DIN EN ISO 11290-1:2005

0,1 ml der Kultur in 10 ml Fraser-Bouillon; Bebrütung: 24 - 48 h bei 35°C – 37°C

Bestätigungsreaktionen:Gramfärbung

KatalaseHämolyse

CAMP-TestRhamnose / Xylose

Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6

Tagen

12

Anr

eich

erun

gB

AX®

-PC

R

Ergebnisse

nach ~ 29 bis 41 Stunden

Nachweis von L. monocytogenes mit der BAX®-PCR:

Probe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser)

Bebrütung: 24±3 h bei 30°C

100 µl in 9,9 ml MOPS-BLEB; Bebrütung: 18 - 24 bei35°C – 37°C

Einstufige Anreicherung

Probe homogenisieren

(1:10 in LEB-Bouillon)Bebrütung: > 24 h bei 30°C

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BAX®-PCR Kits zum Nachweis von L. (monocytogenes)

½ Fraser

MOPS-Bleb

22h, 35 ºC

2,5 d

23 h, 30 ºC

2- stufige AnreicherungQB0610C (QB0609C)

LEB

24h, 37 ºC

1 - stufige AnreicherungQB8135C (QB8125C)

1,5 d

keine AnreicherungQB2912C

Probennahme

4 h, 30 ºC

8 h#QUA 18/05- 07/08

NEU

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Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Taxonomie

Umbenennung von Enterobacter sakazakii in eine neue GattungCronobacter spp. nov.

Die Gattung Cronobacter umfasst die fünf Arten:C. sakazakiiC. muytjensiiC. dublinensisC. turicensisCronobacter genomspecies 1

Von allen Arten geht eine Infektionsgefahr aus.

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Anr

eich

erun

gA

usst

reic

hen

Bes

tätig

enProbe homogenisieren (1:10 in Peptonwasser)

Bebrütung:18±2 h bei 37°C

Ausstreichen auf selektivem chromogenen Agar ESIA

(Alternative: DFI)

Bebrütung 24 ± 2 h bei 44°C

Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSA

48 ± 4 h bei 25 °C

Nachweis von Enterobacter sakazakii DIN ISO TS 22964:2006

0,1 ml der Kultur in 10 ml mLST / Vancomycin;

Bebrütung: 24 ±2 h bei 44°C

Bestätigungsreaktionen:gelbes Pigment

biochemische Charakterisierung(Microbact, RapID, API)

Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6

Tagen

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Anr

eich

erun

gB

AX®

-PC

R

Ergebnisse

nach ~ 28 Stunden

Nachweis von Enterobacter sakazakii mit der BAX® PCR

Probe homogenisieren (1:10 in mLST / Vancomycin)

Bebrütung: 20 – 22 bei 44°C

10 µl in 500 µl in BHI;

Bebrütung: 3 h bei 37°C

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ISO 6888:1 versus Bax-PCR Staphyloccous aureus

Feste Probe 1:10 verd.

2 Baird-Parker-Platten

24 +/- 2 h bei 35-37 ºC

2 x 0,1 ml

5 verdächtige Kolonien in BHI

Koloniezahl notieren

24 +/- 2 h bei 35-37 ºC

24 +/- 2 h bei 35-37 ºC

Koagulasetest: 0,1 ml + 0,3 ml Kaninchenplasma 4-6h, 35-37 ºC , wenn neg. weitere 24 h Inkubation

Ergebnis: bis zu 4 d

10 g Probe in 90 ml Giolitti-Cantoni

22-24 h, 37 ºC

< 24 h neg. und pos. Ergebnis

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Hefen und Schimmelpilze (ISO DIS 21527-1) versusBAX®-PCR

Probe 1:10 Peptonwasser

DRBC> 500 KbE/g

5 d bei 25ºC

Kolonienzählung

44 h, 25 ºC

5 h – 2,5 d pos. und neg. Ergebnis

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Internationale Zertifikate

AOAC International Official MethodSalmonella #2003.09; L. monocytogenes #2003.12

AOAC-RI Performance Tested MethodSalmonella #100201; L. monocytogenes #070202; L. spp #030502, 8 h Listeria030801; E. coli O157:H7 #10401, E. coli O157:H7 MP #050-501 Campylobacter lari/coli/jejuni # 40702; S. aureus # 120701

USDA-FSIS AdoptionSalmonella #MLG 4C.00; L. monocytogenes #MLG 8A.00, E. coli O157:H7 #MLG 5A.00

Health Canada CertificationSalmonella #MFLP-29; L. monocytogenes #MFLP-28, L. spp. #MFLP-15eE. coli O157:H7 #MFLP-30; Enterobacter sakazakii #MFLP-27

AFNOR CertificationSalmonella #QUA 18/3-11/02

NordVal CertificationSalmonella #2006-30-5408

Brazil MAPA Official Reference MethodSalmonella #MLG4C-01, L. monocytogenes #MLG 8A-01

Japanese Ministry of Health, Labour and WelfareListeria sp.; L. monocytogenes

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Gliederung

Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.

• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA

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Mögliche Kontaminationsquellen von Lebensmitteln

1. Kontaminierte Rohstoffe

2. Kontamination während der Verarbeitung

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Hygienemonitoring

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Die Gattung Listeria als Hygieneindikator

Ubiquitäre Verbreitung

L. seeligeri*L. welshimeri*L. monocytogenes*

L. grayiL. innocuaL. ivanovii*

* Bei Infektionen beim Menschen nachgewiesen

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Gliederung

Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.

• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität

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Reverse Transkriptase-PCR

RNA

DNA

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70 S Ribosomen der Bakterien

30 S Untereinheit21 Proteine +16S rRNA (~1540 bp)

50 S Untereinheit34 Proteine +5 S rRNA (120 bp)23 S rRNA (~2900 bp)

= Proteine (35%)= rRNA (65%)

rRNA bis zu 15% der Zelltrockenmasse

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Listeria sp.-Kit Hygienemonitoring

Normale PCR

Etliche tausend Ribosomen/Zelle

RT- PCR mit rRNA als Target

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Gliederung

Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.

• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität

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Schematische Darstellung des Protokolls

DuPont Qualicon Wipesterile

DuPont Q

ualicon Wipe

sterile

Vortexer

Agenz 1Agenz 2

Vortexen und 35 min bei 37°C inkubieren. Danachmit Verdünnunspuffer verdünnen, 30 µl Lysat zu

PCR-Gefäß geben und RT-PCR starten

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BAX®- Protokoll Hygienemonitoring Listeria sp.

Reverse Trans-kriptase-PCR

Detektion +AnalyseZelllyse“Stoffwechsel”Zelllyse

4 h, 30°C DNA-PolymerasePrimerNukleotideSupplementeFluoreszenzfarbstoff Kontroll-DNA+PrimerReverse Transkriptase

Ergebnis liegt nach 8 h vor

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Ergebnisdarstellung nach < 3 h

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Gliederung

Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.

• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität

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Inklusivität / Exklusivität

Inklusivität (58 Isolate der Gattung Listeria) = 100%

Exklusivität (52 Nicht-Listeria-Isolate) = 100%

L. seeligeriL. welshimeriL. monocytogenes

L. grayiL. innocuaL. ivanovii

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Sensitivität

0/44/44/40/44/44/4L. grayi subsp. grayi

KbE/ ml Puffer

4/44/44/44/44/44/4L. welshimeri

4/44/44/44/44/44/4L. seeligeri

4/44/44/44/44/44/4L. monocytogenes

4/44/44/44/44/44/4L. ivanovii

3/44/44/43/44/44/4L. innocua

0/44/44/40/44/44/4L. grayi subsp. murayi

100101102100101102Spezies

BAX® System ClassicBAX® System Q7

Nachweisgrenze = < 101 KbE / mL (~20 - 200 Zellen)

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USDA-FSIS- Methode zum Nachweis von Listeria spp. auf Oberflächen

~100 cm2

2 min

22 h, 30°C

100 µl zu 10 ml Fraser

48 h, 37°C

MOX (100µl)

48 h, 37°C

MicroID

225 ml UVM

Ergebnisse liegen erst nachbis zu 6 d vor

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Kulturmethode versus BAX®-RT-PCR (Edelstahl)

USDA/FSIS

BAX®-System Classic

BAX®-System Q7

Negativkontrolle

L. monocytogenes2 * 104 / 100 cm2

Negativkontrolle

L. ivanovii5,6*104 / 100 cm2

000005

142020202020

000005

52020202020

Ref. PosBest. PosBax Pos

Best.PosBAX pos.n

100 µl BHI-Suspension auf 100 cm2, 18-20 h bei RT getrocknet

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Zusammenfassung BAX®-RT-PCR-Kit Listeria spp. zum Hygienemonitoring

Das bewährt einfache Protokoll der BAX®-PCR ist nur geringfügig modifiziert

Detektion über Schmelzkurvenanalyse

Kein Anreicherungsschritt erforderlich

Inklusivität/Exklusivität = 100 %

Nachweisgrenze = 10 KbE/ ml

Ergebnisse liegen bereits nach 8 h vor

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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit