i geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 il verso di...
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I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32
Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch.
Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari.
Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007
Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane
Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig
Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo
Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte)
servono da segnale per i fattori ed enzimi per :
- i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico
- la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria
- interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri- con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno
Importanza della regolazione delle Ig
I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche
Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig)
Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione
Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc.
Altri sistemi correlati (snc, digerente …)
Chi dice al linfocita quale “switch” fare
E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i
linfociti che producono un certo tipo di Ig
Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig
Cosa si può chiedereA monte e a valle della trascrizione delle Ig
cosa c’è e quali metafunzioni svolge
Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due.
Per ora cerchiamo dei possibili esecutori
Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig
Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale”
L’organizzazione genomica
Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro
importanza relativa
Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti
Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore.2 americani ed 1 francese
Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo
Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle
regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1
Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR
vedi la figura della mappa del locus
strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane
telomero
Chromosome 14q32
enhancer 5’ 3 enhancers 3 enhancers
3 1 2 41 a2
geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *
V D J *
regione duplicata regione duplicatareg. variab.*
Strutture regolative della trascrizione
Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR)3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene VSequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (CH) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione
bibliografiaHenderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163,
Lippincott-Raven, PhiladelphiaStavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345
Chromosome 14
IgH3’EC-2SF AL928742 (40 kb)
H
2
B
HS3
B
U2 U4
U5
B
R3
H
HS1,2
E
R3r U5rU1
R1
U3 U6
U7
U8r
B
U6r
HS4
Ub1 U4-5
R3 U7r
Ub2
B H
R4U9
R5
Ub3
U10
R5
U11
U12
R6
SA2.5 A2R A2F
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA1
U14U13
Ub4
H
1
B
HS3
B
U2U4
U5
B
R3
H*
HS1,2
E
R3r U5r
U1R1
Ua1
R2
U3
U6 U7 U8
B
U6r
HS4
B H
Ua2
R4
Ua3
U9 Ua4
R5U10
U11
R5
U12
R6
U13
SA2.5 A2R
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA2
K10 retrovirus
ELK2
IgH3’EC-1H
U14
Ua5
A
B
Telomere 3 1 2 41 2
CHR77 (35.616 kb)X76785
Y14407AL928767
AL928765 U64453
Poly A site
Poly A site
Internal spacers
Conserved sequence Unit
Selective amplification of HS1,2-B downstream C2 (IgH3’EC-2)
H
2m
HS 3
B B H
HS 1,2
E B
SA2.5
A2R A2F
HS1,24420 bp
ALLELE 3BP3Frw
HS1,2
D3Rev
EcoRI
ALLELE 4B
Poly A site
HPoly A site
1m
B
HS 3
B B H* B
5402 bp
SA2.5 A2R
HS1,2HS 3
Selective amplification of HS1,2-A downstream C1 (IgH3’EC-1)
ALLELE 1AHS1,2
P3Frw D3Rev
EcoRI
ALLELE 2A
ALLELE 3A
ALLELE 4A
HS 1,2
A B
BE
Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp
Repeated element - 38 bpExternal element -17 bp
EcoRI
EcoRI EcoRI
EcoRI
Ua1
R1 R2
U1 U5
U4U2
U3 R3 rR3
U6 U7
U8 U1 R1
U2
Ub1
UU3 4
U5
U6
R3 R3U8 r
U4-5
U7r R3r
U6r U5r
Ub2
R4
14bp 16bp 20bp
Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)
Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)
ALLELE 1A17bp El. END HS1,2
CORE enhancer
17bp El. 38bp Rp
14bp Sp.
ALLELE 2A16bp Sp.
ALLELE 3A
ALLELE 4A
20bp Sp.
ALLELE 3B
31bp El
ALLELE 4B
Sites for : AP4; E47; MYOD; E5
Sites for : NF-kB (Q6)
Sites for : CMYB
M2M1
ALLELE 1
ALLELE 4ALLELE 3ALLELE 2
G A B G A B
CM11 CM 4 CM 5
G A B
100 bp
400 bp
200 bp
300 bp
A
B
LCR (nel topo 4 enhancers)
IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)
V D J
human chromosome 14 q 32
HS3 HS1,2 HS4 HS3 HS1,2 HS4
3 1 2 41 a2 telomere
copia 1 copia 2
mouse Ig heavy locus
HS3A HS1,2 HS3B HS4
L C R a b
Chromosome 14
cluster della catena pesante delle Ig
IgH3’EC-2
Telomere 3 1 2 41 2
SF AL928742 (40 kb)
CHR77 (35.616 kb)X76785
Y14407AL928767
AL928765 U64453
IgH3’EC-1
PLASMACELLULE
Cellule B proliferanti
Cellula B attivata (centroblasto)
IL-2; IL-4; IL-5;
IgG2a o IgG3
IgA o IgG2b
IgE o IgG1
IgM
IFN-
IL-4
TNF-
IL-2; IL-4; IL-5;
Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5;
Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-TNF-
Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)
Locus catena leggera
Locus catena leggera
Locus catena pesante
Cromosoma 22
Cromosoma 2
Cromosoma 14
LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig
ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE
CE
LL
UL
E B
VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana
Locus Catene pesanti
Locus Catene leggere
VDJriarrangiato
VJriarrangiato
VJriarrangiato
V-Jprocessing
VDJriarrangiato
V-DJprocessing
D-Jprocessing
VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana.
Lo splicing produce anche
IgD
Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.
CE
LL
UL
E B
Locus Catene pesanti
Locus Catene leggere
ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE
VJriarrangiato
VJriarrangiato
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
VJ riarrangiato Ipermutazioni
somatiche
PlasmacellulePlasmacelluleCellule MemoriaCellule B attivate
Centrociti
VDJ riarrangiato. Le catene prodotte in
forma di membrana
Switch isotipico a C, C o C. Ipermutazione
somatica
Switch isotipico. Ipermutazione
somatica. Catene pesanti prodotte in
forma di membrana
Switch isotipico. Catene pesanti
prodotte in forma secreta.
VDJ riarrangiato Catene prodotte in forma secreta.
Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.
VH DH JH CH
Ricombinazione V(D)J
V(D)J
Risultato dello switch Cricolo exciso
Ricombinazione class switching (CSR)
b a
V(D)J
IgM
IgE
2b
2a
Switch region:
• Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb
• Il filamento non stampo è ricco in G
• S, S ed S hanno un repeat di 5 bp. S ha un repeat di 49 bp.
Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.
A B C D FETrascrizione regione S
RNA editing ?
AID? AID?
AID?AID?
CSR ricombinasi?
Riconoscimento delle regioni S accessibili
Formazione di breaks al DNAA
B C D FE
AB C
AB C D FE
AB C
CSR ricombinasi?
Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili
Formazione di strutture secondarie (R loop?)
Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA
Riparazione dei breaks
SSS S c-myc
una regione Sdue regioni S Switch su un altro cromosoma
traslocazioneClass switching recombination
AAA B B E FC
Delezioni intra-switch
Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).
1 2
La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T)umorale (non dell’umore)
I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica.L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig).Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.
A che serve lo studio della struttura?
La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia.
La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema.
(aforismi)
Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico
I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti
Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme
Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali
Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 sub-telomerico) Mappa della catena pesante delle IG
Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante.
Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara.
V D J
cluster della catena pesante delle immunoglobuline
Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo
UOMO
3’5’
LCR-A LCR-
SacII
Eag I Eag I
NaeI
120 Kb 130 Kb180 KbVH j 23 1 2 41
Eag I
NaeI
Eag I
NaeI
MluI MluI350 kb
50 kb
LCR- LCR-B
b a 3’5’
TOPO
LCR
Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento
Confronti in silicio : omologie di strutturaricerca cloni EST
Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione)Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primatiConservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti)
I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione
Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.)
Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig
Studio della diversa funzionalita’
Studio di espressione dei markers della maturazione
Studio della induzione della maturazione e switch in vitro
Finalita’Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig
La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico
Le attivita’ coinvolte in questo modello sono:a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia)b) la proliferazione cellulare (linfomi)c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e
malattie autoimmuni)
Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????