Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova

Dipartimento di Medicina - DIMED

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CORSO DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE CLINICHE E SPERIMENTALI

CURRICULUM: SCIENZE EMATOLOGICHE E GERIATRICHE

CICLO XXX

I LINFOCITI TREG E TH17 NEI PAZIENTI CON ORTICARIACRONICA SPONTANEA

Coordinatore: Ch.mo Prof. Paolo Angeli

Supervisore: Ch.mo Prof. Sandro Giannini

Dottorando : Dr. Riccardo Senter

Indice

Riassunto……….………………………………………………………………………………3

Introduzione……..…………………………………………………………………………......4

Orticaria ed angioedema………..…………………………………………………………4

o Inquadramento nosologico…………………...……………………………………4

o Classificazione……………………………………………………………………...5

Orticaria cronica spontanea…….…………………………………………………………7

o Ipotesi autoimmunitaria………………………………………………………...…7

o Ipotesi alternative…………….…………………………………………………...13

Il sistema del complemento………………………….…………………...13

La cascata della coagulazione……………………………………………14

IgE autoreattive…………………………………………………………..14

o Omalizumab………………………………………………………………………15

Orticaria cronica spontanea e linfociti Treg/TH17……………………………………..17

Scopo dello studio….…...…..……………………………………………………………….22

Materiali e metodi...………………………………….……………………………………...23

Casistica……………………………………………………………………………………23

Test cutaneo con siero autologo..…………………………………………………………23

Preparazione delle sospensioni cellulari a partire dal sangue periferico……………....25

Analisi citofluorimetrica…………………………………………………………………..25

Analisi statistica dei dati…....……………………………………………………………..27

Risultati.…………...…………………………………………………………………………..28

Discussione e conclusioni..…...…………………………………………………………….35

Bibliografia…...……………………………………………………………………………….39

3

Riassunto

Introduzione : la reattività cutanea nei riguardi del siero autologo (SA) e la

presenza di anticorpi anti - IgE ed anti -recettore per le IgE che

caratterizzano alcuni pazienti con orticaria cronica spontanea (CSU)

hanno suggerito una patogenesi au toimmunitaria della malattia, ma

l’effettivo meccanismo causale resta oscuro. E’ comunque noto che i mastocit i

rivestono un ruolo fondamentale nella patogenesi , e recenti lavori

suggeriscono un loro probabile ruolo di polarizzazione dei linfociti T helper

in senso TH1 e TH17.

Scopo dello studio : valutare l ’andamento di Treg e TH17 nei pazienti con

CSU rispetto a controlli sani nelle diverse fasi cliniche e in relazione alla

reattività cutanea nei confronti del siero autologo .

Metodi : l’espressione degli antigeni di superficie e intracitoplasmatici di

Treg e TH17 sulle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dei

pazienti con CSU e dei controlli è stata valutata mediante citometria a flusso.

Per identificare i Treg sono stati uti lizzati anticorpi monoclonali (AcM)

rivolt i verso CD4, CD25 e il fat tore di trascrizione Forkhead box P3

(FOXP3), mentre per identificare i TH17 sono stati uti lizzati AcM rivolti

verso CD4, i l recettore per l’Interleuchina 23 (IL23R) e l ’ Interleuchina 17

(IL17).

Risultati : non sono emerse differenze significative tra i due gruppi per

quanto riguarda il numero di linfociti Treg circolanti, la loro espressione di

FOXP3 e il rapporto Treg/TH17. Per quanto riguarda i TH17 non sono emerse

differenze significative nei gruppi cellulari analizzati (IL23R+CD4+,

IL23R+CD4+IL17+, IL17+CD4+), ma abbiamo osservato un rilevante aumento

della percentuale di cellule IL17+CD4+ nei pazienti affetti da CSU rispetto ai

controlli , con una significativa correlazione tra % di cellule IL17+CD4+ e

grado di severità di malattia calcolata con l’Urticaria Activity Score (UAS).

Conclusioni : L’aumento di cellule IL17+CD4+ correla con il grado di

attività di malattia e suggerisce un coinvolgimento dei TH17 nella

patogenesi della CSU.

4

Introduzione

1. Orticaria ed angioedema

1.1 Inquadramento nosologico

L’orticaria è una delle patologie cutanee più frequenti, interessando con

almeno un episodio nell’arco della vita circa il 25% della popolazione

generale . 1 Consiste nella comparsa di pomfi, ovvero lesioni eritematose

ri levate di dimensioni variabili, intensamente pruriginose, che regrediscono

senza lasciare reliquati nell’arco di 24 ore. La sintomatologia è

determinata da vasodilatazione ed incremento della permeabilità vascolare

a livello degli strati più superficiali del derma; il medesimo fenomeno a

carico del derma profondo o del tessuto sottocutaneo determina invece una

lesione distinta, denominata angioedema, che può interessare anche le

mucose ed è costituita da rigonfiamenti molto più voluminosi e persistenti

dei pomfi, che provocano una sensazione di tensione e di dolore anziché di

prurito. 2 Le due condizioni possono presentarsi in maniera isolata o, più di

frequente, associate fra loro in modo variabile nel medesimo paziente; sono

generalmente indotte dal rilascio di istamina e d i altri mediatori derivati

prevalentemente dall’attivazione mastocitaria. 2

Esistono anche forme di orticaria e angioedema che costituiscono entità

nosologiche a sé stanti: 3 -5 tra esse le malatt ie auto-infiammatorie, la

mastocitosi , l ’orticaria vasculi tica e gli angioedemi bradichininergici , ovvero

mediati da un ’iperatt ivazione del sistema da contatto. Tali patologie, assai

più rare, sono legate storicamente all’orticaria “classica” per una certa

somiglianza delle manifestazioni cliniche , ma presentano meccanismi

patogenetici peculiari e ben dist inti

5

1.2 Classificazione

L’orticaria “ c l a s s i c a ” si dist ingue tradizionalmente in acuta e cronica; è

definita cronica quando presente quotidianamente per p iù di sei settimane.3 -5 La

classificazione è del tutto arbitraria, ma la suddivisione è importante: la

maggior parte delle forme acute è determinata da reazioni allergiche

(ipersensibilità immediata) o pseudoallergiche (non IgE mediate) nei confronti

di fattori scatenanti specifici quali farmaci o alimenti, che a volte possono

essere identificati grazie ad una chiara rel azione temporale (Tab.1); nei

quadri cronici al contrario le forme secondarie a determinati stimoli, dette

“inducibili” , sono una minoranza, e perlopiù scatenate da fattori fisici (Tab.1).

La maggioranza delle forme croniche viene pertanto definita “spontanea”

(CSU). In una frazione molto piccola di questi pazienti viene identificata

un’esposizione subcontinua a stimoli allergici o pseudo allergici, oppure la

presenza di patologie infiammatorie o neoplastiche, peraltro solitamente

caratterizzate da significativi sintomi concomitanti (Tab.1);5 negli altri pazienti

non viene identificato un vero e proprio fattore causale , anche se l’orticaria

può essere transitoriamente peggiorata dai farmaci antinfiammatori non

steroidei (FANS) e da vari al imenti .5 -15

Se da un lato ciò determina un acceso dibattito in merito alla reale patogenesi

dell’orticaria cronica spontanea,16 dall’altro contribuisce a rendere tale

condizione particolarmente frustrante per il paziente, con pesanti

ripercussioni su lavoro, studio e relazioni sociali , che frequentemente

sfociano in quadri cl inici di ansia o depressione conclamati .1 ,1 7 -1 9

6

Tabella 1: Classificazione dell’orticaria “classica” (modificata da Zuberbier et al)5

Orticaria Acuta:

Reazioni allergiche (ipersensibilità immediata di tipo I)

Reazioni pseudoallergiche (non IgE-mediate)

Infezioni

Orticaria Cronica:

Orticaria spontanea

- idiopatica

- infezioni (virus epatitici, H. Pylori, parassiti intestinali)

- neoplasie

- patologie autoimmunitarie

- reazioni allergiche e pseudoallergiche*

Orticaria inducibile*:

- “fisica”:

o dermografismo

o colinergica

o da freddo

o da caldo

o solare

o da pressione

o acquagenica

o angioedema vibratorio

- da contatto

*se persiste l ’esposizione allo stimolo scatenante

7

2. Orticaria cronica spontanea

2.1 Ipotesi autoimmunitaria

I pazienti con CSU non presentano caratterist iche cliniche ed

ematochimiche peculiari, salvo una maggiore prevalenza di autoantic orpi

anti -tiroide20 -2 5 ed una frequente refrattarietà alle terapie tradizionali

(antistaminici, steroidi a basso dosaggio) rispetto ad altre forme di

orticaria ad eziologia identificabile. 1 7 ,2 6 Non vi sono inoltre alterazioni

istopatologiche patognomoniche , ed il riscontro di una aumentata

concentrazione mastocitaria non è costante. 2 7 -2 9

L’infil trato infiammatorio è di t ipo linfo -monocitario cronico e comprende una

quota variabile di granulociti eosinofili e basofili in relazione alla fase della

malatt ia. Il pattern citochinico sembra essere di t ipo misto TH1 e TH2. 3 0 - 3 4

Un notevole impulso all’approfondimento dei meccanismi patogenetici

dell’orticaria cronica spontanea è giunto dal riscontro in que sti pazienti

di una reattività cutanea nei riguardi del siero autologo (SA): 3 5 l ’inoculazione

intradermica (i .d.) di siero autologo provoca infatti , in circa il 40% dei

pazienti affetti da CSU in fase attiva, la comparsa di un pomfo

cutaneo circondato da un alone eritematoso.3 5-3 8 La reazione si verifica quasi

esclusivamente nell’orticaria cronica e sembra essere strettamente

correlata all’andamento clinico della malattia. 35 ,3 6 ,3 8 ,39 Con la remissione

dei sintomi si osserva infatti una graduale perdita del la reattività cutanea

dei sieri prelevati in tale fase, mentre la risposta nei confronti del SA

raccolto durante il periodo sintomatico rimane positiva.3 5 La reattività

cutanea dei sieri è stata attribuita alla presenza di “histamine-releasing

factors” (HRF) solubili in grado di indurre l’attivazione e la degranulazione

dei mastociti cutanei , ma la natura di questi fattori rimane al momento

controversa; secondo le teorie attualmente prevalenti almeno una parte delle

orticarie croniche spontanee riconoscerebbe una patogenesi di t ipo

autoimmunitario. 6 ,4 0 -4 3

Diversi autori hanno infatti identificato nel siero di pazienti con CSU

autoanticorpi di classe IgG diretti contro le IgE o contro la cat ena del

recettore ad alta affinità per le IgE (FcRI),3 6 ,44 -4 7 un recettore di membrana

8

che lega con alta affinità le IgE circolanti e che nell’uomo è presente sia in

forma completa tetramerica 2 , sia in forma trimerica 2 . La parte

extracellulare della catena lega la catena pesante delle IgE, mentre le

catene e t rasducono il segnale e mediano l’at t ivazione cellulare.

Basofili e mastocit i esprimono la forma tetramerica del recettore, che

partecipa a lle reazioni allergiche IgE mediate di I t ipo inducendo il

ri lascio di istamina e di altre molecole pro-infiammatorie.

Anche gli eosinofili e le piastrine esprimerebbero in forma completa

l’Fc RI, mentre i fagocit i mononucleati , le cellule di Langherans e quelle

dendritiche possiedono solo la forma recettoriale 2 che, mancando della

catena , interverrebbe nella presentazione di alcuni antigeni o nella

clearance delle IgE circolanti s enza indurre una risposta cellulare

completa. 4 8 ,4 9

G l i anticorpi anti -IgE e anti -FcRI possono avere attività funzionale e

determinare l’attivazione in vitro di basofili e mastocit i di soggetti sani,

con un meccanismo che sembra c oinvolgere il sistema del

complemento. 3 7 ,4 6 ,47 ,5 0 -5 6 Perciò la capaci tà dei sieri di pazienti con CSU

di indurre il rilascio di istamina da basofili o d a m a s t o c i t i di soggetti

sani è considerato il test di scelta per documentare la presenza d i

autoanticorpi funzionali circolanti. Solitamente il test viene eseguito sui

basofili, più semplici da reperire rispetto ai mastociti , strutturalmente simili e

anch’essi coinvolti nella patogenesi della CSU, in quanto si ritrovano in gran

numero nei pomfi e contribuiscono alla produzione di mediatori

infiammatori . 5 7 Tale metodica si è ulteriormente sempli ficata negli ultimi anni,

quando al dosaggio dell’istamina si è affian cata la determinazione

citofluorimetrica dell’espressione di CD203 come marker di attivazione di

basofili e mastociti .5 8

Con l’intento di spiegare perché questi autoanticorpi non inducano le

manifestazioni tipiche dell’anafilassi, quali bro ncospasmo e ipotensione,

Fiebieger e collaboratori hanno suggerito che le IgG anti -FcRI siano in

realtà rivolte verso la forma solubile del recettore, che solo i mastociti cutanei

sarebbero in grado di rilasciare in vivo. Si formerebbero in tal modo

immunocomplessi a livello locale, e la degranulazione dei mastociti sarebbe

mediata da ll’attivazione in situ del complemento, ed in particolare

9

dall’anafilotossina C5a.5 0 Tale ipotesi tuttavia non è stata ulteriormente

indagata in studi successivi.

I fautori della “teoria autoimmunitar ia” t raggono ulteriore sostegno alle

loro tesi dalla prevalenza della CSU nel sesso femminile in età fertile, dalla

correlazione tra CSU e autoanticorpi tiroidei 2 0 -2 5 ,5 9 e dalla aumentata

frequenza di alcuni aplotipi HLA di classe II,6 0 condizioni che

indicherebbero una generica predisposizione di questi pazienti

all’autoimmunità.

Anche l’efficacia terapeutica di procedure quali la somministrazione di

immunoglobuline per via endovenosa,6 1 ,6 2 la plasmaferesi6 3 e l’impiego

di immunosoppressori come la ciclosporina A 6 4 -66 e la ciclofosfamide6 7

sembrerebbe rafforzare l’ipotesi di una patogenesi autoimmunitaria della

CSU, ma i risultati di questi studi si prestano in realtà a numerosi rilievi .

Per quanto concerne il trattamento con immunoglobuline per via sistemica,

esso riguarda pochi casi sporadici,6 1,6 2 , 6 8 e la supposta efficacia può essere

confusa facilmente con una remissione spontanea del tutto casuale, visto

l’andamento a volte intermittente della malattia. Anche i risultati conseguiti

con la plasmaferesi6 3 si riferiscono a casistiche molto limitate; inoltre, i

presidi impiegati per la plasmaferesi contengono abitualmente eparina. Tale

sostanza possiede, oltre che un’attività anticoagulante, anche proprietà

antinfiammatorie, che le derivano sia dalla capacità di interferire con

l 'att ivazione cellulare sia dalla capacità di legare molte proteine

plasmatiche, tra cui alcune frazioni del complemento. 6 9 -7 1 I benefici

temporanei indotti dalla plasmaferesi potrebbero dipendere, più che dalla

riduzione dei livelli di immunoglobuline patogene, proprio dalla rimozione

di HRF circolanti da parte dell’eparina, come suggeriscono alcune

osservazioni di Fagiolo e collaboratori : in alcuni pazienti con positività

cutanea nei confronti di siero autologo e di plasma autologo anticoagulato

con EDTA l’inoculazione i.d. di plasma eparinato non era in grado di

riprodurre la reazione pomfo-eritematosa; lo stesso accadeva dopo aggiunta

di eparina sodica al siero o dopo adsorbimento del siero su eparina legata a

sefarosio;3 8 l’incubazione dei sieri con eparina in fase solida non modificava

le concentrazioni di IgG presenti nei sieri. La risposta positiva di alcuni

pazienti alla somministrazione orale di sulodexide, una miscela di

10

frazioni epariniche e di dermatan -solfato pressoché priva di attività

anticoagula nte ma dotata come l’eparina di una forte carica negativa che

le consente di legare molecole cationiche, supporta indirettamente tale

ipotesi.72 Gli effetti degli immunosoppressori sul l’orticaria, infine,

potrebbero derivare più dalla loro attivi tà antinfiammatoria che dalla azione

immunosoppressiva. I trial clinici finora condotti hanno infatti evidenziato

come la presenza di anticorpi funzionali anti -FcRI non costituisca un

fattore predittivo essenziale per la risposta al trattamento con

ciclosporina.6 4 ,6 5

I dati più sostanziali a favore di una patogenesi immunitaria,

riguardanti la correlazione tra orticaria e presenza nei sieri dei pazienti di

autoanticorpi anti -IgE o anti -FcRI, si prestano a loro volta a numerosi

rilievi.

La discrepanza tra il numero complessivo di casi di CSU con un test

cutaneo positivo 3 5 -3 8 ,4 6 e quelli in cui è possibile dimostrare anticorpi

dotati di attività funzionale è notevole. 36 ,3 7 ,46 ,4 7 ,5 0 ,5 1 Hide et al, in

particolare, hanno riscontrato la presenza di anticorpi circolanti anti -

FcRI o anti -IgE attivi in vitro sui basofili rispettivamente nel 46% e nel

20% di 26 sieri selezionati in base alla loro capacità di indurre una reazione

pomfo -eritematosa in vivo.4 6 Niimi et al, in seguito, in una larga coorte

comprendente 163 casi di CSU hanno identificato 98 pazienti (60%) che

rispondevano positivamente all’inoculazione i.d. di siero autologo. Solo 38/98

sieri (39%), tuttavia, contenevano anticorpi anti -recettore dotati di attività

funzionale in vitro sui basofili o sui mastociti , mentre autoanticorpi

funzionali anti-IgE erano presenti in un numero ancora più esiguo di pazienti

(9/98). 3 7

Per superare tali incongruenze è stato proposto che il test cutaneo

con SA rappresenti più un marker d i “autoreattività” che una metodica

in grado di identif icare le forme autoimmunitarie di orticaria, e che solo

alcune sottoclassi di IgG anti -FcRIs iano in realtà funzionali in vitro e, di

conseguenza, verosimilmente anche in vivo.7 3 ,7 4 E’ tuttavia sorprendente

considerare al riguardo come non sia stato finora pubblicato alcun dato

in merito alla eventuale presenza e all’attività funzionale di anticorpi anti -

IgE o anti -FcRI nel siero di pazienti in fase di remissione clinica o

11

definitivamente guariti dall’orticaria, benché sia noto da lungo tempo che

in queste condizioni il test cutaneo diviene negativo. 3 5 Per quanto inoltre gli

aspetti istologici dell’orticaria cronica siano stati ripetutamente investigati ,

nessuno studio ha dimostrato a tutt’oggi i l deposito di IgG nei vasi

cutanei o nel derma dei pazienti affetti da orticaria cronica

sintomatica, e neppure nelle lesioni indotte dal siero autologo. 3 0 ,3 2 ,7 5 ,76 Infine,

Bossi e collaboratori hanno dimostrato che linee mastocitarie leucemiche

umane possono degranulare quando incubate con il siero di pazienti affetti

da CSU anche se non esprimono FcRI in quanti tà significativa .7 7

Le malattie autoimmuni croniche, del resto, una volta insorte tendono a

persistere per l’intera durata della vita, richiedendo una somministrazione

prolungata di farmaci sosti tutivi, antinfiammatori o immunosoppressori.

L’orticaria, al contrario, dopo periodi prolungati di attività caratterizzati da fasi

sintomatologiche altalenanti , va incontro nella maggior parte dei casi a

guarigione spontanea.

Altri due riscontri molto comuni nell’CSU non sono tipici delle malatt ie

autoimmunitarie. Innanzitutto l’aumento della permeabilità intestinale ed il

ruolo degli addit ivi alimentari nella progress ione delle forme croniche di

orticaria, tanto che una dieta priva per quanto possibile di additivi

alimentari influenza favorevolmente il decorso della malattia in una

percentuale significativa di casi. 7 -1 0 ,7 8 -8 3 In secondo luogo, ma ancora più

rilevante, la ben nota associazione fra orticaria cronica ed intolleranza

ai FANS. 1 1 ,1 2 ,1 5 ,16 Non solo questi farmaci tendono ad esacerbare la CSU,

ma una reazione avversa nei loro confronti può precedere, e forse favorire,

l’insorgenza dell’orticaria cronica.1 3 Le intolleranze ai FANS, tuttavia, anche

se non ancora completamente caratterizzate dal punto di vista

fisiopatologico, sembrano essere mediate da alterazioni enzimatiche in cui il

sistema immunitario non viene coinvolto. 1 2 ,1 4 Ed anche la segnalazione da parte

di Asero et al di una reattività verso il SA nei pazienti con intolleranza ai

FANS,8 4 di problematica interpretazione clinica, non è stata confermata

da altri autori . E’ stato anzi confutato che la reattività cutanea al SA

caratterizzi i pazienti con reazioni avverse ai FANS, dimostrando anche

che il siero prelevato in fase sintomatica durante test di provocazione posit ivo

con FANS non è in grado di indurre alcuna reazione pomfo -eri tematosa.85

12

Queste considerazioni, suffragate dai dati inere nti l’azione inibitoria

dell’eparina sulla reatt ività dei sieri e dalla dimostrazione che la deplezione

delle IgG dai sieri di pazienti con CSU ne modifica l’attività funzionale in

vitro ma non quella in vivo,3 8 ,8 6 suggeriscono che HRF di natura non -

immunoglobulinica possano essere presenti in pazienti diversi o anche in

uno stesso paziente. Il riscontro, da parte del gruppo di Stadler,8 7 ,8 8 di

anticorpi funzionali anti -recettore nel siero di soggetti sani solleva

ulteriori dubbi sul significato reale degli autoanticorpi anti -

FcRI nell’orticaria cronica spontanea, ove potrebbero esercitare un

ruolo patogenetico, rappresentare dei semplici “markers” di malattia o rivelarsi

addirit tura protettivi. Sono stati infatti identificati anticorpi anti -

FcRI che, fissandosi alla base del dominio extracellulare della catena

, impediscono la degranulazione dei basofili in vitro da parte di

anticorpi monoclonali anti -recettore normalmente in grado di indurre il

rilascio di istamina (F. Kricek, Novartis Vienna, comunicazione personale).

Un recente lavoro di Auyeung et al ha riportato in auge l’ipotesi

autoimmunitaria introducendo l’ipotesi di una ipersensibilità cellulo -mediata:

in circa il 50% dei pazienti con CSU sarebbero presenti linfociti T CD4+ in

grado di attivarsi in vitro se incubati con FcRI ricombinante. Le citochine da

essi prodotte richiamavano un fenotipo TH1, con elevate concentrazioni di

IFNγ.89 Nella stessa coorte di pazienti non è stata individuata alcuna

correlazione tra i pazienti portatori di tali linfociti autoreattivi e i pazienti

positivi per autoanticorpi circolanti anti FcRI e anti IgE. Il

coinvolgimento di un’ipersensibilità di t ipo cellulo-mediata nell’orticaria non

è supportato dal quadro clinico, che non suggerisce la presenza di

un’infiammazione locale cronica ; la discussione in merito ad una possibile

patogenesi autoimmunitaria della CSU rimane comunque aperta.

13

2.2 Ipotesi alternative

2.2a Il sistema del complemento

Nel l’ipotesi che fattori di natura non immunoglobulinica possano

effettivamente partecipare al l’eziopatogenesi della CSU attivando i

mastocit i o agendo direttamente sul microcircolo cutaneo,8 6 fra i vari

mediatori cellulari e umorali del processo infiammatorio90 apparirebbe

innanzitutto verosimile un coinvolgimento del complemento. Questo sistema

può infatti essere attivato da molteplici stimoli , sia immunologici (via

classica) che di origine diversa (vie alternativa e delle lectine leganti il

mannosio). Alcune sue frazioni, inoltre, sono in grado tanto di stimolare

fagociti , basofili e mastociti, quanto di contrarre la muscolatura liscia ed

aumentare la permeabilità vas ale legandosi a recettori specifici (C3a, C4a e

soprattutto C5a). 9 0 Proprio il C5a, come già sottolineato, sembra

rappresentare un cofattore indispensabile, se non addirittura l’effettore

terminale, dell’attivazione di basofili e mastociti i n vitro da parte dei sieri

di pazienti con CSU.4 7 ,50 ,51 Ed anche se lo scomplementamento dei sieri e

la deplezione di C5a preformato non ne modificano, pur interferendo con la

loro capacità funzionale in vitro, la reattività cutanea, 8 6 ,91 non si può

escludere che l’esecuzione del TC con SA comporti comunque, a prescindere

dai meccanismi, una generazione locale di C5a. Nell’orticaria cronica

spontanea non sono presenti differenze nella concentrazione plasmatica di

C3a, C5a, C5b-9 tra pazienti con CSU in fase attiva e controlli sani (dati

non pubblicati) . Ciò risulta tuttavia facilmente comprensibile poiché, se così

non fosse, l’orticaria sarebbe accompagnata da reazioni sistemiche eclatanti

specie a carico del distret to cardiovascolare. E’ in ogni caso possibile che

alterazioni modeste, anche transitorie e comunque non ancora investigate,

dell’insieme di proteasi e di proteine regolatorie circolanti che

controllano il sistema del complemento, possano determinare nella CSU una

labilità del sistema complementare non documentabile in vitro, ma tale da

contribuire alle manifestazioni pomfo-eri tematose tipiche dell’orticaria .

14

2.2b La cascata della coagulazione

Una serie di art icoli pubblicati da Asero et al. ha dimostrato l’attivazione

della cascata estrinseca della coagulazione nei pazienti con CSU,

evidenziando valori plasmatici elevati di Fattore VIIa, di frammento

prot rombinico 1+2 e di D-dimero, dovuti all’azione del Fattore tissutale

(FT). La cute orticarioide presenterebbe inoltre una reattività nei confronti

del FT non riscontrabile nei soggetti sani , e le concentrazioni di D-dimero e

di frammento protrombinico 1+2 correlerebbero con l’intensità

dell’orticaria. 9 1 -9 4 E’ plausibile che ciò sia privo di ri levanza patogenetica,

come suggerito da Kaplan e Greaves, 6 e che rifletta semplicemente una

attivazione endoteliale localizzata con rilascio di FT, attivazi one della

cascata estrinseca della coagulazione e successiva fibrinolisi,

analogamente a quanto riportato in pazienti con vascul i te sis temica e

sclerodermia; è stato comunque osservato che la trombina è potenzialmente

in grado di st imolare il mastocita interagendo con specif ic i recettori di

membrana9 1 ed i l suo ruolo di possibile amplificatore dei segnali pro-

infiammatori deve quindi essere tenuto in considerazione.

2.2c IgE autoreattive

Recentemente Maurer e collaboratori hanno identificato IgE rivolte verso la

tireoperossidasi tiroidea (antiTPO) in circa metà di un gruppo di pazienti con

CSU, ed hanno suggerito un meccanismo “auto -allergico”: i mastociti e i

basofili sarebbero st imolati da antigeni self . Data l ’accertata associazione tra

CSU e tiroidite di Hashimoto, gli antigeni tiroidei sono stati i primi ad essere

ricercati ed identificati ; comunque, qualsiasi tipo di antigene self potrebbe

essere virtualmente coinvolto, e ciò potrebbe spiegare lo scatenamento

dell’orticaria anche nei pazienti prive di IgE antiTPO. Tuttavia, IgE antiTPO

sono presenti in un numero considerevole di soggetti san i e l’effet tiva

capacità di questi anticorpi di indurre la degranulazione cellulare non è stata

indagata.9 5

15

Figura 1: Degranulazione mastocitaria indotta da vari st imoli . Fc RI:recettore ad alta affinità per le IgE. TPO: Tireoperossidasi. H1R: recettoredell’Istamina di tipo1

2.3 O ma l i z u ma b

L’introduzione di Omalizumab, un anticorpo di classe IgG monoclonale

umanizzato anti IgE, ha da qualche anno modificato l’approccio al problema

della patogenesi della CSU. Esso è in grado di formare compless i con le IgE

circolanti, favorendone quindi la rimozione dal circolo ; inoltre, fissandosi al

dominio che media il legame tra IgE e FcεRI, non provoca la degranulazione

di mastociti e basofili perché non interagisce con le IgE esposte sulla loro

membrana, in cui tale dominio non è accessibile. 9 6 Multipli trial

randomizzati controllati hanno dimostrato la sua efficacia nell’orticaria

cronica; 9 7 - 1 0 0 sebbene l’esatto meccanismo d’azione non sia ancora del tutto

chiaro, la positività del test al siero autologo o la presenza di anticorpi anti

IgE e anti FcεRIα non sembra condizionarne l’effetto in modo sostanziale . 9 6

16

Omalizumab era stato inizialmente sviluppato come trattamento dell’asma

allergico, patologia in cui tuttora rappresenta una valida opzione terapeutica .

In tale contesto, la dose del farmaco viene aggiustata in base al peso del

paziente ed alla concentrazione sierica delle IgE, con il proposito di

rimuovere dal circolo la maggior parte delle IgE rivolte verso gli

allergeni. 1 0 1 , 1 0 2

Sebbene la CSU non sia per definizione causata da una reazione allergica nei

confronti di un antigene esogeno, né la concentrazione delle IgE appaia

superiore a quella presente nella popolazione generale, 1 0 3 sicuramente

Omalizumab potrebbe rimuovere eventuali IgE autoreattive rivolte verso

antigeni self . Comunque, come segnalato in precedenza, tal i anticorpi sono

stati identificati solo in una parte dei pazi enti , e, soprattutto, la loro presenza

non è un fattore predittivo dell’efficacia del farmaco. 9 6

E’ noto inoltre che Omalizumab, sequestrando la maggior parte delle IgE

circolanti, riduce anche il numero delle IgE legate al FcRI sulla membrana

cellulare di mastociti e basofili; ne consegue una down-regulation del

recettore, che incrementa la soglia di attivazione e degranulazione della

cellula in risposta agli allergeni .1 0 4 Tale meccanismo, che contribuisce

all ’azione terapeut ica nell’asma, è stato osservato anche nel contesto della

CSU: la down-regulation di FcRI interessa sia i basofili sia, con maggiore

latenza, la cellule FcRI+ e IgE+ dermiche.1 0 5 , 1 0 6 Una ridotta espressione di

FcRI potrebbe ostacolare la degranulazione di basofili e mastociti sia di per

sé, sia riducendo i si ti di legame per eventuali anticorpi anti FcRI e anti IgE.

A supporto di questa teoria, la densità di espressione di FcRI sui basofil i

rappresenta un fattore preditt ivo di risposta ad Omalizumab.1 0 6

Diverse altre osservazioni sono però in contrasto con questa ipotesi: anzitutto

manca una chiara correlazione tra risposta clinica e riduzione

dell’esposizione di FcRI e IgE sulla membrana plasmatica;1 0 5 , 1 0 6 l a

presenza di anticorpi anti FcRI o IgE funzionali non rappresenta un fattore

preditt ivo di efficacia del farmaco , anzi i pazienti con posit ività di ASST e

HRA dei basofili tendono a rispondere più lentamente;9 6,1 0 7 l’iperespressione

di CD203c sui basofili, generalmente associata alla presenza di anticorpi anti

FcRI e IgE circolanti e funzionali, rappresenta un fattore predittivo negativo

di risposta ad Omalizumab;1 0 8 infine, alcuni dati mostrano che Omalizumab

17

potrebbe paradossalmente aumentare la suscettibil ità dei basofili

all’at tivazione da parte degli allergeni.1 09

In effetti una percentuale variabile ma cospicua ( circa il 50%) dei pazienti

risponde all’Omalizumab entro una settimana, prima di una significativa

down-regulation cellulare del FcRI, suggerendo che altri meccanismi

d’azione siano coinvolti .9 6 La ricerca in questo ambito è a ttualmente molto

attiva e non si può escludere la presenza in diversi pazienti di diversi

meccanismi patogenetici , che convergono sullo stesso fenotipo clinico.9 6 Va

inoltre considerata la possibilità che Omalizumab esplichi un effetto

modulatore a livello di altre cellule esprimenti FcRI o comunque

potenzialmente sensibili alla deplezione delle IgE libere circolanti , fra le

quali gli eosinofili e le cellule dendritiche. 9 6

3. Orticaria cronica spontanea e linfociti Treg/TH17

A prescindere dagli ipot etici meccanismi associati alla patogenesi

dell ’orticaria cronica spontanea fin qui citati , è nozione ampiamente

condivisa che i mastociti interpretino un ruolo da protagonisti nel mediare

le manifestazioni cl iniche dell’orticaria: sono presenti nelle lesioni pomfoidi ,

degranulano in risposta a svariati stimoli, liberano numerosi mediatori

preformati o n eoformati come istamina, leucotrieni , IL6, TNF, VEGF,

PAF ed altri 6 ,5 7 ,11 0 in grado di attivare l’endotelio ed indurre

vasodilatazione, incremento della permeabilità plasmatica, prurito ed

espressione di proteine di adesione endoteliale che mediano la diapedesi di

granulociti, linfociti ed altre cellule infiammatorie dal sangue al derma. 1 1 0

L’ impiego terapeutico di antistaminici e, quando non sufficienti, di steroidi ed

immunosopressori , conferma da un lato il coinvolgimento delle mast

cell, principale fonte di istamina, e dall’altro come spesso la CSU sia

caratterizzata da una spiccata componente flogistica. 6 3 -69 ,11 1 Oltre a rilasciare

un gran numero di mediatori, si è osservato che i mastocit i esercitano un effetto

immunomodulatore: i n topi infettati sperimentalmente da Leishmania major,

essi favoriscono la maturazione delle cellule dendritiche ed inducono la

proliferazione dei l infociti T helper naive stimolandoli a produrre citochine

18

tipiche delle popolazioni TH1 E TH17, quali IFNγ , IL17 e GM-CSF. La

capacità della mast cell di orientare la differenziazione linfocitaria è

stata confermata osservando come topi Kit W-sh / KitW-sh, pertanto con defici t

mastocitario, se infettati da L. major mostrino una ridotta produzione di

IFN e IL17, esprimano una risposta immunitaria di tipo prevalentemente

TH2 e siano meno resistenti al l’agente patogeno. 112 La potenzialità del

mastocita di modulare e polarizzare la riposta linfocitaria in senso TH1 e

TH17 ci ha portato a focalizzare l’attenzione sull’asse TH17/Treg, il cui ruolo

nella patogenesi di numerose patologie infiammatorie è stato da poco svelato .

Esistono del resto validi presupposti per ipotizzare un ruolo di queste cellule

nella patogenesi della CSU.

I linfociti TH17 rappresentano una sottopopolazione l infocitaria T helper

recentemente identificata113-115 e che nell’uomo deriva da cellule T helper

naive in risposta all’azione di un milieu citochinico di t ipo flogistico,

comprendente in particolare IL1β e IL6, in presenza di TGF L’espansione

e la sopravvivenza dei TH17 dipende invece da IL23. Dal punto di vista

fenotipico queste cellule sono caratterizzate da diversi marcato ri di

membrana quali CD45R0, CD161, il recettore IL23R e recettori per

chemochine fra cui CCR7, CXCR5, CCR4, CCR5, CXCR6 e CCR6. I TH17

sono inoltre contraddistinti dalla produzione del fattore di trascrizione ROR t

e dalla secrezione di interleuchine 17 (IL17A), IL17F, IL6, TNF e

IL22. Il loro ruolo è prevalentemente pro infiammatorio, essendo in

grado di reclutare granulociti neutrofili, di stimolare la produzione di

citochine coinvolte nella flogosi e di condizionare in tal senso il sistema

immunitario.1 1 8 -1 2 0 La risposta TH17 viene innescata da diversi patogeni,

tipicamente extracellulari, fra cui batteri (Propionibacterium a, Klebsiella p,

Streptococcus p) e miceti come Candida Albicans ,12 0 -1 2 4 nei confronti dei

quali questi linfociti costituiscono un fondamentale meccanismo di difesa.

Soggetti con deficit congenito di sviluppo della linea TH17 presentano

infezioni cutanee e polmonari recidivanti, nonché candido si muco cutanea

cronica, con un peculiare aumento di eosinofili ed IgE (Sindrome da IperIgE o

Sindrome di Giobbe).12 5

IL17 è la citochina che caratterizza l’attività pro-infiammatoria dei TH17: tra

le altre funzioni, att iva cellule epiteliali , stimola l’espressione di molecole

di ades ione e amplifica la risposta infiammatoria promuovendo la

19

produzione di IL6 e prostaglandina E2. 1 2 6 Il coinvolgimento dei TH17 è

stato documentato in numerose patologie autoimmuni tra cui a rtrite

reumatoide, LES, vasculi ti ANCA associate, dermatomiosite, sclerosi multipla,

rettocolite ulcerosa e morbo di Crohn.1 27 -1 31 Per quanto riguarda le

patologie allergiche, i livelli sierici di IL17 correlano con la severità clinica

della rinite moderata/severa,1 3 2 mentre nell’asma IL17 amplifica il quadro

infiammatorio specialmente reclutando neutrofil i nell’albero bronchiale. 1 3 3

I linfociti regolatori derivano anch’essi da precursori T helper naive in

presenza di TGF e IL2 e impediscono un’eccessiva attivazione del si stema

immunitario regolandone l’omeostasi e la tolleranza verso auto -antigeni,

contrastando di fatto gli effetti pro-infiammatori ed autoimmunitari di altri T

helper1 1 7 . Nel corso degli anni sono stati classificati in più sottogruppi,

differenziabili in base ad origine, funzione ed espressione di marcatori di

superficie e del fattore di trascrizione forkhead box P3 (FOXP3); tale

classificazione non può ancora considerarsi definitiva, stante la mole di nu ove

osservazioni che vengono continuamente pubblicate in quest’ambito , e sono

descritti significativi overlap tra i diversi gruppi. Si distinguono:134-136

- Le cellule TR1 (T regolatorie di tipo 1) , che vengono prodotte in periferia

e sopprimono la proliferazione delle cellule T specialmente attraverso la

produzione di IL-10; non hanno un marcatore cellulare unico .

- Le cellule TH3 (T helper 3), che originano in periferia, e secernono,

quale principale mediatore, TGFβ; anch’esse non hanno un marcatore

cellulare specifico.

- I linfociti T regolatori CD4 + CD25 + FOXP3 + (Treg), che rappresentano

il gruppo meglio caratterizzato. Essi possono essere a loro volta suddivisi in

due gruppi: Treg di derivazione timica (nTreg) e Treg indotti in periferia

(iTreg). Entrambe le popolazioni esprimono FOXP3 e sopprimono la

risposta immunitaria att raverso un duplice meccanismo di interazione

recettoriale e rilascio di fattori solubili quali TGFβ , IL10 e IL35.117 Le cellule

nTreg vengono prodotte nel t imo durante la linfopoiesi , mentre le iTeg si

sviluppano nei tessuti periferici per esposizione a TGFβ e IL2. 1 37 In v a r i e

malattie autoimmuni quali LES, sclerosi multipla, malattie infiammatorie

croniche inte stinali e diabete mellito tipo I è stata documentata una

alterazione nel numero e/o funzionalità delle cellule Treg, dovuta a

molteplici meccanismi: inadeguata espressione di molecole di superficie

20

con perdita dell’interazione cellulare diretta , deficit secretorio di TGF ,

IL10 e IL35, alterazione della composizione del milieu citochinico

locale.1 3 8 -140

Il rapporto tra Treg e TH17 non è ancora pienamente conosciuto. E’

probabile che lo shift differenziativo nell’uno o nell’altro senso dipenda

fortemente dal milieu citochinico del microambiente tissutale, dove, in

presenza di TGF una elevata concentrazione di ci tochine pro infiammatorie

come IL6, IL21, IL1e Fα promuove la differenziazione in senso TH17,

mentre una concentrazione di ci tochine pro -infiammatorie relativamente

bassa, in presenza di IL2, induce lo sviluppo del l in focita CD4+ naive in

senso Treg.1 1 7 , 1 3 9 ,1 4 0 Da un lato è evidente un meccanismo competitivo tra

i rispett ivi fattori trascrizionali RORt e FOXP3, dall’altro i due programmi

cellulari TH17 e Treg mostrano una notevole plasticità differenziativa.141

Lo sbilanciamento tra TH17 e Treg in favore dei primi determina , in

condizioni fisiologiche, una corretta risposta immunitaria a molte infezioni ;

quando è inappropriato provoca invece la perdita dell’omeos tasi immunitaria

e conduce allo sviluppo di patologie autoimmuni . 1 4 2

E’ di peculiare interesse in relazione all’orticaria lo studio di Chen et al,

che nel 2008 ha riscontrato una aumentata percentuale di cellule

CD4+CD25h i sul totale delle cellule CD4+ circolanti nel sangue

periferico di 19 soggetti affetti da CSU, indipendentemente dalla

reatt ività al siero autologo, rispetto ai controlli sani. Anche l’attività

regolatoria soppressiva delle cellule Treg su CD4+CD25- omologhi

differiva fra pazienti e c ontroll i: le cellule T regolatorie di questi ultimi

presentavano una normale attività soppressiva, mentre in una parte dei

pazienti l’attività regolatoria dei Treg risultava depressa. 1 4 3 Una successiva

analisi citofluorimetrica condotta da Sun et al su 36 pazienti affetti da CSU

è pervenuta a risultati opposti , evidenziando una significativa riduzione di

linfociti CD4+CD25+FOXP3+ nelle orticarie rispetto ai controlli sani . La

riduzione sembrava inoltre più marcata in 12 pazienti con autoanticorpi anti

Fc RI funzionali , documentati mediante immunoblot e HRA dei basofili.1 44

Entrambi gli studi erano l imitati dalla scarsa sintomaticità dei pazienti , che

non permetteva di studiare l’eventuale correlazione tra dato laboratorist ico e

gravità clinica.

21

Per quanto riguarda i TH17 nella CSU, i dati presenti in letteratura sono

piuttosto scarsi: Lopes e collaboratori hanno osservato una riduzione della

proporzione di cellule CD4+IL17+ sul totale delle cellule CD4+ circolanti

rispetto ai controlli sani, sempre peraltro prendendo in considerazione pazienti

poco sintomatici e senza verificare la presenza di una correlazione clinica;1 4 5

Moy e collaboratori hanno rilevato un aumento della percentuale dei TH17

nelle biopsie cutanee di un gruppo l imitato di pazienti , identificando come

TH17 le cellule esprimenti CD3 e i l fat tore di trascrizione relativamente

specifico STAT3.1 4 6 Più forti sono le evidenze che indicano un aumento della

concentrazione plasmatica di IL17 nei pazienti con CSU,147-149

in particolare nei

soggetti con test al plasma147

ed al siero148

autologo positivi. I linfociti dei

pazienti sembrano inoltre produrre più IL17 in risposta al mitogeno.150

Il

livello di IL17 nei pazienti con CSU si colloca nel contesto di un generale

aumento delle citochine infiammatorie, in particolare IL6 e TNFα,103

che sono

tra l’altro coinvolte nella differenziazione del linfocita T naive in senso

TH17.117,120

22

Scopo dello studio

Lo studio ha riguardato 15 pazienti con orticaria cronica spontanea ed un

gruppo di 9 controlli sani; scopo del lavoro è stato determinare la proporzione

di cellule Treg e TH17 circolanti rispetto al totale dei linfocit i CD4+ in tutt i

i soggett i , e quindi verificare:

- eventuali differenze tra pazienti e gruppo di controllo

- eventuali differenze tra pazienti con test cutaneo al siero autologo

posit ivo e negativo

- la correlazione con i l grado di severi tà della malattia nel gruppo dei

pazienti

23

Materiali e metodi

1. Casistica

15 casi (10 femmine, 5 maschi; età media: 49.3±17.1 DS) di CSU in

differenti fasi di attività della malattia sono stati reclutati in maniera

consecutiva tra i pazienti afferenti all’Ambulatorio di Allergologia ed

Immunologia della Clinica Medica 1 dell’Università degli studi di Padova

( Tab 2). L’orticaria è stata classificata come spontanea dopo avere escluso

la presenza di possibili fattori scatenanti di natura fisica, allergica o

pseudoalle rgica, nonché di altre patologie sottostanti . I pazienti erano in

trattamento continuativo con antistaminici associati o meno ad

antileucotrienici e/o steroide. Nessun paziente era in terapia con

immunosoppressori. L’intensità della sintomatologia è stata ca lcolata in base

al numero di pomfi e alla severità del prurito in accordo con l’Urticaria

Activity Score (UAS), strumento proposto dal le linee guida EAACI5 (Tab 3).

Tutti i pazienti avevano preliminarmente espresso il proprio consenso

informato allo studio.

Sono stati inoltre selezionati 9 controlli sani (3 femmine, 6 maschi; età

media: 32.75±8.56 DS) con anamnesi familiare e personale negativa per

orticaria fra il personale medico dell’ Azienda Ospedaliera - Università degli

studi di Padova.

2. Test cutaneo con siero autologo

Campioni di sangue venoso periferico prelevati a digiuno con aghi da 19

G in provette sterili sili conate (Becton-Dickinson, Marlan, Francia) sono

stati lasciat i coagulare per 30’ a temperatura ambiente (TA) e quindi

centrifugati per 15’ a 350g in centrifuga WCS 4236 (ALC, Milano, Italia).

Aliquote di 30 l di siero autologo sono state immediatamente inoculate per

via intradermica (i.d.) sulla superficie volare dell’avambraccio, impiegando

30 l di soluzione fisiologica (SF) i.d. come controllo negativo ed un prick

test standard con istamina come controllo positivo (Stallergenes, Milano).

L’assunzione d i antistaminici e di antileucotrienici era stata sospesa da

24

almeno 48 ore, quella di steroidi da almeno 7 giorni. Le risposte cutanee

sono state osservate nei 60’ seguenti l’esecuzione dei test, esprimendone

l’intensità come la media tra il diametro maggio re della reazione

pomfo-eri tematosa (D1) ed il diametro perpendicolare ad esso (D2),

secondo la formula D1 D2 / 2, e considerando come positive quelle di

diametro uguale o superiore al pomfo indotto dal prick test con istamina.

Reazioni di diametro 0,5 cm sono state comunque interpretate come

negative.

Paziente Sesso Età Clinica SA UAS1 M 53 U ND 42 F 47 U - 03 F 47 U - 24 M 34 U+AE - 55 F 73 U + 46 F 61 U + 47 F 28 U+AE + 48 M 31 U+AE - 69 F 61 U+AE - 210 F 77 U - 511 M 54 U+AE - 512 F 37 U+AE + 513 M 60 U - 214 F 17 U + 315 F 59 U - 4

Tabella 2: Caratteristiche dei pazienti. U orticaria, AE angioedema, SA testal siero autologo, UAS Urticaria Activity Score, ND non disponibile.

Score Pomfi Prurito

0 Nessuno Non presente

1 < 20 /24h Lieve

2 20-50/24h Moderato

3>50/24h o aree

di pomfi confluentiIntenso

Tabella 3: Urticaria Activity Score (UAS)

25

3. Preparazione delle sospensioni cellulari a partire dal sangue

periferico

I prelievi sono stati eseguiti contemporaneamente a quelli utilizzati per

l’esecuzione del test cutaneo con siero autologo , e pertanto nelle stesse

condizioni di wash out farmacologico. Le cellule mononucleate del sangue

periferico (PBMC) sono state ottenute da campioni di sangue fresco

eparinato mediante centrifugazione su gradiente di Ficoll/Hypaque TM (F/H,

GE Healthcare , Uppsala, Svezia).

Il sangue periferico è stato dapprima diluito in rapporto 1:3 con SF a

temperatura ambiente ed agitato delicatamente; in seguito è stato stratificato

lentamente sopra la soluzione di F/H. Si è proceduto ad una centrifugazione

a 900g per 20 minuti a 20 °C, senza freno. L’anello di cellule

mononucleate formatosi all’interfaccia F/H è stato aspirato e sottoposto a

due lavaggi successivi con SF mediante centrifugazione a 400g per 10

minuti a 20°C con freno; il pellet cellulare è stato risospeso in una quantità

adeguata di SF e le cellule sono state contate in camera di Burker,

utilizzando il liquido di Türk diluito 1:25.

4. Analisi citofluorimetrica

L’espressione degli antigeni di superficie e intracitoplasmatici su

PBM C dei pazienti con CSU e dei controlli è stata valutata mediante

citometria a flusso.

Sono stati util izzati i seguenti fluorocromi: Fluoresceina Isotiocianato (FITC),

Ficoeritrina (PE) e Ficoeritrina -Cianina5 (PE-Cy5), che vengono eccitati

alla lunghezza d’onda di 488 nm del laser ad Argon, ed Alloficocianina

(APC) che viene eccitata alla lunghezza d’onda di 633 nm dal laser RED

635. I rispettivi spettri di emissione sono: per FITC nel verde a

53030 nm, per PE nell’arancio a 57542 nm, per PE-Cy5 e APC nel rosso

profondo, rispettivamente a 670 nm e a 660 nm (Becton Dickinson Mountain

View, CA, USA).

26

L’analisi è stata condotta su aliquote pari a 0,5x106 cellule per ciascuna

marcatura di superficie ed a 2x106 cellule per ciascuna marcatura

intracitoplasmatica.

Discriminate le popolazioni cellulari che compongono il campione in

esame in base alle loro caratteristiche morfologiche (dimensione e

granulosità) mediante analisi contemporanea del Forward Scatter (FSC) e del

Side Scatter (SSC) e il relativo dot plot (diagramma a punt i), è stata scelta

come regione di anal isi ( gate) quella linfocitaria.

I dati sono stati generati mediante il software dedicato CellQuest®

(Becton Dickinson ), dopo standardizzazione di ciascun valore con il valore

del controllo isotipico ; abbiamo ricavato, per ogni paziente, il va lore

percentuale di cellule esprimente un determinato marcatore rispetto al totale

delle cellule, e l’intensità media di fluorescenza (MFI) di tale marcatore nelle

cellule considerate.

Per la caratterizzazione immunofenotipica è stato utilizzato un pannello di

Anticorpi monoclonali (AcM) coniugati con fluorocromi, comprendente anti-

CD4 (FITC e PE-Cy5), anti-CD25 (APC), anti-IL23R (FITC), anti-IL17 intra-

citoplasmatico (PE) e anti-FOXP3 intra-citoplasmatico (PE).

Per l’identificazione dei Treg è stato utilizzato lo Human Regulatory T Cell

Staining Kit (eBioscience), che prevede una pre-marcatura con AcM anti -

CD4 (FITC) e anti -CD25(APC) umani, la fissazione e permeabilizzazione

con il FOXP3-staining buffer e la successiva marcatura con anti -FOXP3

umano (PE) o controllo isotipico (PE).

Per l’identificazione dei TH17, dopo la marcatura di superficie con AcM

anti IL23R e anti CD4, le cellule sono state fissate con una soluzione

contenente formaldeide Fix and PERM (Medium A) per 10 mi nuti a

temperatura ambiente, successivamente lavate e permeabilizzate con Fix

and PERM (Medium B) e colorate con l’anticorpo anti IL17 PE o controllo

isotipico (PE) per 30 minuti in ghiaccio. Al termine i campioni sono stati

lisati con una soluzione a base di cloruro d’ammonio, centrifugati ,

risospesi in PBS e letti al citofluorimetro.

Come detto, le analisi sono state condotte su un gate morfologico

linfocitario; è stato poi utilizzato un gate immunologico per CD4 per quanto

riguarda i TH17 e un gate per CD4+CD25h i per quanto riguarda i Treg.

27

Lo studio delle cellule TH17 ha consentito di individuare tre

popolazioni cellulari: cellule CD4+IL23R+, cellule CD4+IL23R+IL17+ e

cellule CD4+IL17+. Ogni dato è stato prodotto sia come valore assoluto

che come percentuale dei linfociti CD4+.

L’analisi dei Treg ha invece considerato l’unica popolazione cellulare

CD4+CD25+FOXP3+ ed i dati sono stati prodotti come valore assoluto,

percentuale rispetto al totale dei CD4+ ed MFI di FOXP3.

5. Analisi statistica dei dati

I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard (DS); il confronto

tra i gruppi è stato effettuato ut ilizzando il test t di Student per dati non

appaiati o il test di Wilcoxon quando appropriato ; per lo studio delle

correlazioni lineari sono stati usati il test di Spearman o il test di Pearson

quando appropriato. Un valore di p<0.05 è stato considerato come

significat ivo.

28

Risultati

L’analisi sui linfociti T helper totali CD4 e CD8 non ha mostrato

differenze significative tra il gruppo dei pazienti affetti da CSU e il

gruppo di controllo (Media±DS %CD4: 39.47±9.52 vs 42.78±6.74, p=0.33;

Media±DS %CD8: 30.53±10.19 vs 31.33±6.02, p=0.81).

I dati immunofenotipici riguardanti l’espressione di Treg e TH17 nel

gruppo di pazienti affett i da CSU sono riportati rispettivamente in tabella 4 e

5:

Paziente %FOXP3+CD25+CD4+N.Assoluto

FOXP3+CD25+CD4+MFI

FOXP3UAS

1 3,44 10635 81,1 42 1,79 7442 39,42 03 1,36 4974 41,9 24 1,64 4922 137,26 55 ND ND ND 46 4,97 10636 78,75 47 2,6 9232 110,87 48 4,01 9750 58,55 69 1,81 4436 54,23 210 2,88 8760 107,05 511 1,88 4226 41,57 512 1,37 5416 25,25 513 2,39 6082 50,43 214 1,75 3930 39,56 315 2,56 6408 48,49 4

MEDIA 2,460714286 6918 65,32DS 1,06 2449,42 32,99

Tabella 4: analis i citofluorimetrica dell’espressione dei marcatori Treg. DS:Deviazione Standard, ND: non disponibile.

29

IL23R+CD4+ IL23R+CD4+IL17+ IL17+CD4+ UASPazienti % N.assoluto % N.assoluto % N.assoluto

1 1,65 6154 0,26 970 0,7 2590 42 1,52 5926 0,25 970 0,34 1342 03 3,96 13674 2,1 7250 18,89 65286 24 1,9 3716 1,08 2106 14,03 27486 55 3,39 10202 0,43 1304 0,75 2260 46 3,08 6616 2,16 4646 51,72 111160 47 2,27 7100 1,25 3902 19,26 60262 48 3,98 10528 2,48 6560 34,6 91474 69 2,59 5588 1,1 2370 5,08 10976 210 1,76 5164 1,3 3860 53,64 153020 511 4,26 9064 2,4 5096 31,52 67018 512 1,4 5932 0,79 3346 12,02 50772 513 4,91 8764 2,35 3938 4,58 7694 214 2,11 5338 0,93 2354 16,49 41800 315 1,67 3939 0,85 1992 33,72 78588 4

MEDIA 2,70 7180,33 1,32 3377,60 19,82 51448,53DS 1,15 2746,09 0,79 1927,26 17,68 44936,42

Tabella 5: analisi citofluorimetrica dell’espressione dei marcatori TH17.DS: Deviazione Standard.

Per quanto riguarda i linfociti Treg, l’analisi delle cellule

FOXP3+CD25+CD4+ circolanti non ha evidenziato differ enze statist icamente

significative tra gruppo di pazienti con CSU e controlli sani, né in

termini di p ercentuale né di numero assoluto (Media±DS

%FOXP3+CD25+CD4+: 2.46±1.06 vs 2.05±0.83, p=0.31; Media±DS

n.assoluto FOXP3+CD25+CD4+: 6918±2449.42 vs 5884±3018.13, p=0.4)

(Fig.2); anche il confronto dell’MFI di FOXP3 tra i due gruppi non

è risultato significativo (Media±DS 65.32±32.99 vs 54.7±22.97, p= 0.36).

(Fig.2).

30

Figura 2: Confronto della % di cellule FOXP3+CD25+CD4+ sul totale deiCD4+ (1) ed MFI di FOXP3(2) tra pazienti e controlli .(media±DS)

Anche il rapporto tra cellule FOXP3+CD25+CD4+ e ciascuna delle tre popolazioni

cellulari riferibili ai TH17 non si è dimostrato differente tra pazienti e

controlli (Fig.3):

1. % FOXP3+CD25+CD4+ / %IL23R+CD4+: 1 .05±0.51 vs 1 .13±0.99, p=0.82

2. % FOXP3+CD25+CD4+ / %IL23R+CD4+IL17+: 2 .91±3.36 vs 2.81±1.94, p=0.92

3. % FOXP3+CD25+CD4+ / %IL17+CD4+: 0.85±1.79 vs 0.44±0.81, p=0.16

Figura 3: Confronto del rapporto tra % di cellule FOXP3+CD25+CD4+ e,rispettivamente, % di cellule IL23R+CD4+ (1), IL23R+CD4+IL17+ (2) eIL17+CD4+ (3), sul totale dei CD4+, tra pazienti e controlli.(media±DS)

p= 0,31 p= 0,361 2

Pazienti Controlli Pazienti Controlli Pazienti Controlli

1. 2. 3.p= 0.82 p= 0.92 p= 0.16

31

Infine, non è stata evidenziata una correlazione significativa tra la percentuale

di cellule FOXP3+CD25+CD4+ e l’attività di malattia espressa come UAS

(p=0.10).

L’analisi citofluorimetrica dei linfociti TH17 ha identificato tre gruppi

cellulari distinti . (Tab.5) L’analisi delle cel lule IL23R+CD4+,

IL23R+CD4+IL7+ e IL17+CD4+ non ha dimostrato differenze significative

tra pazienti e controlli (Fig.4):

1. %IL23R+CD4+: 2.69±1.14 vs 2.60±1.16, p=0.85

2. %IL23R+CD4+IL17+: 1.31±0.78 vs 1.01±0.53, p=0.27

3. %IL17+CD4+: 19.82±17.67 vs 12.05±7.55, p=0.15

Figura 4: confronto della % di cellule IL23R+CD4+(1), IL23R+CD4+IL7+(2) eIL17+CD4+(3) sul totale dei CD4+ tra pazienti e controll i . (media±DS)

L’analis i eseguita sui linfociti IL17+CD4+ ha dimostrato un rilevante

aumento di questa popolazione cellulare nei pazienti rispetto ai controlli,

anche se non è stata raggiunta la significatività statistica (fig.4):

% di cellule IL17+CD4+: 19.82±17.67 vs 12.05±7.55, p=0.15.

Tale popolazione cellulare dimostra una grande variabilità numerica

all’interno del gruppo dei pazienti con CSU, particolarmente marcata

rispetto al gruppo di controllo (Fig.4), e tale variabili tà risulta fortemente

legata a l grado di malattia, con una correlazione statisticamente

significativa tra Urticaria Activity Score e percentuale di cellule

% I

L23

R+C

D4+

IL17

+

Pazienti Controlli

%IL

17+C

D4+

1. 2. 3.p= 0.85 p= 0.27 p= 0.15

32

%IL17+CD4+ ( r=0,52; p=0,023) (Fig.5). Le due popolazioni

IL23R+CD4+IL17+ e IL23R+CD4+ considerate singolarmente non mostrano

invece alcuna correlazione con i l grado di malatt ia (rispettivamente p=0,20 e

0,48) (Fig.5). Coerentemente, non è evidente alcuna correlaz ione tra le

popolazioni IL17+CD4+ e IL23R+CD4+ nei pazienti con CSU (p= 0,41)

(Fig5)

Figura 5: correlazione tra UAS e % di cellule IL17+CD4+(1) ,IL23R+CD4+IL7+(2) e IL23R+CD4+(3) sul totale dei CD4+ nei pazienti ;correlazione tra % di cellule IL17+CD4+ e cellule IL23R+CD4+ neipazienti(4).

p=0,023

r=0,52

p=0,2

p=0,48

1. 2.

3. 4.

p=0,2

33

Considerando tutte le cellule IL17+, ovvero unificando le popolazioni

IL17+CD4+ e IL23R+CD4+IL17+ in un’una sola (IL17+CD4+IL23R±) si

mantiene la correlazione con la gravità di malatt ia espressa con l ’UAS .

(Fig.6) Distinguendo poi, seppur arbitrariamente, tra pazienti con orticaria

grave (UAS≥4) e l ieve (UAS≤3) e confrontando tal i gruppi con la

popolazione di controllo appare evidente che le cellule IL17+CD4+ IL23R±

sono presenti in quantità superiore nei pazienti con orticaria grave, sebbene

la differenza sia al l imite della significatività statist ica. (Fig.6)

1. %IL17+CD4+ IL23R± UAS≥4: 26.50±19.54

2. %IL17+CD4+ IL23R± UAS≤3: 10.42±8.48

3. %IL17+CD4+ IL23R± Controlli : 13.07±7.48

Figura 6: correlazione tra % di cellule IL17+CD4+IL23R± sul totale deiCD4+ e UAS n e i pazienti (1); confronto tra % di cellule IL17+CD4+IL23R±sul totale dei CD4+ tra pazienti con orticari a grave (UAS≥4), l ieve (UAS≤3) econtrolli (2). (media±DS)

p=0,023

r=0,51

1. 2.

UAS≥4 UAS≤3 Controlli

p=0,04

p=0,06

p=0,57

34

Nessuna delle popolazioni cellulari studiate (FOXP3+CD25+CD4+,

IL23R+CD4+, IL23R+CD4+IL17+ e IL17+CD4+) è risultata

significativamente associata ad uno specifico esito del test con siero

autologo. (Fig.7)

Figura 7: confronto tra i pazienti con test al siero autologo (SA) posit ivo enegativo in merito alla % di cellule FOXP3+CD25+CD4+(1) , IL23R+CD4+(2) ,IL23R+CD4+IL17+(3) e IL17+CD4+(4) sul totale dei CD4+. (media±DS)

Nessuna correlazione è stata infine identificata tra le popolazioni cellulari

studiate e le altre caratteristiche demografiche e clinich e dei pazienti

considerate (età, sesso, presenza o meno di angioedema).

1. 2.

3. 4.

35

Discussione e conclusioni

Quando l’orticaria persiste per più di sei settimane viene definita cronica, e

nella grande maggioranza dei casi manca uno st imo lo scatenante

identificabile, per cui si parla di orticaria cronica spontanea (CSU).5 La

patogenesi di questa patologia non è ancora stata chiarita : la dimostrazione

della reattività cutanea nei riguardi del siero autologo ed il riscontro di

anticorpi circolanti anti -IgE ed anti -FcRI in grado di degranulare

mastociti e basofili in una significativa proporzione di pazienti hanno indotto

ad ipotizzare un meccanismo di t ipo autoimmunitario.6 Gli studi si sono

inoltre focalizzat i su altri possibil i fattori di at tivazione di mastociti e

basofil i , il cui ruolo centrale nella patogenes i è universalmente riconosciuto :

sistema del complemento,9 0 cascata della coagulazione,9 1 IgE rivolte verso

antigeni self .9 5 Più recentemente, l’efficacia di Omalizumab ha aperto un

nuovo fronte di ricerca, centrato da una parte sulle note azioni biologiche del

farmaco, ovvero il sequestro delle IgE circolanti e la down -regulation del

Fc RI sulla superficie di mastociti e basofili , e dall’altra sulle caratterist iche

dei pazienti che rispondono a tale terapia , in cui la presenza di autoanticorpi

funzionali anti-IgE ed anti -FcRIα non sembra determinante.96 Recenti dati

hanno dimostrato inoltre una potenziale funzione immunomodulatoria dei

mastociti, capaci di polarizzare la differenziazione di linfociti T naive in

senso TH1 e TH17.1 1 2

Dato che le popolazioni linfocitarie TH17 e Treg, tra loro strettamente

interconnesse, rappresentano sottoclassi T helper particolarmente importanti

nel controllare la reazione infiammatoria, tanto nella fisiologica risposta alle

infezioni che in molti fenomeni autoimmunitari , abbiamo deciso di

approfondire la relazione tra queste cellule e la CSU. 1 1 7 I dati presenti in

letteratura al riguardo sono frammentari e discordanti.

In quest’ot tica, il nostro studio ha confrontato mediante analisi

citofluorimetrica il livello di Treg e TH17 circolanti in 15 pazienti affetti

da CSU in fase sintomatica ed in 9 controlli sani, correlando i dati con il

grado di attività della malattia.

36

Per quanto riguarda i linfociti Treg, non sono emerse differenze tra

pazienti e controlli, né in termini percentuali , né di numero assoluto,

né confrontando l’intensità di espressione di FOXP3 (MFI). Anche i l

rapporto Treg/TH17 non è risultato differente tra pazienti e controll i , e non

è stata individuata alcuna correlazione tra Treg e UAS (Figg 2-3). Questi

dati sono in contrasto con i precedenti studi, che avevano mostrato in una

serie di pazienti1 4 3 un incremento delle cellule CD4+CD25 h i ed in un 'altra

serie1 4 4 una riduzione delle cellule CD4+CD25+FOXP3+. Comunque, a parte

la già segnalata scarsa rappresentatività dei pazienti considerati in tali studi,

dati contraddit tori riguardo la proporzione dei Treg circolanti sono emersi

anche in patologie autoimmuni come l’artrite reumatoide ,1 4 0 e non sono, ad

oggi , di facile interpretazione. Nel presente studio non è stata valutata

l’attività funzionale, che in alcune patologie autoimmuni è alterata a fronte di

un livello plasmatico simile a quella dei controlli sani.1 4 0 ,1 5 1

L’analisi dei linfociti TH17 non ha evidenziato differenze significative tra

pazienti con CSU e controll i in termini percentuali di cellule IL23R+CD4+,

IL23R+CD4+IL7+ e IL17+CD4+; tuttavia si è osservata una grande variabilità

delle cellule IL17+CD4+ nei pazienti rispetto al gruppo di controllo e il loro

livello correla significativamente con il grado di severi tà di malattia

(r=0,52; p=0,023) (Figg. 4-5). Al contrario, le cellule contraddistinte dal la

positività a IL23R, altro marker specifico dei TH17, non appaiono affatto

correlate con la gravità di malattia (Fig. 5), mentre la correlazione si mantiene

se si considerano insieme le due popolazioni IL17+ (IL23R+CD4+IL17+ e

IL17+CD4+: Fig.6). Il dato è rafforzato dal confronto tra pazienti con

orticaria l ieve (UAS≤3), pazienti con ort icaria grave (UAS≥4) e controll i ,

che mostra un netto aumento della popolazione IL17+CD4+IL23R± nei

pazienti con orticaria grave nei confronti delle al tre due popolazioni ,

sebbene ai l imiti della significatività statistica (Fig. 6).

Per spiegare questi dati , non privi di apparenti contraddizioni, si possono

formulare diverse ipotesi . Anzitutto, nonostante i l infocit i TH17 siano

considerati la principale fonte di IL17 nell’organismo umano1 5 2 e tale

citochina caratterizzi la loro funzione secretoria, va tenuto conto della loro

notevole plastici tà: essi sono in grado di riprogrammare la propria

espressione genica se esposti a diversi milieu citochinici . E’ descrit ta in

particolare la potenziale conversione dei TH17 verso un fenotipo Treg e

37

viceversa, fenomeno facil itato dall’analogia degli iniziali step di sviluppo tra

questi due sottotipi l in focitari , e che potrebbe essere importante per la

regolazione dell’ infiammazione dopo la clearance dello stimolo

flogistico;1 4 0 , 153 inoltre è stata osservata la conversione dei TH17 in cellule

TH1- l ike, IFNγ secernenti , quando sottoposte a specifici st imoli quale

un’alta concentrazione di IL12. Questo meccanismo pare essere implicato in

diverse patologie autoimmuni quali artrite reumatoide, malatt ie

infiammatorie croniche in testinali , sclerosi multipla. 1 5 4 -1 5 6 E’ stata descri tta

infine, sebbene in minor dettaglio , una l inea l infocitaria TH17/TH2,

coesprimente IL17 e IL4. 1 5 7 Risulta quindi possibile ipotizzare la pr esenza di

cellule con grado intermedio di differenziazione IL23R-IL17+, che tuttavia

nell’attuale studio non abbiamo caratterizzato ulteriormente.

Un’altra possibile spiegazione deriva dall’azione biologica di IL23, che

secondo la maggior parte degli autori non è di per sé indispensabile per

indirizzare la differenziazione a TH17, ma rappresenta piuttosto

un’importante fat tore di stabil izzazione ed espansione: i l infociti

IL17+CD4+IL23R- potrebbero rappresentare una popolazione TH17 giovane,

non ancora stabil izzata e in continuo rinnovamento. 1 5 8 Sebbene si trat ti di un

parallelismo puramente speculativo, tale andamento sarebbe coerente con i l

comportamento biologico dell’ort icaria, che si caratterizza per l’ intermittente

comparsa delle lesioni pomfoidi, che regrediscono completamente entro 24

ore per ricomparire in alt re sedi senza mai lasciare esiti permanenti a l ivello

cutaneo.

L’apparente aumento dei TH17 è coerente con la capacità dei mastocit i di

indirizzare i l infociti naive verso tale sottoclasse; 1 1 2 a supporto di ciò, nelle

lesioni ort icario idi è presente un’aumentata quanti tà di cellule CD3+

STAT3+ compatibil i con linfociti TH17.1 4 6 Si può quindi ipotizzare che tali

cellule attivate rappresentino da una parte l a conseguenza dell’att ivazione

mastocitaria, e dall’al tra un loro potenziale fattore di amplificaz ione: i TH17

infatti sono fonte di numerosi mediatori pro infiammatori , anzitutto IL17, ma

anche IL6 e TNFα , la cui concentrazione plasmatica è aumentata nella

CSU.1 0 3 I nostri dati sono in netto contrasto con quanto riportato da Lopes e

collaboratori , che ri levavano una significativa riduzione dei TH17 nei

pazienti con CSU; va però ribadito, come accennato prima, che la maggior

38

parte dei pazienti coinvolti in tale studio erano sostanzialmente asintomatici ,

e non era stata eseguita alcuna correlazione con la gra vità clinica.1 4 2

Il l ivello dei Treg e delle diverse popolazioni riferibil i ai TH17 non sembra

significativamente diverso tra pazienti posit ivi e negativi al test al siero

autologo (Fig. 7) . Le cellule IL17+CD4+IL23R± apparirebbero quindi

correlati al la gravità clinica, piuttosto che ad un’ipotetica specifica

eziologia, in particolare di natura autoimmune . Il campione di pazienti è però

estremamente limitato , con soltanto 5 soggett i con test al siero autologo

posit ivo, e non permette di suffragare alcuna co nclusione in merito.

In ogni caso, per quanto limitati dalla bassa numerosità campionaria, i

risultat i preliminari del nostro studio sembrano evidenziare una relazione tra

TH17 e Orticaria Cronica Spontanea, con particolare riferimento alla

correlazione fra severità dei sintomi e livelli di cellule IL17+CD4+ circolanti.

Se tale dato verrà confermato si potranno carat terizzare ulteriormente i

pazienti in relazione al la presenza di autoanticorpi anti -IgE od anti -FcεRI,

alla risposta terapeutica ad Omalizumab, a comorbidità autoimmunitarie

quali la tiroidite di Hashimoto e ad altri possibili fattori .

39

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