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PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL

Presentado por.

r I JARMIJO BARRAGAN MARIA CRISTINA

/Licenciatura: Biologla Experimental

, /bivisión: Ciencias Biologica y de la Salud

Unidad : lztapalapa

Matricula 92233979

Tel. particular : 569-03-32

Lugar de desarrollo: Universidad Autónoma Metropolitana lztapalapa Departamento de Biología de la Reproduccion laboratorio de Neuroendocrinologia. S -330 y S 336

Proyecto:

“EFECTOS DEL COUMESTROL DURANTE LA IMPLANTACIÓN EN LA RATA CEPA WISTAR” J

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Fecha de inicio : 27 DE NOVIEMBRE DE 1997

/Fecha de terminación .....__,,... 27 .DE MAYO DE ,1998 I ,, 1 . .

44J ’ ’- SE SOR (ES): M en C MARIO GARCIA LORENZANA M en C . Ma. del ROSARIO TARRAGÓ CASTELLANOS ’ ’ .

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EFECTOS DEL COUMESTROL DURANTE LA IMPLANTACION EN LA RATA CEPA WISTAR.

Objetivo general.

1 determinar el efecto que tiene el coumestrol durante el proceso de implantación en ratas cepa Wistar

'1.: Cuantificar por medio de la observación macroscópica del útero los sitios de implantaci6n visibles en cada animal 1.2 Análisis histológico de los tero os, determinación de los sitios de implantación a nivel microscópico 1 3 Ciiantificación de !os niveles hormonales de estrógenos y progesterona por radioinmunoanálisis para analizar el efecto del tratamiento con coumestrol

Durante cientos de años las plantas han sido utiiizadas como medicina, los egipcios y los

babiionios entre otros utilizaban a las plantas para el tratamiento de ciertas enfermedades y

dolencias (Baker,l993). Algunos filósofos como Hipócrates y Galeno asi como en algunos textos chinos e indios

se discute la importancia de las plantas para el tratamiento de ciertas enfermedades tales como la infertilidad (Pierre, 1978) incluso hay que serlalar que en la medicina primitiva ya eran empleadas determinadas olantas como hormonas sexuales! de hecho en algunas religiones orientales. ¡a granada era símbolo de fertilidad y amor, en Egipto los granos de polen de palmera eran usados para inducir la fertilidad en la mujer.(Jurado,l989)

Para el siglo XX con el descubrimiento de los antibióticos y otras drogas se da el primer paso para e! estudio de las plantas. En Australia se inicio el estudio de los fitoestrdgenos, los cc3les cor? zompuertos qsimicos ron actividad estrogenica presentes en diversas plantas entre ei!as se encuentran los forrajes Para los a h s 40's se iniciz e! estudio de las plmtas corno

resiultado de 10s problemas de fertilidad observados en el ganado ovine en Austrialia (Baker ?9(i31

Bradairy y vVhite (.I551 ) ioararon aislar oel trébol suaterráneo dos compuestos uotencielrnente esirogeriicos iiarnados geiiisreiria y fortrionetina (\ialderrabano,lY92). Tales ¿thnpiiestos son isoflavonas que gerieralrnente se preseritari 27 la planta en forma de glicosidos a jugacfss cciiubles en agiia y ya? sori fác:l y rápidamente hidrolizados por las glicosidasas !xm?Jo se rompe la estructuz celu!ar cle 13 hoja durante la masticaciOn (Valderrabano, 1992)

Objetivos particulares

Antecedentes

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Posteriormente, se identificaron otros compuestos vegetales que han mostrado, así

mismo, actividad estrogénica.Dentro del grupo de las isoflavonas, la daidzeína y la biochamina A se encuentran principalmente presentes en especies de Trifolium, y el grupo de los coumestranos donde se encuentra principalmente el coumestrol y algunos derivados aislados principalmente del grupo de los Medicagos; la actividad de estos Últimos es de 15 a 20 veces

superior a las isoflavonas (Jurado, 1992) En 1960 se determinó que los fitoestrógenos presentes en el trébol Trifdium

subtenaneum (Jurado,1989) están implicados en los desordenes de fertilidad que Ocurren frecuentemente en ovejas que se alimentan con estos.

La gama de plantas que contienen sustancias estrogénicas es m y amplia, perteneciendo a muy variados géneros, entre ellos podemos citar: irifo/ium (tréboles), Glycine (soja), Medicago (alfalfa), Beta (Remolacha), Prunus (almendras), Lotus, Lupinus, Poa, etc. (Jurado,l989)

A los fitoestrógenos se les clasifica por su estructura química en tres clases (Jurado, 1989): esteroides, isoflavonoides y coumestranos. Dentro de los fitoestrógenos esteroides podemos citar la estrona, el estriol y el p-sitostoroi, sustancias encontradas y aisladas

en la remolacha, avena, oriza, judía, palmas y granada; en el grupo de los isoflavonoides se puede citar la genisteína, daidzeína, rigenina, biochanina A, formononetina, prunetina, aisladas principalmente en los géneros Cflisus, Gensita. Glycine, Medicago, Lupinus, etc. ; finalmente, en el grupo de los coumestranos se han aislados principalmente el coumesiroi, medicagol, sojagol,

aislados de la soja, alfalfas y tréboles (Jurado, 1989). Los niveles de fitoestrógenos en las plantas son variables, dependen tanto del lugar

geográfico donde se encuentren así como de una serie de factores tales como el corte, ano, estado de crecimiento, temperatura y luminosidad (Valderrabano, 1992) clima (los tréboles se sabe que son más activos en invierno que en verano),y los nutrientes existentes en el terreno donde se han desarrollado (Jurado,l989).

El coumestrol se encuentra en pequenas concentraciones (1-2 mg / Kg) en plantas sanas de trébol y en leguminosas tales como la alfalfa, sin influencia aparente sobre el animal que la consume, este tipo de compuesto tienen un efecto tanto antimicrobiano (Feet, 1982) como fungicida (Sukumaran,l980) sin embargo, suele ver aumentada su concentración en Presencia de ataques foliares de hongos como por ejemplo Pseudopessisa medicaginis y Afidos (Le Bars, 1990), pudiendo superar en estos casos los 100 mg / Kg. lo que resulta bastante superior a la concentración mínima de 20-50 mgiKg. considerada como biológicamente activa (Bickoff, 1962); este aumento parece asociado a mecanismos de defensa de los vegetales expuestos a patbgenos foliares .por lo que los niveles de coumestranos en alfalfa pueden mantenerse bajos, controlando pestes y enfermedades. (Valderrabano. 1992).

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Los coumestranos persisten en los forrajes conservados y consecuentemente henos, ensilados, harinas y gránulos pueden contener niveles elevados de coumestrol si proceden de cultivos con niveles apreciables de enfermedades foliares o ataques de áfidos (Valderrabano, 1992)

Los problemas causados por los estrógenos de origen vegetal se deben a su elevada concentración en el plasma sanguíneo de los animales que ingieren las plantas, comparada con la de los estrógenos endógenos. A concentracl6n elevada, un estrógeno vegetal puede ejercer en el animal un efecto importante y producir un desequilibrio hormonal aunque su actividad sea sólo de I O-’ a I O 6 veces la del 17-p (Valderrabano, 1992)

Sin embargo a menudo se encuentran concentraciones relativamente elevadas en especies pratenses y su ingestion diaria por las ovejas puede ser suficiente para producir efectos patológicos como por ejemplo alteraciones reproductivas, tales como infertilidad, o alteraciones tanto en el transporte de los ovocitos a lo largo de los oviductos así también como en el proceso de implantación (.Valderrabano, 1992). Las alteraciones causadas por los coumestranos podrían estar mas relacionadas con la infertilidad, temporal si bien existen pocos datos sobre sus efectos a largo plazo, se ha encontrado que tras dos semanas de retirar a las ovejas de pasto de alfalfa ricos en coumestranos se observa una completa recuperación de sus parámetros reproductivos (Valderrabano, 1992).

Los estrógenos vegetales pueden actuar también como antiestrógeno cuando se les mantiene a una elevada concentración sanguínea compitiendo al unirse con las proteínas receptoras de los tejidos sensibles al estrógeno (por ejemplo: útero ) con los estrógenos end6genos que se encuentran en una proporcidn mucho menor en el plasma sanguineo (Valderrabano,l992)

Se ha observado que el consumo en general de fitoestrógenos induce alteraciones morfológicas en el aparato reproductor del ganado, tales cambios afectan principalmente al ovario, oviducto, útero, cervix y vagina, glándula tiroides, adrenales y mamadas que presentan gran desarrollo glandular y actividad secretora en corderos vacías (Valderrabanol992).

En los casos que se han detectado problemas de infedilidad ,casi siempre van acampanados de hiperplasia endometrial uterina y alteraciones a nivel de cervix, lo que provoca un exceso de moco cervical que dificulta el transporte espermático (Valderraban0~1992)

Así mismo al parecer el consumo de fitoestrógenos juegan un papel importante en la etiología de enfermedades hormono-dependientes, estos efectos pueden ser mediados a través de la influencia de nutrientes en el metabolismo de hormonas sexuales, como por ejemplo la acción antiestrogénica de los isoflavonoides (Whitten y col., 1994).

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incremento en el peso uterino

habilidad para ejercer actividad como antagonista estimulan el

j crecimiento uterino

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competencia por el receptor a acción atenuada en presencia estradiol - del estradiol largas dosis suprimen el pueden inducir tumores de desarrollo de tumor y los mama con dosis pequenas

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Introducción LOS estrdgenos juegan un papel importante durante todas las fases de la implantación y

el desarrollo embrionario. Durante la primera mitad del ciclo menstrual -fase folicular - los

estrógenos y otras hormonas dirigen el desarrollo de un folículo &rico e inducen la liberacih del ovocito en el momento de la ovulación a mitad del ciclo, el resto del tejido folicular que permanece en el ovario dará lugar al cuerpo IÚteo, glándula cuya producción hormonal principal va ser la progesterona (P) (Deura. L.D co 1990).. La mayorla de los investigadores están de acuerdo en que el folículo ovárico maduro es una fuente importante de estrogenos, "Parece que el ovario humano elabora solamente estrdgenos tales como el 17 p estradiol (E*) y estrona.

(Ruiz,l988) Durante la implantación existe una secuencia de cambios morfológicos, fisiológicos y

metabólicos tanto en el embrión como el útero, que deben presentarse de manera concertada para que se efectúe (Loza,1991).La composición hormonal y bioquímica del medio del oviducto y Útero tienen un papel fundamental en este proceso ya que permiten el establecimiento embrionario en un medio adecuado para su nutrición y desarrollo.(Loza,l991). Las deficiencias en las propiedades bloquímicas de los nutrientes, impiden la implantación y dan como resultado un incremento en la mortalidad embrionaria (Loza,l991). Los eventos biológicos que conducen al establecimiento del blastocisto están regulados en forma precisa por un complejo sistema de interacciones hormonales (Loza, 1991)

Las características específicas sobre la etapa de implantación varían en diferentes especies, (Weitlauf,l994) sin embargo, en todos los animales existe una interacción directa del trofoblasto con el epitelio endometrial con el i n de fijar al blastocisto firmemente en el útero (Loza,1991). En las ratas y los ratones por ejemplo el lumen uterino rodea al embrión en las primeras fases de la implantación; por lo tanto el útero tiene la apariencia de abrazar al blastocisto lo cual representa un mecanismo de inmovilización del embrin que se caracteriza por ser hormona-dependiente además de presentar una progresiva interdigitación de microvellosidades que aseguran un incremento en el contacto entre el endometrio y el blastocisto (Weitlauf, 1994). Se ha observado que en ratas ovariectomizadas una dosis de progesterona puede permitir distinguir una progresiva unión entre la parte apical de las células epiteliales del endometrio y el trofoblasto (reacción de ataque) además de presentarse edema dentro del endometrio en respuesta al aumento en los niveles de P. (Weitlauf,1994).

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Durante los primeros días de gestación ,mientras que el óvulo fertilizado se desarrolla y pasa a través de la trompa de falopio; el endometrio uterino atraviesa por cambios progesivos El

estado hormonal de la madre cambia durante este período de preimplantación y la producción balaceada de hormonas esteroides, fundamentalmente P y E2 es esencial en la preparación adecuada de los órganos reproductivos maternos ya que crea las condiciones óptimas para alojar al embrión en desarrollo e iniciar con éxito la implantación (Loza.1991). Una vez que el embrión ha entrado en el útero, se une a la pared uterina (endometrio), en donde ha de llevar a cabo su desarrollo posterior. (Ruiz, 1988).

La P actúa sobre el endometrio haciendo a este capaz de acoger y nutrir al embrión en desarrollo (la P. actúa sobre las células induciéndo la síntesis de glucógeno, promueve el crecimiento de los vasos sangufneos etc). Cuando se lleva a cabo la implantación, el trofoblasto, o la placenta en desarrollo estimula el cuerpo Iúteo para que mantenga la producción de P hasta que la propia placenta alcance su capacidad funcional para la síntesis de esta hormona y mantenga así la gestación; sino existe fecundación, el cuerpo Iúteo comienza a degenerar lo cual se ve reflejado en una disminución en los niveles de P, y culmina con el inicio del sangrado menstrual (Deura. L.D co 1990). Así mismo, durante la implantación todos los embriones de los mamíferos se introducen al epitelio uterino y se asocian con la lámina basal para establecer una relación vascular definitiva con la madre, uno de los cambios que se presentan durante este proceso en el caso de rata y el ratón, es el incremento de la actividad de la fosfatasa alcalina, de

la permeabilidad vascular y la decidualizaoión, que no es más que la transformación del endometrio en respuesta a la implantación la cual se observa por un incremento en peso y talla del útero, este incremento no se debe Únicamente a la diferenciación y proliferación que son inducidos al inicio de la ovulación por los E2 (Weitlauf,1992), sino también a la infiltración de una variedad de tipos celulares (leucocitos entre ellos se encuentran los macrofagos y los linfocitos) que son derivados de la permeabilidad vascular y el edema.(Weitlauf,1994). En general el proceso de implantación incluye tanto a tejidos maternos como el trofoblasto; las hormonas maternas controlan las modificaciones cíclicas del endometrio fuera de los periodos de gestación. Durante el embarazo el endometrio también está expuesto a las actividades del biastocisto. ei

cual puede producir sustancias similares a las hormonas: que por lo general ejercen su infiuencia sobre los órganos maternos (incluyendo las glándulas endocrinas) y tienen un efecto local en el

endometrio conocido como reacción decidual (Hamilton,l973). Los cambios que ocurren en el endometrio corn3 son la proliferaciSn y 13 diferenciasión i durante el proceso de irpantación S D ~ i3rmc1o-.ciLpenlient-s prinii,paimmt? 1.2

E?.fVVeitlziuf 7992). I.?! hipótesis de C)ickm?n? (1979) señala que !os E2 requeridos er: i?

implantación son liberados tanto del ovario como del embrión preimplantado SE: ha siigeridn ni NP id secreciciin uterina de diversas sustancias vasoactivas como son el AMPc serotonina. hisiairiim

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Humano Sugiere ser esencial

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Hamster NO esencial, ia implantación se realiza normalmente s610 con 1 $ progesterona l

Conejo 1 No obligatoria. El estrdgéno solamente facilita el proceso 1 ! __I_R 1 Obligatoria. La implantación no se efectúa sin la participación i 1 !

Rata Rat6n K ..,. ~. . ~ ~ , ._~, ; ; ~ ~ , ,,

clasificación de especies que requieren la participación estrogénica durante la implantación (Loza,l991)

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En el ratón la regulación endocrina sistémica principia con la "sensibilizaci6n" de! Úter? por acci6n de la P, la cual se inicia en la tarde del día 3 del embarazo y tiene una duración de 48

horas. Pocas horas después (alrededor de las 12.00 h del sexto día), los E 2 inducen una fase corta de receptividad endometria¡ la cual ha sido denominada recientemente '.ventana de

implantación", la que se sabe induce un incremento en la slntesis de prostaglandinas

(Loza, 1991 ). Tanto los E2 como la P causan cambios bioquímicos y estructurales en el epitelio

endometrial que influyen en la composición qufmica del fluido uterino. Las investigaciones recientes han senalado que tanto E2 como Pi administrados parentalmente a animales ovariectomizados, afectan el metabolismo de los carbohidratos: la síntesis de ácidos nucléicos y el contenido total de glucógeno en los embriones preimplantados.(Loza. 1991).

Así también, estas hormonas son capaces de inhibir la acción una del otro.en forma recíproca y en estas condiciones se considera que actúan de manera antagónica, en lac

hembras de los mamlferos se habla de una fase preovulatoria estrogénica o folicular y una fase postovulatoria progestacional (Ruiz, 1988)

El modelo experimental que utiliza ratas ovariectomizadas (en el segundo día del embarazo) ha sido muy utilizado para probar la importancia de los estrógenos en la implantación, se ha observado que la concentración de esta hormona en el plasma es crítica. En ratas ovariectomizadas que son inyectadas con 80 ng de EI se observa un incremento de la actividad mitótica del endometrio que se ve reflejada en un aumento en los sitios de implantación, sin embargo al inyectar progesterona en ratas ovariectomizadas (en el segundo día del embarazo) no se observa actividad mitótica (Weitlauf,1994); los blastocistos se mantienen sin unir ai útero por tiempo prolongado, tal condicidn conocida como "implantación retardada" se caracteriza por una reducción en la slntesis de DNA,'y en la mitosis de las células del blastoristo además de una disminución en el metabolismo embrionario (Lozaal 991 ).

En el caso de las glándulas epiteliales una sola inyección de EI no es suficiente, se necesita una continua administración para permitir que se lleve a cabo la mitosis. En el estroma

uterino ni el E2 ni la P solos inducen la actividad mitótica, es necesario una aosis de t2 y después una dosis de P. En general el E 2 estimula la proíiferación del epitelio luminaí y gianduíar (Weitlauf,1994).

En cuanto a la diferenciación celular 13s cambios ocurren en todos los cornpartimle:;tus del erdometrio en respursta a I2 vzriaci6n ds hormmas esteroidess. Curin% se realiza ~LX

cva:iect3rnla el epitelio Iumin3! se [leg3 a atrcfiar psteri3- a est3 (Mleitlal-!f '994) L3s céiulas

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el retículo endoplásmico es escaso Se han observado cambios en respuesta a la

administración de estrógenos, el citoplasma llega a ser altamente basófilo, existe un incremento en cantidad de retículo endoplásmico, el núcleo ocupa !a región basal: el complejo de golgi se

incrementa en numero marcadamente y la longituci de ¡as rnicrovellosidades es aumentaaa (Weitlauf,l994).

Hay relativamente poca información acerca de la citodiferenciacón de las glándulas epiteliales, se ha puesto más atención en la actividad secretora; en animales ovariectomizados, se sabe que un continuo tratamiento de P con o sin E2 provoca un aumento en la secreción glandular después de 8 días; simultáneamente una inyección de P y E2 permite una secreción masiva justo en el dla 5. Normalmente en los ratones y la rata en el cuarto día del embarazo las células del epitelio glandular se observa con veslculas que desaparecen en los días 5 y 6 cuando comienza el periodo de actividad secretora de estas glándulas (Weitlauf, 1994).

Las células estromales también muestran cambios hormona-dependientes particularmente, en animales ovariectomizados se ha demostrado que el nucléolo de estas células es pequeiio, hay una reducción en la cantidad de citoplasma, el retículo endoplásmico es poco prominente, después del tratamiento con E2 solo existe un incremento despreciable en el componente glandular del nucléolo y no existen camb’ios significativos en el citoplasma, sin embargo despues del tratamiento con P, hay un marcado alargamiento del nucleolo, el citoplasma llega a tener muchos polirribosomas, si el E2 es aitadido después de la P. todos los aspectos de estos cambios son acentuados.(Weitlauf. 1994)

Como hemos señalado los estrógenos poseen un papel importante en los periodos de preimplantación e implantaci6n en los mamíferos, sin embargo se desconoce el efecto del coumestrol sobre estas primeras etapas de la gestación.

El estudio de los fitoestrógenos cada vez se vuelve más importante y necesario tanto por los efectos que pueden tener en el ganado que los consume y que se traducen en pérdidas económicas así como la relevancia que tienen en el humano, en este caso es importante considerar que los efectos antagonistas-agonistas de estos compuestos pueden ayudar a la prevención o mejoramiento de enfermedades estrógeno - dependientes o incluso a agravarlos; es además importante recalcar también que en E I tiumano pueden provocar problemas de fertilidad.

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El presente trabajo busca analizar el efecto del cournestrol durante la preimplantación e

implantación, etapas en las cuales los estrógenos tienen un papel importante y es muy probable que este tipo de compuestos modifique los procesos naturales

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MATERIAL Y MÉTODO Recursos necesarios: 1 .- mesas de trabajo e instalaciones (agua, energia electrica, drenaje y campana de extracción) 2. -reactivos 3.-material de cristaleria como matraces erlen -meyer. probetas,pipetas,vasos de precipitado, etc.. . . 4.-I5 ratas maduras de la cepa wistar (hembras). 5-material bibliografico

Animates: Para el presente trabajo se utilizarán 15 ratas gestantes de la cepa Wistar divididas en tres grupos con igual número de animales cada uno.

Por medio de frotis vaginal se realizará un seguimiento del ciclo estral, en la etapa de

proestro se colocarán con un macho para permitir que se lleve a cabo la cópula, al día siguiente se verificará por presencia de espermatozoides en el frotis y se considerará este día como día cero de gestación.

Tratamientos: Los animales serán divididos en 3 grupos experimentales: Grupo control: únicamente se le administrará el vehiculo 100 pI de aceite Grupo experimental 1 : 24.8 pg de coumestrol Grupo experimental: 4 pg de 17 p estradioi (dosis equimolar de estradiol)

La administración será diaria a partir del día 2 de gestacibn hasta el dla 7 en el cual se considera termina el proceso de irnplantacibn en la rata. AI finalizar el tratamiento las ratas serán pesadas y posteriormente decapitadas para la obtención de sangre para la determinación y del Útero, el cual será pesado para calcular el índice útero somático (IUS) y fijado en Bouin para el posterior análisis histológico. Análisis histológico.

Una vez disecado el Útero de cada rata serán sometidos a una serie de procesos para su estudio microscopico, tales procesos incluven la fijación. deshidratación. aclaramiento, inclusión, cortes finos y tinción.

Fijación.- cada tejido será fijado con liquido de Bouiri por un periodo de 24 horas, posteriormente serán lavados con alcohol al 70 % hasta eliminar totalmente el exceso de bouir:,

Deshidratación una vez eliminsdo el exceso de bcuin e! tejido será sonetiG3 2 mi serie cle lavados con alcohol de 70 O h hasta alcohol absoluto a diferentes tiempos todo est(> p r a

eliminar el agun contenida en los kjidos

Aclaramiento Una vez finalizada la deShidrat~CiOn cima el telido sera colocado en cilia

solimón de xilol a diferentes tiempos esroc cot1 ,a iinaiidad cie sustituir el aicoriai ne paso anterini

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Inclusión: cada tejido será colocado en parafina 1 y parafina I! por un periodo de 1.30 hrs

Tinción: íos tejidos serán teaidos mediante la técnica de hematoxilina - eosina para posteriormente realizar los cortes de 5pm

Determinaciones hormonales.

Una vez que se obtengan las muestras sanguíneas, se centrifugarán a 1500 g durante 20 minutos. El plasma as[ obtenido se congelará a -20 C hasta la determinación hormonal. Las determinaciones tanto de estrógenos (E2) como progesterona (P4) se realizará por medio de mdioinmunoanálisis (RIA) con anticuerpos de alta especificidad, que permiten cuantificar de O. 1 a i2.0 ng/rnl de suero en el caso de P4 y de d10 a 640 pglml de seuro para el €2 (Herrera, 1993). La extracción de esteroides se realizará con eter etílico en una proporción de l : lO , el éter se evaporará y el extracto se resuspenderá en una solución amortiguadora de fosfatoc pH 7.0. La pérdidas durante el procedimiento seguido se calcurarán a partir de sueros agregados de 3H-P4 o 3H-17pE2. Para cada hormona, la curva estándar se construirá con 8 concentraciones (de 6.25 a 1600 pgltubo de P4 y de 0.5 a 64 pgffubo de E2). Los estándares se prepararán mediante diluciones apropiadas, a partir de soluciones de los esteroides recristalizados, de 1 OOp glml y se verificarán por absorción ultravioleta a 240 nm para P4 y 280 nm para E2.

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Estroqériico. de acuerdo con Aiieri y iioisv ei témino esrrogeilrco se aplica a ioUa SusIar~cia

admnistidda a ratas ;nodiiras y í>variectom,zadas. procidse corniiicacion vaginal. simiiaí a id

sbser-vada en el oestruc(Juíadú 1939) Fitoestrógeno: toda aquei!a sustancia de xi' ,+ri '. vege!ai que 5ent ac:i,*iYoci

ectrogénica(Jsrado.;l 989)

Programa de actividades

TIEMPO DE DEDICACION:

6 HORAS DIARIAS

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Criterios de evaluación Se realizaran revkiones mensuales de los avances obtenidos en el trabajo,asi mismo este sera presentado en el congreso de histología del proximo año junto con otros trabajos que se realizan en el laboratorio sin embargo en el reporte final no seran incluidos tales experiencias obtenidas en el congreso debido a que este inicia a principios de octubre.

Resultados

Cuantificación macróscopica de los sitios de implantación: i

Unicamente se observan sitios de implantación en los animales tratados

con coumestrol así como en el grupo control, en los animales tratados con

estradiol no se observa ningún sitio de implantación. Los resultados fueron

significativos entre los grupos tratados con coumestrol y el control con relación

a los grupos tratados con estradiol. Los valores para los grupos fueron GC 7 I:

3.39; grupo 2, 8.2 f 4.18 y grupo 3, 8.8 f 3.03 (gráfica 1).

lndice útero somático

El indice Útero somático so se vio modificado en los diferentes

tratamientos, los valores para cada grupo son los siguientes: GC 0.59 f 0.1 1 g;

grupo 2, 0.68 ? 0.22 g; grupo 3, 0.5 k 0.12g; grupo 4, 0.51 f 0 . 0 6 g y grupo 5

0.36 f 0.06 g. (gráfica 2)

Análisis estadístico.

Se aplico la prueba estadística F asimilada de Cochran para más de dos

muestras con varianzas no homogéneas ( Wayne 1994) para los sitios de

implantacion. El 1.S.U fue estadísticamente analizado por medio de un

análisis de varianza de una entrada de Fischer (Wayne 1994). En ambos

casos la probabilidad utilizada fue de 0.05.

Análisis histológico.

Las zonas de la placenta del grupo control se encuentran en proceso de

conformación, apreciandose claramente una regionalización alrededor el

embrión, presentándose este último perfectamente bien conservado

(ectoderm0 y endoderm0 bien definidos). La decidua basal presenta arterias

venas y células deciduales ligeramente basofilas y núcleo compacto, La zona

intermedia muestra células gigantes y de glucogeno, con arteriolas y venulas.

La región laberíntica muestra capas celulares y sinciciales, así como la

presencia de pequeños capilares. (figuras. I ,5,6 y 7)

En los grupos tratados con concentraciones bajas de coumestrol, las tres

zonas se distinguen claramente, sin embargo el embrión muestra un desarrollo

temprano con un menor numero de capas celulares que el control, además la

capa coriónica se presenta con un lento desarrollo, lo que indica un menor

desarrollo placentario y embrionario .(figuras.2,8,9 y 1 O).

Los grupos tratados con altas concentraciones de coumestrol muestran

un endometrio con hipersecreción profusamente glandularizada, se aprecian

glándulas tubulares simples y ramificadas e incluso glándulas intra-epiteliales.

Además en el miometrio se aprecian vasos de gran calibre. (figuras. 3 y 11)

Las tres capas muestran un mayor desarrollo tanto por espesor corno

por vascularización en comparación con el grupo control anteriormente

descrito. Se observa además ausencia de embrión, sin embargo la región

embrionaria se aprecia con un daiio considerable.(figura.12).

El endometrio de los grupos tratados con las diferentes concentraciones de

estradiol muestran un epitelio típicamente secretor con glandulas tubulares,

además de presentar una abundante vascularización en la región del miometrio

no se observan sitios de implantación en ninguno de los individuos.(figura. 4 y

13).

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DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:

En el presente trabajo se observó que las dosis de coumestrol

empleadas no tienen un efecto significativo sobre los procesos de implantación

al compararlos con los animales tratados con estradiol en los cuales se vió

totalmente anulado este proceso.

Es importante mencionar que no podemos, a pesar de los resultados

obtenidos, descartar que el coumestrol tenga efecto sobre los procesos de

implantación, ya que en este caso las dosis de coumestrol administradas

fueron equimolare: - las de estradiol y no equipotenciales.

En cuanto ai ndice Útero somático no se observaron modificaciones ni

por los tratamientos -:i por las dosis empleadas con relación al grupo control.

Sin embargc el análisis histológico reveló que el tratamiento con ambas

dosis de coumestrol sí indujo cambios tanto en el desarrollo placentario como

en el desarrollo embrionario manifestándose en ambos casos un retraso con

relación al grupo control. Este efecto además se presentó de manera dosis

dependiente ya que 'en el grupo tratado con la dosis alta de coumestrol se

observa un mayor retraso en el desarrollo así como mayor glandularización.

En los animales tratados con estradiol no se observan sitios de

implantación y el epitelio es típicamente secretor y con una alta

vascularización, características que se observan aunque no en igual grado de

desarrollo en los animales tratados con las dosis altas de coumestrol.

En general podemos concluir que el coumestrol presenta diferentes

potencias según el.efecto que se analice, ya que si bien, no fueron las dosis

utilizadas suficientes para detener los procesos de implantación si lo fueron

para producir modificaciones en el desarrollo de la placenta y del embrión en

los cuales se observa un retraso en relación al tiempo de gestación.

Actividades Realizadas I er. Semestre (DIC-MAY 1997)

Actividades Diciembre Revisión X Bibliográfica Frotis vaginal X Sacrifico y Obtención de muestras

Enero Febrero Marzo Abril Mayo X X X X X

X X X X X X X X

Actividades Junio Julio Revisión X X Bibliografca Sacnfico y X X Obtencion de muestras Curva standari X

Agosto Septiembre Octubre Noviembre X X X X

X X X

X X X X

Actividades Diciembre Enero Febrero Marzo Revisión X X X X

Estudio X X X X Bibliográfica

Histologico

Abril Mayo X X

X X

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Resumen ~.b;frcto dei coumcstrd en el praccru de impianiacion en i a rata cepa Wistar"

Grupo

Tratamiento

Control 1 2 3 4

Aceite cou. cou. E* Et

Concentración 1OOpl 14.2pg 28 .4~9 2pg 4pg