identifikace bakterií metodou broad-range pcr-hrma
DESCRIPTION
Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA. Lucie Navrátilová 2. ročník MBB PřF UP v Olomouci 2007/2008. určení diagnózy co nejdříve. medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií. Bakterie. nejjednodušší jednobuněčn é organism y , viditeln é pod mikroskopem - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/1.jpg)
Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA
Lucie Navrátilová2. ročník MBB
PřF UP v Olomouci
2007/2008
![Page 2: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/2.jpg)
určení diagnózy co nejdříve
medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií
![Page 3: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/3.jpg)
Bakterie
• nejjednodušší jednobuněčné organismy, viditelné pod mikroskopem
• patogenní X nepatogenní
![Page 4: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/4.jpg)
DNA(deoxyribonukleová kyselina)
• nosič genetické informace v podobě sekvencí nukleotidů
• podle rozdílností mezi geny se dají organismy identifikovat
GEN = sekvence nukleotidů s biologickou funkcí
![Page 5: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/5.jpg)
Identifikace
• určení izolovaného mikroba
• souboru znaků mikroba porovnává se znaky identifikační maticí
![Page 6: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/6.jpg)
Broad-range PCR-HRMA
![Page 7: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/7.jpg)
PCR(Polymerase Chain Reaction)
• biochemická reakce
• využívá DNA-polymerázy ke klonování DNA
DENATURACE (94-96°C) NASEDÁNÍ PRIMERŮ (cca 53°C) EXTENZE (72°C)
![Page 8: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/8.jpg)
HRMA(High-Resolution Melting Analysis)
• identifikace bakterií na základě odlišností mezi tt jejich DNA
Tm = melting temperature
![Page 9: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/9.jpg)
Příklad
• zvolený gen leží v úseku 16S rDNA
• zkoumané druhy bakterií: Burkholderia cepacia
pickettii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia
![Page 10: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/10.jpg)
Burkholderia cepacia
http://www.wickipedia.cz
![Page 11: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/11.jpg)
Pseudomonas aeruginosa
http://www.wickipedia.cz
![Page 12: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/12.jpg)
Stenotrophomonas maltophilia
http://www.wickipedia.cz
![Page 13: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/13.jpg)
PCR směs pro 1 reakci
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1
• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl
templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR
oleje
![Page 14: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/14.jpg)
PCR směs pro 1 reakci
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1
• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl
templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR
oleje
![Page 15: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/15.jpg)
PCR směs pro 1 reakci
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1
• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl
templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR
oleje
![Page 16: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/16.jpg)
PCR směs pro 1 reakci
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1
• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl
templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR
oleje
![Page 17: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/17.jpg)
PCR směs pro 1 reakci
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1
• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl
templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR
oleje
![Page 18: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/18.jpg)
Obr.2: Aparatura pro PCR-HRMA
Obr.3: RotorGene
![Page 19: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/19.jpg)
DNA
5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’
![Page 20: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/20.jpg)
Denaturace DNA
5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’
3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’
![Page 21: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/21.jpg)
Nasedání primerů
5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’3’-CTAATATC-5’
5’-GCGATTAG-3’3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’
![Page 22: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/22.jpg)
Extenze primerů
5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGG3’-CTAATATC-5’
5’-GCGATTAG-3’ GCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’
3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’
![Page 23: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/23.jpg)
Graf 1: Normalizovaný graf denaturované DNA
teplota °C
fluor
esce
nce
- no
rmal
izov
aná
![Page 24: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/24.jpg)
Graf 2: Normalizovaný graf denaturované DNA
fluor
esce
nce
- no
rmal
izov
aná
teplota °C
![Page 25: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/25.jpg)
Použitá literatura
• deSilva D., Blackett J.,High-Resolution melting & Unlabeled probes Developing a Simple and Inexpensive Genotyping Assay with Lunaprobes, Genetic Engineering & biotechnology News, 27, publish on-line: http://www.genengnews.com/articles/chtitem.aspx?tid=1986&chid=1
• Votava M., Lékařská mikrobiologie - obecná, Neptun, 2005
![Page 26: Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681465b550346895db37af7/html5/thumbnails/26.jpg)
Děkuji za pozornost!