identifikasi alel gen sitokrom p450 2a67 pada …ii identifikasi alel gen sitokrom p450 2a67 pada...

ii

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN

METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Natasya Nora Rubiyo

NIM: 168114019

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii


iv


v


vi


vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Tuhan menetapkan langkah-langkah orang yang hidupnya berkenan

kepada-Nya; apabila ia jatuh, tidaklah sampai tergeletak, sebab Tuhan

menopang tangannya.”

(Mazmur 37: 23-24).

“If somebody offers you an amazing opportunity, but you are not sure you

can do it, say yes, then learn how to do it later.” – Richard Branson

Saya persembahkan kepada,

Tuhan yang Maha Esa

Kedua orang tua saya yang selalu mendukung saya dalam keadaan terpuruk

sekalipun

Kakak tercinta saya yang selalu menguatkan saya ketika saya putus asa

Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menuntut

ilmu selama ini.


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan yang Maha Esa atas

berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul

“Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok Ras

Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction”.

Penulis menyusun skripsi ini untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma. Skripsi yang disusun merupakan bagian dari penelitian Dr.

Christine Patramurti, Apt. dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6 *4, *7, dan *9

pada Subjek Uji Nonperokok Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di

Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)”.

Penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak.

Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih

kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, dosen pembimbing yang telah

berperan seperti orang tua dalam memberikan pendampingan, masukan,

nasihat serta dukungan kepada penulis.

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji yang telah

memberikan kritik dan saran kepada penulis.

4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang telah

memberikan kritik dan saran kepada penulis.

5. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku Kepala Penanggung Jawab

Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam

penggunaan laboratorium untuk kepentingan penelitian.

6. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku dosen Pembimbing Akademik atas

bimbingannya selama masa perkuliahan.

7. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma


ix


x

DAFTAR ISI

Halaman

COVER ...............................................................................................................

HALAMAN JUDUL ...........................................................................................

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..............................................................

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...............................................

HALAMAN PERSEMBAHAN ..........................................................................

PRAKATA ..........................................................................................................

DAFTAR ISI .......................................................................................................

DAFTAR TABEL ...............................................................................................

DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................

ABSTRAK ..........................................................................................................

ABSTRACT ..........................................................................................................

PENDAHULUAN ...............................................................................................

METODE PENELITIAN ....................................................................................

HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................................

KESIMPULAN ...................................................................................................

SARAN ...............................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................

LAMPIRAN ........................................................................................................

BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................

i

ii

iii

iv

v

vi

vii

viii

x

xi

xii

xiii

xiv

xv

1

2

6

15

15

16

19

33


xi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Frekuensi Alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 ........................................... 13

Tabel 2. Efek Polimorfi gen CYP2A6 pada beberapa obat ................................... 14

13

14


xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis........................................................................... 9

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida

CYP2A6*7.............................................................................. 10

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan

CYP2A6*7 (perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna

hijau dan abu-abu, primer ditunjukkan oleh warna

merah)….................................................................................. 12

Gambar 4. Elektrogram produk PCR dari berbagai isolat DNA..............

13


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Ethical Clearence Penelitian.............................................

Lampiran 2. Go TaqGreen Master Mix Certification of Analysis.........

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix.............

Lampiran 4. Usage information of FavorPrepTM

Blood Genomic DNA

Extraction Mini Kit...........................................................

Lampiran 5. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse

CYP2A6*7..........................................................................

Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers..............

Lampiran 7. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA..............

Lampiran 8. Elektroforegram Hasil PCR..............................................

Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sampel..............................................

Lampiran 10. Data Subjek.....................................................................

Lampiran 11. Formulir Kuisioner Subjek Uji........................................

Lampiran 12. Frekuensi Alel.................................................................

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

32


xiv

ABSTRAK

Asap rokok merupakan campuran aerosol kompleks yang mengandung

senyawa prokarsinogenik yaitu nitrosamin. Senyawa nitrosamin akan berubah

menjadi karsinogenik setelah teraktivasi oleh gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6).

CYP2A6 sering mengalami polimorfisme, salah satu polimorfisme yaitu

CYP2A6*7 yang mengalami substitusi nukleotida T menjadi C pada urutan

nukleotida 8454 pada ekson 9. Hal ini mengakibatkan penurunan aktivitas enzim

dalam metabolisme nitrosamin. Variasi alel gen ini ditemukan pada perokok ras

kulit hitam cukup tinggi yaitu sebesar 13,33%. Penelitian ini bertujuan

mengetahui keberadaan dan frekuensi alel CYP2A6*7 pada isolat DNA

nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia. Penelitian ini merupakan penelitian

deskriptif observasional yaitu dilakukan identifikasi alel CYP2A6*7 pada 30

sampel isolat DNA nonperokok ras kulit hitam Papua di Indonesia dengan metode

polymerase chain reaction (PCR) dan dianalisis menggunakan metode

elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan adanya alel CYP2A6*7 pada

nonperokok ras kulit hitam Papua dengan frekuensi 0%, sehingga dapat

disimpulkan bahwa pada ras kulit hitam Papua nonperokok berpotensi mengalami

risiko kanker akibat menghirup asap rokok.

Kata Kunci: CYP2A6*7, ras kulit hitam Papua, Polymerase Chain Reaction

(PCR)


xv

ABSTRACT

Cigarette smoke is example of a complex aerosol mixture which contains

procarcinogen compound such as nitrosamine. Nitrosamine compound will

transform into a carcinogenic compound after being activated by cytochrome

P450 2A6 gene (CYP2A6). CYP2A6 often experiences polymorphism, which one

of them is called CYP2A6*7 which undergoes T nucleotide substitution to C in

nucleotide 8454 in exon 9. This polymorphism causes reduction of the enzyme’s

ability to metabolize nitrosamine. The variation of this allele was found at a quite

high rate which is 13.33% in black Papuan smokers. This study aimed to

determine the presence and frequency of CYP2A6*7 alleles in DNA isolated from

non-smokers population of black Papuan in Indonesia. This research is an

observational descriptive study, which was done by identifying CYP2A6*7 alleles

in 30 samples of DNA isolated from non-smokers population of black Papuan in

Indonesia using polymerase chain reaction (PCR) method and was analyzed using

electrophoresis method. The result showed the presence of CYP2A6*7 alleles in

non-smoker population of black Papuan with a frequency of 0%, thus it can be

concluded that said race has potential risk of cancer due to inhalation of cigarette

smoke.

Keywords: CYP2A6*7, black Papuan, Polymerase Chain Reaction (PCR)


1

PENDAHULUAN

Merokok merupakan salah satu kebiasaan yang sering dilakukan oleh

seluruh masyarakat di Indonesia maupun di dunia. Penelitian terbaru telah

memberikan bukti bahwa kebiasaan merokok tidak hanya dipengaruhi oleh

lingkungan, tetapi juga faktor genetik (Minematsu et al., 2006). Kebiasaan

merokok menyebabkan perokok aktif dapat menyebarkan polusi asap rokok.

Menurut Dede dan Cinar (2016), orang yang menghirup asap rokok tersebut

merupakan perokok pasif. Faktor risiko yang ditimbulkan dari asap rokok yaitu

dapat menyebabkan penyakit dan kematian (Schroeder and Warner, 2010).

Asap rokok merupakan campuran aerosol kompleks yang mengandung

nitrosamin yang mengandung tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Beberapa

senyawa golongan TSNA adalah 4-(mehylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone

(NNK), N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanabasine (NAB), dan N-

nitrosoanatabine (NAT) (Ashley et al., 2010). Menurut IARC (2007), senyawa

NNK dan NNN dikategorikan sebagai golongan 1 yang bersifat karsinogenik bagi

manusia dan dapat menginduksi kanker paru-paru, hati, rongga hidung, esofagus

dan eksokrin pankreas. Enzim yang berkontribusi dalam mengaktivasi kedua

senyawa tersebut yaitu CYP2A6, sehingga dapat menginduksi karsinogenesis

terhadap paru-paru (Chiang et al., 2011; Xue et al., 2014).

Aktivitas CYP2A6 sangat tergantung pada perbedaan individu, etnis,

serta variabilitas genetik CYP2A6 (Jordjevic et al., 2013; Kadlubar et al., 2009).

Saat ini terdapat 89 bentuk polimorfisme CYP2A6 yang telah teridentifikasi

(PharmVar, 2012). Variasi urutan DNA yang terjadi dalam suatu populasi dengan

frekuensi 1% atau lebih tinggi disebut polimorfisme. Polimorfisme yang terjadi

dapat berupa satu atau lebih perubahan nukleotida, seperti halnya mutasi (Karki et

al., 2015). Polimorfisme CYP2A6 yang terjadi pada ras berbeda menyebabkan

terjadi perubahan aktivitas dari enzim CYP2A6 dalam memetabolisme

nitrosamin. Beberapa penelitian menunjukkan CYP2A6 dalam memetabolisme

nitrosamin lebih rendah pada ras kulit hitam dibandingkan ras kulit putih (Liu et

al., 2011; Minematsu et al., 2006; Mwenifumbo et al., 2005; Nakajima et al.,

2006; Tanner et al., 2018).


2

Ras kulit hitam atau ras Negroid merupakan ras yang memiliki ciri

khusus warna dan bentuk rambut yaitu kulit berwarna hitam dan berambut

keriting. Populasi yang memiliki kesamaan ciri dengan ras Negroid (kulit hitam)

yaitu Afrika-Amerika dan masyarakat asli Papua (Waluya, 2007). Pada ras kulit

hitam ditemukan beberapa variasi gen CYP2A6 yaitu alel CYP2A6*2, *4, *5, *7,

*9, *10, *11, *17, *19, dan *20 (Nakajima et al., 2006). Polimorfisme alel

CYP2A6*7 ditemukan pada ras Negroid (kulit hitam) perokok di Afrika dan ras

Negroid perokok di Indonesia yaitu di daerah Papua (Tanner et al., 2018;

Tirtawamsa, 2018; Wassenaar, 2015).

Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme gen

CYP2A6 yaitu alel *7 pada populasi nonperokok ras kulit hitam Papua. Pada

individu yang memiliki alel gen CYP2A6*7 dapat menurunkan kemampuan

aktivitas dalam memetabolisme nitrosamin menyebabkan menurunnya kadar

senyawa karsinogenik nitrosamin yang telah teraktivasi dalam tubuh dan risiko

kanker. Hasil yang didapat dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan

untuk pengendalian wilayah asap rokok pada nonperokok ras kulit hitam Papua di

Indonesia.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah sampel darah dari populasi nonperokok ras

kulit hitam Papua. Primer forward: 5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3’

dan primer reverse: 5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ yang diadopsi dari

Minematsu et al. (2006), Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA

polimerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH

8,3 (Vivantis), Nuclease-Free Water (Promega Medison), agarosa (GeneDireX),

aqua pro injection, DNA loading dye 6X 10 mL (berisi glycerol 3,3 mL,

bromphenol blue 25 mg, aqua pro injection 6,7 mL), etanol absolute, 1KB (0,25-

10 kb) DNA ladder (SMOBiO), reagen FavorPrepTM

Blood Genomic DNA

Extraction Mini Kit, dan FluoroVueTM

Nucleic Acid Gel Stain.


3

Alat Penelitian

Tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL, vorteks, HeraeusTM

PicoTM

17

Microcentrifuge–Thermo Fisher Scientific, collection tube, microtube (0,2 mL),

tabung sentrifugasi, kolom FABG, elution tube, ice box, blue tip, white tip, yellow

tip, mikropipet ukuran 1-10 µL (Socorex Swiss), mikropipet ukuran 100-1000 µL

(Socorex Swiss), kamera mirrorless Fujifilm XA3, gelas ukur 50 mL dan 100 mL

(Pyrex), gelas beker 200 mL (Pyrex), erlenmeyer 250 mL (Pyrex), UV

Transilluminator, disposable gloves, hot plate, magnetic stirrer, vacutainer K2,

Thermal cycler Perkin Elmer 2400 dan neraca timbangan analitik ketelitian

0,0001 (Mettler Toledo).

Kriteria Subjek Uji

Penelitian ini menggunakan isolat DNA yang berasal dari subjek uji

nonperokok ras kulit hitam Papua di Indonesia. Kriteria subjek uji yaitu

nonperokok berjumlah 30 orang, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal

third degree relatives (kakek dan nenek orang Papua asli), pernah terpapar asap

rokok, dan sehat jasmani dan rohani. Subjek uji diwawancara terlebih dahulu,

dengan sadar bersedia menandatangani inform consent. Penelitian yang dilakukan

telah memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran

Universitas Kristen Duta Wacana Yogyakarta.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Pada penelitian ini dilakukan pengambilan sampel darah subjek uji oleh

petugas perawat. Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan

ditampung dalam vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4 mg. Darah segar

yang diperoleh disimpan pada suhu ± 4˚C sebelum dilakukan analisis. Darah ini

kemudian digunakan untuk mengidentifikasi alel CYP2A6*7.

Isolasi DNA

Reagen yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel darah yaitu

reagen FavorPrepTM

Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sebanyak 200 µL

sampel darah diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge 1,5 mL.

Sebanyak 20 µL Proteinase K dan 200 µL FABG buffer ditambahkan ke dalam

sampel kemudian divorteks secara cepat untuk mencampurkan larutan tersebut,


4

diinkubasi selama 15 menit pada suhu 60˚C untuk melisiskan sampel dan

divorteks setiap 3 menit selama 30 detik. Setelah diinkubasi, sampel disentrifugasi

dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Sampel yang telah disentrifugasi

ditambahkan 200 µL etanol absolute, dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 30 detik dan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 30 detik.

Kolom FABG dipasangkan pada collection tube dan sampel dipindahkan dari

tabung sentrifugasi ke dalam collection tube, kemudian disentrifugasi selama

13000 rpm selama 1 menit. Setelah disentrifugasi cairan yang terdapat di dalam

collection tube dibuang, lalu dipasangkan kolom FABG pada collection tube baru.

Kolom FABG yang telah dipindahkan dicuci dengan 500 µL W1 buffer lalu

disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 1,5 menit, kemudian cairan yang

terbentuk pada collection tube setelah sentrifugasi dibuang. Kolom FABG dicuci

kembali dengan 750 µL wash buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm

selama 1,5 menit, kemudian cairan yang terbentuk pada collection tube setelah

sentrifugasi dibuang. Setelah cairan tersebut dibuang kemudian disentrifugasi

selama 4 menit untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG yang telah kering

dipindahkan pada elution tube, lalu ditambahkan 200 µL elution buffer pada

kolom FABG kemudian didiamkan dalam posisi berdiri selama 3 menit. Setelah

didiamkan selama 3 menit, sampel disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm

selama 3 menit untuk mengelusi DNA. Fragmen DNA yang terbentuk setelah

disentrifugasi disimpan pada suhu -70°C.

Penyiapan Gel Agarosa

Pada penelitian ini digunakan agarosa 1% pada elektroforesis dengan

menimbang 250 mg agarosa dilarutkan dalam 25 mL 1X TBE (10 mL 1X TBE

yang telah dilarutkan dalam 100 mL aquabidest) kemudian dipanaskan di atas hot

plate sambil diaduk hingga mendidih menggunakan magnetic stirrer hingga larut

lalu ditambahkan 2,5 µL larutan nucleic acid gel stain dan diaduk hingga

homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel sebanyak 25 ml yang telah diberi

sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel

mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Agarosa dengan konsentrasi 1 %


5

digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian isolat DNA, sedangkan untuk

mengidentifikasi hasil PCR menggunakan agarosa konsentrasi 1,5%.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Isolat DNA disiapkan sebanyak 4,0 µL, kemudian ditambahkan aqua pro

injection sebanyak 1,0 µL dan dicampurkan dengan loading dye sebanyak 1,0 µL.

Campuran tersebut diambil sejumlah 6 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-

sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA

ladder sebanyak 4,0 µL sebagai marker. Gel agarosa ditempatkan ke dalam gel

tray elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer 1X TBE, dilakukan

elektroforesis dengan tegangan 110 volt selama 45 menit. Molekul DNA pada gel

tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil

elektroforesis berupa gel agarosa dideteksi di bawah UV transilluminator dan

didokumentasikan menggunakan kamera. Panjang pita DNA dapat diketahui

dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi

pita DNA ladder.

Amplifikasi Alel CYP2A6*7

Fragmen DNA dari alel CYP2A6*7 dilakukan amplifikasi menggunakan

primer forward: 5'-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3', primer reverse: 5’-

AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ (Minematsu et al., 2006). Reaksi PCR

dilakukan dengan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix 12,5 μL,

primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA 5,0 µL, ditambahkan

dengan nuclease free water sampai volume akhir campuran 25,0 µL. Amplifikasi

dilakukan menggunakan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi

PCR yang telah dioptimasi oleh Tirtawamsa (2018) dan Karut (2018) yaitu: initial

denaturasi pada suhu 95°C (5 menit), dilanjutkan dengan denaturasi pada 95°C

(20 detik), kemudian annealing pada suhu 56,5°C (30 detik) dan ekstensi pada

suhu 72°C (30 detik). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan

selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.

Keberhasilan amplifikasi dapat dilihat dengan menggunakan fase diam agarosa

1,5% pada elektroforesis dan dievaluasi menggunakan lampu UV transilluminator

kemudian didokumentasikan menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3.


6

Analisis Produk PCR

Hasil produk PCR dianalisis menggunakan teknik elektroforesis.

Sebanyak 5,0 µL hasil PCR ditambahkan loading dye sebanyak 1,0 µL, kemudian

diambil 6,0 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang ada pada gel

menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder

sebanyak 3,0 µL sebagai marker. Hasil produk PCR dielektroforesis

menggunakan agarosa 1,5% sebagai fase diam yang telah ditambahkan dengan

nucleic acid gel stain dan dievaluasi menggunakan lampu UV transilluminator

kemudian didokumentasikan menggunakan kamera. Produk PCR yang terbentuk

yaitu alel normal CYP2A6*1 dengan panjang pita 439 bp.

Analisis Hasil

Hasil yang akan dianalisis yaitu ada tidaknya alel CYP2A6*1 dan alel

CYP2A6*7, serta frekuensi kedua alel tersebut pada nonperokok ras kulit hitam

Papua dilihat dengan menggunakan elektroforesis. Bila hasil elektroforesis pada

panjang pita 439 bp, menunjukkan adanya alel CYP2A6*1 dan jika hasil

elektroforesis tidak terdeteksi menunjukkan adanya alel CYP2A6*7.

Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 dapat dihitung menggunakan

rumus sebagai berikut:

Frekuensi alel CYP2A6*1 =


HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi polimorfisme CYP2A6.

Terdapat tiga tahapan utama yang dimiliki yaitu analisis kualitatif isolat DNA,

amplifikasi alel CYP2A6*7 dan analisis hasil produk polymerase chain reaction

(PCR) menggunakan teknik elektroforesis. Polymerase chain reaction (PCR)

merupakan suatu proses penggandaan (amplifikasi) untaian basa-basa DNA yang

dibatasi dengan adanya pasangan primer pengapit. Proses ini menggunakan teknik

pengaturan suhu dan penggunaan enzim yang tahan terhadap suhu tinggi. Enzim

dan primer spesifik terhadap target yang akan diamplifikasi mempengaruhi


7

keberhasilan metode PCR. Metode ini digunakan untuk mendeteksi polimorfisme

yang terjadi pada suatu gen (Maftuchah, et al., 2014).

Pemilihan Subjek Uji

Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 subjek nonperokok

yang terdiri dari 11 perempuan dan 19 laki-laki. Subjek uji yang digunakan

berasal dari ras kulit hitam Papua minimal sampai tiga generasi (kakek dan nenek

orang Papua asli), pernah terpapar asap rokok karena nitrosamin yang akan

dideteksi terdapat di dalam asap rokok, serta sehat jasmani dan rohani. Pada

penelitian ini subjek uji yang digunakan memiliki rata-rata usia 20 tahun dengan

syarat dapat mengerti tujuan, manfaat dan bersedia mengikuti penelitian ini, serta

dengan sadar mengisi inform consent. Menurut Manti dan Licari (2018), usia

lebih dari 18 tahun telah memenuhi syarat untuk mengikuti penelitian dan dapat

mengisi inform consent tanpa persetujuan dari pihak lain. Ukuran sampel

minimum menurut B-Rao (2001) dalam penelitian ini adalah 30 sampel yang

dapat dilihat pada lampiran (Lampiran 9).

Isolasi DNA dari Sampel Darah

Tahap isolasi DNA dari sampel darah pada penelitian ini bertujuan untuk

melisiskan sel karena DNA terdapat pada nukleus, denaturasi nukleoprotein, tahap

menonaktifkan nuklease dan enzim lainnya, menghilangkan kontaminan biologis

maupun kimia, dan mengendapkan DNA (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014).

Surzycki (2000) menyatakan bahwa dalam proses mengisolasi DNA, perlu

diperhatikan bahwa harus menghasilkan DNA tanpa mengandung kontaminan

seperti protein maupun RNA. Sampel darah akan diisolasi menggunakan FABG

buffer untuk proses melisiskan sel karena DNA terdapat di dalam nukleus.

Penambahan larutan buffer pada isolasi DNA berfungsi untuk mencegah

degradasi DNA atau kerusakan DNA oleh ion logam berat yang dapat

mempengaruhi hasil deteksi menggunakan gel elektroforesis (Chacon-Cortes and

Griffiths, 2014; Hearn and Arblaster, 2010; Handoyo and Rudiretna, 2001). DNA

yang telah dilisiskan kemudian diendapkan menggunakan etanol absolute (Hearn

and Arblaster, 2010). Proses pengendapan DNA bertujuan agar DNA yang telah

lisis tidak larut pada saat proses menghilangkan kontaminan dari DNA


8

menggunakan W1 buffer dan wash buffer (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014).

DNA yang telah dicuci, dilarutkan menggunakan elution buffer yang juga dapat

berfungsi untuk menjaga agar DNA yang dihasilkan tidak mengalami kerusakan

(Chacon-Cortes and Griffiths, 2014) dan kemudian disimpan di dalam freezer

dengan suhu sekitar -70°C untuk penyimpanan yang lebih lama yaitu 5 tahun atau

lebih serta dapat menjaga untai DNA tidak mengalami kerusakan pada saat

penyimpanan (Surzycki, 2000). Kemurnian hasil isolasi DNA dapat dilihat secara

kualitatif dengan menggunakan teknik elektroforesis.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Penelitian ini menggunakan isolat DNA yang berasal dari sampel darah

populasi nonperokok ras kulit hitam Papua. Proses analisis kemurnian isolat DNA

menggunakan elektroforesis dengan fase diam gel agarosa 1,0% (Arbeli and

Fuentes, 2007). Menurut Patramurti et al. (2014), molekul DNA yang memiliki

pita berukuran lebih dari 3000 bp serta menghasilkan pita tebal dan tunggal,

menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan murni, tidak terdegradasi dan

tidak tercemar. Apabila terbentuk pita ganda dan tipis menunjukkan bahwa isolat

yang digunakan sudah tercemar atau terdegradasi (Patramurti et al., 2014). Hasil

elektroforesis isolat DNA dapat dilihat menggunakan lampu UV transilluminator.

Pada hasil elektroforesis yang telah dilakukan menunjukkan terbentuknya pita

tunggal yang tebal dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1). Pita tunggal

menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan dalam keadaan murni dan tidak

terkontaminasi, terbentuknya pita yang tipis disebabkan karena konsentrasi isolat

DNA yang kecil. Kualitas dan kemurnian DNA yang diekstraksi merupakan

faktor penting dalam analisis PCR, sehingga DNA yang diperoleh dari proses

isolasi harus sangat murni bebas dari kontaminan-kontaminan yang dapat

menghambat kinerja analisis PCR (Tan and Yiap, 2009). Berdasarkan hasil

analisis kemurnian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa isolat DNA yang

dihasilkan murni dan terbebas dari kontaminan. Oleh karena itu, proses PCR yang

akan dilakukan tidak terhambat dan terganggu oleh kontaminan, sehingga hasil

yang didapatkan dari penelitian ini akurat.


9

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan elektroforesis

Keterangan:

M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker

5, 10, 15, 20, 25 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarosa 1%; fase gerak larutan TBE 1X;

kecepatan 110 V/cm; total volume injeksi 6 µL

Amplifikasi Alel CYP2A6*7

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel

CYP2A6*7 menggunakan metode PCR (Minematsu et al., 2006). Pada proses

PCR, kondisi tiap-tiap tahap PCR yang diadopsi dari penelitian Tirtawamsa

(2018) dan Karut (2018) yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit

dilanjutkan dengan denaturasi pada 95°C selama 20 detik, annealing pada suhu

56,5°C selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus

amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan selanjutnya diakhiri dengan

final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.

Tahap denaturasi merupakan tahap awal dalam melakukan proses PCR.

Proses denaturasi dilakukan pada suhu tinggi yaitu 95°C untuk memisahkan dua

untai DNA dengan cara mengganggu ikatan hidrogen dan interaksi susunan basa

yang menyatukan untai DNA menggunakan suhu tinggi, sehingga DNA beruntai

ganda akan menjadi untai DNA tunggal (Kadri, 2014; Handoyo and Rudiretna,

2001). DNA beruntai ganda yang telah terpisah, kemudian mengalami penurunan

suhu pada tahap annealing untuk memungkinkan primer yang digunakan dalam

proses amplifikasi terpasang pada daerah komplementer dari cetakan DNA

beruntai tunggal. Primer yang telah melekat pada untai tunggal DNA yang

Isolat DNA 3000 bp 10000 bp

bp

M 5 10 15 20 25


10

diinginkan, digunakan untuk membuat salinan DNA yang identik (Joshi, 2010).

Primer dalam reaksi PCR berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang

akan diamplifikasi sehingga diperlukan primer yang spesifik sehingga dapat

membentuk DNA sesuai yang diinginkan (Kalendar et al., 2011; McPherson and

Moller, 2006). Menurut Lorenz (2012), primer yang baik yaitu spesifik dan tidak

menempel pada organisme lain. Primer yang baik mengandung 18-30 basa

nukleotida, spesifisitas primer rendah apabila panjang primer kurang dari 18 basa.

Panjang primer lebih dari 30 basa tidak mempengaruhi peningkatan spesifisitas

primer secara bermakna. Kandungan basa nukleotida G dan C dalam suatu primer

sebesar 40-60% sebab apabila primer dengan % G dan C rendah diperkirakan

tidak mampu menempel secara efektif pada DNA cetakan sehingga dapat

menurunkan efisiensi proses PCR. Pada urutan nukleotida ujung 3’ harus

mengandung G atau C yang berperan dalam proses pengikatan primer dengan

DNA cetakan dan menghindari terjadinya mismatch.

Pada penelitian ini, digunakan primer yang diadopsi dari penelitian

Minematsu et al. (2006) yang dapat mengamplifikasi CYP2A6*1 yaitu primer

forward: 5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-3’ dan primer reverse: 5’-

AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’ yang akan menempel pada exon ke-9

pada CYP2A6*1. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1 dapat dilihat

pada gambar 2.

Alel CYP2A6*1

Primer forward

5’ 3’

CTCCCAGTCACCTAAGGACAT TTTTACCCGTACTTGCGGG

GAGGGTCAGTGGATTCCTGTA AAAATGGGCATGAACGCCC

5’ 3’

Primer reverse

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1

Keterangan:

: arah penempelan primer forward

: arah penempelan primer reverse

Tahap terakhir pada proses PCR yaitu tahap ekstensi. Tahap ekstensi

merupakan tahap memperpanjang untai DNA baru, dimulai dari posisi primer

yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target. Proses


11

memperpanjang untai DNA dilakukan oleh Taq polymerase. Taq polymerase

memiliki kecepatan penyusunan nukleotida pada suhu 72°C yaitu sekitar 35-100

basa nukleotida/detik, sehingga untuk produk PCR dengan panjang 1000 pasang

basa, waktu 30 detik merupakan waktu yang tepat untuk tahap perpanjangan

primer. Pada akhir ekstensi, dilakukan penambahan waktu 5 menit untuk

memastikan seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Tahap-

tahap PCR dapat diulangi sebanyak 35 siklus sehingga pada akhir siklus

amplifikasi akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang

merupakan hasil polimerase dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan

dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan.

Tahap amplifikasi pada penelitian ini menghasilkan produk PCR berupa

fragmen DNA berukuran 439 bp yang merupakan produk dari alel CYP2A6*1.

Pada gambar 3 ditunjukan potongan urutan basa nukleotida CYP2A6*1 yang

diadopsi dari Gen Bank. Pada gen alel CYP2A6*7 terjadi perbedaan satu basa

dengan gen alel CYP2A6*1 yaitu basa T (timin) menjadi C (sitosin) pada exon 9

menyebabkan penurunan fungsi alel (Mwenifumbo et al., 2005). Perbedaan satu

basa ini terjadi pada urutan basa primer forward gen alel CYP2A6*1 ke-21

menyebabkan primer tidak dapat menempel pada DNA target sehingga produk

yang diharapkan tidak dapat terbentuk akibat proses amplifikasi tidak

berlangsung. Perbedaan yang terjadi dapat dilihat dengan mencocokkan potongan

alel normal CYP2A6*1 menurut Gen Bank dengan urutan basa CYP2A6*7

menurut Minematsu et al. (2006) yang dapat dilihat pada gambar 3. Selain primer

forward, terdapat primer reverse yang hanya dapat digunakan untuk

mengamplifikasi gen alel CYP2A6*1 sehingga produk yang diharapkan terbentuk

yaitu hanya produk CYP2A6*1. Hal ini dapat membantu dalam menentukan

frekuensi keberadaan alel gen CYP2A6*7 pada isolat DNA ras kulit hitam Papua.


12

A. CTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTT B. CTCCCAGTCACCTAAGGACACTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTT

A. TGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGC B. TGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGC

A. GAGGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGA B. GAGGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGA

A. CCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGA B. CCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGA

A. AAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGCGGCT B. AAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGCGGCT

A. CAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAA B. CAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAA

A. CCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTC B. CCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTC

A. CTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCACGCT B. CTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCACGCT

A. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT

B. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7

(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan abu-abu, primer

ditunjukkan oleh warna merah)

Keterangan:

A. : Potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank

B. : Urutan basa CYP2A6*7 menurut Minematsu et al. (2006)

Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis

Produk PCR hasil amplifikasi alel CYP2A6*1 dalam mengidentifikasi

alel CYP2A6*7 dilihat menggunakan teknik elektroforesis dengan gel agarosa

1,5% dan didokumentasikan menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3.

Produk PCR yang didapatkan yaitu berukuran 439 bp dari 30 sampel isolat DNA

ras kulit hitam Papua (Gambar 4). Pita yang terbentuk pada ukuran 439 bp

menunjukkan terbentuknya alel aktif yaitu CYP2A6*1 dengan frekuensi 100%

dari 30 sampel (Tabel 1).


13

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA

Keterangan:

M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker

1-7 : Produk PCR dari isolat DNA yang berbeda

Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE

1X; kecepatan 110 V/cm; volume injeksi 6 µL

Tabel 1. Frekuensi Alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7

Alel Jumlah Frekuensi (%)

CYP2A6*1/CYP2A6*1 30 100

CYP2A6*1/CYP2A6*7 0 0

Fujieda (2004) dan Tanner et al. (2018) mengatakan bahwa individu

yang memiliki alel CYP2A6*7 akan mengalami penurunan aktivitas enzim dalam

mengaktivasi nitrosamin, sehingga nitrosamin tidak berubah menjadi karsinogenik

yang dapat menyebabkan risiko kanker. Pada gambar 4 menunjukkan hasil yaitu

sebanyak 30 sampel nonperokok ras kulit hitam Papua tidak memiliki alel

CYP2A6*7 namun memiliki alel CYP2A6*1 yang memiliki aktivitas enzim

normal dalam memetabolisme nitrosamin menjadi karsinogenik, sehingga

individu tersebut kemungkinan berisiko terkena kanker. Hasil amplifikasi pada

gambar 4 memperlihatkan terbentuknya 2 pita yaitu pita pertama berukuran 439

bp merupakan produk CYP2A6*1, sedangkan pita kedua berukuran 398 bp. Pita

kedua dimungkinkan merupakan produk yang dapat dikode oleh primer yang

digunakan pada penelitian ini. Hasil tersebut dapat diduga bahwa primer yang

M 7 1 2 3 4 6 5

250 bp

500 bp

Pita 2 berukuran

398 bp

10000 bp

Pita 1 berukuran

439 bp

(CYP2A6*1)


14

digunakan pada penelitian ini tidak mengkode secara spesifik pada CYP2A6*1,

namun dapat mengkode CYP yang lain.

Enzim CYP2A6 tidak hanya bertanggung jawab memetabolisme

nitrosamin namun dapat juga memetabolisme senyawa obat (Raunio et al., 2001).

Hubungan yang ditunjukkan antara polimorfisme gen dengan penggunaan obat

dalam terapi suatu penyakit tertentu sangat erat. Pada studi metabolisme obat yang

dilakukan oleh Endo et al., (2007), ditemukan bahwa metabolisme pilokarpin

menjadi 3-hydroxypilocarpine diperantarai oleh enzim CYP2A6, sehingga apabila

terjadi polimorfisme pada gen CYP2A6 yaitu CYP2A6*7 dapat menurunkan

aktivitas enzim dalam memetabolisme obat menyebabkan efek terapi yang

diharapkan tidak tercapai (Sumirtanurdin et al., 2019; Tanner et al., 2018; Park et

al., 2011). Selain pilokarpin, terdapat beberapa obat yang proses metabolismenya

diperantarai oleh CYP2A6 yaitu asam valproat, efavirenz, letrozole dan tegafur

(Tabel 2).

Tabel 2. Efek polimorfi gen CYP2A6 pada beberapa obat

Jenis

Alel Nama Obat Efek Pustaka

*4 Asam

Valproat

Terjadi penurunan kecepatan proses

hidroksilasi asam valproat menjadi 3-

OH asam valproat; 4-OH asam

valproat dan 5-OH asam valproat.

(Tanner and

Tyndale, 2017).

*9, *10,

*17, *19

Efavirenz Terjadi penurunan kecepatan proses

hidroksilasi efavirenz menjadi 7-OH-

efavirenz

(Tanner and

Tyndale, 2017;

McDonagh et

al., 2012).

*4, *4C,

*7 *11,

*18, *19

Tegafur Menurunkan bentuk aktif dari tegafur

(5-fluorourasil)

(Yamamiya et

al., 2014;

McDonagh et

al., 2012).

*4, *7,

*9, *10,

Letrozole Menurunkan kecepatan pada proses

oksidasi letrosol menjadi karbinol

(McDonagh et

al., 2012).

Berdasarkan tabel 2, dapat dilihat bahwa polimorfisme CYP2A6 dapat

mempengaruhi nasib obat dan respon obat di dalam tubuh. Oleh karena itu perlu

dilakukan penggalian informasi terhadap CYP yang dimiliki oleh pasien agar

mencapai target terapi yang diharapkan.


15

KESIMPULAN

Penelitian ini bertujuan untuk melihat keberadaan dan frekuensi gen

sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) alel *7 pada isolat DNA nonperokok ras kulit

hitam Papua. Hasil yang didapatkan yaitu tidak ditemukan isolat DNA yang

memiliki alel CYP2A6*7 atau memiliki frekuensi 0% pada nonperokok ras kulit

hitam Papua di Indonesia.

SARAN

1. Dilakukan penelitian identifikasi alel lain yang diduga dapat mempengaruhi

tingkat risiko terkena kanker pada ras kulit hitam Papua selain perokok

maupun nonperokok seperti CYP2A6*8, CYP2A6*10, dan CYP2A6* 11.

2. Dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi alel CYP2A6*7 pada

nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia, dengan kriteria subjek uji yang

berbeda seperti sedang mengalami penyakit tertentu.

3. Dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap pita 2 yang terbentuk pada produk

amplifikasi penelitian ini dengan menggunakan primer yang sama untuk

melihat sub family sitokrom P450 (CYP) yang dikode oleh primer tersebut

pada ukuran 398 bp.


16

DAFTAR PUSTAKA

Arbeli, Z., Fuentes, C.L., 2007. Improved Purification and PCR Amplification of

DNA from Environmental Samples. Federation of European

Microbiological Societies (FEMS) Microbiological Letters, 272, 269-

275.

Ashley, D.L., O’Connor, R.J., Bernert, J., Watson, C.H., Polzin, G.M., 2010.

Effect of Differing Levels of Tobacco-Specific Nitrosamines in Cigarette

Smoke on the Levels of Biomarkers in Smokers. Cancer Epidemiology

Biomarkers and Prevention, 19, 1389–1398.

B-rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.

Human Heredity, 52, 191–200.

Chacon-Cortes, D., Griffiths, L.R., 2014. Methods for Extracting Genomic DNA

from Whole Blood Samples: Current Perspectives. Journal of

Biorepository Science for Applied Medicine, 2, 1-9.

Chiang, H., Wang, C., Lee, H., Tsou, T., 2011. Metabolic effects of CYP2A6 and

CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)-

induced gene mutation. A mammalian cell-based mutagenesis approach.

Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2), 145–152.

Dede, C., dan Cinar, N., 2016. Environmental Tobacco Smoke and Children’s

Health. Iranian Journal of Pediatrics, 26(5), 4–5.

Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M.A., Dosaka-akita,

H., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., Kamataki, T., 2004.

Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of

smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese

smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451–2458.

Handoyo, D., Rudiretna, A., 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase

Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(10), 17-29.

Hearn, R.P., Arblaster, K.E., 2010. DNA Extraction Techniques for Use in

Education. Biochemistry Molecular Biology Education, 38(3), 161-166.

IARC, 2007. IARC Monographs On The Evaluation Of Carcinogenic Risks To

Humans; “Smokeless Tobacco And Some Tobacco-Specific N-

Nitrosamines”. World Health Organization International Agency For

Research On Cancer. Volume 89.

Jordjevic, N.D., Arrillo, J.A.C., Roek, M.P.J.V.D.B., Ishikawa, J.K., Oh, H.R.,

Ertilsson, L.B., Klillu, E.A., 2013. Comparisons of CYP2A6 Genotype

and Enzyme Activity between Swedes and Koreans. Japanese Society for

the Study of Xenobiotics, 28(2), 93-97.

Joshi, M., dan D, Deshpande J. 2011. Polymerase Chain Reaction; Methods,

Principles and Application. International Journal of Biomedical

Research, 5, 81-97.

Kadlubar, S., Anderson, J.P., Sweeney, C., Gross, M.D., Lang, N.P., Kadlubar,

F.F., Anderson, K.E., 2009. Phenotypic CYP2A6 Variation and the Risk

of Pancreatic Cancer. Journal of the Pancreas, 10(3), 263–270.

Kalendar, R., Lee, D., Schulman, A.H., 2011. Java Web Tools for PCR, in silico

PCR, and Oligonucleotide Assembly and Analysis. Elsevier Genomics,

38, 137-144.


17

Karki, R., Pandya, D., Elston, R.C., Ferlini, C., 2015. Defining “mutation” and “

polymorphism” in the era of personal genomics. BMC Medical

Genomics, 8, 1–7.

Karut, A.K., 2018. Identifikasi Gen CYP2A6 Alel *7 pada Isolat DNA Perokok

Suku Tionghoa di Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction.

Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, 1-16.

Liu, T., David, S.P., Tyndale, R.F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y.-H., Yu,

X.-Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X.-Z., Chen, W.-Q., 2011.

Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern

China. National Institute of Health Public Access, 106(5), 985-994.

López-Flores, L.A., Pérez-Rubio, G., Falfán-Valencia, R., 2017. Distribution of

Polymorphic Variants of CYP2A6 and Their Involvement in Nicotine

Addiction. Experimental and Clinical Sciences Journal, 16, 174-196.

Lorenz, T.C., 2012. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus

Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized

Experiment, 63, 1-15.

Maftuchah, Winaya, A., Zainudin, A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi

Molekuler. Deepublish Publisher, Sleman.

Manti, S., Licari, A., 2018. How to Obtain Informed Consent for Research.

Breathe, 14(2), 145-152.

McDonagh, E.M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B.,

Whirl-Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB Summary – Very

Important Pharmacogene Information for Cytochrome p-450, Family 2,

Subfamily A, polypeptide 6 (CYP2A6). National Institutes of Health

Public Access Pharmacogenet Genomics, 22(9), 695-708.

McPherson, M.J., Moller, S.G., 2006. PCR. 2nd

Edition. New York: Taylor &

Francis, 305.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., 2006.

Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4, *7 and *9

polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.

Mwenifumbo, J.C., Myers, M.G., Wall, T.L., Lin, S., Sellers, E.M., Tyndale, R.F.,

2005. Ethnic variation in CYP2A6*7, CYP2A6*8 and CYP2A6*10 as

assessed with a novel haplotyping method. Pharmacogenetics and

Genomics, 15(3), 189–192.

Nakajima, M., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,

Kwon, J.-T., McLeod, H.L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive evaluation

of variability in nicotine metabolism and CYP2A6 polymorphic alleles in

four world populations. Kanazawa University Repository for Academic

resources, 1-33.

Park, S.R., Kong, S.Y., Nam, B.H., Choi, I., Kim, C.G., Lee, J.Y., Cho, S.J., Kim,

Y.W., Ryu, K.W., Lee, J.H., Rhee, J., Park, Y.I., Kim, N.K., 2011.

CYP2A6 and ERCCI Polymorphisms Correlate with Efficacy of S-I plus

Cisplatin in Metastatic Gastric Cancer Patients. British Journal of

Cancer, 104, 1126-1134.

Patramurti, C., Nurrochmad, A., Martono, S., Science, P., Mada, G., Chemistry,

P., 2014. Polymorphism Of Cytochrome P450 2a6 (Cyp2a6*1 And


18

Cyp2a6*4) Among Javanese Indonesian Smoker And Non Smoker.

Indonesian Journals of Pharmacy, 26(1), 11–19.

PharmVar, 2012. CYP2A6. https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6, diakses

pada tanggal 14 April 2019 pukul 17.45 WIB.

Raunio, H., Rautio, A., Gullstén, H., Pelkonen, O., 2001. Polymorphisms of

CYP2A6 and its Practical Consequences. British Journal of Clinical

Pharmacology, 52(4), 357-363.

Schroeder, S.A., Warner, K.E., 2010. Don’t Forget Tobacco. The England Journal

of Medicine, 201–204.

Stephenson, F.H., Abilock, M.C., 2014. PCR Optimization.

Sumirtanurdin, R., Thalib, A.Y., Cantona, K., Abdulah, R., 2019. Effect of

Genetic Polymorphisms on Alzheimer’s Disease Treatment Outcomes;

An Update. Clinical Interventions in Aging, 14, 631-642.

Surzycki, S., 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,

Berlin, Heidelberg, New York.

Tan, S.C., Yiap, B.C., 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and

The Present.. Journal of Biomedicine Biotechnology, 1-10.

Tanner, J.-A., Henderson, J.A., Buchwald, D., Howard, B. V., Henderson, P.N.,

Tyndale, R.F., 2018. Variation in CYP2A6 and nicotine metabolism

among two American Indian tribal groups differing in smoking patterns

and risk for tobacco-related cancer. HHS Public Access Pharmacogenet

Genomics, 27(5), 169–178.

Tirtawamsa, G.A., 2018. Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *7

Pada Isolat DNA Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia dengan

Metode Polymerase Chain Reaction. Skripsi. Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, 1-12.

Wassenaar, C.A., 2015. Variation in Nicotine and Nitrosamine Pharmacology

Genes and Smoking-Associated Lung Cancer by Smoking-Associated

Lung Cancer. Department of Pharmacology and Toxicology University of

Toronto, 27-40.

Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of Cancer Induction by Tobacco-

Specific NNK and NNN. Journal of Cancers, 6, 1138–1156.

Yamamiya, I., Kunihiro, Y., Ishii, Y., Yamada, H., Chiba, M., 2014. Effect of

CYP2A6 Genetic Polymorphism on the Metabolic Conversion of

Tegafur to 5-Fluorouracil and Its Enantioselectivity. American Society

for Pharmacology and Experimental Therapeutics (ASPET) Journal, 42,

1485-1492.

Yusuf, Z.K., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), 1-6.


https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6

19

LAMPIRAN


20

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


21

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certification of Analysis


22

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


23

Lampiran 4. Usage information of FavorPrepTM

Blood Genomic DNA Extraction

Mini Kit


24

Lampiran 5. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*7


25

Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers


26

Lampiran 7. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA

M 1 2 3 4 5


27

Lampiran 8. Elektroforegram Hasil PCR

1 2 3 4 5 6 7 M M 8 9 10 14

11 13 12 14

15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28

29 30

M

M M 29 30


28

Lampiran 9. Perhitungan Jumlah Sampel

Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal

pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:

Nmin ≥ log (1 – π)/2log (1 – fmin)

Keterangan:

Nmin : Jumlah sampel minimal

π : probabilitas alel utama

fmin : frekuensi alel minor

Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:

CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*7 (alel minor). Maka menurut B-Rao

(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =

0,95 dan fmin = 0,05.

Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:

Nmin = log (1 – π)/2log (1 – fmin)

= log (1 – 0,95)/2log (1-0,05)

= 28,89

= 29 orang

Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang.

Jumlah tersebut sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik

polimorfisme.


29

Lampiran 10. Data Subjek

Subjek Genotip Tingkat risiko kanker

1p CYP2A6*1/CYP2A6*1 Normal































30

Lampiran 11. Formulir Kuisisoner Subjek Uji


31


32

Lampiran 12. Frekuensi Alel


=

= 100%


=

= 0%


33

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Natasya Nora Rubiyo, lahir di

Merauke pada tanggal 25 November 1998 dan merupakan

anak ketiga dari pasangan Eddi Mulariman Rubiyo dan Judith

Yemima Pepiana. Pendidikan formal yang telah ditempuh

oleh penulis yaitu mulai dari TK St. Bernadeta (2002-2004),

melanjutkan ke tingkat sekolah dasar di SD YPPK St.

Fransiskus Xaverius 2 Merauke (2004-2010), tingkat sekolah

menengah pertama di SMP Negeri 2 Merauke (2010-2013), dan tingkat sekolah

menengah atas di SMA Stella Duce 2 Yogyakarta (2013-2016). Pada tahun 2016,

penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang perguruan tinggi di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam

kepanitiaan Pelepasan Wisuda tahun 2016 dan Pelepasan Wisuda tahun 2017

sebagai anggota seksi PDD, sebagai koordinator seksi dalam kegiatan kepanitiaan

TITRASI 2017, serta sebagai anggota seksi dalam kegiatan kepanitiaan Latihan

Alam 1 PSM Cantus Firmus pada tahun 2018. Selain aktif dalam kegiatan

kepanitiaan, penulis juga mengikuti beberapa perlombaan dalam bidang seni yaitu

perlombaan Pekan Olahraga dan Seni Farmasi Indonesia (PORSFI) pada tahun

2017 sebagai juara 1 dan perlombaan Paduan Suara Gerejawi Mahasiswa

Nasional XV pada tahun 2018 dengan membawa mendali emas dan perak.


identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*7 pada …ii identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*7 pada...

Documents

identifikasi alel gen sitokrom p450 2a67 pada …ii identifikasi alel gen sitokrom p450 2a67 pada...