identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*9 pada subjek …

i

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*9 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN

METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Mensiana Lodvi Putarato

NIM : 168114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*9 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN

METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Mensiana Lodvi Putarato

NIM : 168114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Saya persembahkan skripsi ini untuk :

Tuhan Yesus

Bapak Victor Ngongo Putarato, Mama Dorkas Lende, Endo

Putarato, Alm. Rian Putarato, Ney Putarato dan Ona.

Keluarga Besar Loli dan Wewewa.

Sahabat dan teman-teman saya tercinta, serta Almamater

saya.


vi


vii


viii

PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Tuhan yang Maha Esa karena atas berkat,

kasih dan penyertaan-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul

“Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*9 pada Subjek Uji Nonperokok Ras

Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” untuk

memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program

Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma. Skripsi ini merupakan bagian dari

penelitian Dr. Christine Patramurti, Apt., dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6

Alel *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di

Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” .

Selama proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan

bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan

terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan sekaligus dosen

pembimbing atas segala kesabaran, bimbingan, ilmu, semangat, nasihat serta

dukungan kepada penulis.

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma dan juga sebagai dosen penguji yang

telah memberi semangat, kritik serta saran yang sangat membangun dalam

penelitian ini.

4. Bapak Maywan Hariono Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang telah

memberi semangat, kritik dan saran yang sangat membangun dalam

penelitian ini.

5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik

(DPA) atas bimbingannya selama ini.

6. Bapak Kayatno selaku laboran yang telah membantu selama penelitian.


ix

7. Segenap dosen Fakultas Farmasi yang dengan sabar dan tulus membagikan

ilmu pengetahuan kepada penulis serta karyawan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta atas pelayanan dan bantuannya

selama ini.

8. Bapak Victor Ngongo Putarato, Mama Dorkas Lende serta adik-adik penulis

Yuninto Medvi Putarato, Alm. Aprianto Nidvi Putarato, Nerliyati Radvi

Putarato, Ona Rostanti Pati Iwu, Elisabet Sarinto Ina Kii, dan Devandi

Giovani Porta Lero atas cinta kasih, motivasi, dukungan dan doa yang terus

membuat penulis kuat dan bersemangat dalam menggapai segala harapan dan

cita-cita. Terkhusus untuk satu-satunya adik laki-laki penulis Alm. Aprianto

Nidvi Putarato terima kasih pernah hadir dan membuat hidup penulis

berwarna serta selalu bersyukur atas kebaikan Tuhan dalam keluarga kami

“Terang Indah” dan seluruh keluarga besar kami.

9. Alm. Opa Dato Toda dan Oma Ester Waingu Bella (Ina Ngongo), Alm. Opa

Matius Lende Domba, dan Almh. Oma Apliana Peda Daido, serta Opa

Benyamin Bora Busha dan Oma Lidia K. Wolla atas segala perhatian, cinta

kasih dan dukungan doa yang selalu menguatkan penulis sehingga penulis

dapat melangkah sejauh ini. Terkhusus untuk Alm. Opa Dato Toda yang telah

berpulang sebelum penulis lahir, melalui cerita Bapak dan keluarga penulis

tahu Opa sangat menyayangi penulis dan cucu-cucu Opa yang lain, serta Alm.

Opa Matius Lende Domba dan Almh. Oma Apliana Peda Daido terima kasih

untuk segala kasih sayang dan kenangan dimasa kecil yang pernah Opa dan

Oma berikan kepada penulis.

10. Keluarga besar Loli terkhusus Keretoma dan Kurutepe serta keluarga besar

Wewewa terkhusus Pantendabola yang selalu mendoakan dan memberikan

semangat serta dukungan kepada penulis.

11. Sahabat-sahabat penulis “LORY” yakni Resita Wedu, Ocha Valentine dan

Yani Etna yang selalu setia dan memotivasi penulis untuk terus berkembang

serta selalu menjadi sahabat berbagi cerita baik dalam suka dan duka.

12. Wiwy, Indah Gery Cho, Rani Langkeru, Agatha Maia, dan Ayu P.D. yang

selalu setia mendukung dan memberikan semangat kepada penulis baik dalam


x


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ......................................................................................... i

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. vi

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................ vii

PRAKATA ....................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv

ABSTRAK ........................................................................................................ xv

ABSTRACT ....................................................................................................... xvi

PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 7

KESIMPULAN ................................................................................................. 13

SARAN ............................................................................................................. 14

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 15

LAMPIRAN ...................................................................................................... 18

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 33


xii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hubungan polimorfisme CYP2A6 dengan respon substrat/obat... ........ 13


xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kemurnian isolat DNA................................................... 9

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen alel gen CYP2A6*1 ............... 10

Gambar 3. Urutan nukleotida alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 ....... 11

Gambar 4. Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 ........ 12


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearance........................................................................ 19

Lampiran 2. Perhitungan Jumlah Sampel ........................................................ 20

Lampiran 3. Hasil Kuesioner ........................................................................... 21

Lampiran 4. Data Subjek Uji Hasil Kuesioner ................................................. 24

Lampiran 5. Usage Information of FavorPrepTM

............................................. 25

Lampiran 6. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ....................... 27

Lampiran 7. Usage Information of Go Taq Green Master Mix......................... 28

Lampiran 8. Product Information of DNA Ladder ........................................... 29

Lampiran 9. Product Datasheet of primer forward and reverse ....................... 30

Lampiran 10. Hasil Analisis Kemurnian Isolat DNA ......................................... 31

Lampiran 11. Hasil Identifikasi Alel Gen CYP2A6*1 dan *9 ............................ 31

Lampiran 12. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *1 dan *9 ...................................... 32


xv

ABSTRAK

Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNA) seperti 4-(metilnitrosamino)-

1-(3-piridil)-1-butanon (NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) merupakan

senyawa prokarsinogen yang terdapat dalam asap rokok. TSNA perlu diaktivasi

untuk dapat menjadi senyawa karsinogen yang menyebabkan kanker. Enzim

sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan salah satu enzim yang mengaktivasi

TSNA yang diekspresikan oleh gen CYP2A6 dan diketahui memiliki

polimorfisme yang tinggi. Salah satunya adalah alel gen CYP2A6*9 yang

mengalami single nucleotide polymorphism (SNP) dalam kotak TATA di daerah

promotor (T-48G). Polimorfisme CYP2A6*9 telah dilaporkan terjadi pada

populasi Afrika berkulit hitam di Ghana yang memiliki kesamaan ras dengan ras

kulit hitam Papua Indonesia, yaitu ras Negroid. Penelitian ini adalah studi

deskriptif observasional dengan tujuan untuk mengidentifikasi keberadaan

CYP2A6*9 dan frekuensi CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras kulit hitam

Papua Indonesia. Subjek uji berjumlah 30 orang dengan kriteria inklusi dan

eksklusi yang diambil sampel darahnya lalu dilakukan isolasi DNA. Polimorfisme

pada CYP2A6*9 diidentifikasi dengan menggunakan metode Polymerase Chain

Reaction (PCR). Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan alel gen

CYP2A6*9 dari 30 subjek uji, sehingga enzim CYP2A6 akan bekerja secara

normal dalam proses aktivasi metabolisme TSNA.

Kata Kunci: CYP2A6*9, polimorfisme, TSNA, nonperokok, ras kulit hitam

Papua, PCR.


xvi

ABSTRACT

Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNA) such as 4-(metilnitrosamino)-1-

(3-piridil)-1-butanon (NNK) and N-nitrosonornikotin (NNN) are procarcinogenic

compounds found in cigarette smoke. TSNA needs to be activated to change it into

carcinogen that causes cancer. Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) is an enzyme

that activates TSNAs expressed by the CYP2A6 gene and known to have a high

polymorphism. One of them is the CYP2A6*9 gene allele which experiences

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in the TATA box of the promoter region

(T-48G). The CYP2A6*9 polymorphism has been reported in black African

populations in Ghana who have racial similarities to the black Papuan, the

Negroid race. This is an observational descriptive study with the aim to identify

the presence of CYP2A6*9 and the frequency of CYP2A6*9 in black non-smoker

Papua Indonesia. Thirty people are involved as subjects in this study with

inclusion and exclusion criteria. Blood samples were collected and then DNA

furtherly isolated. Polymorphisms in CYP2A6*9 were identified using the

Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The results showed that there were no

CYP2A6*9 gene alleles from 30 test subjects, so the CYP2A6 enzyme would work

normally in the process of TSNA metabolism activation.

Keywords: CYP2A6*9, polymorphism, TSNA, non-smoker, black Papuan, PCR.


1

PENDAHULUAN

Polusi asap rokok merupakan salah satu masalah yang sedang

diselesaikan pemerintah Indonesia. Hal ini dilakukan dengan mengeluarkan

Undang-undang No. 36 tahun 2009 tentang Kesehatan pada pasal 115 yang

mengatur tentang larangan merokok di tempat umum atau Kawasan Tanpa Rokok

(KTR) dan menyediakan area khusus untuk merokok (Suryantisa, 2018). Kota

Yogyakarta merupakan salah satu daerah yang telah menerapkan KTR dengan

mengeluarkan Peraturan Daerah Kota Yogyakarta No. 2 tahun 2017 tentang KTR

untuk mengatasi polusi asap rokok. Masalah polusi asap rokok penting untuk

diselesaikan karena asap rokok menyebabkan pencemaran udara yang dapat

dihirup oleh perokok itu sendiri dan juga perokok pasif. Perokok pasif adalah

orang yang bukan perokok tetapi menghirup asap rokok orang lain atau orang

yang berada dalam satu ruangan tertutup dengan orang yang sedang merokok

(Kementerian Kesehatan RI, 2019). Asap rokok yang dihirup oleh perokok pasif

jauh lebih berbahaya bagi kesehatan karena berisiko terkena berbagai penyakit

seperti serangan jantung atau stroke dan kanker paru-paru (Suryantisa, 2018).

Asap rokok merupakan aerosol kompleks yang mengandung sekitar 4000

senyawa toksik dan karsinogenik (Ashley et al., 2010; Geiss and Kotzias, 2007;

Suryantisa, 2018). Asap rokok mengandung Tobacco-specific nitrosamines

(TSNA) (IARC, 2004) seperti 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon

(NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) (Ashley et al., 2010) yang merupakan

senyawa karsinogen bagi manusia apabila dimetabolisme aktivasi oleh suatu

enzim, namun apabila tidak teraktivasi maka senyawa ini bersifat prokarsinogen

(Geiss and Kotzias, 2007; IARC 2007). Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6)

merupakan salah satu enzim utama yang mengaktifkan TSNA seperti NNN dan

NNK terutama dalam asap rokok (Liu et al., 2013; Mwenifumbo et al., 2008;

Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012) dan NNAL yang merupakan hasil metabolik

dari NNK. Aktivasi NNK, NNN dan NNAL terjadi melalui reaksi α-hidroksilasi

yang menghasilkan senyawa dengan ion diazonium yang dapat terikat pada DNA

sehingga dapat membentuk DNA adduct yang menyebabkan kanker pada jaringan

yang terpapar asap rokok seperti paru-paru dan laring (Chiang et al., 2011; Hecht


2

and Hoffmann, 1989; Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Selain senyawa TSNA,

enzim CYP2A6 juga berperan dalam memetabolisme obat-obatan dan bahan

kimia (Alsanosi et al., 2014; Fujieda et al., 2004). Enzim CYP2A6 merupakan

enzim yang dikode oleh gen CYP2A6 (Rossini et al., 2008). Gen CYP2A6 telah

dilaporkan banyak mengalami polimorfisme (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

Polimorfisme pada CYP2A6 menyebabkan kerja enzim menjadi

menurun, meningkat atau bahkan menghilang (Mwenifumbo et al., 2010; Raunio

and Rahnasto-Rilla, 2012). Hingga saat ini telah diidentifikasi 89 jenis alel

CYP2A6 (PharmVAr, 2012). Alel gen CYP2A6*1 merupakan bentuk normal atau

wild type dari gen CYP2A6, sedangkan sebagian lainnya merupakan bentuk yang

mengalami polimorfisme. Menurut Minematsu et al. (2006), polimorfisme gen

CYP2A6 yang umum pada populasi Asia adalah variasi alel gen CYP2A6 *4,*7

dan *9. Pada alel gen CYP2A6*9 terjadi single nucleotide polymorphism (SNP)

dalam kotak TATA di daerah promotor (T-48G), yang dapat menurunkan

aktivitas transkripsi dan metabolik in vivo dari CYP2A6 (Minematsu et al., 2006;

Yoshida et al., 2003). Hal ini menyebabkan penurunan aktivasi senyawa TSNA

yang berpotensi mengurangi risiko kanker paru-paru (Liu et al., 2013; Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012).

Alel gen CYP2A6*9 dapat ditemukan pada populasi maupun ras tertentu

dalam jumlah frekuensi yang berbeda. Pada populasi Afrika berkulit hitam di

Ghana ditemukan alel gen CYP2A6*9 dengan frekuensi 5,7% (Gyamfi et al.,

2005). Populasi Afrika di Ghana ini memiliki kesamaan ras dengan ras kulit hitam

Papua Indonesia yaitu ras Negroid (Gayanti, 2017). Hal ini menunjukkan terdapat

kemungkinan populasi Papua di Indonesia juga memiliki polimorfisme

CYP2A6*9. Penelitian yang bertujuan untuk mengidentifikasi CYP2A6*9 telah

dilakukan oleh Prabowo (2017) pada subjek uji perokok ras kulit hitam Papua

Indonesia dan didapatkan frekuensi alel gen CYP2A6*9 adalah 0%. Oleh karena

itu, perlu dilakukan identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada subjek uji yang berbeda

yaitu nonperokok untuk mengetahui lebih lanjut mengenai frekuensi polimorfisme

alel gen CYP2A6*9 pada ras kulit hitam Papua Indonesia.


3

Polimorfisme pada alel gen CYP2A6*9 ini dapat dideteksi dengan

metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah metode yang dapat

melipatgandakan (amplifikasi) potongan DNA dalam waktu singkat (Bintang,

2018). Menurut Bintang (2018) dan Querci et al. (2006) metode PCR terdiri atas 3

tahapan yaitu: pemisahan untai DNA (denaturasi), annealing dan sintesis DNA

(extension).

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Sampel darah subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua, Primer

forward: (5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-

GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’) (Yoshida et al., 2003), Promega Go Taq

Green Master Mix (yang mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, dan

buffer), FavorPrepTM

Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell), 10X Tris-

Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), agarose

(Vivantis), FluoroVueTM

Nucleic Acid Gel Stain (SMOBIO), 1KB (0.25-10 kb)

DNA Ladder (SMOBIO), loading dye, etanol absolut (Sigma Chemical Co., St.

Louis), dan Water For Injection (WFI) (Ikapharmindo).

Alat Penelitian

Alat-alat gelas, Thermal cycler Perkin Elmer 2400, satu set Elektroforesis

horizontal (Sigma Aldrich), UV Transilluminator (fisher scientific), dispossable

gloves, microtube 1,5 mL, hot plate (Thermo scientific), mikropipet, waterbath,

blue tip, yellow tip, white tip, Microcentrifuge (Thermo fisher scientific), kamera

Mirrorless Fuji Film XA3, spuit injeksi 3 mL (Terumo), vacutainer K2 yang

mengandung EDTA 5,4 mg, PCR® Tubes (Axygen), FABG column, collection

tube 2 mL, timbangan analitik (METTLER AE 260), dan vortex.

Pemilihan Subjek Uji

Subjek uji dalam penelitian ini berjumlah 30 orang dengan kriteria yaitu

nonperokok, berusia ≥18 tahun, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal

sampai third degree relativies (kakek dan nenek orang Papua asli), dan tinggal di

Yogyakarta. Pada penelitian ini dilakukan eliminasi pada subjek uji yang sedang


4

terkena penyakit yang disebabkan oleh virus dan bakteri. Subjek uji dengan sadar

dan bersedia menandatangani inform consent. Penelitian yang dilakukan di

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma ini telah

memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran

Universitas Kristen Duta Wacana, Yogyakarta.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Sampel darah dari subjek uji akan diambil oleh petugas profesional

perawat. Sampel darah subjek uji diambil dari pembuluh vena, yang kemudian

ditampung dalam vacutainer K2 yang berisi EDTA 5,4 mg. Sampel darah yang

diperoleh disimpan pada suhu ± 4°C, sebelum dianalisis. Sampel darah ini

kemudian akan digunakan untuk identifikasi alel gen CYP2A6*9.

Isolasi DNA

Sampel darah yang telah disiapkan kemudian diisolasi dengan

menggunakan FavorPrepTM

Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sampel

darah diambil sebanyak 200 µL dan dipindahkan ke microtube 1,5 mL. Proteinase

K sebanyak 20 µL dan FABG buffer 200 µL ditambahkan ke dalam sampel lalu

divortex sebentar. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 60°C

selama 15 menit untuk melisiskan sampel serta pada setiap menit ke-3 divortex

selama 30 detik. Setelah selesai diinkubasi campuran tersebut disentrifugasi pada

kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kemudian ditambahkan 200 µL etanol

absolut ke dalam sampel dan divortex selama 30 detik. Campuran tersebut

kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kolom

FABG disiapkan dan dipasangkan pada collection tube, lalu campuran sampel

ditransfer dari microtube 1,5 mL ke dalam kolom FABG yang telah terpasang

collection tube. Campuran sampel yang telah dipindahkan disentrifugasi pada

kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, lalu cairan yang ada pada collection tube

dibuang. Selanjutnya kolom FABG dipasangkan pada collection tube baru. Kolom

FABG segera dicuci dengan ditambahkan 500 µL W1 buffer lalu disentrifugasi

pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit lalu sisa cairan pada collection tube

dibuang. Kolom FABG kemudian dicuci dengan 750 µL wash buffer lalu

disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit lalu sisa cairan pada


5

collection tube dibuang. Selama 4 menit dilakukan sentrifugasi untuk

mengeringkan kolom FABG. Kolom FABG yang telah kering dipasangkan pada

elution tube dan ditambahkan 200 µL elution buffer pada FABG kolom.

Kemudian dibiarkan berdiri diam selama 3 menit dan disentrifugasi selama 3

menit untuk mengelusi DNA pada kecepatan 13.000 rpm. Isolat DNA disimpan

pada suhu -70°C.

Analisis Kemurnian Isolat DNA

Analisis kemurnian isolat DNA dapat dilakukan dengan metode

elektroforesis yang menggunakan gel agarose 1,0%. Cara pembuatan gel agarose

1,0% yaitu dengan menggunakan 250 mg agarose yang dilarutkan dalam larutan

1x TBE buffer sebanyak 25 mL. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dengan

hot plate sambil diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut dan menjadi jernih.

Larutan agarose 1% yang telah jernih diangkat, lalu ditambahkan 2,5 μL larutan

Nucleic Acid Gel Stain dan diaduk hingga homogen. Larutan gel agarose yang

telah siap, dituang ke dalam cetakan gel yang sebelumnya telah diberi sisiran pada

tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisiran dicabut setelah gel mengeras

sehingga terbentuk sumur-sumur, kemudian ditempatkan ke dalam gel tray

elektroforesis yang sudah berisi larutan 1x TBE buffer. Isolat DNA diambil

sebanyak 4,0 μL, ditambahkan WFI sebanyak 1,0 μL dan dicampur dengan

loading dye sebanyak 1,0 μL. Campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 μL dan

dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel

diisi dengan 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebanyak 3,0 μL sebagai marker dan

dilakukan elektroforesis dengan kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit. Pada pH

netral molekul DNA yang bermuatan negatif akan bergerak menuju kutub positif

karena adanya pengaruh medan listrik. Hasil elektroforesis dideteksi di bawah UV

Transilluminator dan didokumentasikan menggunakan kamera Mirrorless Fuji

Film XA3. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus

masing-masing pita sampel isolat DNA dengan posisi pita DNA ladder.

Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR

Fragmen alel gen CYP2A6*9 diidentifikasi melalui proses amplifikasi

menggunakan primer yang diadopsi dari Yoshida et al. (2003), yaitu primer


6

forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'- GGC

TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR

menggunakan bahan yang terdiri atas Promega Go Taq Green Master Mix 12,5

μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, dan WFI

5,0 μL. Kondisi PCR untuk proses amplifikasi yang digunakan didasarkan pada

hasil optimasi yang dilakukan oleh Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan

mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR diatur sebagai

berikut: initial denaturasi pada suhu 94ºC selama 3 menit; dilanjutkan dengan

denaturasi pada suhu 94ºC selama 30 detik; annealing pada suhu 60ºC selama 30

detik dan ekstensi pada suhu 70ºC selama 25 detik. Siklus amplifikasi dilakukan

sebanyak 35 kali dan diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC selama 5

menit. Hasil produk PCR disimpan pada suhu -70°C.

Identifikasi Alel Gen CYP2A6*9

Hasil produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis pada kecepatan

100 volt/cm selama 30 menit menggunakan fase diam agarose 1,5% yang

ditambahkan dengan Nucleic Acid Gel Stain dan fase gerak larutan 1x TBE buffer.

Hasil elektroforesis kemudian dilihat dengan menggunakan lampu UV

Transilluminator. Hasil produk PCR ditunjukkan dengan adanya pita yang

kemudian didokumentasi dengan kamera Mirrorless Fuji Film XA3. Produk PCR

yang terbentuk pada penelitian ini adalah alel gen CYP2A6*1 yang berada pada

pita 368 bp (Yoshida et al., 2003).

Analisis Hasil

Untuk mengetahui adanya alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9

dapat dideteksi dengan metode elektroforesis. Adanya produk yang terbentuk

menunjukkan alel gen CYP2A6*1, sedangkan jika tidak terbentuk produk maka

menunjukkan adanya alel gen CYP2A6*9.

Frekuensi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 dapat dihitung dengan

rumus:

Frekuensi CYP2A6*1 =



7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan alel gen

CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia.

Penelitian ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA,

analisis kemurnian isolat DNA, dan identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada produk

PCR yang diamplifikasi dengan metode PCR. Metode yang digunakan dalam

mengidentifikasi alel gen CYP2A6*9 adalah metode PCR yang dapat

melipatgandakan (amplifikasi) potongan DNA dalam waktu singkat (Bintang,

2018). CYP2A6*9 merupakan alel yang akan diidentifikasi dalam penelitian ini

karena telah dilaporkan terdapat pada beberapa ras dan populasi di dunia.

Pemilihan Subjek Uji

Subjek uji dalam penelitian ini berjumlah 30 orang yang terdiri atas 19

orang laki-laki dan 11 orang perempuan yang berusia 18-23 tahun (Lampiran 4).

Subjek uji merupakan keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal sampai third

degree relatives dan tinggal di Yogyakarta. Jumlah sampel minimal pada

penelitian genetik menurut B-Rao (2001) adalah 29 orang (Lampiran 2), sehingga

jumlah sampel subjek uji yang digunakan sudah memenuhi kriteria. Pada

penelitian ini terdapat kendala dalam mencari subjek uji yang bersedia

berpartisipasi dalam penelitian ini serta sebagian besar calon subjek uji adalah

perokok. Pada subjek uji yang merupakan seorang perokok akan langsung

dieksklusikan. Hal ini karena penelitian ini hanya akan mengidentifikasi alel gen

CYP2A6*9 pada subjek nonperokok. Pada subjek uji yang sedang sakit akibat

virus dan bakteri juga akan dieksklusikan karena dapat mempengaruhi kemurnian

hasil isolasi DNA.

Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan reagen FavorPrepTM

Blood Genomic DNA

Extraction Mini Kit yang terdiri atas Proteinase K, FABG Buffer, W1 buffer, wash

buffer, dan elution buffer serta etanol absolut. Pada isolasi DNA dengan

Extraction Mini Kit bahan yang digunakan telah dirancang untuk memudahkan

dalam melakukan isolasi DNA serta terdapat fasilitas FABG column yang

merupakan tabung dengan matriks yang berfungsi untuk mengikat DNA. Matriks


8

tersebut terlindung oleh tabung sehingga tidak mudah rusak (Kamaliah, 2017).

Selain reagen terdapat beberapa alat yang digunakan untuk membantu proses

isolasi seperti vortex dan microcentrifuge. Vortex adalah suatu alat yang berfungsi

untuk mencampur sampel darah dengan reagen sehingga dapat tercampur dengan

homogen (Maftuchah et al., 2014), sedangkan microcentrifuge berfungsi untuk

memisahkan suatu bahan berdasarkan berat molekul dengan kecepatan tertentu

(Bintang, 2018).

Pada isolasi DNA dengan Extraction Mini Kit diawali dengan pelisisan

sel dengan menggunakan proteinase K dan FABG buffer (Anonim, 2019;

Khosravinia et al., 2007), selain itu proteinase K juga berfungsi untuk pemurnian

DNA dari protein (penghancuran protein) (Anonim, 2019; Fatchiyah et al., 2011;

Kamaliah, 2017). DNA yang diperoleh setelah pelisisan sel masih tercampur

dengan isi sel yang lain sehingga dilakukan proses presipitasi DNA dengan

menggunakan etanol absolut (Kamaliah, 2017). DNA yang telah terpresipitasi

kemudian akan dicuci dengan W1 buffer untuk menghilangkan residu protein dan

residu RNA serta dicuci juga dengan wash buffer untuk menghilangkan residu

garam serta etanol (Geneaid, 2019). Tahap terakhir ditambahkan elution buffer

untuk melarutkan atau mengelusi DNA. Isolat DNA kemudian disimpan di dalam

freezer pada suhu -70°C. Hasil isolat DNA dapat dianalisis kemurniannya secara

kualitatif dengan teknik elektroforesis.

Analisis Kemurnian Isolat DNA

Analisis kemurnian isolat DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis

sebelum isolat DNA diamplifikasi dengan metode PCR. Elektroforesis merupakan

teknik untuk memisahkan makromolekul seperti DNA dan protein yang

bermuatan karena adanya pengaruh medan listrik berdasarkan berat molekul dan

berguna dalam analisis kualitatif produk PCR. Selain untuk mendeteksi

kemurnian DNA elektroforesis dapat digunakan untuk menentukan berat molekul

(BM) dan menetapkan titik isolistrik (Bintang, 2018). Hasil analisis kemurnian

isolat DNA yang baik ditandai dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal serta

tidak terbentuk pita ganda pada ukuran >10.000 bp yang menunjukkan isolat

DNA murni, tidak tercemar oleh protein atau bagian sel lain serta tidak


9

terdegradasi (Faatih, 2009; Patramurti et al., 2014). Posisi pita >10.000 bp dapat

diketahui dengan menggunakan 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker

yang dapat menampilkan pita dari 250 bp sampai 10.000 bp. Berdasarkan hasil

penelitian bentuk pita yang dihasilkan adalah pita tunggal dan tebal yang memiliki

ukuran DNA >10.000 bp (Gambar 1). Hal ini menunjukkan isolat DNA murni dan

tidak terkontaminasi.

Gambar 1. Hasil analisis kemurnian isolat DNA.

Keterangan:

M : 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker

5, 10, 15, 20, dan 25 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarose 1%, fase gerak larutan 1x TBE

buffer, kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit.

Identifikasi Alel Gen CYP2A6*9

Identifikasi alel gen CYP2A6*9 menggunakan metode PCR. Kondisi

PCR pada penelitian ini diatur menurut hasil optimasi oleh Cindy (2017), yaitu

initial denaturasi pada suhu 94ºC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 94ºC

selama 30 detik, annealing pada suhu 60ºC selama 30 detik dan ekstensi pada

suhu 70ºC selama 25 detik. Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 35 kali dan

diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC selama 5 menit.

Keberhasilan dalam proses amplifikasi juga ditentukan oleh ketepatan

primer dan penggunaan beberapa bahan. Primer merupakan potongan DNA yang

terdiri atas beberapa basa nukleotida yang berfungsi mengawali proses amplifikasi

dengan menempel pada template DNA CYP2A6 sebagai target amplifikasi

(Gambar 2). Penempelan (annealing) primer terjadi setelah pemisahan

(denaturasi) untai DNA ganda menjadi untai DNA tunggal (Yuwono, 2005).

10.000 bp

M 5 10 15 20 25

250 bp


10

Primer yang digunakan diadopsi dari Yoshida et al. (2003), yaitu primer forward

5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse 5'- GGC TGG GGT

GGT TTG CCT TTA-3'.

GATTCCTCTCCCCTGGAAC TAAAGGCAAACCACCCCAGCC

CTAAGGAGAGGGGACCTTG ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen alel gen CYP2A6*1.

Keterangan:

: Arah penempelan primer forward

: Arah penempelan primer reverse

Selain primer penambahan bahan-bahan seperti WFI dan Promega Go

Taq Green Master Mix yang mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2,

dan buffer juga memiliki peran penting dalam proses amplifikasi. Taq DNA

polymerase berperan dalam membuat untai baru atau memperpanjang (ekstensi)

rantai DNA setelah penempelan primer pada template DNA dengan

menambahkan basa nukleotida pada template DNA. Sumber basa nukleotida

dalam amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR ini berasal dari

deoksiribosanukleotida trifosfat (dNTPs), karena dNTPs mengandung

deoksiadenosina trifosfat (dATP), deoksisistidina trifosfat (dCTP),

deoksiguanosina trifosfat (dGTP), dan deoksitimina trifosfat (dTTP). MgCl2

merupakan salah satu faktor penting karena akan mempengaruhi aktivitas enzim

Taq DNA polymerase, sedangkan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH

sehingga Taq DNA polymerase tetap berada dalam kondisi optimum selama

proses amplifikasi berlangsung (Bintang, 2018).

Hasil amplifikasi ditunjukkan dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal

pada 368 bp yang menunjukkan alel gen CYP2A6*1, sedangkan bila tidak

terbentuk pita pada 368 bp maka produk merupakan alel gen CYP2A6*9.

Terbentuknya pita pada alel gen CYP2A6*1 karena primer forward yang

digunakan dapat menempel pada ekson urutan 395 sampai 376 dan primer reverse

5’ 3’

5’ 3’

Primer forward

Primer reverse


11

dapat menempel pada ekson urutan 48 sampai 28. Namun, pada alel gen

CYP2A6*9 primer reverse yang digunakan tidak dapat melakukan amplifikasi

karena terjadi SNP dalam kotak TATA di daerah promotor (T-48G) yang

ditunjukkan pada gambar 3. Hal ini mengakibatkan tidak terjadi proses

penempelan primer reverse (Yoshida et al., 2003).

A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

B. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

B. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

B. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

B. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

B. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

B. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

B. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC

B. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC

A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG

B. CYP2A6*9 ACCCCAGCC

Gambar 3. Urutan nukleotida alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9

(perbedaan pada basa nukleotida berwarna hijau dan biru yang mengalami SNP).

Keterangan :

A. Potongan urutan basa alel gen CYP2A6*1 menurut Gen Bank

B. Urutan basa alel gen CYP2A6*9 menurut Yoshida et al. (2003).

Hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis dan dilihat di

bawah UV Transilluminator. Berdasarkan hasil analisis, semua sampel produk

PCR menunjukkan terbentuknya pita tunggal, tebal dan terang pada 368 bp.

Namun demikian, terdapat beberapa pita tunggal tipis yang kurang terang pada

368 bp (Gambar 4) yang disebabkan oleh konsentrasi DNA yang kecil. Hal ini

dipengaruhi oleh kecilnya jumlah fragmen DNA yang teramplifikasi serta


12

kecilnya konsentrasi template DNA sehingga mempengaruhi intensitas pita yang

dihasilkan (Azizah, 2009; Fahlevi et al., 2017; Rahayu et al., 2016). Hal tersebut

dapat dibuktikan dengan analisis kuantitatif menggunakan Spektrofotometer,

namun karena jumlah sampel terbatas maka analisis tersebut tidak dapat

dilakukan. Terbentuknya pita pada 368 bp dari hasil analisis 30 sampel produk

PCR menunjukkan bahwa semua subjek uji memiliki enzim CYP2A6 yang

bekerja secara normal dalam aktivasi metabolisme senyawa TSNA dalam asap

rokok yang bersifat prokarsinogen. Hal ini dikarenakan semua subjek uji memiliki

alel gen CYP2A6*1 (wild type) dengan frekuensi 100% (n=30) dan tidak

memiliki bentuk polimorfi alel gen CYP2A6*9 dengan frekuensi 0% (Lampiran

12).

Gambar 4. Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9

Keterangan:

M : 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker

15-17, 19 dan 21 : Produk PCR dengan pita tunggal, tebal dan terang

18 dan 21 : Produk PCR dengan pita tunggal, tipis dan kurang terang

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%, fase gerak larutan 1x TBE

buffer, kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit.

Selain pada TSNA, CYP2A6 juga memiliki peran dalam memetabolisme

beberapa obat dan bahan kimia seperti nikotin, coumarin, tegafur, dan letrozole

(Tabel 1). Pada individu dengan alel gen CYP2A6*1 proses metabolisme akan

terjadi secara normal sedangkan pada individu dengan bentuk polimorfi

CYP2A6*9 proses metabolisme akan 50% lebih lambat karena terjadi SNP

(Minematsu et al., 2006; Patramurti dan Fenty, 2017). Namun pada bentuk wild

500 bp

250 bp 368 bp

Pita tipis dan

kurang terang

10.000 bp

21 20 19 18 17 16 15 M


13

type maupun polimorfi CYP2A6*9 terdapat keuntungan dan kekurangannya

masing-masing. Berdasarkan hasil identifikasi pada 30 sampel produk PCR

didapatkan hasil bahwa semua sampel memiliki alel gen CYP2A6*1 sehingga

proses metabolisme pada beberapa substrat seperti nikotin, coumarin, tegafur, dan

letrozole oleh enzim CYP2A6 akan terjadi secara normal.

Tabel 1. Hubungan polimorfisme CYP2A6 dengan respon substrat/obat.

Substrat/Obat Alel Efek Sumber

Nikotin *9 Penurunan inaktivasi nikotin

menjadi cotinine melalui reaksi C-oksidasi dan metabolisme cotinine

melalui 3'-hidroksilasi menjadi 3'-

hidroksikotinin sehingga

menurunkan tingkat ketergantungan merokok

dibandingkan *1.

Hukkanen et al.

(2005); McDonagh et al. (2012); Pelkonen et

al. (2000); Raunio and

Rahnasto-Rilla (2012).

Coumarin *9 Penurunan metabolisme coumarin menjadi senyawa 7-

hydroxnycoumarin, sehingga

meningkatkan metabolisme

coumarin oleh enzim CYP lain yang dapat membentuk senyawa

coumarin 3,4-epoxide yang

bersifat hepatotoksik dibandingkan *1

Farinola and Piller (2007); Raunio and

Rahnasto-Rilla (2012).

Tegafur *9 Penurunan metabolisme tegafur

menjadi 5-fluorouracil (5 FU)

yang merupakan metabolit aktif untuk pengobatan kanker

dibandingkan *1.

McDonagh et al.

(2012); Sung et al.

(2009).

Letrozole *9 Penurunan eliminasi letrozole,

melalui penurunan metabolisme letrozole menjadi metabolit

karbinol yang tidak aktif

dibandingkan *1

Bhatnagar, (2007);

McDonagh et al., (2012)

KESIMPULAN

Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras

kulit hitam Papua Indonesia adalah tidak adanya alel gen CYP2A6*9 dengan

frekuensi 0% dari 30 subjek uji.


14

SARAN

Penulis menyarankan untuk melakukan penelitian dengan jumlah subjek

uji yang lebih besar. Dapat pula dilakukan penelitian pada gen CYP2A13 yang

juga merupakan salah satu gen yang berperan dalam aktivasi metabolisme

senyawa TSNA dalam asap rokok.


15

DAFTAR PUSTAKA

Alsanosi, S.M.M., Skiffington, C., Padmanabhan, S., 2014. Pharmacokinetic

Pharmacogenomics, in: Handbook of Pharmacogenomics and Stratified

Medicine. Elsevier Inc., pp. 341–364.

Anonim, 2019. Genomic DNA Extraction. https://www.prima-

sci.com/14481965/genomic-dna-extraction. Accessed 19 November

2019.

Ashley, D.L., O’Connor, R.J., Bernert, J.T., Watson, C.H., Polzin, G.M., Jain,

R.B., Hammond, D., Hatsukami, D.K., Giovino, G.A., Cummings, K.M.,

McNeill, A., Shahab, L., King, B., Fong, G.T., Zhang, L., Xia, Y., Yan,

X. (Jane), McCraw, J.M., 2010. Impact of Differing Levels of Tobacco-

Specific Nitrosamines in Cigarette Smoke on the Levels of Biomarkers in

Smokers 1389–1398.

Azizah, A., 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi DNA Daun, Bunga, dan

Buah Kelapa Sawit Normal dan Abnormal. Skripsi. Fakultas Matematika

Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Bogor.

B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.

Human Heredity, 52(4), 191–200.

Bhatnagar, A.S., 2007. The discovery and mechanism of action of letrozole.

SPringer, 105, 7–17.

Bintang, M., 2018. Biokimia Teknik Penelitian. Edisi 2. Erlangga, Jakarta.

Chiang, H. chih, Wang, C.Y., Lee, H.L., Tsou, T.C., 2011. Metabolic effects of

CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-

butanone (NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based

mutagenesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2),

145–152.

Cindy., 2017. Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada

Identifikasi CYP2A6*9. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma. Yogyakarta.

Faatih, M., 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains

dan Teknologi, 10(1), 61–67.

Fahlevi, M.R., Bakti, D., Sitepu, S.F., 2017. Karakterisasi Molekuler Elaeidobius

kamerunicus Faust. (Coleoptera: Curculionidae) Asal Sumatera Utara

Menggunakan Metode Amplified Fragment Length Polymorphism

(AFLP). Jurnal Agroekoteknologi FP USU, 5(4), 941–953.

Farinola, N., Piller, N.B., 2007. CYP2A6 polymorphisms : is there a role for

pharmacogenomics in preventing coumarin-induced hepatotoxicity in

lymphedema patients ? 8(2), 151–158.

Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., Rahayu, S., 2011. Biologi Molekular:

Prinsip Dasar Analisis. Erlangga, Jakarta.

Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M.A., Sakurai, M.,

Dosaka-Akita, H., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., Kamataki, T.,

2004. Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of

smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese

smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451–2458.


https://www.prima-sci.com/14481965/genomic-dna-extraction

https://www.prima-sci.com/14481965/genomic-dna-extraction

16

Gayanti, 2017. Pemodelan Hubungan Alometri Tinggi Badan Dan Berat Badan

Menggunakan Ordinary Least Product Regression. Institut Pertanian

Bogor.

Geiss, O., Kotzias, D., 2007. Tobacco , Cigarettes and Cigarette Smoke,

Reproduction.

Geneaid, 2019. Why does the plasmid DNA extraction kit require two washings

with two types of wash buffers (W1 and Wash Buffer) while competitors

kits require one washing?. https://www.geneaid.com/faq/why-does-

plasmid-dna-extraction-kit-require-two-washings-two-types-wash-

buffers-w1-and-wash. Accessed 19 November 2019.

Gyamfi, M.A., Fujieda, M., Kiyotani, K., Yamazaki, H., Kamataki, T., 2005. High

prevalence of cytochrome P450 2A6*1A alleles in a black African

population of Ghana. European Journal of Clinical Pharmacology,

60(12), 855–857.

Hecht, S.S., Hoffmann, D., 1989. The relevance of tobacco-specific nitrosamines

to human cancer. Cancer Surv, 8(2), 273–294.

Hukkanen, J., Iii, P.J., Benowitz, N.L., 2005. Metabolism and Disposition

Kinetics of Nicotine 57(1), 79–115.

IARC, 2007. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to

Humans. The International Agency for Research on Cancer, Lyon,

France.

IARC, 2004. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to

Humans. International Agency for Research on Cancer, Lyon, France.

Kamaliah, 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi Dna Phenol-Chloroform dan Kit

Extraction pada Sapi Aceh dan Sapi Madura 5(1), 60–65.

Kementerian Kesehatan RI, 2019. Yuk, Mengenal Apa itu Perokok pasif?.

http://www.p2ptm.kemkes.go.id/infographic/yuk-mengenal-apa-itu-

perokok-pasif. Diakses pada tanggal 22 Maret 2019.

Khosravinia, H., Murthy, H.N.N., Parasad, D.T., Pirany, N., 2007. Optimizing

factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood.

African Journal of Biotechnology, 6(4), 481–486.

Liu, T., Xie, C.-B., Ma, W.-J., Chen, W.-Q., 2013. Association Between CYP2A6

Genetic Polymorphisms and Lung Cancer: A Meta-Analysis of Case-

Control Studies. Environmental and Molecular Mutagenesis, 54, 133–

140.

Maftuchah, Winaya, A., Zainudin, A., 2014. Teknik Dasar: Analisis Biologi

Molekuler. Deepublish, Yogyakarta.

McDonagh, E.M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B.,

Whirl-Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB summary: very

important pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2,

subfamily A, polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22(9),

695–708.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,

H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by

CYP2A6*4, *7 and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal,

27(2), 289–292.


https://www.geneaid.com/faq/why-does-plasmid-dna-extraction-kit-require-two-washings-two-types-wash-buffers-w1-and-wash



http://www.p2ptm.kemkes.go.id/infographic/yuk-mengenal-apa-itu-perokok-pasif

http://www.p2ptm.kemkes.go.id/infographic/yuk-mengenal-apa-itu-perokok-pasif

17

Mwenifumbo, J.C., Lessov-schlaggar, C.N., Zhou, Q., Krasnow, R.E., Swan,

G.E., Benowitz, N.L., Tyndale, R., 2008. Identification of Novel

CYP2A6 * 1B Variants : The CYP2A6 * 1B Allele is Associated With

Faster In Vivo Nicotine Metabolism 83(1), 115–121.

Mwenifumbo, J.C., Zhou, Q., Benowitz, N.L., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2010.

New CYP2A6 gene deletion and conversion variants in a population of

Black African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.

Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6 *

4 dan CYP2A6 * 9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia 15(1),

50–56.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., Martono, S., 2014. Polymorphism of

Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese

Indonesian Smoker and Non Smoker 26(1), 11–19.

Pelkonen, O., Rautio, A., Raunio, H., Pasanen, M., 2000. CYP2A6 : a human

coumarin 7-hydroxylase. Elsevier, 144(2000), 139–147.

PharmVAr, 2012. CYP2A6 allele nomenclature.

https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6. Accessed 17 June 2019.

Prabowo, D.A., 2017. Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *9

pada Subyek Uji Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia. Skripsi.

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Yogyakarta.

Querci, M., Jermini, M., Eede, G. Van de, 2006. The analysis of food samples for

the presence of genetically modified organisms. JRC European

Commission, Europe.

Rahayu, A.R., Pancasakti, H., Budiharjo, A., 2016. Pelacakan Gen Sitokrom

Oksidase Subunit 1 (Co1) DNA Mitokondria Pada Itik Tegal (Anas sp.)

18(2), 114–122.

Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,

and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.

Rossini, A., Simao, Tatiana de Almeida Albano, R.M., Pinto, L.F.R., 2008.

Review CYP2A6 polymorphisms and risk for tobacco ‑ related cancers

Review. Pharmacogenomics, 9(11), 1737–1752.

Sung, J.H., Dhiman, A., Shuler, M.L., 2009. A Combined Pharmacokinetic –

Pharmacodynamic ( PK – PD ) Model for Tumor Growth in the Rat with

UFT Administration. Journal of Pharmaceutical Sciences, 98(5), 1885–

1904.

Suryantisa, I., 2018. Situasi Umum Konsumsi Tembakau di Indonesia. Pusat Data

dan Informasi Kementerian Kesehatan RI. Jakarta Selatan

Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J.T., Yokoi, T.,

2003. Effects of polymorphism in promoter region of human CYP2A6

gene (CYP2A6*9) on expression level of messenger ribonucleic acid and

enzymatic activity in vivo and in vitro. Clinical Pharmacology and

Therapeutics, 74(1), 69–76.

Yuwono, T., 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta.


https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6

18

LAMPIRAN


19

Lampiran 1. Ethical Clearance


20

Lampiran 2. Perhitungan Jumlah Sampel

Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal

pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001)adalah :

≥

Keterangan:

: jumlah sampel minimal

: probabilitas alel utama

: frekuensi alel minor

Pada penelitian ini terdapat dua alel yang akan diteliti, yaitu: CYP2A6*1

(alel utama) dan CYP2A6*9 (alel minor). Menurut B-Rao (2001), nilai dan

untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah = 0,95 dan

Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian ini adalah:

=

=

= 28,89

= 29 orang

Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang.


21

Lampiran 3. Hasil Kuesioner


22


23


24

Lampiran 4. Data Subjek Uji Hasil Kuesioner

Subjek Umur (Tahun) Jenis Kelamin

1P 19 Perempuan

2P 23 Laki-laki

3P 22 Laki-laki

4P 19 Perempuan

5P 22 Perempuan

6P 23 Laki-laki

7P 19 Laki-laki

8P 22 Laki-laki

9P 20 Perempuan

10P 19 Perempuan

11P 18 Perempuan

12P 19 Perempuan

13P 22 Laki-laki

14P 20 Perempuan

15P 21 Perempuan

16P 21 Laki-laki

17P 20 Laki-laki

18P 20 Laki-laki

19P 19 Laki-laki

20P 19 Laki-laki

21P 23 Laki-laki

22P 22 Laki-laki

23P 20 Laki-laki

24P 18 Laki-laki

25P 19 Laki-laki

26P 20 Laki-laki

27P 20 Laki-laki

28P 19 Perempuan

29P 20 Laki-laki

30P 22 Perempuan


25

Lampiran 5. Usage Information of FavorPrepTM


26


27

Lampiran 6. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


28

Lampiran 7. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


29

Lampiran 8. Product Information of DNA Ladder


30

Lampiran 9. Product Datasheet of primer forward and reverse


31

Lampiran 10. Hasil Analisis Kemurnian Isolat DNA

Lampiran 11. Hasil Identifikasi Alel Gen CYP2A6*1 dan *9

21 20 19 18 17 16 15 M 28 27 26 25 24 23 22 M

1 2 3 4 5 6 7 M 14 13 12 11 10 9 8 M

29 30 M

M 5 10 15 20 25


32

Lampiran 12. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *1 dan *9

Alel Jumlah Frekuensi

CYP2A6*1 30 100%

CYP2A6*9 0 0%


=

= 100%


=

= 0%


33

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Mensiana Lodvi Putarato, lahir di

Waikabubak pada tanggal 31 Mei 1997. Penulis merupakan

anak pertama dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Victor

Ngongo Putarato dan Ibu Dorkas Lende. Penulis menempuh

pendidikan TK sampai SMA di Sumba Barat, Nusa Tenggara

Timur pada TK Pertiwi (2001- 2003), SD Masehi Waikabubak

II (2003-2009), SMP Negeri 3 Waikabubak (2009-2012), dan SMA Negeri 1

Waikabubak (2012-2015). Pada tahun 2016, penulis melanjutkan pendidikan ke

jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta. Selama masa kuliah, penulis aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti

Pharmalympic tahun 2017 sebagai anggota divisi pendaftaran, Tiga Hari Temu

Akrab Farmasi (Titrasi) 2018 sebagai anggota divisi medis, dan Pharmacy

Performance tahun 2018 sebagai koordinator divisi konsumsi. Penulis juga

berpartisipasi sebagai koordinator asisten dosen Biokimia tahun 2019.


identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*9 pada subjek …

Documents