identifikasi bakteri dan karakterisasi enzim …

IDENTIFIKASI BAKTERI DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE KASAR DARI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK P12 ASAL MATA AIR

GUNUNG MERAPI

IDENTIFICATION OF BACTERIA AND CHARACTERIZATION OF CRUDE CELLULASE ENZYME FROM CELLULOLYTIC BACTERIA ISOLATE P12

ORIGINATED FROM MOUNT MERAPI WATER SPRING

Kiki Oliviani 155100500111002

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Bioteknologi

Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Tekonologi Pertanian

Universitas Brawijaya Jl. Veteran Malang, 65145

iv

DAFTAR ISI

LEMBAR PERSETUJUAN .................................................................................. i

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... ii

PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI ................................................................. iii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... iv

DAFTAR TABEL ................................................................................................. v

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi

RINGKASAN .................................................................................................... vii

SUMMARY ....................................................................................................... vii

BAB I ................................................................................................................. 1

PENDAHULUAN ................................................................................................ 1

1.1 Latar belakang .......................................... Error! Bookmark not defined.

1.2 Rumusan masalah ................................................................................... 2

1.3 Tujuan penelitian ....................................... Error! Bookmark not defined.

1.4 Manfaat penelitian ..................................... Error! Bookmark not defined.

1.5 Hipotesis ................................................... Error! Bookmark not defined.

BAB III ................................................................................................................. 4

METODOLOGI PENELITIAN .............................................................................. 4

3.1 Tempat dan waktu penelitian .................................................................... 4

3.2 Alat dan bahan ......................................................................................... 4

3.3 Metode penelitian ..................................................................................... 4

3.4 Pelaksanaan penelitian ............................................................................ 5

3.5 Pengamatan dan analisis data .................. Error! Bookmark not defined.

3.6 Diagram alir penelitian ............................... Error! Bookmark not defined.

BAB IV .............................................................................................................. 20

PEMBAHASAN ................................................................................................. 20

4.1 Kurva pertumbuhan isolat P12 .............................................................. 20

4.2 Hasil uji 16S rRNA ................................................................................. 21

4.3 Penentuan waktu panen enzim selulase ................................................ 23

4.4 Pemurnian enzim dengan amonium sulfat ............................................. 25

4.5 Hasil karakterisasi enzim selulase .......................................................... 28

BAB V ............................................................................................................... 38

PENUTUP ......................................................................................................... 38

5.1 Kesimpulan ........................................................................................... 38

5.2 Saran .................................................................................................... 38

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 39

v

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Hasil Uji Blast .............................................................................. 22

Tabel 4.2 Hasil pemurnian enzim dengan pengendapan amonium sulfat .... 25

Tabel 4.3 Tahapan pemurnian enzim selulase ............................................ 27

Tabel 4.4 Hasil uji ANOVA pH optimum enzim ............................................ 29

Tabel 4.5 Hasil uji ANOVA suhu optimum enzim ......................................... 31

Tabel 4.6 Hasil uji ANOVA stabilitas pH enzim ............................................ 33

Tabel 4.7 Hasil uji ANOVA stabilitas suhu enzim ......................................... 35

Tabel 4.8 Hasil uji ANOVA pengaruh penambahan ion ............................... 36

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 3.1 Tahapan penelitian ....................................................................... 12

Gambar 3.2 Diagram alir pembuatan stok kultur .............................................. 13

Gambar 3.3 Diagram alir analisis 16S rRNA .................................................... 14

Gambar 3.4 Diagram alir penentuan waktu panen enzim selulase ................... 15

Gambar 3.5 Diagram alir pemurnian enzim ...................................................... 16

Gambar 3.6 Diagram alir penentuan pH optimum ............................................ 17

Gambar 3.7 Diagram alir penentuan suhu optimum ......................................... 17

Gambar 3.8 Diagram alir stabilitas pH .............................................................. 18

Gambar 3.9 Diagram alir stabilitas suhu ........................................................... 18

Gambar 3.10 Diagram alir penambahan ion ...................................................... 19

Gambar 4.1 Kurva pertumbuhan isolat bakteri P12 ......................................... 20

Gambar 4.2 Pohon Filogeni ............................................................................. 23

Gambar 4.3 Penentuan waktu panen enzim selulase ....................................... 24

Gambar 4.4 Kurva pH optimum ....................................................................... 29

Gambar 4.5 Kurva suhu optimum .................................................................... 31

Gambar 4.6 Kurva stabilitas pH ....................................................................... 33

Gambar 4.7 Kurva stabilitas suhu .................................................................... 34

Gambar 4.8 Pengaruh penambahan ion .......................................................... 36

vii

Kiki Oliviani. 155100500111002. Identifikasi Bakteri dan Karakterisasi Enzim Selulase Kasar dari Isolat Bakteri Selulolitik P12 asal Mata Air Gunung Merapi. SKRIPSI. Pembimbing I: Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si

RINGKASAN

Bakteri sekarang lebih banyak dieksplorasi secara luas untuk produksi enzim selulase karena pertumbuhannya cepat, mampu memproduksi multienzim, stabil pada suhu dan pH yang ekstrim. Proses identifikasi isolat bakteri selulolitik dapat dilakukan dengan menggunakan fenotif, biokimia dan genotif untuk mengetahui jenis atau spesies bakteri tersebut. Selain itu, proses isolasi dan purifikasi enzim harus dilakukan untuk menghilangkan zat pengotor salah satunya dengan menggunakan metode pengendapan menggunakan amonium sulfat. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan isolasi dengan isolat bakteri P12 yang memiliki aktivitas selulolitik tertinggi (2,326 ±0,219). Pada penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi isolat P12 secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA dan memurnikan serta mengkarakterisasi enzim selulase hasil dialisis yang diproduksi oleh isolat P12 yang berasal dari mata air Gunung Merapi terhadap variasi suhu, pH, dan ion.

Penelitian yang dilakukan bersifat deskriptif dengan menggunakan pendekatan kuantitatif. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahapan yaitu identifikasi jenis bakteri menggunakan gen 16S rRNA, pemurnian parsial enzim selulase hasil ekstraksi dari isolat bakteri selulolitik P12, karakterisasi enzim selulase hasil dialisis (pH dan suhu optimum, stabilitas pH dan suhu, serta pengaruh penambahan ion).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat bakteri P12 berkerabat dekat dengan bakteri Bacillus licheniformis strain 103D-012 berdasarkan hasil uji 16S rRNA dengan nilai kemiripan 99,51%. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim selulase yakni 0,0303 U/mg, aktivitas enzim setelah pengendapan dengan amonium sulfat fraksi 70% yakni 0,0107 U/mg, dan aktivitas enzim setelah didialisis yakni 0,0103 U/mg. Karakterisasi enzim selulase hasil dialisis optimum pada pH 7 dan suhu 50°C, bersifat stabil pada suhu 30-90°C, stabil pada asam dan basa (pH 3-9) setelah diinkubasi selama 1 jam. Penambahan ion Ca2+ mampu meningkatkan aktivitas enzim.

Kata Kunci: Enzim Selulase, Karakterisasi enzim, 16S rRNA.

viii

Kiki Oliviani. 155100500111002. Identification of Bacteria and Characterization of Crude Cellulase Enzyme from Cellulolytic Bacteria Isolate P12 Originated from Mount Merapi Water Spring. FINAL PROJECT. Supervisor I: Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si

SUMMARY

Bacteria are widely explored for production of cellulase enzymes because of their rapid growth, capable producing multi-enzyme, stable at extreme temperature and pH. The process of identifying cellulolytic bacteria isolates can be carried out using phenotypes, biochemistry and genotypes to determine the type or species of these bacteria. In addition to that process of isolation and purification of enzyme must be done to remove impurities, one of them by using precipitation method with ammonium sulfate. In previous studies, isolation was carried out with bacterial isolate P12 which had the highest cellulolytic activity (2.326 ± 0.219). In this study aims to identify isolate P12 molecularly using 16S rRNA gene, purify and characterize cellulase enzyme after dialysis produced by isolates P12 originating from Mount Merapi springs purified by variations in temperature, pH, ion.

The research conducted was descriptive using a quantitative approach. This research was conducted in three stages, identification of bacterial types using 16S rRNA gene, partial purification of cellulase enzyme extracted from cellulolytic bacterial isolate P12, characterization of cellulase enzyme after dialysis (optimum pH and temperature, stability pH and temperature, and effect of ion addition).

The result of research showed that P12 bacterial isolate was related to Bacillus licheniformis strain 103D-012 based on 16S rRNA test with 99,51% percen identity. Specific activity of raw extract of cellulase enzyme was 0,0303 U/mg, enzyme activity after ammonium sulfate sedimentation 70% fraction was 0,0107 U/mg, and enzyme activity after dialysis was 0,0103 U/mg. Cellulase enzyme after dialysis was optimum at pH 7 and 50°C, stable at 30-90°C, stable in acids and bases (pH 3-9) after incubation for 1 hour. Addition of Ca2+ ion can increase the enzyme activity. Keywords: enzyme cellulase, enzyme characterization, 16S rRNA.

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pemanfaatan enzim dalam beberapa bidang industri semakin diminati

sebagai biokatalisator. Peningkatan pemanfaatan enzim pada industri dari tahun

ke tahun meningkat hingga 10-15% (Mufarrikha dkk, 2014). Enzim juga

merupakan salah satu senyawa yang ramah lingkungan dibandingkan dengan

bahan-bahan kimia yang biasa digunakan. Salah satu enzim yang banyak

digunakan di industri yaitu enzim selulase. Enzim selulase ini banyak digunakan

dalam industri tekstil, makanan, industri pulp dan kertas, biofuel, detergen, dan

pakan ternak (Julia et al., 2016).

Enzim selulase (E.C 3.2.1.4) mampu menghidrolisis ikatan -1,4 glikosidik

yang ada pada selulosa. Enzim selulase dapat diproduksi dari fungi, bakteri dan

protozoa. Bakteri yang mampu memproduksi enzim selulase yaitu Bacillus

subtillis, B. amyloliquifaciens, B. licheniformis, B. circulan, B. flaxus, Bacteriodes

sp., Cellulomonas biazotea, Pseudomonas cellulosa, Clostridium thermocellum

(Kuhad et al., 2011). Bakteri sekarang lebih banyak dieksplorasi secara luas

untuk produksi enzim selulase karena pertumbuhannya cepat, mampu

memproduksi multienzim, stabil pada suhu dan pH yang ekstrim (Gautam and

Jitender. 2014). Beberapa penelitian terdahulu mengenai bakteri selulolitik yang

telah dilakukan antara lain oleh Sonia dan Kusnadi (2015) telah melakukan

isolasi bakteri selulolitik dari padang pasir Tengger Bromo dengan aktivitas

tertinggi pada substrat dedak gandum 0,045 U/mL dengan suhu 850C, pH 8.

Menurut Yuda (2013) yang telah mengisolasi bakteri selulolitik termofilik dari

sumber mata air panas Gunung Kelud dengan crude enzim selulase Caldimonas

sp L.1.1.2 optimum pada suhu 90°C, aktivitas enzim 1,346 U/mL dan pH

optimum 6.

Eksplorasi dan isolasi bakteri penghasil enzim selulase secara umum

membutuhkan proses identifikasi. Identifikasi isolat bakteri selulolitik dapat

dilakukan secara fenotif dan genotif. Identifikasi fenotif meliputi morfologi sel,

pewarnaan gram, uji oksidasi, dll. Identifikasi genotif dilakukan dengan

pembacaan sekuen basa nitrogen pada nukleotida penyusun fragmen gen 16S

rRNA bakteri. Identifikasi morfologi memiliki kelemahan yaitu seringnya terjadi

kesalahan dalam pembedaan spesies dan galur bakteri serta karakter fenotif

2

bakteri tidak bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan perubahan kondisi

bakteri dan lingkungannya (Nurwati dan Refdinal, 2015). Kekurangan identifikasi

bakteri secara fenotif dapat diatasi dengan melakukan identifikasi secara genotif

dengan menggunakan fragmen 16S rRNA. Gen 16S rRNA hampir dimiliki oleh

seluruh spesies bakteri dan urutan basa nitrogen gen 16S rRNA memiliki

keragaman intraspesifik yang lebih rendah dibandingkan dengan gen pengkode

protein yang lain (Nuroniyah dan Surya, 2012).

Selain dilakukan proses identifikasi isolat bakteri selulolitik yang telah

didapatkan, enzim selulase yang telah diproduksi oleh bakteri selulolitik masih

bercampur dengan pengotor lain seperti komponen sel. Pemurnian enzim dapat

digunakan untuk mengurangi atau menghilangkan zat pengotor tersebut.

Pemurnian ini juga untuk meningkatkan aktivitas spesifik enzim yang telah

diproduksi. Proses pemurnian dapat dilakukan dengan memanfaatkan sifat-sifat

enzim yaitu berdasarkan muatan, ukuran, dan afinitas (Sutrisno, 2017).

Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Rahmawati (2018) telah

mengisolasi 4 isolat bakteri selulolitik asal mata air Gunung Merapi. Pada isolat

P12 yang telah di dapatkan memiliki indeks selulolitik tertinggi dari yang lain

sebesar 2,326 ±0,219. Selain itu, isolat bakteri P12 memiliki karakteristik warna

putih susu, bentuk koloni point, elevasi irregular, permukaan kasar, margin

lobate, mampu menghasilkan endospora, bersifat katalase positif dan berbentuk

coccus. Penelitian sebelumnya pengujian karateristik enzim dilakukan pada

ekstrak kasar enzim dengan hasil suhu optimum 40-50°C dan pH optimum 8

dengan aktivitas spesifik 2,574±0,014 (U/mg). Berdasarkan beberapa

pengamatan tersebut, pada penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi isolat

P12 secara molekuler dengan menggunakan gen 16S rRNA dan serta

mengkarakterisasi enzim selulase hasil dialisis dari isolat P12 asal mata air

Gunung Merapi hasil dialisis terhadap variasi suhu, pH, dan pengaruh ion

terhadap aktivitas enzim enzim.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah jenis isolat bakteri P12 asal mata air Gunung Merapi berdasarkan

gen penyandi 16S rRNA?

2. Bagaimana aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri

selulolitik P12 dari mata air Gunung Merapi sebelum dan sesudah

pengendapan dengan amonium sulfat?

3

3. Bagaimana karakteristik enzim selulase hasil dialisis (pH dan suhu

optimum, serta stabilitas pH dan suhu, dan pengaruh penambahan ion)

yang dihasilkan oleh isolat bakteri selulolitik P12 dari sumber mata air

Gunung Merapi?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui jenis bakteri dari isolat P12 asal mata air Gunung Merapi

berdasarkan gen penyandi 16S rRNA.

2. Mengetahui aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri

selulolitik P12 dari mata air Gunung Merapi sebelum dan sesudah

pengendapan dengan amonium sulfat.

3. Mengetahui karakteristik enzim selulase hasil dialisis (pH dan suhu

optimum, serta stabilitas pH dan suhu, dan pengaruh penambahan ion)

yang dihasilkan oleh isolat bakteri selulolitik P12 dari sumber mata air

Gunung Merapi.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi mengenai

potensi bakteri selulolitik yang berasal dari mata air Gunung Merapi untuk

menghidrolisis secara enzimatis limbah yang mengandung selulosa dan

memberikan informasi mengenai jenis atau spesies isolat bakteri selulolitik P12,

karakteristik enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri selulolitik P12 asal

mata Air Gunung Merapi.

1.5 Hipotesis

1. Pengendapan amonium sulfat dapat meningkatkan aktivitas enzim

selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri P12.

2. pH dan suhu optimum, stabilitas pH dan suhu, serta pengaruh

penambahan ion dapat meningkatkan aktivitas yang dihasilkan oleh isolat

bakteri P12.

4

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

1.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium

Kimia dan Biokimia, Laboratorium Bioteknologi Fakultas Teknologi Pertanian

Universitas Brawijaya, dan Laboratorium Genetika dan Molekuler UIN Maulana

Malik Ibrahim Malang mulai Bulan Oktober 2018 - April 2019.

1.2 Alat dan Bahan

1.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik

(Ohaus Sccout Pro SP-402), kompor listrik (Maspion), autoklaf (Tomy ES 315),

laminar air flow (Magnehelic), vortex (Corning LSETM), sentrifuge dingin (Thermo

Scientific SL 40), pH meter (Trans Instrument), inkubator, mikropipet,

spektrofotometer (Jenway 6305), shakerwaterbath (Julabo SW-22), PCR,

elektroforesis DNA, trans iluminator, glassware seperti gelas beker, gelas ukur,

erlenmeyer, ose, bunsen, labu ukur, cawan petri, tabung reaksi dan pipet ukur.

1.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yakni isolat P12 dari sumber

mata air gunung Merapi diperoleh dari PT. Songsong Buwono Lestari. Media

untuk pertumbuhan bakteri selulolitik menggunakan media CMC agar yang terdiri

dari CMC (Himedia; Viscosity: 1500-300 cP), MgSO4•7H2O, pepton, K2HPO4,

FeSO4•7H2O, CaCl2•2H2O, (NH4)2SO4, ekstrak khamir, agar bakto dan glukosa.

Bahan untuk analisa antara lain akuades, alkohol 70%, NaCl 1M, glukosa, DNS,

Na-K-Tartrat, NaOH, fenol, Na2SO4, buffer sitrat fosfat 0,05M, buffer fosfat

0,05M, buffer tris-HCl 0,05M, (NH4)2SO4, kantong selofan (Sigma-Aldrich), EDTA,

NaHCO3, BaCl2, HCl, H2O2, KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, NaCl, dan gliserol.

1.3 Metode Penelitian

Penelitian yang digunakan yaitu jenis penelitian deskriptif dengan

menggunakan pendekatan kuantitatif. Penelitian ini dilakukan dengan 3 tahap

yaitu identifikasi jenis bakteri menggunakan gen 16S rRNA, pemurnian parsial

enzim selulase hasil ekstraksi dari isolat bakteri selulolitik P12, karakterisasi

5

enzim selulase hasil dialisis (pH dan suhu optimum, serta stabilitas pH dan suhu,

dan pengaruh penambahan ion).

1.4 Pelaksanaan Penelitian

1.4.1 Pembuatan stok kultur

a. Pembuatan stok kultur 10 mL

Pembuatan stok kultur dilakukan dengan mengambil 1 ose isolat bakteri

selulolitik P12 kemudian dimasukkan ke dalam 10 mL media cair CMC steril.

Setelah itu dilakukan inkubasi dalam shakerwaterbath dengan kecepatan 100

rpm selama 24 jam dan suhu 50°C (Irfan et al., 2012).

b. Pembuatan stok kultur 100 mL

Pembuatan stok kultur dilakukan dengan menginokulasikan 10% isolat

bakteri selulolitik P12 kemudian dimasukkan ke dalam 100 mL media cair CMC

steril. Setelah itu dilakukan inkubasi dalam shakerwaterbath dengan kecepatan

100 rpm selama 24 jam dan suhu 50°C (Irfan et al., 2012).

1.4.2 Identifikasi bakteri dengan gen 16S rRNA

1.4.2.1 Isolasi DNA bakteri

Kultur bakteri yang telah berumur 48 jam dimasukkan ke dalam tabung

eppendorf sebanyak 2 mL, kemudian disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm

selama 2 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet sel ditambah dengan

200 µL PBS. Kemudian larutan di masukkan ke dalam 750 µL BashingBead tube.

Sampel dalam tube di vortex selama ± 5 menit untuk memaksimalkan proses

pemecahan sel sehingga DNA akan keluar dari dalam sel. Setelah itu sampel di

sentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Supernatan (400 µL)

diambil dan dimasukkan ke dalam Zymos-Spin III-F Filter dalam tube dan

disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Dilakukan penambahan 1.200 µL Genomic

Lysis Buffer ke dalam filtrat. Diambil 800 µL campuran larutan dan dimasukkan

ke dalam Zymo-Spin IIC Coloumn dalam tube, setelah itu sampel disentrifus

dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit dan langkah ini diulang sebanyak

2 kali. Kemudian dilakukan penambahan 200 µL DNA pre-wash buffer ke dalam

tube dan disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Kemudian

ditambahkan lagi dengan 500 µL DNA wash buffer ke dalam tube dan disentrifus

dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Kemudian larutan hasil

sentrifugasi dipindahkan ke dalam mikrotube dan ditambahkan dengan 100 µL

DNA elution buffer. Proses isolasi DNA ini dilakukan sesuai dengan prosedur

6

yang tertera pada Zymo-kit (satu set alat dan bahan untuk isolasi DNA yang di

keluarkan oleh www.zymoresearch.com).

1.4.2.2 Amplifikasi gen 16S rRNA

Komponen reaksi terdiri dari 10 µL PCR mix, 1 μl primer forward dan 1

µl primer reverse, ddH2O 5 μl, dan DNA sampel 3 μl dicampurkan ke dalam

mikrotube. Proses pencampuran larutan dilakukan dengan metode pipetting

untuk menghomogenisasi larutan. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam

PCR untuk proses amplifikasi dengan tahapan pre-denaturation 94°C selama 4

menit, denaturation 94°C selama 1 menit, annealing 50°C selama 1 menit,

extension 72°C selama 2 menit, kemudian terjadi pengulangan sebanyak 30

siklus, setelah itu final extension 72°C selama 3 menit. Hasil PCR dapat diamati

dengan menggunakan elektroforesis. DNA hasil PCR selanjutnya akan dianalisis

basa nukleotida dengan sekuensing dan analisis pohon filogeni dengan bantuan

program MEGA7 (Khotimah dkk., 2017).

1.4.2.3 Elektroforesis DNA

Pada tahap awal proses elektroforesis dilakukan dengan membuat gel

agarosa 1%. Pembuatannya dilakukan dengan melarutkan 1 gram agarosa ke

dalam 100 ml TAE, kemudian di panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

Setelah itu larutan agarosa di tuang pada cetakan gel dan disisipkan sisir untuk

membuat sumuran. Larutan dibiarkan beberapa saat hingga memadat

membentuk gel. Gel yang sudah terbentuk di letakkan pada chamber

elektroforesis dengan posisi sumur pada kutub negatif. Kemudian dituang larutan

buffer TAE hingga gel terendam dan tidak melebihi batas maksimum buffer

(Khotimah dkk., 2017).

Selanjutnya dilakukan injeksi sampel DNA dan loading dye, dengan

terlebih dahulu mencampurkan DNA dengan loading dye pada kertas parafilm

menggunakan mikropipet. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam masing-

masing sumuran dan dihubungkan elektroda dengan sumber arus listrik dan di

running hingga proses selesai (±45 menit). Setelah proses elektroforesis selesai,

gel agarosa dipindahkan ke dalam alat transiluminator untuk visualisasi pita DNA

yang terbentuk (Khotimah dkk., 2017).

1.4.3 Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri

Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri bertujuan untuk menentukan

waktu pertumbuhan bakteri agar diperoleh kondisi sel yang optimum untuk

produksi enzim selulase. Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan dengan cara

http://www.zymoresearch.com/

7

mengambil 10 mL stok kultur cair kemudian dimasukkan ke dalam 90 mL media

CMC cair steril. Setelah itu dilakukan inkubasi pada shakerwaterbath kecepatan

100 rpm dengan suhu 50°C. Dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 343 nm setiap 1 jam pada 4 jam

pertama, kemudian setelah itu dilakukan pengamatan 2 jam berikutnya dan 4 jam

sekali sampai jam ke 30 jam (Rahayu dkk., 2010).

1.4.4 Penentuan waktu optimum produksi enzim selulase

Penentuan waktu optimum produksi enzim selulase diawali dengan

penentuan waktu penuangan inokulum yang telah dilakukan pada tahap

sebelumnya. Hal ini bertujuan untuk mengetahui waktu pertumbuhan

eksponensial bakteri pada inokulum yang akan digunakan. Penentuan waktu

optimum produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan 1 ose bakteri ke

dalam 2 mL media CMC cair kemudian diinkubasi pada suhu 50°C pada

shakerwaterbath dengan kecepatan 100 rpm selama 26 jam. Kemudian diambil 1

mL dari larutan stok 2 mL dan dimasukkan ke dalam 9 mL media CMC cair

kemudian diinkubasi pada suhu 50°C pada shakerwaterbath dengan kecepatan

100 rpm selama 26 jam. Setelah itu, stok kultur 10 mL dimasukkan ke dalam 90

mL media CMC cair (media produksi). Kemudian diinkubasi suhu 50°C pada

shakerwaterbath dengan kecepatan 100 rpm dan dilakukan pengamatan aktivitas

enzim setiap hari hingga 6 hari. Pengamatan aktivitas enzimnya dilakukan

dengan diambil 10 mL sampel media kemudian disentrifus dengan kecepatan

5000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan hasil sentrifus diuji

aktivitas enzim selulasenya dengan metode DNS. Setelah itu data aktivitas enzim

tiap hari pengamatan diplotkan dalam grafik dengan waktu inkubasi sebagai

absis dan aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat. Waktu panen enzim

ditentukan dengan melihat waktu inkubasi dengan aktivitas selulase tertinggi

(Dini dan Ifah, 2014).

1.4.5 Produksi dan ekstraksi enzim

Produksi dan ekstraksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan 1 ose

bakteri ke dalam 2 mL media CMC cair kemudian diinkubasi pada suhu 50°C

pada shakerwaterbath dengan kecepatan 100 rpm selama 26 jam. Kemudian

diambil 1 mL dari larutan stok 2 mL dan dimasukkan ke dalam 9 mL media CMC

cair kemudian diinkubasi pada suhu 50°C pada shakerwaterbath dengan

kecepatan 100 rpm selama 26 jam. Setelah itu, stok kultur 10 mL dimasukkan ke

dalam 90 mL media CMC cair (media produksi) dan diinkubasi suhu 50°C pada

8

shakerwaterbath dengan kecepatan 100 rpm. Stok kultur isolat P12 sebanyak

10% dari media produksi dimasukkan ke dalam 1 L media produksi enzim

selulase. Setelah itu dilakukan inkubasi pada shakerwaterbath suhu 50°C

dengan kecepatan 100 rpm lama waktu berdasarkan hasil penentuan waktu

optimum produksi. Media produksi enzim yang mengandung kultur isolat P12

disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit suhu 4°C untuk

mengendapkan biomassa bakteri (Apriani dkk., 2014).

1.4.6 Presipitasi dengan amonium sulfat

Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim dari komponen-

komponen pengotor dan menghilangkan senyawa lain yang dapat menganggu

aktivitas enzim. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk permunian

enzim yaitu metode pengendapan dengan menggunakan ammonium sulfat.

Metode pengendapan dengan ammonium sulfat dilakukan dengan cara

mengambil 970 mL ekstrak kasar enzim selulase, kemudian ditambahkan

dengan ammonium sulfat 60%. Penambahan tersebut disertai dengan

pengadukan pada suhu ±4°C selama 30 menit. Kemudian disentrifus dengan

kecepatan 8000 rpm pada suhu 4°C selama 20 menit. Endapannya merupakan

enzim selulase fraksi 60% dan supernatan hasil sentrifus ditambahkan dengan

ammonium sulfat 70%. Penambahan tersebut disertai dengan pengadukan pada

suhu ±4°C selama 30 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm

pada suhu 4°C selama 20 menit. Endapannya merupakan enzim selulase fraksi

70% dan supernatan hasil sentrifus ditambahkan dengan ammonium sulfat 80%.

Penambahan tersebut disertai dengan pengadukan pada suhu ±4°C selama 30

menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu 4°C selama

20 menit. Endapannya merupakan enzim selulase fraksi 80% dan supernatan

hasil sentrifus dibuang (Krisna dan Lia, 2012).

1.4.7 Dialisis

Dialisis dilakukan untuk menghilangkan garam yang masih tercampur

dengan enzim. Proses dialisis dilakukan dengan menggunakan kantong selofan.

Endapan yang berupa enzim selulase didialisis dengan ditambahkan buffer fosfat

pH 8 dan dimasukkan ke dalam kantong selofan. Kemudian larutan dalam

kantong selofan direndam dalam buffer fosfat 0,05 M pH 8 dan diaduk dengan

menggunakan stirrer pada suhu 4°C selama satu malam. Buffer perendam

diganti setiap 6 jam sekali sampai semua garam terpisah. Dialisis dihentikan bila

semua garam ammonium sulfat telah keluar dari membran dengan mengujinya

9

menggunakan larutan BaCl2 dan HCl. 3 tetes BaCl2 0,1 M dan 3 tetes HCl 0,1 M

ditambahkan ke dalam larutan buffer yang ada di luar kantong selofan. Ion-ion

sulfat (SO42-) akan membentuk endapan putih BaSO4. Apabila sudah tidak

membentuk endapan, maka dialisis dihentikan. Larutan enzim yang diperoleh

dari dialisis diuji aktivitasnya dan ditentukan kadar protein dengan menggunakan

metode biuret (Krisna dan Lia, 2012).

1.4.8 Uji aktivitas enzim selulase

Aktivitas enzim selulase diukur dengan menghitung kadar gula reduksi

yang dihasilkan dari proses hidrolisis selulosa. 1 mL enzim dicampurkan dengan

1 mL CMC 1% pada buffer fosfat 0,05 M pH 8. Kemudian diinkubasi pada suhu

50°C selama 30 menit. Setelah diinkubasi, reaksi dihentikan dengan

ditambahkan 2 mL reagen DNS dan didihkan pada penangas air selama 15

menit. Kadar gula reduksi dihitung dengan mengukur nilai absorbansi sampel

pada panjang gelombang 520 nm (Irfan et al., 2012). Pengukuran aktivitas

selulase sampel dibuat 3 larutan, pada perlakuan kontrol, enzim yang akan

direaksikan dengan substrat terlebih dahulu diinaktivasi dengan memanaskan

enzim selama 15 menit dalam air mendidih. Pada blanko, larutan enzim diganti

dengan buffer fosfat 0,05 M untuk direaksikan dengan substrat. Perlakuan

kontrol dan blanko dilakukan secara bersamaan dengan metode dan tahapan

yang sama (Irawan dkk., 2008).

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 = ((𝐴𝑠 − 𝐴𝑏) − (𝐴𝑘 − 𝐴𝑏))

Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam

persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa. Kemudian aktivitas

selulase dihitung berdasarkan rumus berikut: (Irawan dkk., 2008)

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑆𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑒 (𝑈/𝑚𝑙) =𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝐺𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 (

𝑚𝑔𝑚𝑙

) 𝑥1000 𝑥 𝐹𝑃

𝑉 × 𝑡 × 𝐵𝑀

Keterangan :

As = Absorbansi sampel

Ab = Absorbansi blanko

Ak = Absorbansi kontrol

V = Volume enzim (1 mL)

BM = Berat molekul glukosa (180 g/mol)

t = Waktu inkubasi (menit)

FP = Faktor Pengencer

10

1.4.9 Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim Selulase

Aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan dengan membagi aktivitas

enzim selulase dengan kadar protein. Penentuan aktivitas spesifik selulase

dilakukan pada ekstrak kasar enzim dan enzim hasil pemurnian. Aktivitas

selulase dapat dihitung dnegan rumus: (Gautam and Jitender, 2014)

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 (𝑈/𝑚𝑔) =𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 (𝑈/𝑚𝑙)

𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 (𝑚𝑔/𝑚𝑙)

1.4.10 Karaterisasi enzim selulase

1.4.10.1 Penentuan pH optimum

Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim

selulase hasil dialisis pada rentang pH 3-9 dengan interval 1 unit. Prosesnya

dilakukan dengan cara 1 mL CMC 1% yang terlarut dalam buffer sitrat fosfat 0,05

M (pH 3-6), buffer fosfat 0,05 M (pH 6-8), dan buffer tris HCl 0,05 M (pH 9)

ditambahkan dengan 1 mL enzim. Kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama

30 menit, setelah itu ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL dan larutan

didihkan pada penangas air selama 15 menit. Kadar gula reduksi dihitung

dengan mengukur nilai absorbansi sampel pada panjang gelombang 520 nm.

Data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan pH sebagai absis dan

aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat. pH optimum ditentukan berdasarkan

pH dengan aktivitas selulase tertinggi (Iqbal et al., 2011).

1.4.10.2 Penentuan suhu optimum

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim

selulase hasil dialisis pada kondisi pH optimum dari tahap sebelumnya. Variasi

suhu yang digunakan yaitu 30-90°C dengan selang 10°C. Prosesnya dilakukan

dengan cara 1 mL enzim ditambahkan dengan 1 mL CMC 1% yang terlarut

dalam buffer optimum. Kemudian diinkubasi pada rentang suhu 30-90°C selama

30 menit setelah itu ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL dan larutan



Data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan suhu sebagai absis dan

aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat. Suhu optimum ditentukan berdasarkan

pH dengan aktivitas selulase tertinggi (Iqbal et al., 2011).

11

1.4.10.3 Stabilitas pH

Stabilitas pH bertujuan untuk menentukan kestabilan enzim sampai pH

tertentu. Stabilitas pH ditentukan dengan menginkubasi enzim hasil dialisis

(tanpa substrat) pada kisaran pada rentang pH 3-9 dengan interval 1 unit selama

1 jam suhu 4°C. Setelah waktu inkubasi masing-masing selesai enzim

ditambahkan dengan substrat CMC 1%, kemudian diinkubasi pada suhu 50°C

selama 30 menit, setelah itu ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL dan

larutan didihkan pada penangas air selama 15 menit. Kadar gula reduksi dihitung


Aktivitas residunya dihitung dengan rumus: (Seo et al., 2013)

% 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 =𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝐻 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑢(𝑈/𝑚𝑙)

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝐻 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑚𝑢𝑚 (𝑈/𝑚𝑙) 𝑥 100%

1.4.10.4 Stabilitas suhu

Stabilitas suhu bertujuan untuk menentukan kestabilan enzim sampai

suhu tertentu. Stabilitas pH ditentukan dengan menginkubasi enzim (tanpa

substrat) pada kisaran pada rentang 30-90°C dengan selang 10°C selama 1 jam.

Setelah waktu inkubasi masing-masing selesai enzim ditambahkan dengan

substrat CMC 1%, kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama 30 menit,

setelah itu ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL dan larutan didihkan pada

penangas air selama 15 menit. Kadar gula reduksi dihitung dengan mengukur

nilai absorbansi sampel pada panjang gelombang 520 nm. Aktivitas residunya

dihitung dengan rumus: (Seo et al., 2013)

% 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 =𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑢ℎ𝑢 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑢(𝑈/𝑚𝑙)

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑢ℎ𝑢 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑚𝑢𝑚 (𝑈/𝑚𝑙) 𝑥 100%

1.4.10.5 Pengaruh penambahan ion

Pengaruh penambahan ion terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan

menguji aktivitas enzim selulase terhadap beberapa ion yaitu KCl, CaCl2, MnCl2,

MgCl2, dan NaCl dengan konsentrasi 10 mM. Prosesnya dilakukan dengan cara

1 mL CMC 1% yang terlarut dalam buffer optimal dan larutan ion 10 mM

ditambahkan dengan 1 mL enzim. Kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama

30 menit, setelah itu ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 mL dan larutan


dengan mengukur nilai absobansi sampel pada panjang gelombang 520 nm.

Data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan ion sebagai absis dan

aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat (Gaur and Soni, 2015).

12

1.5 Pengamatan dan analisis data

Pengamatan data secara kuantitatif dengan mengetahui data aktivitas

enzim selulase (U/mL) yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara deskriptif

dengan menentukan nilai aktivitas selulase tertinggi pada masing-masing

perlakuan (pH dan suhu optimum, serta stabilitas pH dan suhu, dan pengaruh

penambahan ion) dan hasil perhitungan untuk mengetahui pengaruh perlakuan

terhadap aktivitas enzim.

1.6 Diagram alir penelitian

1.6.1 Tahapan Penelitian

Gambar 3.1 Tahapan Penelitian

Dialisis

Isolat P12

Pembuatan kurva pertumbuhan isolat

Peremajaan

Ekstrak kasar enzim

Pengendapan dengan amonium sulfat

Penentuan waktu optimum produksi

enzim selulase

Produksi dan ekstraksi enzim

Enzim hasil dialisis

Pengukuran aktivitas enzim

dan aktivitas spesifik enzim

Karakterisasi enzim:

- pH optimum

- Suhu optimum

- Stabilitas pH

- Stabilitas suhu

- Penambahan ion

Analisis 16S rRNA Identifikasi bakteri

13

1.6.2 Diagram Alir Pembuatan Stok Kultur

Gambar 3.2 Diagram alir pembuatan stok kultur isolat P12 (Irfan et al., 2012)

1 ose isolat P12

Diinkubasi dalam shakerwaterbath

kecepatan 100 rpm, selama 24 jam,

suhu 50°C

10 mL media CMC cair steril

Diinkubasi dalam shakerwaterbath

kecepatan 100 rpm, selama 24 jam,

suhu 50°C

Stok kultur isolat P12

Diambil 10% stok kultur

Dimasukkan ke dalam 100 mL media

cair

14

1.6.3 Diagram alir identifikasi bakteri

Gambar 3.3 Diagram alir analisis 16S rRNA

Kultur isolat bakteri P12

Dimasukkan ke dalam tabung

eppendorf

Diambil 2 mL

DNA isolat bakteri selulolitik P12

Amplifikasi gen 16s rRNA

Disentrifus 14000 rpm selama 2

menit

Isolasi DNA bakteri dengan Zymo-kit

Elektroforesis DNA

Sequencing DNA

Analisis pohon filogeni

Hasil

15

1.6.4 Diagram Alir Penentuan Waktu Panen Enzim Selulase

Gambar 3.4 Diagram alir penentuan waktu panen enzim selulase (Dini dan Ifah,

2014).

Diinkubasi dalam shakerwaterbath 50°C, 120 rpm sampai

selama 6 hari (setiap hari dilakukan sampling)

Diambil 10 ml biakan bakteri

Disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm, suhu 4°C selama

15 menit

Ekstrak enzim kasar

enzim selulase

Endapan

90 ml media cair CMC

10 ml kultur starter cair

Diuji aktivitas enzim selulase dengan uji DNS

16

1.6.5 Diagram alir Pemurnian enzim dengan Amonium Sulfat

Diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit

Didiamkan 24 jam pada suhu 4°C

Dilakukan sentrifugasi 8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C







Gambar 3.5 Diagram alir pemurnian enzim (Krisna dan Lia, 2012)

Endapan I didialisis dan diukur

aktivitas dan kadar proteinnya

Supernatan I

Amonium sulfat 60-70%

Endapan II didialisis dan diukur


Supernatan II


Endapan III didialisis dan diukur


Supernatan III


970 ml ekstrak enzim selulase

17

1.6.6 Diagram Alir Penentuan pH Optimum Enzim Selulase

Gambar 3.6 Diagram alir penentuan pH optimum (Iqbal et al., 2011)

1.6.7 Diagram Alir Penentuan Suhu Optimum Enzim Selulase

Gambar 3.7 Diagram alir penentuan suhu optimum (Iqbal et al., 2011)

1 mL CMC 1% yang terlarut dalam

buffer sitrat fosfat 0,05 M (pH 3-6),

buffer natrium fosfat 0,05 M (pH 7-8),

dan buffer tris HCl (pH9)

Diinkubasi pada suhu 500C selama

30 menit

Diuji dengan metode DNS

Hasil

1 mL enzim hasil dialisis

2 mL DNS

1 mL CMC 1% yang terlarut dalam

buffer optimum

Diinkubasi pada suhu 30-60°C

selama 30 menit


Hasil


2 mL DNS

18

1.6.8 Diagram Alir Stabilitas pH Enzim Selulase

Gambar 3.8 Diagram alir stabilitas pH (Seo et al., 2013).

1.6.9 Diagram Alir Stabilitas Suhu Enzim Selulase

Gambar 3.9 Diagram alir stabilitas suhu (Seo et al., 2013)

1 mL Buffer sitrat fosfat 0,05 M (pH

3-6), buffer natrium fosfat 0,05 M (pH

7-8), dan buffer tris HCl (pH9)

Diinkubasi pada suhu 50°C selama

60 menit


Hasil



30 menit

2 mL DNS

Diambil 1 mL 1 mL CMC 1% yang

terlarut dalam buffer

optimal

Diinkubasi pada suhu 30-60°C

selama 60 menit




30 menit

2 mL DNS

1 mL CMC 1% yang

terlarut dalam buffer

optimal

Hasil

19

1.6.10 Diagram Alir Penambahan Ion

Gambar 3.10 Diagram alir penambahan ion (Gaur and Soni, 2015).



30 menit

2 mL DNS

1 mL CMC 1% yang terlarut

dalam buffer optimal dan ion

(CaCl2, MgCl2, NaCl, KCl,

MgCl2, MnCl2)

Hasil


20

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Kurva pertumbuhan Isolat P12

Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dilakukan untuk mengetahui fase

logaritmik/ fase pertumbuhan dari bakteri. Kurva pertumbuhan diperoleh dengan

membuat plot antara waktu inkubasi dan Optical Density (OD). Optical Density

(OD) dapat digunakan untuk mengukur tingkat kekeruhan dengan menggunakan

panjang gelombang tertentu, dimana semakin keruh suatu media cair atau

larutan menunjukkan jumlah masa bakteri semakin banyak (Atma, 2018).

Kurva pertumbuhan isolat P12 dibuat dengan mengamati Optical Density

(OD) isolat setiap 1 jam pada 4 jam pertama, kemudian setelah itu 2 jam

kemudian dan 4 jam sekali hingga jam ke-30 menggunakan spektrofotometer

dengan panjang gelombang 343 nm. Data absorbansi yang didapatkan

kemudian di plotkan ke grafik dengan waktu inkubasi sebagai sumbu absis dan

Optical Density (OD) sebagai sumbu ordinat. Grafik kurva pertumbuhan isolat

P12 dapat dilihat pada Gambar 4.1

Gambar 4.1 Kurva pertumbuhan isolat bakteri P12

Kurva pertumbuhan pada Gambar 4.1 menunjukkan bahwa isolat P12

mengalami pertumbuhan dengan fase lag dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-4.

Pada fase ini pertumbuhan bakteri tidak terjadi secara signifikan dikarenakan

pada fase ini bakteri hanya menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Kemudian

terjadi peningkatan OD atau biasa disebut dengan fase eksponensial dari jam ke-

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

OD

Bak

teri

Waktu (jam)

21

4 hingga ke-26, hal ini menunjukkan bahwa sel mulai membelah dengan cepat

dan konstan. Berdasarkan data tersebut dapat diketahui bahwa pertumbuhan

bakteri isolat P12 secara optimal pada media CMC terjadi hingga jam ke-26

dengan nilai OD bakteri 2,631. Setelah jam ke-26 nilai OD menurun yang

menunjukkan bahwa bakteri berada pada fase kematian, dimana pada fase ini

pertumbuhan bakteri mengalami penurunan pertumbuhan. Jumlah sel bakteri

paling tinggi terdapat pada fase log akhir. Pada fase ini, sel mulai aktif membelah

serta perkembangbiakan sel semakin meningkat sehingga didapatkan jumlah sel

terbanyak. Peningkatan jumlah sel berhenti disebabkan karena jumlah nutrisi

dalam media telah berkurang sehingga menyebabkan kematian sel (Supriyanto

dkk., 2015). Pada penelitian lain menyebutkan bahwa Bacillus licheniformis

selama 4 jam mengalami adaptasi kemudian setelah itu mengalami peningkatan

jumlah sel hingga paling optimal pada jam ke 24 inkubasi (Zhou et al., 2019).

Kurva pertumbuhan isolat P12 yang telah dilakukan dijadikan sebagai

dasar waktu penuangan inokulum yang terbaik yang menunjukkan pertumbuhan

sel paling tinggi. Berdasarkan grafik tersebut waktu penuangan inokulum pada

media produksi enzim yaitu pada akhir fase logaritmik isolat yang terjadi pada

jam ke-26 dimana OD sel memiliki nilai tertinggi.

4.2 Hasil uji 16S rRNA

Identifikasi isolat P12 yang dilakukan dengan menganalisis gen 16S rRNA

melalui proses amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer universal. Primer

reverse yang digunakan yaitu 1492R (5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’) dan

primer forward yaitu 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’). Hasil sekuensing

dari gen 16S rRNA yang diamplifikasi masih merupakan data mentah yang harus

diolah menggunakan program bioedit. Kemudian membandingkan sekuen gen

16S rRNA isolat P12 dengan dengan data sekuens gen 16S rRNA yang sudah

tersedia di GenBank menggunakan program BLASTN yang terdapat pada NCBI.

Menurut Narita dkk. (2012), identifikasi spesies bakteri dapat dilakukan dengan

menganalisis potongan sekuen gen 16S rRNA berdasarkan data genom yang

ada di GenBank dan sekuens yang paling dekat dengan sampel dilihat dari

sekuens yang identik dan nilai kemiripan yang paling tinggi.

22

Tabel 4.1 Hasil uji Blast

Spesies Bakteri Acsession

Number Nilai kemiripan

Bacillus licheniformis

strain WJB11

KU877628.1 99,51%


strain 103D-012

KT763347.1 99,51%


strain HT-21

KJ526831.1 99,51%


strain AS-08E

JN118574.1 99,51%


strain D4-10-2-2

MK063871.1 99,51%


strain Q63

KP686132.1 99,44%


strain T7

MH000674.1 99,44%


strain BRM0439913

MH3050709.1 99,44%


strain D4-10-1-3

MK063868.1 98,37%


strain BaDB18

JX237853.1 98,31%

Hasil sekuensing dari DNA isolat bakteri P12 menghasilkan urutan basa

nukleotida. Basa nukelotida tersebut kemudian di masukkan ke dalam NCBI

untuk dilakukan Blast secara online untuk mengetahui kesamaan nukleotida

dengan data sekuens bakteri lain yang sudah tersedia di GenBank. Hasil Blast

menunjukkan kesamaan urutan nukleotida isolat P12 dengan urutan nukleotida

bakteri yang ada pada GenBank. Hasil Blast ditunjukkan pada Tabel 4.2 nilai

hasil kemiripan dari perbandingan antara urutan nukleotida hasil sekuensing

isolat bakteri P12 dengan urutan nukleotida 10 bakteri yang ada di GenBank

yaitu Bacillus licheniformis strain WJB11, Bacillus licheniformis strain Q63,

Bacillus licheniformis strain T7, Bacillus licheniformis strain BRM0439913,

Bacillus licheniformis strain 103D-012, Bacillus licheniformis strain HT-21,

Bacillus licheniformis strain AS-08E, Bacillus licheniformis strain D4-10-2-2,

Bacillus licheniformis strain D4-10-1-3, dan Bacillus licheniformis strain BaDB18.

Pohon filogeni yang menggambarkan hubungan kekerabatan isolat bakteri P12

dengan Bacillus licheniformis lain yang terdapat pada GenBank ditunjukkan

pada Gambar 4.2.

23

Gambar 4.2 Pohon Filogeni

Pohon filogeni ini dibuat dengan menggunakan metode Neighbor-joining.

Pada Gambar 4.2 menunjukkan hubungan kekebarabatan isolat bakteri P12

dengan Bacillus licheniformis. Berdasarkan hasil pohon filogeni menunjukkan

bahwa isolat bakteri P12 berkerabat dekat dengan Bacillus licheniformis strain

103D-012 dengan nilai bootstrap 64%. Nilai bootstrap menjadi tolak ukur penentu

tingkat kepercayaan pohon filogeni. Semakin tinggi nilai bootstrap maka semakin

tinggi pula tingkat kepercayaan topologi (cabang) pohon hasil yang telah dibuat

(Syamsul dkk., 2008).

Bacillus licheniformis dapat ditemukan di tanah, bulu burung dan bahan

tanaman. Bacillus licheniformis ini umumnya diketahui menyebabkan keracunan

makanan, pembusukan pada makanan, dan mencemari susu. Bakteri ini

cenderung membentuk spora sehingga dapat digunakan dalam produksi enzim

dan antibiotik. Suhu pertumbuhan optimalnya adalah 50°C tetapi juga dapat

bertahan pada suhu yang lebih tinggi. Bakteri ini biasanya digunakan dalam

industri bioteknologi untuk memproduksi enzim seperti protease, -amylase, -

mannanase, keratinase, endoglukanase, glukoamilase, pektinase, dan antibiotik

(Ghani et al., 2013.).

4.3 Penentuan Waktu Panen Enzim Selulase

Penentuan waktu panen enzim diperlukan untuk mengetahui waktu

inkubasi yang tepat untuk menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas

tertinggi. Penentuan waktu optimum produksi enzim selulase dilakukan dengan

melakukan pengujian aktivitas enzim selulase setiap hari selama 6 hari waktu

inkubasi. Setelah itu data pengamatan aktivitas enzim setiap hari diplotkan dalam

24

grafik dengan waktu inkubasi sebagai absis dan aktivitas selulase sebagai

sumbu ordinat. Waktu panen enzim ditentukan dengan melihat waktu inkubasi

dengan aktivitas enzim selulase tertinggi (Rahmadini, 2012). Kurva waktu panen

enzim dapat dilihat pada Gambar 4.3.

Gambar 4.3 Penentuan waktu panen enzim selulase

Berdasarkan kurva pada Gambar 4.3 penentuan waktu produksi yang

dihitung dari nilai aktivitas enzim tertinggi dengan menggunakan metode DNS

menunjukkan bahwa aktivitas enzim tertinggi terdapat pada hari pertama dengan

nilai aktivitas 0,0114 U/ml. Kemudian aktivitas enzim mengalami penurunan pada

hari ke-2 dan terus menurun pada hari ke-3 hingga hari ke-6. Peningkatan

aktivitas enzim selulase terjadi pada hari ke-0 sampai hari ke-1 menunjukkan

bahwa terjadi interaksi antara enzim selulase dengan selulosa membentuk

kompleks enzim-substrat yang menghasilkan glukosa sebagai produk. Hal ini

sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri yang menunjukkan jumlah sel

terbanyak pada jam ke 26. Nilai aktivitas enzim sebanding dengan jumlah sel

yang terdapat pada media semakin banyak sel yang terdapat pada media maka

enzim yang dihasilkan juga akan banyak. Penurunan aktivitas enzim selulase

yang terjadi pada hari ke-2 hingga hari ke-6 menunjukkan bahwa interaksi antara

enzim selulase dengan selulosa menurun. Hal ini disebabkan oleh akumulasi

produk yang terbentuk pada hari sebelumnya yang menyebabkan penghambatan

bagi enzim selulase.

Berdasarkan grafik tersebut dapat ditentukan bahwa waktu panen enzim

selulase pada hari ke-1 dengan aktivitas enzim selulase 0,0114 U/ml. Beberapa

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0 1 2 3 4 5 6 7

Akt

ivit

as e

nzi

m (

U/m

L)

Waktu (hari)

25

penelitian lain menunjukkan bahwa waktu optimum untuk produksi enzim

selulase yaitu selama 48 jam dengan nilai maksimum aktivitas enzim selulase

yaitu 0,1419 U/mL (Roopa et al., 2017), Bacillus licheniformis juga menghasilkan

enzim selulase yang optimal selama 48 jam (Balakumaran et al., 2015), produksi

enzim selulase oleh bakteri Bacillus licheniformis RT-17 maksimum pada 24 jam

inkubasi dengan nilai aktivitas yaitu 8,88 U/mL (Tariq et al., 2018).

4.4 Pemurnian Enzim dengan Amonium Sulfat

Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan

dari senyawa lain yang menganggu. Salah satu metode yang biasa digunakan

dalam pemurnian enzim tahap awal yaitu melakukan pengendapan

menggunakan amonium sulfat untuk mengendapkan keseluruhan protein dalam

sampel. Amonium sulfat mengandung ion-ion garam yang akan menurunkan

kelarutan protein. Ion-ion garam tersebut akan mengikat molekul air yang

berinteraksi dengan protein sehingga protein lain akan teragregasi dan

mengendap (Rachmadini, 2007). Pengendapan bertujuan untuk pemurnian

enzim sehingga dapat meningkatkan aktivitas spesifik enzim tersebut. Tujuan

adanya variasi penggunaan amonium sulfat yaitu untuk mengetahui konsentrasi

amonium sulfat yang digunakan pada sampel dan menghasilkan aktivitas enzim

yang tertinggi (Triana, 2013).

Pengendapan protein enzim dengan amonium sulfat dilakukan dengan

menambahkan amonium sulfat 60%-80%. Pengukuran aktivitas selulase

dilakukan untuk mengetahui konsentrasi kejenuhan amonium sulfat yang tepat

dalam mengendapkan enzim selulase yang ditunjukkan dengan tingginya

aktivitas yang dihasilkan. Aktivitas enzim selulase hasil pengendapan dengan

amonium sulfat disajikan pada tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil Pemurnian Enzim dengan Pengendapan Amonium Sulfat

Tahapan purifikasi Aktivitas

enzim (U/ml) Kadar protein

(mg/ml) Aktivitas spesifik

(U/mg)

Amonium sulfat 60% 0,003 0,429 0,0062

Amonium sulfat 70% 0,005 0,430 0,0107

Amonium sulfat 80% 0,002 0,381 0,0065

Berdasarkan Tabel 4.2 yang menunjukkan aktivitas enzim selulase pada

beberapa tingkat kejenuhan amonium sulfat menunjukkan bahwa aktivitas enzim

selulase meningkat seiring dengan penambahan amonium sulfat. Penambahan

26

amonium sulfat dengan konsentrasi 60% menghasilkan aktivitas enzim sebesar

0,003 U/ml, kemudian aktivitas enzim meningkat pada penambahan amonium

sulfat hingga konsentrasi 70% sebesar 0,005 U/ml. Tetapi pada penambahan

amonium sulfat hingga konsentrasi 80% aktivitas enzim menurun menjadi 0,002

U/ml. Penurunan aktivitas enzim ini disebabkan karena pada konsentrasi 70%

cukup banyak enzim yang terendapkan sehingga pada konsentrasi 80% hanya

sebagian enzim yang tersisa yang terendapkan (Kurniawan dkk., 2013) dan

semakin tingginya konsentrasi amonium sulfat yang ditambahkan dapat

menurunkan selektivitas dalam proses pengendapan (Narayan et al., 2008).

Aktivitas spesifik enzim pada Tabel 4.2 yang menunjukkan penambahan

amonium sulfat 70% sebesar 0,0107 U/mg sedangkan aktivitas spesifik enzim

pada penambahan amonium sulfat 80% sebesar 0,0065 U/mg. Aktivitas spesifik

enzim menunjukkan tingkat kemurnian enzim dimana semakin tinggi aktivitas

spesifik enzim maka semakin tinggi tingkat kemurnian. Berdasarkan data

penelitian tersebut dapat disimpulkan bahwa penambahan amonium sulfat

hingga kejenuhan 70% dapat digunakan untuk mengendapkan ekstrak kasar

enzim selulase yang diproduksi oleh isolat bakteri P12 karena menghasilkan nilai

aktivitas spesifik yang tertinggi dibandingkan dengan fraksi lainnya. Menurut

Mardiana (2018), penambahan amonium sulfat hingga konsentrasi 70% dapat

meningkatkan aktivitas enzim sebesar 0,036 U/ml. Namun penambahan

amonium sulfat hingga kejenuhan 80% dapat menurunkan aktivitas enzim

menjadi 0,013 U/mL. Pengendapan enzim selulase juga dilakukan oleh Lee et al.

(2008) yang melaporkan bahwa 70% amonium sulfat dapat meningkatkan

aktivitas spesifik selulase yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus amyoliquefaciens

DL-3 sebesar 533,40 U/mg. Alviyulita et al. (2014) melaporkan bahwa

pengendapan amonium sulfat 70% dapat mengendapkan enzim protease yang

memiliki aktivitas sebesar 116,13 U/mL. Hasil pengendapan enzim dengan

penambahan amonium sulfat hingga kejenuhan 70% yang memiliki aktivitas

spesifik tertinggi dibandingkan dengan penambahan amonium sulfat dengan

kejenuhan 60% dan 80% kemudian dipilih untuk dilanjutkan pada rangkaian

proses selanjutnya yaitu dialisis.

Dialisis adalah teknik untuk memisahkan komponen yang kecil dan tidak

diinginkan dari suatu larutan dengan menggunakan difusi pasif dan selektif oleh

membran semipermeable. Garam yang digunakan dalam proses pengendapan

harus dihilangkan dari enzim karena garam amonium sulfat dan ion-ion yang

27

terdapat pada endapan bersama dengan enzim dapat mempengaruhi kestabilan

enzim selama penyimpanan sehingga perlu dilakukan dialisis untuk

menghilangkannya (Berg et al., 2002).

Dialisis dilakukan dengan menggunakan kantong dialisis dengan pori

berukuran 12 kDa. Pada tahap dialisis enzim (protein) ditempatkan di dalam

kantung (membran) semipermeable yang direndam dengan larutan buffer

tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan keluar melalui membran dan molekul

yang besar akan tertahan di dalam membran dialisis. Diketahui berat molekul

dari enzim selulase berkisar antara 26-200 kDa, sehingga enzim selulase tidak

dapat keluar melalui pori pada kantong dialisis tetapi amonium sulfat yang

berupa ion dapat keluar dengan mudah melalui membran (Sonia dan Kusnadi,

2015).

Tahapan pemurnian parsial enzim selulase dilakukan dengan melakukan

pengendapan protein pada ekstrak kasar enzim selulase dengan amonium sulfat

kemudian dilakukan dialisis untuk menghilangkan sisa amonium sulfat. Data

aktivitas enzim dari masing-masing tahapan dapat dilihat pada Tabel 4.3

Tabel 4.3 Tahapan Pemurnian Enzim Selulase

Tahapan purifikasi

Volume (ml)

Aktivitas enzim (U/ml)

Kadar protein (mg/ml)

Aktivitas spesifik (U/mg)

Yield (%)

Tingkat kemurnian

(fold)

Enzim kasar

970 0,010 0,340 0,0303 100 -

Amonium sulfat 70%

800 0,005 0,430 0,0107 45 0,354

Dialisis 70%

50 0,004 0,381 0,0103 38 0,340

Hasil pemurnian enzim pada Tabel 4.3 menunjukkan kadar protein enzim

kasar yakni 0,340 mg/ml sedangkan enzim hasil dialisis 0,381 mg/ml dan

aktivitas spesifik enzim kasar yakni 0,0303 U/mg sedangkan enzim hasil dialisis

yakni 0,0103 U/mg. Pada proses presipitasi enzim nilai kadar protein sebanding

dengan aktivitas spesifik enzim yaitu jika kadar protein menurun maka aktivitas

spesifik enzim juga menurun ataupun sebaliknya (Madhusudhan et al., 2008).

Hal ini sesuai dengan data pada Tabel 4.3 yaitu kadar protein dan aktivitas

spesifik pada pengendapan enzim dengan amonium sulfat 70% lebih tinggi

dibandingkan dengan enzim hasil dialisis. Penurunan ini disebabkan karena

pada proses dialisis terjadi perpindahan molekul yang berukuran kecil dari dalam

membran menuju keluar membran yang berisi larutan buffer sehingga akan

28

terjadi perpindahan larutan buffer masuk ke dalam membran dan mengencerkan

larutan di dalam membran.

Pada Tabel 4.3 dapat dilihat bahwa setelah pengendapan dengan

amonium sulfat hingga kejenuhan 70%, yield mengalami penurunan menjadi 45

% dan setelah proses dialisis nilai yield menjadi 38%. Pada beberapa penelitian

antara lain menurut Azaidan et al. (2017) pada proses pemurnian enzim selulase

yang dihasilkan oleh Bacillus sonorensis HSC7 diperoleh yield sebesar 55,52%

setelah proses pengendapan dengan amonium sulfat kemudian diperoleh yield

sebesar 11,97% setelah proses dialisis. Pada penelitian Mardiana (2018) pada

proses pengendapan enzim selulase dari kapang endofit laut dengan kejenuhan

amonium sulfat 70% yield yang diperoleh 3,35%. Tahapan pemurnian yang baik

mempertimbangkan tingkat kemurnian dan yield. Tingkat kemurnian yang tinggi

dan yield yang rendah sehingga menyisakan sedikit protein merupakan tahapan

yang baik digunakan untuk penelitian. Sedangkan jika yield yang tinggi dengan

tingkat kemurnian yang rendah akan menunjukkan banyak kontaminan (protein

selain yang diinginkan) dalam fraksi (Berg et al., 2002). Berdasarkan tabel hasil

penelitian menunjukkan yield enzim selulase dari isolat P12 hasil dialisis

menurun jika dibandingkan dengan ekstrak kasar.

Pada Tabel 4.3 menunjukkan bahwa tingkat kemurnian enzim kasar yaitu

0,354 setelah dilakukan proses pengendapan dengan amonium sulfat dan

mengalami penurunan menjadi 0,340 setelah dilakukan proses dialisis. Tingkat

kemurnian sebanding dengan aktivitas spesifik enzim, semakin tinggi aktivitas

spesifik enzim maka tingkat kemurnian enzim juga akan semakin tinggi (Berg et

al., 2002). Pada penelitian ini aktivitas spesifik enzim selulase sebanding dengan

tingkat kemunian yaitu penurunan aktivitas spesifik enzim yang tidak terlalu

drastis sebanding dengan tingkat kemurnian. Hal ini menunjukkan bahwa pada

tingkat kemurnian enzim masih belum optimal dikarenakan ativitas spesifik enzim

yang tidak terjadi peningkatan.

4.5 Hasil Karakterisasi Enzim Selulase

4.5.1 pH Optimum Enzim Selulase Isolat P12

Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim

selulase hasil dialisis pada rentang pH 3-9 dengan interval 1 unit. Setelah itu

data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan pH sebagai absis dan

aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat. pH optimum ditentukan berdasarkan

29

pH dengan nilai aktivitas enzim selulase tertinggi. Kurva pH optimum enzim

selulase dapat dilihat pada Gambar 4.4.

Gambar 4.4 Kurva pH optimum

Berdasarkan Gambar 4.4 hasil uji aktivitas optimum enzim terhadap pH

menunjukkan bahwa pada pH 3 aktivitas enzim selulase dari isolat bakteri P12

yaitu 0,006 U/ml, pada pH 4 aktivitas enzimnya 0,012 U/ml, pada pH 5 aktivitas

enzimnya 0,013 dan pH 6 aktivitas enzimnya yaitu 0,013 U/mk, pada pH 7

aktivitas enzimnya mengalami kenaikan hingga 0,020 U/ml tetapi pada pH 8

aktivitas enzimnya semakin rendah yaitu 0,006 U/ml. Pada pH 9 aktivitas

enzimnya yaitu 0,0016. Uji ANOVA dengan selang kepercayaan 95% untuk

mengetahui adanya perbedaan nyata antar range pH tersebut. Hasil uji ANOVA

dapat dilihat pada Tabel 4.4

Tabel 4.4 Hasil Uji ANOVA pH Optimum Enzim

SK dB JK KT F Hitung P-Value

pH 6 0,000577 0,000096 1378,19 0,000

Eror (galat ) 14 0,000001 0,000000

Total 20 0,000578

Berdasarkan hasil uji ANOVA dapat dilihat bahwa p-value < 0,05

sehingga hasil aktivitas pada penentuan pH optimum Berbeda Nyata.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Akt

ivit

as e

nzi

m (

U/m

l)

pH

Buffer Sitrat

Buffer Phosphat

Buffer Tris HCl

30

Berdasarkan data pengujian tersebut dapat disimpulkan bahwa enzim dalam

keadaan optimum yang ditunjukkan dengan aktivitas tertinggi yakni pada pH 7.

Ion H+ yang ada dalam larutan pH berpengaruh pada bagian katalitik

enzim sehingga menyebabkan terjadinya perubahan struktur konformasi enzim.

Perubahan pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim melalui pengubahan

struktur atau muatan residu asam amino yang berfungsi dalam pengikatan

substrat. Penurunan aktivitas pada beberapa pH kemungkinan terjadi karena

perubahan muatan gugus fungsi residu asam amino pada enzim (Sinaga, 2016).

Dapat disimpulkan bahwa pH optimum enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

P12 yaitu 7. pH optimum enzim selulase isolat P12 sama seperti beberapa

penelitian yaitu menurut Sinaga (2016) enzim selulase yang diproduksi oleh

isolat bakteri 6-2 menunjukkan aktivitas enzim tertinggi pada pH 7 dengan

aktivitas enzim sebesar 0,037 U/mL. Enzim selulase yang dihasilkan oleh

Bacillus subtilis K-18 menghasilkan akvitas tertinggi pada pH dengan nilai

aktivitas sebesar 3 U/mL (Irfan et al., 2017). Enzim selulase yang diproduksi oleh

Paenibacillus sp.menunjukkan aktivitas enzim tertinggi pada pH 7 dengan

aktivitas sebesar 0,9 U/mL (Islam and Narayan, 2018).

4.5.2 Suhu Optimum Enzim Selulase Isolat P12

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim

selulase hasil dialisis pH optimum dari tahap sebelumnya. Variasi temperatur

yang digunakan yakni 30-90°C dengan selang 10°C. Setelah itu data aktivitas

enzim diplotkan dalam grafik dengan suhu sebagai absis dan aktivitas selulase

sebagai sumbu ordinat. Suhu optimum ditentukan berdasarkan suhu dengan

aktivitas selulase tertinggi. Kurva suhu optimum enzim selulase dapat dilihat

pada Gambar 4.5.

31

Gambar 4.5 Kurva suhu optimum

Berdasarkan Gambar 4.5 hasil uji aktivitas optimum enzim terhadap suhu

menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulase yang dihasilkan isolat bakteri P12

mengalami peningkatan hingga suhu 50°C dan setelah itu mengalami penurunan

hingga suhu 90°C. Uji ANOVA dengan selang kepercayaan 95% untuk

mengetahui adanya perbedaan nyata antar range suhu tersebut. Hasil uji

ANOVA dapat dilihat pada Tabel 4.5

Tabel 4.5 Hasil Uji ANOVA Suhu Optimum Enzim


pH 6 0,000401 0,000067 787,63 0,000

Eror (galat ) 14 0,000001 0,000000

Total 20 0,000402


sehingga hasil aktivitas pada penentuan suhu optimum Berbeda Nyata.

Berdasarkan data pengujian tersebut dapat disimpulkan bahwa enzim dalam

keadaan optimum yang ditunjukkan dengan aktivitas tertinggi yakni pada suhu

50°C.

Peningkatan suhu akan menyebabkan aktivitas enzim selulase meningkat

karena energi kinetik meningkat sehingga interaksi antara substrat dan enzim

meningkat dan menghasilkan produk yang semakin banyak. Penurunan aktivitas

enzim selulase pada suhu lebih tinggi dari 50°C dikarenakan protein dari enzim

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 20 40 60 80 100

Akt

ivit

as e

nzi

m (

U/m

l)

Suhu (°C)

32

rusak dan terdenaturasi. Suhu yang lebih tinggi juga menyebabkan terputusnya

ikatan sekunder enzim akibat energi kinetik yang terlalu besar dari molekul

enzim. Suhu optimum merupakan suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi enzim

dan akan menghasilkan aktivitas enzim tertinggi. Ketika enzim memiliki aktivitas

enzim tertinggi maka laju reaksi biologis yang dikatalisisnya tertinggi. Pada suhu

rendah aktivitas enzim rendah karena enzim dan molekul substrat memiliki energi

kinetik yang lebih sedikit sehingga ada lebih sedikit tabrakan antara substrat

dengan enzim. Pada suhu optimum tumbukan antara enzim dan substrat sangat

efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat semakin mudah dan

produk yang terbentuk meningkat. Pada suhu tinggi, bentuk enzim berubah

sehingga tidak ada substrat yang berikatan dengan enzim. Energi panas yang

terlalu tinggi dapat meningkatkan kinetika enzim untuk mencapai titik yang dapat

melampaui batas energi yang diperlukan untuk merusak ikatan kovalen yang

menyusun struktur tiga dimensi enzim. Akibatnya rantai polipeptida menjadi tidak

terlipat (unfolding) atau terdenaturasi dan disertai dengan penurunan aktivitas

katalitik secara drastis (Sivakumar et al., 2016).

Enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri P12 yang optimum

pada suhu 50°C ini memiliki kesamaan dengan beberapa isolat antara lain

Bachilus licheniformis B7 sebesar 9,5 U/mL pada suhu 50°C, Bacillus subtilis

YJ1 optimum pada suhu 50-60°C (Yin et al., 2010), Bacillus sp. optimum pada

suhu 50°C dengan aktivitas enzim sebesar 0,37 U/ml (Listyaningrum et al.,

2018).

4.5.3 Stabilitas pH Enzim Selulase Isolat P12

Stabilitas enzim terhadap pH dilakukan dengan menguji enzim selulase

hasil dialisis diinkubasi selama 1 jam pada rentang pH 3-9 dengan interval 1 unit

pada suhu 4°C. Setelah itu dilakukan uji aktivitas enzim selulase pada suhu dan

pH optimum. Data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan pH sebagai

absis dan aktivitas relatif sebagai sumbu ordinat. Stabilitas enzim terhadap pH

dilihat dari aktivitas relatif yang tetap stabil dalam berbagai pH. Kurva stabilitas

pH enzim selulase dapat dilihat pada Gambar 4.6.

33

Gambar 4.6 Kurva stabilitas pH

Berdasarkan kurva pada Gambar 4.6 hasil uji stabilitas enzim selulase

terhadap pH menunjukkan bahwa enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

bakteri P12 relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam pada pH 3-9. Hal ini

ditunjukkan dengan adanya perlakuan penambahan asam atau basa pada enzim

yang tidak menyebabkan penurunan aktivitas relatif enzim dibawah 50%. Uji

ANOVA dengan selang kepercayaan 95% untuk mengetahui adanya perbedaan

nyata antar range pH tersebut. Hasil uji ANOVA dapat dilihat pada Tabel 4.6

Tabel 4.6 Hasil Uji ANOVA Stabilitas pH Enzim


pH 6 0,000178 0,000060 1778,19 0,000

Eror (galat ) 14 0,000001 0,000000

Total 20 0,000178


sehingga hasil aktivitas pada penentuan stabilitas pH Berbeda Nyata.

Berdasarkan data pengujian tersebut dapat disimpulkan bahwa pengaruh

perlakuan pH mempengaruhi stabilitas enzim secara nyata.

Hasil kestabilan enzim yang sama yaitu pada enzim selulase yang

dihasilkan oleh Geobacillus sp. HTA426 stabil pada pH 3-10 selama 1 jam

inkubasi dengan relatif aktivitasnya lebih dari 50% (Potprommanee et al., 2017)

dan enzim selulase yang dihasilkan oleh Bacillus vallismortis RG-07 bersifat

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

Akt

ivit

as r

ela

tif

(%)

pH

Buffer Sitrat

Buffer Phosphat

Buffer Tris HCl

34

stabil pada pH 4-10 dengan inkubasi selama 1 jam (Gaur and Soni, 2015). Hasil

pengujian ini menunjukkan bahwa enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

bakteri P12 bersifat stabil terhadap pH asam dan basa (3-9) setelah diinkubasi

pada suhu 30-90°C.

4.5.4 Stabilitas Suhu Enzim Selulase Isolat P12

Stabilitas enzim terhadap suhu dilakukan dengan menguji enzim selulase

hasil dialisis diinkubasi selama 1 jam pada rentang suhu 30-90°C dengan interval

10°C. Setelah itu dilakukan uji aktivitas enzim selulase pada suhu dan pH

optimum. Data aktivitas enzim diplotkan dalam grafik dengan suhu sebagai absis

dan aktivitas relatif sebagai sumbu ordinat. Stabilitas enzim terhadap pH dilihat

dari aktivitas relatifnya lebih dari 50%. Kurva stabilitas suhu enzim selulase dapat

dilihat pada Gambar 4.7.

Gambar 4.7 Kurva stabilitas suhu

Berdasarkan kurva pada Gambar 4.7 hasil uji stabilitas enzim selulase

terhadap suhu menunjukkan bahwa enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

bakteri P12 relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 30-90°C. Hal

ini ditunjukkan dengan adanya perlakuan panas yang tidak menyebabkan

penurunan aktivitas enzim dibawah 50%. Uji ANOVA dengan selang

kepercayaan 95% untuk mengetahui adanya perbedaan nyata antar range suhu

tersebut. Hasil uji ANOVA dapat dilihat pada Tabel 4.7

50

60

70

80

90

100

110

0 20 40 60 80 100

Akt

ivit

as r

ela

tif

(%)

Suhu (°C)

35

Tabel 4.7 Hasil Uji ANOVA Stabilitas Suhu Enzim


pH 6 0,000195 0,000033 272,32 0,000

Eror (galat ) 14 0,000002 0,000000

Total 20 0,000197


sehingga hasil aktivitas pada stabilitas suhu Berbeda Nyata. Berdasarkan data

pengujian tersebut dapat disimpulkan bahwa pengaruh perlakuan suhu

mempengaruhi stabilitas enzim secara nyata.

Hasil kestabilan enzim yang sama yaitu pada enzim selulase yang

dihasilkan oleh Bacillus subtilis (AS3) stabil pada suhu 20-50°C selama 1 jam

inkubasi dengan aktivitas relatifnya lebih dari 50% (Deka et al., 2013) dan enzim

selulase yang dihasilkan oleh Bacillus vallismortis RG-07 bersifat stabil pada

suhu 30-105°C dengan inkubasi selama 1 jam (Gaur and Soni, 2015). Hasil

pengujian ini menunjukkan bahwa enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat

bakteri P12 bersifat stabil terhadap suhu 30-90°C setelah diinkubasi selama 1

jam.

4.5.5 Pengaruh Penambahan ion terhadap aktivitas enzim selulase

Penambahan ion dilakukan untuk mengetahui pengaruh beberapa ion

terhadap aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat bakteri P12. Ion-ion

yang digunakan yaitu KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, dan NaCl dengan konsentrasi

10 mM. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan ion pada substrat yang

terlarut dalam buffer optimum. Setelah itu data aktivitas enzim diplotkan dalam

grafik dengan ion sebagai absis dan aktivitas selulase sebagai sumbu ordinat.

Kurva pengaruh penambahan ion terhadap aktivitas enzim selulase dapat dilihat

pada Gambar 4.8.

36

Gambar 4.8 Pengaruh penambahan ion

Berdasar grafik pada Gambar 4.8 diatas menunjukkan aktivitas enzim

yang lebih tinggi setelah ditambahkan dengan ion dibandingkan dengan enzim

yang tanpa penambahan ion (kontrol). Aktivitas enzim tertinggi setelah dilakukan

penambahan dengan ion KCl, CaCl2, MnCl2 dengan aktivitas tertinggi yaitu 0,099

U/mL. Sedangkan penambahan ion MgCl2, dan NaCl menyebabkan penurunan

aktivitas enzim selulase hingga mencapai 0,083 U/mL. Uji ANOVA dengan

selang kepercayaan 95% untuk mengetahui adanya perbedaan nyata antar ion

tersebut. Hasil uji ANOVA dapat dilihat pada Tabel 4.8

Tabel 4.8 Hasil Uji ANOVA Pengaruh Penambahan Ion


pH 5 0,000496 0,000099 3578,23 0,000

Eror (galat ) 12 0,000000 0,000000

Total 17 0,000496


sehingga hasil aktivitas pada pengaruh penambahan ion Berbeda Nyata.

Berdasarkan data pengujian tersebut dapat disimpulkan bahwa pengaruh

penambahan ion mempengaruhi aktivitas enzim secara nyata.

Menurut penelitian Gaur dan Soni (2015) enzim selulase yang dihasilkan

oleh Bacillus vallismortis RG-07 aktif pada penambahan ion Ca2+, Mg2+, dan Na+

dengan aktivitas enzim 184,4, 175,1 dan 141,4% tetapi dihambat oleh ion Fe2+,

0,075

0,080

0,085

0,090

0,095

0,100

0,105

Kontrol KCl CaCl2 MnCl2 MgCl2 NaCl

Akt

ivit

as e

nzi

m (

U/m

l)

Ion

37

K+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Hg2+ dan Ni2+. Menurut Pokhrel (2014) aktivitas enzim

selulase yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis dengan penambahan ion Mn2+

menghasilkan aktivitas enzim tertinggi mencapai 0,81 U/mL jika dibandingkan

dengan penambahan ion K+, Na+, dan NH4+ menghasilkan aktivitas enzim yang

rendah. Menurut Annamali et al. (2012) aktivitas enzim selulase yang dihasilkan

oleh Bacillus licheniformis AU01 meningkat dengan adanya penambahan ion

Ca2+ (154 %), Mg2+ (108,50%), dan Mn2+ (108,33%). Berdasarkan data pengujian

dapat disimpulkan bahwa ion Ca2+ dapat meningkatkan aktivitas enzim selulase

dalam memecah susbtrat menjadi produk. Menurut Dini dan Ifah (2014)

menyatakan bahwa ion Ca2+ merupakan modelator positif yang akan

menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim sehingga akan

mempermudah interaksi antara enzim dengan susbtrat sehingga meningkatkan

aktivitas katalitik enzim.

38

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini yakni:

1. Isolat P12 asal mata air Gunung Merapi berkerabat dekat dengan Bacillus

licheniformis strain 103D-012 berdasarkan hasil uji 16S rRNA.

2. Aktivitas spesifik enzim selulase kasar yaitu 0,0303 U/mg dan setelah

dilakukan pengendapan dengan menggunakan amonium sulfat, aktivitas

spesifik enzim selulase menjadi 0,0103 U/mg.

3. Enzim selulase yang telah dilakukan dialisis optimum pada pH 7 dan suhu

50°C dan stabil pada rentang suhu 30-90°C, pH asam dan basa (3-9)

serta penambahan ion Ca2+ mampu meningkatkan aktivitas enzim.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap enzim selulase yang

dihasilkan oleh isolat P12 yakni identifikasi berat molekul enzim selulase

dengan SDS-PAGE dan Zimogram

2. Perlu dilakukan proses pemurnian dengan metode lain seperti ion

exchange untuk membandingkan metode pemurnian enzim yang sesuai

untuk pemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat P12.

3. Perlu dilakukan karakterisasi stabilitas enzim dengan waktu inkubasi yang

lebih lama dan pengujian pada berbagai substrat.

39

DAFTAR PUSTAKA

Agustina, W. and Elfi S. V. H. 2018. Natural Wrapping Paper from Banana

(Musa paradisiaca Linn) Peel Waste with Additive Essential Oils.

Journal of Physics: Conf. Series 1022

Alviyulita M, Hasibuan PRM, Hanum Ff. 2014. Pengaruh penambahan

amonium sulfat (NH4)2SO4 dan waktu perendaman buffer fosfat

terhadap perolehan crude papain dari daun pepaya (Carica papaya, L).

Jurnal Teknik Kimia. 3(3): 9-12

Andriana, M. N. 2009. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase Dari Isolat

Bakteri Termofilik Sumber Air Panas Cangar (Tahura R. Soeryo), Batu,

Jawa Timur. Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang

Annamali, N., Mayavan V. R., Sivaramasamy, Elayaraja, Rengathavasi T.,

Shanmugam V., and Thangavel B. 2012. Purification and

Characterization of Thermostable Alkaline Cellulase from Marine

Bacterium Bacillus licheniformis AU01 by Utilizing Cellulosic Wastes.

Wastes Biomass Valor. 3: 305-310

Apriani, K., Yuli H., dan Ganis F. K.. 2014. Produksi dan Uji Aktivitas Selulase

dari Isolat Bakteri Selulolitik Sungai Indragiri. JOM FMIPA. 1(2): 261-

267

Aryani, S. W. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Selulase

dari Kapang Selulolitik Mucor sp. B2. Skripsi. Universitas Airlangga.

Surabaya

Atma, Y. 2018. Prinsip Analisis Komponen Pangan Makro & Mikro Nutrien.

Deepublish. Yogayakarta

Azaidan F., Arastoo B., Abdolhamid N., Zahra K. dan Mehdi H. 2017. Production

and Characterization of an Acido-Thermophilic, Organis Solvent

Stable Cellulase from Bacillus Soonorensis HSC7 by Conversion of

Lignocellulosic Wastes. Journal of Genetic Engineering and

Biotechnology 15: 187-196

Balakumaran, M. D., Kalaichelvan, P. T. and Santhi, R. 2015. Explotion of

Agroindustrial Wastes as Substrates for Cellulase Production by

Bacillus licheniformis MTCC 429. Microbiology Journal. 5: 36-42

Berg, J.M., Tymoczko J., Stryer, L. 2002. Biochemistry 5th Edition. W.H

Freeman. New York

40

Bintang, M., 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta

Chen, H. 2014. Biotechnology of Lignocellulose: Theory and Prcatice.

Chemical Industri Press. Beijing

Dini, R. I., dan Ifah M. 2014. Produksi dan Karaterisasi Enzim Selulase

Ekstrak Kasar dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut.

Jurnal Teknologi dan Industri Pertanian Indonesia. 6(3): 69-75

Elias, I. and Jeans L. 2009. Fast Neighbor Joining. Theoretical Computer

Science. 410(21-23): 1993-2000

Gaur R. and Soni T. 2015. Isolation, Production, Purification, and

Characterization of an organic-Solvent-Thermostable Alkalophilic

Cellulase from Bacillus vallismortis RG-07. BMC Biotecnology. 15(19):

1-12

Gautam, R., and Jitender S. 2014. Optimatization, Purification of Cellulase

Produced from Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum Under Solid

State Fermentation and Its Potential Applications in Denim Industry.

International Journal of Science and Research. 3 (6): 1759-1763

Ghani, M., Asma A., Afsheen A., Rashida R. Z., Nadir N. S. and Shah A. U. Q.

2013. Isolation and Characterization of Different Strains of Bacillus

licheniformis for the Production of Commercially significant enzymes.

J. Pharm. Sci. 6(4): 691-697

Granstrom, M. 2009. Cellulose derivates: Synthesis, Properties and

Applications. Academic Disertation. University of Helsinki. Finland

Hartanti. 2010. Isolasi dan Seleksi Bakteri Sleulolitik Termofilik dari Kawah

Air Panas Gunung Pancar, Bogor. Skripsi. FMIPA. IPB. Bogor

Hasanah, N. dan Iwan S. 2015. Aktivitas Selulase Isolat Jamur dari Limbah

Media Tanam Jamur Merang. Prosiding Seminar Nasional Masyarakat

Biodiversitas Indonesia. 1(5):1110-1115

Ikram, U., Javed M. M., Khan T. S., and Shiddiq Z. 2005. Cotton Saccharifying

Activity of Cellulases Produced by Co-Culture of Aspergillus niger

and Trichoderma viride. Res. J. Agric. & Biol. Sci. 1(3): 241-245

Iqbal, H. M. N., Ishtiaq A., Muhammad A. Z., and M. Irfan. 2011. Purification

and Characterization of The Kinetic Parameters of Cellulase Produced

from Wheat Straw by Trichoderma viride Under SSF and Its Detergent

Compability. Advances in Blosclence and Biotechnology. 2: 149-156

41

Irawan B., Sutihat, Sumardi. 2008. Uji Aktivitas Selulase dan lupase pada

Mikrofungi selama Proses Dekomposisi Limbah Cair Kelapa Sawit

dengan Pengujian Kultur Murni. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan

Pengabdian Masyarakat Universitas Lampung: 284-291

Irawati, R. 2016. Karakterisasi pH, Suhu dan Konsentrasi Substrat pada

Ezzim Selulase Kasar yang Diproduksi oleh Bacillus circulans. Skripsi.

Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim. Malang

Irfan, M., Asma S., Quratulain S., and M. Nadeem. 2012. Isolation and

Screening of Cellulolytic Bacteria from Soil and Optimatization of

Cellulase Production and Activity. Turkish Journal of Bichemistry. 37(3):

287-293

Julia, B. M., Allasia M. B., Bassani G., and Farruggia B. 2016. Potential Use of

Soybean Hulls and Water Papaer as Support in SSF for Cellulase

Production by Aspergillus niger. Biocatalysis and Agricultural

Biotechnology

Khotimah, H., Siti Nur J., dan Rejeki S. F. 2017. Keragaman Secara Molekuler

Bakteri Asam Laktat pada Ileum dan Sekum Ayam Broiler yang Diberi

Perlakuan Pakan Hasil Fermentasi Chrysonilia crassa. Jurnal Biologi.

6(4): 29-40

Khotimah, Husnul, Siti Nur Jannah, Rejeki Siti Ferniah. 2017. Keragaman

Secara Molekuler Bakteri Asam Laktat pada Ileum dan Sekum Ayam

Broiler yang Diberi Perlakuan Pakan Hasil Fermentasi Chrysonilia

crassa. Jurnal Biologi. 6 (4): 29-40

Krisna, A. W., dan Lia O.N. 2012. Purifikasi dan Karaterisasi Protease dari

Bakteri Isolasi dari Whey Tahu. Jurnal Teknologi. 13(3): 149-156

Kuhad, R. C., Rishi G., and Ajay S. 2011. Microbial Cellulases and Their

Industrial Applications. Enzyme Reseacrh

Kumar, S. and Sudhindra R. G. 2000. Efficiency of The Neighbor-Joining

Method in Reconstructing Deep and Shallow Evolutionary

Relationships in Large Phylogenies. Journal of Molecular Evolution.

51:544-553

Kurniawan, R., Juhanda S., Aditia N., dan Irfan D. 2013. Isolasi Enzim Bromelin

dalam Bentuk Serbuk dari Buah Nanas. Prosiding Seminar Nasional

Teknik Kimia “ Kejuangan”. Yogyakarta

42

Lavanya, Devabaktuni, P. K. Kulkarani, Mudit D., Prudhvi K. R., and L. Naga V.

K. 2011. Source of Cellulose and Their Applications – A Review.

International Journal of Drug Formulation and Research. 2(6): 19-38

Lee YJ, Kim BK, Lee BH, Jo KI, Lee NK, Chung CH, Lee YC, Lee JW. 2008.

Purification and characterization of cellulase produced by Bacillus

amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. Bioresource Technology. 99

(1): 378-386

Listyaningrum, N. P., Aji S., and Agustin K. W. 2018. Characterizaton of

Thermostable Cellulase Produced by Bacillus strains Isolated from

Solid Waste of Carrageenan. International Conference on Green Agro-

industry and Biotechnology.

Madhusudhan, M. C., Raghavarao K. S. M. S. and Sanjay N. 2008. Integrated

Process for Extraction and Purification of Alcohol Dehydrogenase

from Baker’s Yeast Involving Precipitation and Aqueous Two Phase

Extraction. Biochemical Engineering Journal. 38: 414-420

Majid, F. C. N. 2009. Formulasi Pacth Mukoadhesif Propranololhidroklorida:

Pengaruh Perbandingan Konsentrasi Natrium Karboksilmetilselulosa

dan Polivinil Pirolidon Terhadap Sifat Fisik Patch dan Pelepasan Obat.

Skripsi. Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta

Mardiana, Rina. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase Kapang

Endofit Laut. Skripsi. Bogor. Institut Pertanian Bogor

Mayasari. 2016. Pemurnian Enzim Amilase dari Bakteri Amilolitik

Endogenous Bekatul secara Parsial Menggunakan Amonium Sulfat.

Skripsi. Universitas Maulana Malik Ibrahim. Malang

Meryandini, A., Wahyu W., Besty M., Titi C. S., Nisa R., dan H. S. 2009. Isolasi

Bakteri Selulolitik dan Karaterisasi Enzimnya. Makara Sains. 13 (1): 33-

38

Mitruka, B. M. 2017. Methods of Detection and Identification of Bacteria.

CRC Press. Florida

Mufarrikha, A., Anna R., dan Sasangka P. 2014. Optimasi Kondisi Produksi

Pektinase dari Aspergillus niger. Kimia Student Journal. 2(1): 393-399

Murray, R.G.E, Holt, John G., 2001. The History of Bergey’s Manual dalam

Sukartiningrum, 2012. Penentuan Pohon Filogenetik Bakteri Xilanolitik

Sistem Abdominal Rayap Tanah Berdasarkan 16S rRNA. Skripsi.

Universitas Airlangga. Surabaya

43

Narayan., A. V., Madhusudhan M.C. Raghavarao K. S. M. S. 2008. Extraction

and Purification of Ipomoea Peroxidase Employing Three-phase

Partitioning. Appl Biochem Biotechnol. 151: 263-272

Narita, V., Arif L. A., Siti I. M., Nuri Y. F. 2012. Analisis Bioiformatika Berbasis

Web untuk Eksplorasi Enzim Kitosanase Berdasarkan Kemiripan

Sekuens. Journal Al-Azhar Indonesia. 1(4): 197-203

Nenci. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Selulase dari Trichoderma viride

Strain T051 dengan Substrat Jerami. Skripsi. Universitas indonesia.

Depok

Noviyanti, T., Puji A., dan Winda R. 2012. Pengaruh Temperatur Terhadap

Aktivitas Enzim Protease dari Daun Sansakng (Pycnarrhena cauliflora

Diels). JKK. 1(1): 31-34

Ntushelo, K. 2013. Identifying Bacteria and Studiying Bacterial Diversity

Using The 16S Ribosomal RNA Gen-Based Sequensing Techniques: A

Review. Academic Journal. 7(49), pp: 5533-5540

Nuroniyah, T. dan Surya R. P. 2012. Identifikasi Spesies Isolat Bakteri S1

dengan Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA. Jurnal Teknik

Pomits. 1(1): 1-6

Nurwati, L., dan Refdinal N. 2015. Identifikasi Spesies Isolat Bakteri Galur D

dengan Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA. Jurnal Sains

dan Seni ITS. 4(2): 23370-3250

Nurwati, Laras, dan Refdinal Nawfa. 2015. Identifikasi Spesies Isolat Bakteri

Galur D dengan Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA.

Jurnal Sains dan Seni ITS. 4 (2): 23370-3250

Oyeleke, S. B., Oyewole O. A., Egwim E. C., Dauda B. E. N., and Ibeh E. N.

2012. Cellulase and Pectinase Production Potential of Aspergillus

niger Isolated From Corn Cob. Bayero Journal of Pure and Applied

Sciences. 5(1): 78-83

Pokhrel, B., Binod B., and Rubin T. M. 2014. Production, Purifictation and

Characterization of Cellulase from Bacillus subtilis Isolated from Soil.

Europian Journal of Biotechnology and Bioscience. 2(5): 31-37

Purkan, P. H. D., dan Sumarsih S. 2015. Produksi Enzim Selulase dari

Aspergillus niger Menggunakan Sekam Padi dan Ampas Tebu

Sebagai Induser. Jurnal Ilmu Dasar. 16(2): 95-102

44

Putri, S. 2016. Karakterisasi Enzim Selulase yang Dihasilkan Oleh

Lactobacillus plantarum pada Variasi Suhu, pH, dan Konsentrasi

Substrat. Skripsi. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

Malang

Rachmadini D. 2007. Mempelajari Pemurnian Enzim Kitosanase Termostabil

dari Isolat Bacillus licheniformis MB-2 asal Tompaso Manado Ulawesi

Utara. Skripsi. IPB. Bogor

Rachmania, R. A., Priyo W., Aniza M. W., dan Dini R. I. 2017. Profil Berat

Molekul Enzim Protease Buah Nanas (Ananas comosus L.Merr) dan

Pepaya (Carica papaya L.) Menggunakan Metode SDS-PAGE. Jurnal

Penelitian Kimia. 13(1): 52-65

Rahayu, F., Sudjindro, dan Untung S. B. 2010. Seleksi dan Pengujian Potensi

Bakteri Indigenous Air Rendaman Kenaf (Hibiscus cannabinus L.)

Sebagai Bakteri Selulolitik, Pektinolitik, dan Lignolitik. Buletin

Tanaman Tembakau, Serat dan Minyak Industri. 2(2): 81-87

Rahmadini, I. 2012. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri

yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut. Disertasi Doktor. Institut

Pertanian Bogor. Bogor

Rahman, M. A. A.l, Essam H. Abdel S., Mohamed N. E., Bahgat M. R., Emad E.

E., and Hassan M. A. A. 2015. A Novel Promising Thermotolerant

Cellulase-Producing Bacillus licheniformis 1-1v Strain Suitable for

Composting of Rice Straw. International Journal of Advanced Research.

3(12): 413-423

Rahmawati, N. 2018. Karaterisasi dan Pemurnian Parsial Ekstrak Kasar

Enzim Selulase dari Isolat Bakteri Selulolitik Asal Mata Air Gunung

Merapi. Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang

Roopa, R., M. Charulatha, and S. Meignalakshmi. 2017. Production of

Cellulase from Bacillus subtilis under Solid-State Fermentation Using

Fiber Wastes of Palmyra Palm. International Journal Current Microbiology

and Applied Sciences. 6(6):2225-2231

Sari, F. 2012. Purifikasi Parsial dan Karaterisasi Endoglukanase dari

Trichoderma viride T051 pada Fermentasi Menggunakan Substrat

Dedak Padi. Skripsi. UI. Depok

Seo, J. K., T. S. Park, I. H. Kwon, M. Y. Piao, C. H. Lee, and Jong K. Ha. 2013.

Characterization of Cellulolytic and Xylanolytic Enzymes of Bacillus

45

licheniformis JK7 Isolated from the Rumen of a Native Korean Goat.

Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 26(1): 50-58

Seo, J. K., T. S. Park, I. H. Kwon, M. Y. Piao, C. H. Lee, and Jong K. Ha. 2013.

Characterization of Cellulolytic and Xylanolytic Enzymes of Bacillus

licheniformis JK7 Isolated from the Rumen of a Native Korean Goat.

Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 26 (1):50-58

Sinaga, R. E. 2016. Pemanfaatan Substrat Limbah Pertanian Menggunakan

Enzim Selulase. STEVIA. 6(2):102-110

Sivakumar, N., Amira A. Z., Saif A.l B., Abdulkhadir E., and Elsadig A. E. 2016.

Isolation and Characterization of Cellulolytic Bacillus lichenifromis

from compost. African Journal of Biotechnology. Vol. 15(43): 2434-2446

Sonia N.M. dan Kusnadi J. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Parsial Enzim

selulase dari isolat bakteri selulolitik OS-16 asal Padang Pasir

Tengger-Bromo. Jurnal Pangan dan Agroindustri. 3: 11-19

Sudjadi, Z. I., Sismindari dan Putu R. S. R. 2004. Pengaruh pH, Suhu dan

Penyimpanan pada Stabilitas Protein MJ-30 dari Daun Mirabilis jalapa

L. Majalah Farmasi Indonesia. 15(1): 1-6

Sumarlin, O. L., Dikdik M., Suryatna, dan Yoga A. 2013. Identifikasi Potensi

Enzim Lipase dan Selulase pada Sampah Kulit Buah Hasil Fermentasi.

Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia (JIPI). 18 (3): 159-166

Supriyanto, A., Anita N. H., dan Ni’matuzahroh. 2015. Studi Viabilitas dan Pola

Pertumbuhan Bacillus megaterium Pada Konsentrasi Molase dan

Waktu Inkubasi yang Berbeda. Jurnal Ilmiah Biologi. Vol. 3 (1): 12-20

Susanti R. dan Fidia F. 2017. Teknologi Enzim. CV ANDI OFFSET. Yogyakarta.

Sutrisno, A. 2017. Teknologi Enzim. UB Press. Malang

Syamsul, M., Arifin Z., dan Sri S. 2008. Keragaman Genetik Ayam Lombok

Berdasarkan Sekuen D-LOOP DNA Mitokondria. JITV. 13(4): 308-314

Tan, W. C., Umah R. K., Chia W. P., Yee S. T., Jegadeesh R., Azliza M. A. and

Vikineswary S. 2015. Gaboderma neo-japonicum Imazeki Revisited:

Domestication Study and Antioxidant Properties of Its Basidiocarps

and Mycelia. Scientific Report

Tariq, Rida, Immad Ansari, Faizan Qadir, Asia Ahmed, Maria Shariq, Urooj

Zafar, Aqeel Ahmad, Shakeel Ahmed Khan, and Muhammad Sohail. 2018.

Optimization of Endoglucanase Production from Thermophilic Strain

of Bacillus Licheniformis RT-17 and Its Application for

46

Saccharification of Sugarcane Bagasse. Pakistan Journal of Botany. 50

(2): 807-816

Triana, R. 2013. Pemurnian dan karakterisasi Enzim Glukosa Oksidase dari

Isolat Lokal Aspergillus niger (IPBCC.08.610). Skripsi. Institut Pertanian

Bogor. Bogor

Uci, M. S., Anthoni A., Nurmiati. 2012. Penapisan dan Karakterisasi Bakteri

Selulolitik Termofilik dan Analisis Aktivitas Selulolitiknya. Jurnal

Biologi Universitas Andalas. 1(2): 166-171

Winarto, S. 2009. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Isolat

Bakteri Sumber Air Panas Songgoriti, Batu, Jawa Timur. Skripsi.

Universitas Brawijaya. Malang

Xia, M. L., Lan W., Zhi-xia Y., and Hong-zhang C. 2015. A Novel Digital Color

Analysis Method for Rapid Glucose Detection. Analysis Method. 7 (16):

6654-6663

Yin L., Lin H., Xiao Z. 2010.Purification and Characterization of Cellulase

from Bacillus subtilis YJ1. J Marine Sci Technol Vol.18 : 466-471

Yuda, R. A. A. 2013. Isolasi Bakteri Selulolitik Termofilik dari Sumber Air

Panas Gunung Merapi dan Karakterisasi Crude Enzim Selulase.

Skripsi. UNAIR. Surabaya

Zawiyah. 2017. Optimasi Konsentrasi Sumber Karbon pada Produksi Enzim

Selulase dari Bakteri Indigen Larva Leucinodes orbonalis Guenee.

Skripsi. UIN Sunan Kalijaga. Yogyakarta

Zhang, X. Z., and Yi H. P. Z. 2013. Cellulases: Characteristics, Sources,

Production, adn Applications. Bioprocessing Technologies in

Biorefinery for Sustainable Production of Fuels, Chemicals, and

Polymers. John Wiley & Sons, Inc.

Zhou, C., Huan L., Feiyan Y., Haonan C., Haikun W., Fufeng L., Yu L., Huitu Z.,

Fuping L. 2019. Development and Application of a CRISPR/Cas9

System for Bacillus licheniformis genomu editing. International Journal

of Biological Macromolecules. 122: 329-337

identifikasi bakteri dan karakterisasi enzim …

Documents