Identifikasi fenotipik dan genotipik Bakteri Asam Laktat asal fermentasi spontan Pisang var. Agung Semeru (Musa paradisiaca formatypica)

Identifikasi fenotipik dan genotipik Bakteri Asam Laktat asal fermentasi spontan Pisang var. Agung Semeru (Musa paradisiaca formatypica)

Abstrak : Bakteri asam laktat dapat ditemukan pada produk makanan seperti susu dan produk daging, serealia, singkong, buah-buahan atau sayuran produk. tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi fenotipik dan genotipik bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi pf spontan mentah var agung semeru pisang (musa paradisiaca formatypica). Identifikasi fenotipik didasarkan pada morfologi umum, tes fisiologis, API dan sistem Biolog. Identifikasi genotipe yang digunakan reaksi berantai polimerase metode (PCR) dan analisis 16 S rRNA urutan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua kelompok LAB (FS nh 1 dan FSnh A mengisolasi) dapat menggunakan gliserol, D-ribosa, D-xylose, D-glukosa, D-fruktosa, D-manose, metil alfa D-gluco pyranoside, N- asetil glukosamin, esculin besi, sitrat, salisin, D-selobiosa, D-sakarosa, gentibiose dan kalium glukonat sebagai sumber karbon. Selain itu FSnh 1 isolat yang digunakan D-galaktosa, L-sorbose, L-rhamnose, dan amygdalin, sementara FSnh A mengisolasi digunakan metil alfa D-glukopiranosa, arbutin, D-maltosa, D-laktosa, D-trehalosa, D-turanose, dan kalium 5-ketogluconate sebagai sumber karbon. Identifikasi genotipe menunjukkan bahwa lactobacillus sp terkait dengan fermentasi spontan var agung semeru pisang diidentifikasi sebagai lactobacillus salivarus dan lactobacullis fructivorans.BAB IPendahuluan 1.1 Latar BelakangBakteri Asam Laktat merupakan bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi asam laktat. Efek bakterisidal dari asam laktat berkaitan dengan penurunan pH lingkungan menjadi 3-4,5 sehingga pertumbuhan bekteri lain termasuk bakteri pembusuk akan terhambat (Amin dan Leksono, 2001). Pada umunnya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 6-8 (Amano, 1962). Berdasarkan taksonomi, terdapat sekitar 20 genus bakteri yang termasuk dalam BAL (Aerococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococccus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vegococcus, dan Weissella).Bakteri asam laktat digunakan dalam bidang fermentasi, misalnya dalam pembuatan yoghurt, keju, mentega, susu asam dll. Bakteri asam laktat dalam fermentasi berguna untutk melindungi produk dari pencemaran bakteri patogen, meningkatkan nutrisi , serta berpotensi memberikan dampak yang positif bagi kesehatan manusia (Wikipedia, 2011). Bukti bahwa mikroorganisme sangat bermanfaat dituliskan dalam Al-Quran surah Al-Baqaroh ayat 164 :

Sesungguhnya pada kejadian semua langit dan bumi dan perubahan malam dan siang dan kapal yang berlayar di lautan membawa barang yang bermanfaat bagi manusia, dan apa yang diturunkan Allah dari langit dari ada air, maka dihidupkanNya dengan (air) itu bumi, sesudah matinya , seraya disebarkanNya padanya dari tiap-tiap jenis binatang, dan peredaran angin, dan awan yang diperintah di antara langit dan bumi; adalah semuanya itu tanda-tanda bagi kaum yang berakal.

Sifat dari bakteri asam laktat ini adalah amilolitik, dimana BAL dapat mendegredasi pati. Sifat-sifat fisik dari BAL ini dapat diketahui dengan pengamatan morfologi koloni, pengamatan mikroskopis (pewarnaan gram), uji fisiologis, metabolik (biokimia) atau dengan kemotaksonomi. Sedangkan untuk identifikasi dari genotipik nya dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler yaitu dengan sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengan metode polymerase chain reaction(PCR)-sekuensing, fungsinya untuk mengetahui jenis gen nya dengan mencocokan gen dari ke 20 genus pada bakteri asam laktat. Digunakan metode PCR karena enzim polimerase itu sendiri dapat memecah ikatan antar basa nitrogen. Pisang merupakan buah yang memiliki kandugan karbohidrat yang cukup tinggi fungsi dari karbohidrat itu sendiri untuk menghasilkan energi dalam tubuh. Karena dalam pisang tersebut memiliki karbohidrat cukup tinggi maka dapat menghasilkan bakteri asam laktat yang bermanfaat bagi kesehatan manusia dan dapat melindungi bahan-bahan fermentasi dari bakteri patogen yang berbahaya bagi kesehatan. Pisang yang digunakan merupakan pisang yang berasal dari daerah lumajang, selain dapat meningkatkan manfaat pisang sebagai distributor bakteri asam laktat juga dapat meningkatkan hasil ekonomi warga lumajang. 1.2 Rumusan MasalahBagaimana cara identifikasi fenotipik Bakteri Asam Laktat?Termasuk dalam genus apakah Bakteri Asam Laktat tersebut?

1.3 Tujuan Untuk mengetahui fenotipik dari Bakteri Asam LaktatUntuk mengetahui genus dari Bakteri Asam Laktat1.4 Batasan MasalahPisang yang digunakan merupakan produk asli indonesia dengan jenis Pisang var. Agung Semeru (Musa paradisiaca formatypica)Identifikasi bakteri asam laktat berupa fenotipik dan genotipik

1.5 Manfaat PenelitianMemberikan informasi mengenai fenotipik serta genotipik dari Bakteri Asam LaktatMemberikan ilmu baru dalam bidang kimia tentang genetika dengan menggunakan komputasi

BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.2 Dasar Teori2.2.1 Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi asam laktat. Efek bakterisidal dari asam laktat berkaitan dengan penurunan pH lingkungan menjadi 3 sampai 4,5 sehingga pertumbuhan bakteri lain termasuk bakteri pembusuk akan terhambat (Amin dan Leksono, 2001). Pada umunya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 6-8 (Buckle et al., 1987). Bakteri Asam Laktat merupakan kelompok besar bakteri menguntungkan yang memiliki sifat relatif sama. Saat ini Bakteri Asam Laktat digunakan untuk pengawetan dan memperbaiki tekstur dan cita rasa bahan pangan (Chabela, dkk., 2001). Bakteri Asam Laktat mampu memproduksi asam laktat sebagai produik akhir perombakan karbohidrat, hidrogen peroksida, dan bakteriosin (Afrianto, dkk., 2006). Dengan terbentuknya zat antibakteri dan asam maka pertumbuhan bakteri pathogen seperti Salmonella dan E. coli akan dihambat (Silalahi, 2000). Efektivitas Bakteri Asam Laktat dalam menghambat bakteri pembusuk dipengaruhi oleh kepadatan Bakteri Asam Laktat, strain bakteri asam laktat, dan komposisi media (Jeppensen dan Huss, 1993). Selain itu, produki substansi penghambat dari bakteri asam laktat dipengaruhi oleh media pertumbuhan, pH, dan temperature lingkungan (Ahn dan Stiles, 1990). Sebagian besar BAL dapat tumbuh sama baiknya di lingkungan yang memiliki dan tidak memiliki O2(tidak sensitif terhadap O2), sehingga termasuk anaerob aerotoleran.Bakteri yang tergolong dalam BAL memiliki beberapa karakteristik tertentu yang meliputi: tidak memiliki porfirin dansitokrom, katalase negatif, tidak melakukanfosforilasitranspor elektron, dan hanya mendapatkan energi dari fosforilasi substrat. Hampir semua BAL hanya memperoleh energi dari metabolisme gula sehingga habitat pertumbuhannya hanya terbatas pada lingkungan yang menyediakan cukupgulaatau bisa disebut dengan lingkungan yang kayanutrisi.Kemampuan mereka untuk mengasilkan senyawa (biosintesis) juga terbatas dan kebutuhan nutrisi kompleks BAL meliputiasam amino,vitamin,purin, danpirimidin.Berdasarkan studi genetika, beberapa sifat BAL yang berhubungan dengan fermentasi cenderung disandikan oleh gen-gen di [plasmid] (DNA ekstrakromosomal).Sifat-sifat yang dimaksud meliputi produksiproteinase, metabolisme karbohidrat, transporsitrat, produksi eksopolisakarida, produksi bakteriosin, dan resistensi terhadapbakteriofag.DNA plasmid dapat ditransfer antarbakteri dengan beberapa mekanisme, sepertikonjugasiyang umum terjadi padaLactococcussehingga sifat-sifat tersebut dapat menyebar.

2.2.2 Fenotipik dan Genotipik Bakteri Asam LaktatIdentifikasi fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti bentuk sel dan pewarnaan Gram, uji fisiologis, metabolik (biokimia) atau kemotaksonomi. Identifikasi genotip dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler yaitu sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengaan metode Polymerase Chain Reaction (PCR)-sekuensing(Ammmor et al.2005).2.2.3 PCR (polymerase chain reaction) metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secarain vitropada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secarain vivoyang bersifat semi konservatif.

BAB III Metodologi 3.1 Metode

Bakteri asam laktat Isolasi bakteri asam laktatIdentifikasi fenotipik dengan menggunakan API 50CHIdentifikasi genotipik menggunakan PCR dan analisis urutan DNA pengkode 16S rRNAAmplifikasi DNA pengkode 16S rRNA dengan PCRAnalisis urutan DNA pengkode 16S rRNAHasil dan pembahasan Karakterisasi fenotipik dari BAL sebanyak 12 isolat, Beberapa isolat memiliki kesamaan morfologi sehingga dikelompokkan menjadi dua kelompok yang selanjutnya akan diidentifikasi dengan menggunakan kit API 50CHL untuk mengetahui pola fermentasinya. Kelompok I terdiri atas 10 isolat (FSnh 1 10) yang diwakili oleh isolat FSnh 1 dengan karakteristik sel bentuk batang pendek, koloni bulat sedang, berwarna putih susu dengan elevasi cembung, tidak membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 15oC dan 45oC serta tumbuh optimal pada suhu 35oC. Kelompok II terdiri atas 2 isolat (FSnh A dan B) yang diwakili oleh isolat FSnh A dengan karakteristik sel bentuk batang pendek, koloni bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan, membentuk gas dan tumbuh optimal pada suhu 35oC dan 45oC tetapi tidak tumbuh optimal pada suhu 15oC. Kedua isolat BAL tersebut mampu memfermentasi gula tertentu sebagai sumber karbon. Karakterisasi genotipik isolat bakteri asam laktat dilakukan berdasarkan DNA pengkode gen 16S rRNA untuk menentukan genus dan strainya. DNA pengkode ini dapat dijadikan penanda molekuler untuk definisi spesies karena molekul ini ada pada setiap organisme dengan fungsi yang identik pada seuruh organisme. Oleh karea itu dapat dirancang suatu primer universal untuk seluruh kelompok. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA memungkinkan digunkan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat enunjukan hubungan kekerabatan serta asal mula (nenek moyang) suatu organisme.

isolat dari BAL FSnh 1 dan FSnh A diamplifikasi dengan menggunakan primer 63F dan 1378R. Berdasarkan marker pita DNA yang digunakan mendekati 1500 pasang basa. Hasil tersebut relevan dengan produk PCR yang dihasilkan sekitar 1400 pasang basa.Analisis hasil sekuensing diawali dengan melakukan :Melakukan pensejajaran urutan basa DNA pengkode 16S rRNA pada kesua isolat BAL dari sekuen forward (F) dan sekuen Reverse (R) dengan menggunakan proram bioedit CAP contig assembly program. Sekuen parsial DNA pengkode 16S rRNA disejajarkan dengan sekuen lengkap Genbank DNA pengkode 16S rRNA dari beberapa genus bakteri asam laktat dengan menggunakan program perangkat lunakDNA pengkode menunjukan bahwa isolat FSnh 1 dan FSnh A merupakan family dari Latobacillaceae. Genus lactobacillus memeliki skor 75 sedangkan untuk genus Weissella yang paling rendah yaitu sebesar 41 untuk isolat FSnh 1 dan 39 untuk isolat FSnh A.

Berikut ini adalah hasil elektroforesis dengan gel agarosa

Komposisi nukleotida penyusun DNA pengkode 16S rRNA setiap isolat itu berbeda-beda sehingga dilakukan analisis kekerabatan menggunakan program BLAST-N. FSnh 1 memiliki kemiripan dengan Lactobacillus delbruekci subsp bulgaricus NDO2 (81%), L. Amylovorous GRL 1112 (80%), dan L. Iners (80%) yang masing-masing memiliki nilai diatas 80%. Sedangkan untuk BAL FSnh A memiliki kemiripan 81% dengan Lactobacillus iners dan L. Delbruekci subsp bulgaricus, serta 80% dengan Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254. Setelah didapat hasil kekeranatan tersebut, kemudian dilanjutkan dengan analisis pohon filogenetik secara dua tahap. Tahap pertama fungsinya untuk mensejajarkan sekuen kedua BAL denganisolat internasional dari genus yang berbeda dalam satu family yaitu lactobacillaceae. Tahap pertama menunjukan bahwa skor untuk kesejajaran tinggi adalah 75 (Lactobacillus) dan 39 (Weisella). Kesejajaran antara BAL FSnh 1 dan FSnh A sebesar 92 yang menunjukan bahwa kedua isolat tersebut berada dalam satu genus. Tahap kedua, mensejajarkan kedua isolat BAL dengan isolat inernasional dari spesies yang berbeda dalam satu genus Lactobacillus dari hasil tahap pertama, didapatkan hasil skor tertinggi untuk FSnh 1 adalah 75 dengan Lactobacillius salivarus dan untuk FSnh A 76 dengan Lactobacillus fructivorans. Hal ini menunjukkan keduanya memiliki edekatan genus yaitu Lactobacillus.