identifikasi gen cyp2a6 alel *9 pada perokok suku … · gen cyp2a6 memiliki peran dalam...

IDENTIFIKASI GEN CYP2A6 ALEL *9 PADA PEROKOK SUKU

TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN

REACTION

(PCR)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Evan Julian Candaya

NIM : 148114121

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i



REACTION

(PCR)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Evan Julian Candaya

NIM : 148114121

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii

Persetujuan Pembimbing



REACTION

(PCR)

Skripsi yang diajukan oleh:

Evan Julian Candaya

NIM : 148114121

Pembimbing utama

PEMBIMBING


iii

PengesahanSkripsiBerjudulIDENTIFIKASI GEN CYP2A6 ALEL *9 PADA PEROKOK SUKU

TIONGHOA DI INDONESIA DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN

REACTION

(PCR)

Oleh :

Evan Julian Candaya

NIM : 148114121

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal:………………………..

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D.

Panitia Penguji: Tanda

tangan

1. Dr. Christine Partramurti, M.si., Apt. ………….....…

2. Maywan Hariono Ph.D., Apt. …….................

3. Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc. ………………


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan karya sederhana ini untuk :

TUHAN YESUS

Keluarga tercinta, papa, mama, koko dan adik yang selalu memberikan

dukungan.

Almamaterku, sahabat tercinta, dan semua orang yang mendapatkan manfaat dari

karya sederhana ini.


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah.

Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarism dalam naskah ini,

maka saya bersedia menanggung segala sanki sesuai perundang-undangan yang

berlaku.

Yogyakarta, 27 Februari 2018

Penulis

Evan Julian Candaya


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma

Nama : Evan Julian Candaya

Nomor Mahasiswa : 148114121

Dengan pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:



REACTION

(PCR)

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Demikian saya memberikan kepada

Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan

dalam bentuk media lain, mengolahnya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikannya secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalty kepada saya selama tetap mencamtumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta.

Pada tanggal 27 Februari 2018

Yang menyatakan,

(Evan Julian Candaya)


vii

PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala

rahmat dan tuntunannya selama penulis membuat karya tulis ini, sehingga penulis

dapat menyelesaikan naskah skripsi yang berjudul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel

*9 pada Perokok Suku Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR)” sebagai salah satu persyaratan memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Berkat dorongan, motivasi

dan doa dari berbagai pihak, akhirnya karya tulis ini dapat selesai dengan baik. Oleh

karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin dan arahan kepada

peneliti.

2. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk penggunaan segala

fasilitas laboratorium selama penelitian

3. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang

telah membimbing dan memberi masukan, serta bersedia meluangkan waktu,

tenaga, dan pikiran untuk berdiskusi dan mengarahkan penulis dalam penyusunan

skripsi

4. Ibu Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc selaku dosen penguji atas saran dan

dukungan yang membangun dalam penelitian ini

5. Bapak Maywan Haryono, Ph.D., Apt selaku dosen penguji atas saran dan

dukungan yang membangun dalam penelitian ini

6. Ibu Pebhe Hendra, Ph.D., Apt selaku Dosen Pembimbing Akademik atas

bimbingannya selama ini.

7. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses

perkuliahan


viii

8. kepada peneliti untuk melakukan penelitian

9. Papa, Mama, Koko, Adik dan seluruh keluarga tercinta yang telah memberikan

semangat, dorongan, doa, dan kasih sayang kepada penulis hingga terselesainya

naskah ini

10. Rekan seperjuangan penelitian ini yakni Rabulas Tri Nugroho, Dismas Adi,

Jasvidianto Chriza. Terima kasih atas semangat dan kerjasamanya selama ini

11. Rekan satu bimbingan yakni Maria Clara, Yulius Denis, Maria Redita, Chintya

Halim, Petrus Febrian Widiantoro, dan Yohana Alpionita. Terima kasih atas

bantuan dan kerjasamanya selama ini

12. Pak Kayat, pak Heru, pak Bima, pak Bimo, pak Parlan selaku laboran

laboratorium biokimia

13. Teman-teman FSM C 2014 dan Keluarga Besar farmasi 2014, terima kasih

atas kebahagiaan dan kebersamaan selama ini

14. Komisi Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran

Universitas Kristen Duta Wacana, yang telah memberikan ijin untuk melakukan

penelitian

15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah

mendukung dalam penyusunan naskah ini

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan

serta masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan

kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata penulis berharap

semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu

farmasi.

Yogyakarta, 27 Februari 2018

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...................................................... ii

HALAMAN PENGESEHAN SKRIPSI.................................................................iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................. v

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ............................................................. vii

PRAKATA.............................................................................................................vii

DAFTAR ISI...........................................................................................................ix

DAFTAR TABEL .................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN..........................................................................................xii

ABSTRAK ......................................................................................................... xiiiii

ABSTRACT............................................................................................................xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ........................................................................................ 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 6

KESIMPULAN ...................................................................................................... 11

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 12

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 26


x

DAFTAR TABEL Tabel I. Karakteristik Subjek Penelitian Suku Tionghoa ....................................7

Tabel II. Frekuensi Alel CYP2A6.......................................................................11


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Elektroforegram hasil isolat DNA.....................................................8

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida

CYP2A6*9........................................................................................9

Gambar 3. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai

isolat DNA......................................................................................10


xii

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Ethical Clearance............................................................................... 15

Lampiran 2. Hasil Kuisioner................................................................................... 16

Lampiran 3. Informed Consent................................................................................ 18

Lampiran 4. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis............................. 19

Lampiran 5. Usage Information of Go Taq Green Master Mix.............................. 20

Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers................................... 21

Lampiran 7. Product Datasheet of primer forward and reverse CYP2A6*9......... 21

Lampiran 8. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Menggunakan Elektroforesis... 22

Lampiran 9. Hasil PCR........................................................................................... 23

Lampiran 10. Usage Information of FavorPrepTM.................................................. 24

Lampiran 11. Karakteristik subyek uji ................................................................... 25


xiii

ABSTRAK

Gen CYP2A6 memiliki peran dalam metabolisme nikotin di dalam darah yang diketahui memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi. Gen CYP2A6 terdapat 2 jenis alel yaitu alel aktif dan alel tidak aktif. CYP2A6 *9 merupakan alel CYP2A6 yang mengalami mutasi titik pada TATA box (T-48G) pada ujung '5 sehingga menyebabkan penurunan aktivitas. Adanya polimorfisme pada CYP2A6 dapat dideteksi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).

Pada penelitian ini digunakan Primer forward 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', primer reverse 5'- GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3' dan Promega Go Taq Green Master Mix. Kondisi PCR yang digunakan: initial denaturation pada suhu 94ºC selama 3 menit, denaturation pada suhu 94ºC selama 30 detik, annealing pada suhu 60ºC selama 30 detik, extension pada suhu 70ºC selama 25 detik dan dilakukan sebanyak 30 siklus kemudian diakhiri dengan final extension pada suhu 72ºC selama 5 menit.

Hasil penelitian menunjukkan adanya alel CYP2A6*9 pada perokok pria suku Tionghoa Indonesia sehingga dapat dikatakan bahwa jumlah batang rokok yang dikonsumsi perokok pria suku Tionghoa Indonesia dipengaruhi oleh alel CYP2A6*9.

Kata kunci: CYP2A6*9, Polimorfisme, PCR


xiv

ABSTRACT

CYP2A6 gene has a role in the metabolism of nicotine in blood that is known to have high levels of polymorphism. The CYP2A6 gene has 2 types of alleles, an active and an inactive allele. CYP2A6 * 9 is a CYP2A6 allele that has a point of mutation in the TATA box (T-48G) at the end of '5 causing a decrease in activity. The presence of polymorphisms in CYP2A6 can be detected using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. Primary forward, reverse primers and reagents used in this study were 5'-GAT TCC CCC CTG CTA C-3 ', 5'- GGC TGG GGT TG TTG CCT TTA-3', and Promega Go Taq Green Master Mix, respectively PCR was conditioned as followed: initial denaturatuin at 94ºC for 3 minutes, denaturation at 94ºC for 30 seconds, annealing at 60ºC for 30 seconds, extension at 70ºC for 25 seconds, followed by 30 cycles, and then final extension at 72ºC for 5 minutes. The results showed that there is CYP2A6*9 allele in Indonesian Tionghoa male smoker. In conclusion, there is influence of CYP2A6*9 existence toward the number of cigarette being consumed by Indonesian Tionghoa male smokers

Keywords: CYP2A6*9, Polymorphism, PCR


1

PENDAHULUAN Merokok merupakan suatu penyebab kematian dengan frekuensi yang

tinggi di dunia terutama di Indonesia. Perilaku merokok sangat berkembang pada

masyarakat Indonesia yang dapat dilihat dari semua kalangan. Jumlah perokok di

dunia mencapai 2,8 miliar orang, dimana setiap tahun ada 5 juta orang yang

meninggal akibat penyakit yang disebabkan oleh rokok (WHO, 2015). Menurut

Peto et al (2014), secara global 50% remaja pria dan 10% remaja perempuan

merupakan perokok aktif, tingginya perokok aktif tersebut menyebabkan kematian

sebesar 5 juta orang pada tahun 2010 dan pada tahun berikutnya akan diperkirakan

mengalami peningkatan sebanyak 10 juta orang. Perilaku merokok pada usia 15

tahun ke atas di Indonesia cenderung mengalami peningkatan dari 34,2% pada

tahun 2007 menjadi 36,3% pada tahun 2013 dengan prevalensi laki-laki sebesar

64,9% dan perempuan sebesar 2,1% (Riskesdas, 2013). Perilaku merokok ini dapat

dipicu beberapa faktor yaitu kebiasaan merokok pada orangtua, mempunyai teman

yang merokok, serta adanya faktor sosial ekonomi yang mendukung seseorang

untuk merokok (Rodriguez et al, 2011).

Peristiwa di atas merupakan fakta bahwa terdapat hubungan yang erat antara

perilaku merokok dengan faktor ketergantungan. Faktor ketergantungan yang

dimaksud merupakan faktor ketergantungan genetik perokok terhadap nikotin yang

memiliki kontribusi sebesar 50-70% (Boardman, 2006; Minematsu, 2006; Tyndale

and Sellers, 2002). Di antara banyak gen yang diduga berperan dalam

ketergantungan genetik perokok terhadap nikotin terdapat gen CYP2A6, yaitu gen

yang memiliki peran untuk mengkode enzim sitokrom P450 (Oscarson, 2011).

Enzim ini memiliki tanggung jawab dalam metabolisme nikotin menjadi Nicotine-

Δ1’(5’)-iminium ion dan selanjutnya diubah menjadi 3-hidroksikotinin sebagai

metabolit tidak aktif di dalam darah, sehingga dapat menghilangkan atau

menurunkan efek nikotin (Gullstén 2000; Rao et al., 2000; Hukkanen et al., 2005;

Davies dan Soundy, 2009). Gen CYP2A6 memiliki 2 alel yang berperan dalam

metabolisme nikotin yaitu alel aktif dan tidak aktif. Bentuk aktif dari gen CYP2A6

yaitu alel CYP2A6 *1 (wild type), sedangkan bentuk tidak aktifnya antara lain yaitu

alel CYP2A6*4, CYP2A6*7 dan CYP2A6 *9.


2

Perbedaan metabolisme nikotin disebabkan oleh gen CYP2A6, dapat

menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim sitokrom P450

(Raunio dan Rahnasto-Rilla, 2012). Peristiwa ini dapat dikatakan sebagai kejadian

polimorfisme pada gen CYP2A6 dengan tingkat polimorfisme yang tinggi

(Maggert, 2012). Polimorfisme memiliki dampak pada ketergantungan fisik

terhadap rokok untuk mempertahankan kadar nikotin dalam darah. Alel CYP2A6

*9 merupakan bentuk terjadinya polimorfisme akibat adanya mutasi pada TATA box

(O`Loughin J., 2004), sehingga dapat menurunkan atau menghilangkan

metabolisme nikotin dalam darah (Yoshida et al., 2002; hukkanen et al., 2005).

Bentuk polimorfisme gen CYP2A6 banyak ditemukan pada populasi di Asia

dengan frekuensi CYP2A6*4 (11-20%), CYP2A6*7 (4-7%), CYP2A6*9 (20%)

(Kwon et al., 2001; Nakajima et al., 2006; Oscarson et al., 1999; Rao et al., 2000).

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis

untuk amplifikasi DNA secara in vitro. Terdapat beberapa tahapan penting dalam

proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat

yaitu denaturasi, annealing dan pemanjangan untai DNA. Metode ini dilakukan

untuk mengidentifikasi alel secara spesifik yaitu dengan menggunakan primer dan

enzim yang sama (Yusof, 2009). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi

alel CYP2A6 *9 pada suku Tionghoa di Indonesia.

METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Pada

penelitian ini dilakukan penggambaran hasil polimorfisme gen CYP2A6 pada satu

populasi.

Alat Penelitian

Thermal cycler Perkin Elmer 2400, satu set elektroforesis horizontal (Sigma

Aldrich), UV Transilluminator (fisher scientific), mikro sentrifuge (fisher

scientific), timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 g (Metler Toledo),

dispossable gloves, receivertubes 1,5 mL, blue tip, yellow tip, white tip, hot plate

(thermo scientific), spuit injeksi 3 mL (Terumo), vacutainer K2 yang mengandung

EDTA 5,4 mg, PCR® Tubes (Axygen), kamera DSLR.


3

Bahan Penelitian

Primer forward: (5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer

reverse: (5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’), sampel darah perokok pria

suku Tionghoa indonesia, promega Go Taq Green Master Mix (taq DNA

polymerase, dNTPs, MgCl2 dan buffer), kit DNA isolasi (FavorPrep Genomic

DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)), 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH

8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), gel agarosa (Vivantis), Gel red (Nucleic Acid Gel

Stain (Biotium)), 100 bp DNA Ladder (vivantis), DNA loading dye (vivantis),

etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua bidestilata steril (Ikapharmindo).

Penentuan Subyek Uji pada Suku Tionghoa

Perokok berjenis kelamin laki-laki sebanyak 30 orang keturunan Tionghoa

asli minimal sampai third degree relativies ( kakek dan nenek orang Tionghoa asli),

berumur 20 hingga 40 tahun, telah merokok selama 5-10 tahun dan mengkonsumsi

minimal 5 batang rokok sehari baik rokok putih dan rokok kretek. Subyek uji tidak

sedang mengonsumsi obat rutin atau sedang menjalani pengobatan untuk berhenti

merokok dalam sebulan terakhir. Subyek uji tidak boleh menderita penyakit yang

mengharuskan beristirahat total selama ≥ 10 hari dalam sebulan terakhir, seperti

heart diseases, renal failure, pulmonary diseases. Subyek uji tidak boleh menderita

penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati, dan hematoma. Pemilihan subyek uji

dilakukan melalui wawancara dan mengisi kusioner sesuai dengan kriteria pada

penelitian ini serta menandatangani informed consent. Penelitian ini telah

memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Kristen

Duta Wacana.

Pengambilan sampel darah pada subyek uji

Pengambilan sampel darah dilakukan oleh perawat profesional, sampel

darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam vaccumtainer

K2 yang berisi EDTA. Darah segar yang diperoleh disimpan pada suhu ± 4°C,

sebelum dianalisis. Darah ini kemudian digunakan untuk identifikasi alel

CYP2A6*9.


4

Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit DNA isolasi

(FavorPrep™). Jumlah sampel yang digunakan sebanyak 30 sampel darah.

Disiapkan 300 µL sampel darah pada tabung mikrosentrifuge 1,5 ml, ditambahkan

900 µL RBC lisis buffer kemudian dihomogenkan dengan cara digojok dan

diinkubasi selama 10 menit. Supernatan dihilangkan, ditambahkan 100 µL buffer

yang sama. Pada langkah berikutnya ditambahkan 200 µL FABG buffer, divorteks

agar homogen, setelah itu diinkubasi pada suhu ruangan dan dibolak-balik setiap 3

menit. Elution buffer dipanaskan dengan waterbath pada suhu 70ºC. Langkah

berikutnya ditambahkan etanol 96% sebanyak 200 µL ke dalam tube dan divorteks

selama 10 detik. Kolom FABG yang telah dipasangkan dengan 2 ml collection tube

dan sampel dipindahkan ke dalam kolom FABG tersebut, disentrifuge selama 5

menit pada kecepatan maksimal (14.000 rpm atau 10,000 x g) dan kolom FABG

dipindahkan ke collection tube yang baru. Langkah berikutnya Kolom FABG dicuci

dengan 400 µL W1 buffer dan disentrifuge dengan kecepatan maksimal, dibuang

cairan yang turun pada collection tube. Kolom FABG dipindahkan pada 2 ml

collection tube, Kolom FABG dicuci dengan 600 µL wash buffer yang sudah

ditambahkan etanol. Sentrifuge selama 30 detik pada kecepatan maksimal dan

buang cairan pada collection tube. Kolom FABG diletakkan kembali pada 2 ml

collection tube dan sentrifuge dengan kecepatan maksimal untuk mengeringkan

column. Kolom FABG yang telah kering diletakkan pada 1,5 ml mikrosentrifuge

tube dan ditambahkan 100 µL elution buffer yang telah dipanaskan ke tengah

membran Kolom FABG. Kolom FABG didiamkan selama 3-5 menit pada posisi

tegak agar elution buffer dapat terserap membran Kolom FABG dan disentrifuge

pada kecepatan maksimal selama 30 detik untuk mengelusi DNA. Hasil isolasi

DNA disimpan pada suhu -20ºC.

Analisis kemurnian isolat DNA

Elektroforesis menggunakan agarosa 1,0 % dilakukan dengan cara 1,0 g

agarosa dilarutkan dalam larutan 1x TBE sebanyak 100 mL lalu dipanaskan pada

hot plate hingga mendidih sambil diaduk hingga larut, kemudian ditambahkan 5 µL

larutan gel red dan diaduk hingga homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel


5

sebanyak 25 ml yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras.

Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur dan

ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 1x

TBE. Isolat DNA sebanyak 2,0 µL (kadar 50 ng) ditambahkan aquabidest sebanyak

3,0 µL, kemudian dicampur dengan loading dye sebanyak 1,0 µL, kemudian

campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur

gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder

sebanyak 4,0 µL sebagai marker dan dilakukan elektroforesis dengan tegangan 125

volt selama 30 menit. Molekul DNA pada gel tray akan bergerak dari kutub negatif

menuju kutub positif pada pH netral. Hasil elektroforesis berupa gel agarosa

dideteksi di bawah UV transilluminator dan didokumentasikan menggunakan

kamera DSLR. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus

masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.

Amplifikasi isolat DNA dengan metode PCR.

Untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan

amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi Yoshida et al. (2003), yaitu

primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', primer reverse: 5'-GGC

TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan

menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Kadar genomik DNA yang

digunakan kira-kira 50 ng dengan volume akhir campuran 25 µL, yang terdiri dari

reagent 12,5 µL, primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA 5,0

µL, aquabidest 5 µL. Penentuan rentang suhu annealing dan jumlah siklus

amplifikasi berdasarkan pada hasil optimasi yang dilakukan oleh Cindy (2015).

Kondisi PCR digunakan adalah sebagai berikut: initial denaturasi pada suhu 94ºC

(3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94ºC (30”); annealing pada suhu

60ºC (30”) dan ekstensi pada suhu 70ºC (25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan

sebanyak 30 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC (5’).

Analisis produk PCR dengan menggunakan elektroforesis

Keberhasilan amplifikasi produk PCR dianalisis menggunakan

elektroforesis dengan fase diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan gel

red dan dilihat hasilnya dengan menggunakan lampu UV. DNA yang terekspresi


6

didokumentasi dengan kamera DSLR Canon 7D. Produk PCR yang terbentuk pada

penelitian ini adalah CYP2A6 *1, berada pada pita 368-bp (Yoshida et al, 2003).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian polimorfisme pada gen CYP2A6 ini dilakukan dalam empat

tahapan, yaitu isolasi DNA, analisis kemurnian isolat DNA, PCR pada amplifikasi

CYP2A6*9 dan analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis.

Polymerase Chain Reaction merupakan salah satu metode yang dilakukan untuk

mengidentifikasi alel secara spesifik, yaitu dengan menggunakan enzim dan

sepasang primer yang bersifat spesifik terhadap DNA yang akan dilipatgandakan

(Yusof, 2009). Alel CYP2A6*9 merupakan jenis alel yang diidentifikasi pada

penelitian ini. Pemilihan alel CYP2A6*9 didasarkan pada terjadinya polimorfisme

pada gen CYP2A6 yang dapat mempengaruhi metabolisme nikotin yaitu dapat

mengurangi atau menurunkan metabolisme nikotin pada populasi Asia (Nakajima

et al., 2006).

Penentuan subyek uji pada suku Tionghoa

Pada penelitian ini terdapat sebanyak 30 subyek yang berasal dari perokok

berjenis kelamin laki-laki dengan suku Tionghoa Indonesia minimal 3 generasi

yang berumur 20-40 tahun dan minimal menghisap rokok 5 batang dalam sehari

selama minimal 5 tahun. Menurut B-Rao (2011), jumlah minimum subyek uji

dalam penelitian polimorfisme genetik adalah 30 sampel. Keseluruhan subyek uji

rata-rata berumur 22 dengan rentang umur 20-30 tahun, subyek uji rata-rata

menghisap rokok dalam satu hari adalah 13 batang dengan rentang rokok yang

dihisap perharinya 5-25 batang dan melakukan aktivitas merokok rata-rata selama

6 tahun dengan rentang 5-8 tahun. hasil karakteristik subyek uji pada penelitian ini

dapat dilihat pada tabel I.


7

Tabel I. Karakteristik Subjek Penelitian Suku Tionghoa

Karakteristik Nilai

Jumlah Subjek 30 perokok Umur

- Mean ± SD - Range

21,9± 2,16 20-30

Jumlah batang rokok yang dihisap perhari

- Mean ±SD - Range

12,96 ± 4,80 5-25

Lama merokok - Mean ±SD - Range

5,8 ± 1,17 5-8

Keterangan: SD= Standar deviasi Berdasarkan karakteristik subyek uji tersebut menunjukkan aktivitas

merokok dipengaruhi oleh polimorfisme gen CYP2A6. Menurut penelitian Pitarque

et al (2005) perbedaan aktivitas enzim CYP2A6 berdampak pada penurunan kadar

nikotin dalam darah yang disebabkan karena seseorang memiliki alel CYP2A6 *9

dan menurut penelitian Liu et al (2011) bentuk alel tidak aktif dapat mempengaruhi

aktivitas enzim menjadi lebih lambat daripada bentuk aktifnya. Hal ini

menunjukkan faktor ketergantungan aktivitas merokok seseorang dipengaruhi oleh

kadar nikotin di dalam tubuh yang ditentukan oleh konsumsi nikotin, dimana

seseorang yang memiliki alel CYP2A6 *9 memiliki kadar nikotin yang lebih rendah

dibandingkan dengan alel CYP2A6 *1 (Raunio dan Rahnasto-Rilla, 2012).

Kelemahan pada penelitian ini adalah sulitnya mencari subyek uji perokok laki-laki

suku Tionghoa Indonesia yang berdomisili di Yogyakarta.

Isolasi DNA

Sebanyak 30 sampel dilakukan isolasi DNA dengan menggunakan kit DNA

isolasi (FavorPrep™). Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan

DNA dari bahan lain seperti protein, lemak dan karbohidrat. Prinsip utama dalam

isolasi DNA ada tiga tahap yaitu penghancuran (lisis) sel darah merah dengan

menambahkan RBC lysis, ektrasi DNA dari inti sel dengan menambahkan FABG

buffer (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Dilakukan dehidrasi DNA agar

terjadi presipitasi dengan menambahkan etanol 96% dan dilakukan penguapan


8

dengan sentrifugasi sebelum melanjutkan ke langkah berikutnya (Ausubel et al.,

2003). Kemudian dilakukan pencucian dari residu etanol 96% dengan

menambahkan W1 buffer dan wash buffer lalu dilakukan pengeringan pellet DNA.

Langkah yang terakhir melarutkan DNA dengan menambahkan elution buffer atau

TE agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan di dalam freezer

dengan suhu -20°C hingga waktu berminggu-minggu (Verkuil et al, 2008). Hasil

isolasi DNA dapat dilihat secara kualitatif dengan menggunakan elektroforesis.

Analisis hasil kemurnian isolat DNA

Setelah melakukan isolasi DNA, hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif

untuk mengetahui kualitas DNA yang didapat dengan menggunakan gel agarosa

pada elektroforesis (Fatchiyah, 2011; Broeders et al., 2014). Hasil elektroforesis

menunjukkan adanya pergerakan DNA maupun tidak ada pergerakan yang terlihat

pada gel agarosa berupa pita tebal dan tipis (gambar 1).

Isolat DNA

Gambar 1. Elektroforegram hasil isolat DNA Keterangan: M : DNA ladder 1-7 : DNA isolat Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarosa 1%; Fase Gerak Larutan TBE 1%; Kecepatan 125 V/cm.

7 6 5 4 3 2 1 M


9

Perbedaan tebal pita pada gel agarosa tersebut disebabkan karena perbedaan

konsentrasi DNA yang terekstraksi atau terdegradasi sehingga mempengaruhi tebal

pita yang terlihat pada gel agarosa tersebut (Patramurti et al., 2014). Pada penelitian

ini isolat DNA yang memiliki ukuran pita yang lebih dari 3000 bp menunjukkan

isolat DNA yang murni dan akan digunakan untuk amplifikasi.

Amplifikasi isolat DNA dengan metode PCR

Prinsip kerja Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah menggandakan potongan

DNA tertentu dari bentuk untaian DNA. (Stephenson dan Albilock, 2012). Prosedur

Identifikasi alel dari CYP2A6*9 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian

yang pernah dilakukan oleh Cindy (2015). Kondisi PCR yang digunakan adalah

Initial denaturasi pada suhu 94ºC (3’), dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu

94ºC (30”) pada tahap tersebut terjadi proses pemisahan untai pilinan DNA dengan

cara memutus ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan menjadi rantai

tunggal, berikutnya annealing pada suhu 60ºC (30”) terjadi proses penempelan

primer, primer yang digunakan adalah primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC

CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'

yang nantinya akan menempel pada target pasang basa nukleotida pada isolat DNA

(Gambar 2). Subyek uji yang memiliki alel CYP2A6 *9 tidak terjadi penempelan

primer, hal tersebut karena adanya perbedaan basa nukleotida dengan alel CYP2A6

*1 pada kotak promotor TATA sehingga tidak dapat diamplifikasi (Yoshida, 2003).

Alel CYP2A6*1

Primer forward

5' 3'

GATT CCTC TCCC CTGG AAC TAAA GGCA AACC ACCC CAGCC

CTAA GGAG AGGG GACC TTG ATTT CCGT TTGG TGGG GTCGG

5' 3' Primer reverse

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1 Keterangan:

: arah penempelan primer forward : arah penempelan primer reverse


10

Langkah berikutnya ekstensi pada suhu 70ºC (25”) Siklus amplifikasi

tersebut dilakukan sebanyak 30 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi

pada suhu 72ºC (5’), pada tahap ini taq polimerase membantu penempelan dNTP

agar terjadi pemanjangan untai DNA dengan ion Mg2+ sebagai kofaktor enzim taq

polymerase (Muladno, 2002). Hasil dari proses PCR tersebut kemudian dapat

dilihat pada UV transilluminator dan didokumentasi dengan kamera DSLR.

Gambar 3. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai

isolat DNA Keterangan: M : DNA Ladder 1-7 : Produk PCR Kondisi Elektroforesis: Fase diam agarosa 1,5 %; Fase Gerak Larutan TBE 1%; Kecepatan 125 V/cm.

Hasil analisis produk PCR dari 30 sampel yang dilakukan dengan

menggunakan elektroforesis menghasilkan produk PCR dengan ukuran 368 bp dan

ada yang tidak menghasilkan produk PCR (gambar 3), ada dan tidaknya produk

PCR tersebut ditentukan oleh spesifitas primer yang digunakan agar untaian DNA

dapat diamplifikasi (McPherson dan Moller, 2006). Hal tersebut menunjukkan dari

30 subyek uji terdapat 23 orang memiliki alel aktif berupa CYP2A6 *1 dengan

frekuensi 76,6% dan 7 orang yang memiliki alel tidak aktif berupa CYP2A6 *9

dengan frekuensi 23,4% (Tabel II), sehingga orang yang memiliki alel tidak aktif

CYP2A6 *9 kemungkinan tidak mengalami ketergantungan merokok karena

metabolisme nikotin lebih lambat daripada orang yang memiliki alel aktif CYP2A6

Isolat DNA


11

*1 yang nantinya berpengaruh pada respon tubuh untuk mempertahankan kadar

nikotin di dalam darah (Hukkanen, 2005).

Tabel II. Frekuensi alel CYP2A6

Alel Frekuensi Alel

CYP2A6 *1 23

CYP2A6 *9 7

Frekuensi alel CYP2A6 *1 = !"#$%'()*+,-./0+1%"2#"1'3%

𝑥100%

= 899:𝑥100%

= 76,6%

Frekuensi alel CYP2A6 *9 =!"#$%'()*+,-./0+1%"2#"1'3%

𝑥100%

= ;9:𝑥100%

= 23,4%

KESIMPULAN Hasil amplifikasi isolasi DNA yang dilihat dengan menggunakan

elektroforesis menunjukkan bahwa terdapat alel CYP2A6*9 pada suku Tionghoa

di Indonesia. Dari 30 orang perokok suku Tionghoa di Indonesia ditemukan 7 orang

memiliki alel tidak aktif CYP2A6 *9 dengan frekuensi sebesar 23,4% yang berarti

dapat mengalami penurunan metabolisme nikotin di dalam darah dan memiliki

resiko yang lebih rendah terhadap ketergantungan merokok daripada 23 orang yang

memiliki alel aktif CYP2A6 *1.


12

DAFTAR PUSTAKA

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., et al., 2003. Current Protocols in Molecular Biology.

Badan Pusat Statistik, 2010. Kewargaan Suku Bangsa. Boardman, J.D., Onge, J.M.S., Haberstick, B.C., Timberlake, D.S. & Hewitt, J.K.

2006. Schools and The Heritability of Smoking Behaviors: Theoretical and Methodological Considerations.

B-Rao C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies. Human Heredity, 52:191–200.

Broeders S, Huber I, Grohmann L, Berben G, Taverniers I, Mazzara M, Roosens NH, Morisset D., 2014. Guidelines for validation of quantitative real-time PCR methods. Elsevier, 2 (June)115-126.

Cindy., 2017, Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada identifikasi CYP2A6*9, Skripsi, Fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Corkill, G., Rapley, R., 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techiques in Molecular Biomethods.

Davies, G.E., & Sound, T.J., The Genetics of Smoking and Nicotine Addiction. www.sdsma.org/documents/Davies.pdf, di unduh pada tanggal 23 april 2017.

Dempster, M., Donnelly, M., O’Loughlin, C., 2004. The Validity of The MacNew Quality of Life in Heart Disease Questionnaire. Health and Quality of Life Outcomes, 2:6.

Dolphin, W. D., 2008. Biological Investigations. Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular,

Prinsip Dasar Analisis. Gullstén, H., 2000. Significance of Polymorphism in CYP2A6 Gene. Department

of Pharmacology and Toxicology University of Oulu, 52(4): 357–363. Hukkanen, J., Jacob III, P. & Benowitz, N.L., 2005. Metabolism and Disposition

Kinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 57(1):79-115.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno, H., et al., 2006. Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7 and *9 Polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.

Kwon, J.T. et al., 2001. Nicotine metabolism and CYP2A6 allele frequencies in Koreans. Pharmacogenetics, 11(4):317-23.

Kementerian Kesehatan RI, 2013. Riset Kesehatan Dasar. Bakti Husada. Liu, J., Mao, Q., Liu, Y., Hao, X., Zhang, S., & Zhang, J., 2013. Analysis of miR-

205 and miR-155 expression in the blood of breast cancer patients. Chin J Cancer Res, 25(1), 46–54.

Maggert, K. A., 2012. Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In Between. Genetic Research International, 1-9.

McPherson, M.J., dan Moller, S.G. 2006. PCR. Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Nakajima, Miki., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,


13

Kwon, J. T., McLeod, H. L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive evaluation of variability in nicotine metabolism and CYP2A6 polymorphic alleles in four ethnic populations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(3): 282-29.

O’Loughin, J., Paradis, G., Kim, W., DiFranza, J.R., Meshefedijan, G., et al. 2004. Genetically decreased CYP2A6 and the risk of tobacco dependence: a prospective study in novice smokers. Tab control, 13(4):422-8.

Oscarson, Michael., 2011. Genetic Polymorphisms in the Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) Gene : Implications for Interinduvidual Difference in Nicotine Metabolism. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 29(2):91-5.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11-19.

Peto, L., Behzad, N., Peter, H., Rogier, V.D., Nguyen, V.K., et al., 2014. The Bacterial Aetiology of Adult Community-Acquired Pneumonia in Asia. Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 108(6):326-37.

Rao, Y., Hoffmann, E., Zia, M., Bodin, L., Zeman, M., Sellers, E.M. & Tyndale, R.F., 2000. Duplications and Defects in The CYP2A6 Gene: Identification, Genotyping, and In vivo Effects on Smoking. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 58(4):747-55.

Raunio, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, Structure, Regulation, and Function, Drugs Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73-88.

Rodriguez, E.M., et al., 2011. Cancer-Related Sources of Stress for Children with Cancer and Their Parent. Journal of Pediatric Psychology, 37 (2):185-197.

Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014, PCR Optimization. Tyndale , R.F., Sellers, E., 2005. Variable CYP2A6-Mediated Nicotine Metabolism

Alters Smoking Behavior and Risk. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 29(4):548-52.

Yoshida R., Nakajima M., Watanabe Y., Kwon JT., Yokoi T., 2002. Genetic polymorphisms in human CYP2A6 gene causing impaired nicotine metabolism. Br. J. Clin. Pharmacol, 54(5):511-7.

Yusof, W., Gan, S.H., 2009. High Prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9

Alleles Detected Among a Malaysian Population. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry, 403(1-2),105–9.

Pelt-Verkuil, E. V., Belkum, A. V., dan Hays, J. P. 2008. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification.

WHO, 2013. About: Media Centre- Tobacco Fact sheet Updated June 2016. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en/. di unduh dari pada tanggal 10 Februari 2017.


14

LAMPIRAN


15

Lampiran 1. Ethical Clearance


16

Lampiran 2. Hasil Kuisioner


17


18

Lampiran 3. Informed Consent


19

Lampiran 4. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


20

Lampiran 5. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


21

Lampiran 6. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers

Lampiran 7. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*9


22

Lampiran 8. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Elektroforesis

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

22 23

24 25 26 27 28 29 30


23

Lampiran 9. Hasil Analisis Kualitatif Produk PCR menggunakan Elektoforesis

8 9 10 11 12 13 14 M

15 16 17 18 19 20 21

22 23 M

24 25 26 27 28 29 30 M


24

Lampiran 10. Usage Information of FavorPrepTM


25

Lampiran 11. Karakteristik Subjek Uji

Subyek Uji

Umur (tahun)

Total Skor FTND

Lama Merokok (tahun)

Jumlah Batang Rokok (per hari)

1 20 2 5 10 2 26 1 6 11 3 22 5 8 7 4 23 2 6 7 5 23 4 6 17 6 22 6 5 25 7 23 1 5 7 8 20 1 6 10 9 26 4 6 16 10 21 4 5 18 11 22 4 5 9 12 20 2 5 9 13 22 4 5 10 14 23 3 8 5 15 20 4 5 8 16 21 6 5 18 17 21 5 7 19 18 21 5 7 13 19 20 4 8 20 20 21 5 7 16 21 22 4 6 10 22 21 2 5 13 23 22 3 6 8 24 21 4 7 15 25 20 3 5 13 26 30 1 5 20 27 22 4 6 12 28 22 5 8 14 29s 20 3 5 14 30s 22 4 6 15


26

BIOGRAFI PENULIS

Skripsi dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel

*9 pada Perokok Suku Tionghoa Indonesia dengan

Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)” ditulis

oleh Evan Julian Candaya, lahir di Magelang, 16 Juli

1996 merupakan anak kedua dari 3 bersaudara. Anak

dari pasangan Kamasta dan Fenny Noviati. Penulis

menempuh pendidikan di TK Remaja pada tahun 2001

– 2002, SD Remaja pada tahun 2002 – 2008, SMP

Remaja pada tahun 2008 – 2011, SMA Kolese

Debritto pada tahun 2011 – 2014, dan pada tahun 2014 meneruskan pendidikan di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama Menempuh

pendidikan di Fakultas Farmasi USD penulis pernah aktif dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan dan kepanitian seperti menjadi anggota divisi Dana dan Usaha pada

acara Pelepasan Wisuda I tahun 2014, divisi Acara pada acara Pharmacy Road to

School (2015), TITRASI (Tiga Hari Temu Akrab Farmasi) pada tahun 2015,

koordinator divisi Acara pada acara Pharmacy Performance (2016), koordinator

divisi Acara pada acara Lomba Cerdas Cermat (LCC) pada tahun 2016. Bukan

hanya aktif diberbagai organisasi dan kepanitiaan, penulis juga aktif dalam Unit

Kegiatan Fakultas (UKF) Futsal Squadra Viola periode 2014-2017, Unit Kegiatan

Fakultas (UKF) basket periode 2014-2017 dan asisten dosen pada praktikum

Biokimia tahun 2017. Dengan motivasi dan ketekunan untuk belajar serta

pengalaman yang dimiliki, penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dan semoga

penulisan skripsi ini dapat menambah pengetahuan bagi pembaca.


identifikasi gen cyp2a6 alel *9 pada perokok suku … · gen cyp2a6 memiliki peran dalam...

Documents