identifikasi polimorfisme gen delta- …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... ·...

IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA-

AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE (ALAD) DAN

HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN ANEMIA PADA

MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN

PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF

HIDAYATULLAH JAKARTA ANGKATAN 2012-2014

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA KEDOKTERAN

Oleh :

Moch Rizki Ramadhan

NIM. 11141030000024

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1438 H / 2017 M

ii

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa :

1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk

memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata 1 di Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan

sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Jika di kemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau

merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima

sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Ciputat, 9 Juli 2017

Moch Rizki Ramadhan

iii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING

IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA – AMINOLEVULINIC ACID

DEHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN ANEMIA

PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI

DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANGKATAN 2012 – 2014

Laporan Penelitian

Diajukan kepada Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)

Oleh

Moch Rizki Ramadhan

NIM. 11141030000024

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1438 H / 2017 M

iv

LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Penelitian berjudul Identifikasi Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic

Acid Dehydratase (ALAD) dan Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada

Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 yang diajukan oleh Moch Rizki

Ramadhan (NIM 11141030000024), telah diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan pada tanggal 26 Juli 2017. Laporan penelitian ini telah diperbaiki

sesuai dengan masukan dan saran penguji, serta telah diterima sebagai salah satu syarat

memperoleh gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked) pada Program Studi Kedokteran dan

Profesi Dokter.


DEWAN PENGUJI

Ketua Sidang

Chris Adhyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIP. 19690511 200312 1 001

Pembimbing 1

Chris Adhyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIP. 19690511 200312 1 001

Pembimbing 2

DR. Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed

Penguji 1

Nurlaely Mida R, S.Si, M.Biomed, DMS

NIP. 19671119 200501 2 001

Penguji 2

dr. Riva Auda, Sp.A, M.Kes

NIP. 19761217 200801 2 015

Pimpinan Fakultas

Dekan FKIK UIN Jakarta

Prof. DR. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes

NIP. 19650808 198803 1 002

Kaprodi PSKPD UIN Jakarta

dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, FACS, PhD

NIP. 19721103 200604 1 001

v

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh,

Alhamdulillah puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

rahmat dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan laporan

penelitian dengan judul IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA –

AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA

DENGAN KEJADIAN ANEMIA PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI

KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF

HIDAYATULLAH JAKARTA ANGKATAN 2012 - 2014. Sholawat serta salam

semoga tetap tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW, yang telah membawa kita dari

zaman jahiliyah menuju zaman ilmu pengetahuan.

Penyusunan laporan penelitian ini dapat terselesaikan karena bantuan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada yang

terhormat :

1. Kedua orang tua saya, Bejo Santoso dan Nur Hanifah yang selalu memberikan

kasih sayang, restu, doa, dan semangat, sehingga memotivasi dan menguatkan

saya dalam melakukan penelitian ini,

2. Dr. KH. Asep Saifuddin Chalim, M.A. selaku kyai pondok pesantren Amanatul

Ummah yang selalu memberikan doa bagi santrinya,

3. Kementrian Agama RI yang telah menyelenggarakan PBSB sehingga kami

sebagai santri pesantren dapat memiliki kesempatan untuk menimba ilmu di FKIK

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,

4. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,

5. dr. Nouval Shahab, Sp.U, PhD, FICS, FACS. selaku Ketua Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter,

6. Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan DR. Zeti Harriyati, M.Biomed. selaku

pembimbing yang telah membimbing, mengajarkan, memfasilitasi dan

menyemangati.

7. dr. Riva Auda, Sp.A, M.Kes dan Nurlaely Mida R, M.Biomed, DMS. selaku

penguji yang telah bersedia menguji dan mengoreksi laporan penelitian ini.

vi

8. Laboran laboratorium biokimia dan biologi, Mbak Ayi dan Mbak Sur yang telah

membantu berlangsungnya penelitian ini.

9. Adik saya tercinta, Jaziilah Naflah Naziihah yang telah memberikan semangat

dalam menyelesaikan penelitian ini.

10. Annisa Tristiana yang telah membantu membimbing dan menyemangati dalam

penyelesaian penulisan laporan penelitian ini.

11. Teman sekelompok penelitian, Raissya Armilla, Ajeng Ristia SP, Nurul

Fathimah, dan Annisa Firdausi yang telah menyemangati, membantu, dan

berjuang bersama dalam penelitian ini.

12. Semua responden yang telah bersedia untuk menjalani penelitian ini.

13. Keluarga besar CSSMoRA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang selalu

memberikan dukungan.

14. Keluarga besar Alumni PP. Amanatul Ummah yang selalu menyemangati.

Penulis menyadari dalam penyusunan laporan ini masih banyak terdapat kekurangan.

Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan panulis terima demi laporan

penelitian yang lebih baik. Penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi

masyarakat. Demikian, semoga Allah selalu memberi balasan, rahmat dan ridho-Nya

kepada seluruh pihak yang membantu penelitian ini. Amin.

Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh.


Penulis

vii

ABSTRAK

Moch Rizki Ramadhan. Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter. Identifikasi

Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALAD) dan

Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada Mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Angkatan 2012 – 2014. 2017.

Aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) merupakan enzim yang berfungsi mengkatalis

kondensasi dua molekul Aminolevulinic acid (ALA) menjadi Monopyrrole

porphobilinogen (PBG) dalam proses pembentukan heme. Polimorfisme gen ALAD

diketahui berperan penting pada metabolisme timbal (Pb) di dalam darah. Tujuan

penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya polimorfisme genetik ALAD pada

mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 (N = 102). Metode yang digunakan adalah

Amplification Refractory Mutation System – PCR (ARMS – PCR). Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa genotip ALAD-1/2 memiliki proporsi terbanyak (N = 71) pada

populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

Kata kunci : ALAD, Pb, ARMS – PCR

viii

ABSTRACT

Moch Rizki Ramadhan. Medicine and Physician Profession Study Program.

Identification of Delta – Aminolevulinic Acid (ALAD) Gene Polymorphism and its

Correlation with Anaemia in Students of Medicine and Physician Profession Study

Program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 –

2014. 2017.

Aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) is an enzyme that catalyzes the condensation

of two mollecules Aminolevulinic acid (ALA) to form Monopyrrole phorpobilinogen

(PBG) in the pathway for heme synthesis. ALAD gene polymorphism is important for

Lead (Pb) metabolism in blood. The purpose of this research is to discover the existance

of ALAD gene polymorphism on the students of medicine and physician profession study

program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 – 2014 (N

= 102). The method was used Amplification Refractory Mutation System – PCR (ARMS

– PCR). The result of this research show that ALAD – 1/2 genotype has higher

frequencies (N = 71) in the students of medicine and physician profession study program

of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 – 2014 population.

Keywords : ALAD, Pb, ARMS – PCR

ix

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ............................................................................................................i

LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN.......................................................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................................iv

KATA PENGANTAR ..................................................................................................... v

ABSTRAK ..................................................................................................................... vii

ABSTRACT ................................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ...................................................................................................................ix

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................xi

DAFTAR TABEL ......................................................................................................... xii

DAFTAR SINGKATAN ............................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................xiv

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................................ 1

1.1.Latar Belakang ......................................................................................................... 1

1.2.Rumusan Masalah .................................................................................................... 2

1.3.Hipotesis .................................................................................................................. 3

1.4.Tujuan ...................................................................................................................... 3

Tujuan Umum ............................................................................................................. 3

Tujuan Khusus ............................................................................................................ 3

1.5.Manfaat Penelitian ................................................................................................... 3

Manfaat bagi Peneliti .................................................................................................. 3

Manfaat bagi Institusi ................................................................................................. 3

Manfaat bagi Masyarakat ........................................................................................... 4

Manfaat Klinis ............................................................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 5

2.1. Landasan Teori ........................................................................................................ 5

2.1.1. Pencemaran Logam Berat Pb ........................................................................... 5

2.1.2. Polimorfisme Gen ALAD ................................................................................ 9

2.1.3. Efek Terganggunya Enzim ALAD ................................................................. 13

2.1.4. Spektrofotometri UV ...................................................................................... 17

2.1.5. Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction

(ARMS – PCR) ............................................................................................... 19

2.2. Kerangka Teori ..................................................................................................... 23

2.3. Kerangka Konsep .................................................................................................. 24

2.4. Definisi Operasional ............................................................................................. 24

x

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................................... 26

3.1. Desain Penelitian .................................................................................................. 26

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................... 26

3.3. Sampel Penelitian .................................................................................................. 26

3.4. Besar Sampel ........................................................................................................ 26

3.5. Teknik Pengambilan Sampel ................................................................................ 27

3.6. Kriteria Pemilihan Sampel .................................................................................... 27

3.6.1. Kriteria Inklusi ............................................................................................... 27

3.6.2. Kriteria Eksklusi ............................................................................................. 27

3.7. Cara Kerja ............................................................................................................. 27

3.7.1. Perizinan Subjek Penelitian ............................................................................ 27

3.8. Alur Penelitian ...................................................................................................... 28

3.9. Prosedur Penelitian ............................................................................................... 29

3.10. Cara Kerja Penelitian .......................................................................................... 31

3.10.1. Pengumpulan Data ....................................................................................... 31

3.10.2. Desain Primer ............................................................................................... 31

3.10.3. Isolasi DNA .................................................................................................. 32

3.10.4. Amplifikasi Genom dengan ARMS-PCR .................................................... 34

3.10.5. Elektroforesis dan Gel Docummentation System ......................................... 35

3.11. Anaisis Data ........................................................................................................ 37

3.12. Etika Penelitian ................................................................................................... 37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 38

4.1. Isolasi DNA Genom .............................................................................................. 38

4.2. Identifikasi Genetik ALAD Menggunakan ARMS-PCR ..................................... 39

4.3. Karakteristik Sampel ............................................................................................. 42

4.3.1. Karakteristik Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin ......................................... 42

4.3.2. Karakteristik Sampel Berdasarkan Usia ......................................................... 42

4.3.3. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin .......................................................... 43

4.3.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin .................. 44

4.3.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia ............. 45

4.4. Keterbatasan Penelitian ......................................................................................... 47

BAB V SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 48

5.1. Simpulan ............................................................................................................... 48

5.2. Saran ..................................................................................................................... 48

PERNYATAAN PENELITIAN ................................................................................... 49

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 50

LAMPIRAN ................................................................................................................... 56

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Mekanisme Multi – Organ Failure Akibat Paparan Pb................................ 8

Gambar 2.2. Proses Pembentukan Protein ....................................................................... 10

Gambar 2.3. Proses Pembentukan Heme ......................................................................... 12

Gambar 2.4. Proses Pembentukan PBG dari 2 Molekul ALA yang Dikatalis oleh Enzim

ALAD ......................................................................................................... 13

Gambar 2.5. Molekul Hemoglobin .................................................................................. 14

Gambar 2.6. Proses Pembentukan dan Degradasi Eritrosit ............................................. 15

Gambar 2.7. Klasifikasi Anemia Berdasarkan Indeks Eritrosit ....................................... 15

Gambar 2.8. Etiologi Anemia Mikrositik Hipokromik ................................................... 16

Gambar 2.9. Perbandingan Kadar DNA dan Protein dengan Panjang Gelombang Pada

Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV ................................................ 17

Gambar 2.10. Perbandingan Kadar U, MU, DMU, FU, dan Timin dengan Panjang

Gelombang Pada Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV .................... 18

Gambar 2.11. Desain Primer pada ARMS-PCR.............................................................. 20

Gambar 2.12. Tabel Pasangan Basa pada Desain Primer ARMS ................................... 21

Gambar 2.13. Tahap Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD dengan ARMS-PCR dan

Elektroforesis .............................................................................................. 22

Gambar 4.1. Deteksi Kualitatif DNA Genom dengan Elektroforesis ............................. 39

Gambar 4.2. Hasil PCR Tahap 1 ..................................................................................... 39

Gambar 4.3. Hasil PCR Tahap 2 ..................................................................................... 40

Gambar 4.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin ............... 44

Gambar 4.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia ......... 45

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Definisi Operasional ....................................................................................... 24

Tabel 3.1. Alat dan Bahan Penelitian .............................................................................. 29

Tabel 3.2. Primer yang Digunakan pada Proses PCR ..................................................... 31

Tabel 3.3. Tahapan Isolasi Genom DNA ........................................................................ 32

Tabel 3.4. Komposisi Mix PCR pada PCR Tahap 1 ........................................................ 34

Tabel 3.5. Komposisi Mix PCR pada PCR Tahap 2 ........................................................ 35

Tabel 3.6. Tahapan Elektroforesis ................................................................................... 36

Tabel 4.1. Data Kemurnian DNA Genom Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan

Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ..... 38

Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD pada Mahasiswa Program

Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Angkatan 2012 - 2014 ................................................................................... 41

Tabel 4.3. Deskripsi Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin ............................................... 42

Tabel 4.4. Deskripsi Sampel Berdasarkan Usia .............................................................. 43

Tabel 4.5. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin .......................................................... 43

xiii

DAFTAR SINGKATAN

ALA Aminolevulinic Acid

ALAD ẟ - Aminolevulinic Acid Dehydratase

ALAS ẟ - Aminolevulinic Acid Synthase

APA American Pediatric Association

ARMS Amplification Refractory Mutation System

CDC Centers for Disease Control and Prevention

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

Fe Ferrum (Zat Besi)

GABA γ – Aminobutiric Acid

Hb Haemoglobin

MCH Mean Cell Haemoglobin / Mean Corpuscular Haemoglobin

MCHC Mean Cell Haemoglobin Concentration / Mean

Corpuscular Haemoglobin Concentration

MCV Mean Cell Volume / Mean Corpuscular Volume

NHANES National Health and Nutrition Examination Survey

NMDA N – Methyl – D – Aspartate

Pb Plumbum (Timbal)

PBG Phorpobilinogen

PCR Polymerase Chain Reaction

PSKPD Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ribonucleic Acid

ROS Reactive Oxygen Species

TIBC Total Iron Binding Capacity

UIN Universitas Islam Negeri

UV Ultra Violet

Zn Zink

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden ........................................................ 56

Lampiran 2. Lembar Persetujuan Etik (Ethical Approval) .................................... 57

Lampiran 3. Gen ALAD pada Manusia ................................................................. 58

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian ................................................................ 59

Lampiran 5. Hasil Isolasi DNA Genom ................................................................. 61

Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .............................. 62

Lampiran 7. Hasil PCR Tahap 1 ............................................................................ 66

Lampiran 8. Karakteristik Sampel ......................................................................... 69

Lampiran 9. Hasil Analisis Statistik ...................................................................... 75

Lampiran 10. Nilai Normal Pemeriksaan Hematologi Eritrosit ............................ 83

Lampiran 11. Curriculum Vitae Peneliti ................................................................ 84

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Logam merupakan zat yang memiliki konduktivitas listrik yang tinggi, dan

dapat melepaskan elektronnya untuk membentuk kation. Logam ditemukan secara

bebas di alam dan komposisinya berbeda di setiap tempat. Hal ini disebabkan oleh

faktor lingkungan serta variasi sifat dari logam itu sendiri. Logam berat merupakan

polutan yang banyak ditemukan di lingkungan dan sifat toksiknya dapat

menimbulkan permasalahan yang serius dalam lingkup kesehatan. Timbal (Pb)

merupakan salah satu logam yang memiliki toksisitas tinggi dan banyak terkandung

dalam bahan industri, makanan, rokok, dan air minum. Sumber Pb ini berasal dari

bahan bakar minyak, cat, pipa, baterai, mainan dan kran.[1, 2]

Berdasarkan pemantauan Kementrian Lingkungan Hidup Republik

Indonesia, emisi transportasi terbukti sebagai penyumbang pencemaran udara

tertinggi di Indonesia yaitu sekitar 85%. Menurut Environtment Project Agency

pada kendaraan bermotor sekitar 25% Pb tetap berada di dalam mesin dan 75%

lainnya akan mencemari udara sebagai asap knalpot.[3]. Pb dapat masuk ke dalam

tubuh melalui proses pencernaan, pernapasan, dan paparan langsung terhadap kulit.

Pb yang masuk ke dalam tubuh akan menyebar melalui aliran darah. Bentuk kimia

Pb merupakan faktor penting yang memengaruhi sifat Pb di dalam tubuh.

Komponen Pb organik misalnya tetraethil Pb dapat langsung terabsorbsi melalui

kulit dan membran mukosa. Pb organik diabsorbsi terutama melalui saluran

pencernaan dan pernafasan. Pb akan menumpuk di dalam tubuh karena dipengaruhi

ukuran partikelnya.[4]

Paparan Pb dapat memengaruhi kesehatan manusia, salah satunya dapat

memengaruhi perkembangan intelektual pada bayi dan anak. Selain itu dapat pula

memengaruhi fungsi kognitif orang dewasa. Penelitian sebelumnya menunjukkan

bahwa jumlah Pb yang tinggi di dalam tubuh berhubungan dengan hipertensi,

penyakit vaskular perifer, naiknya angka mortalitas pada orang dewasa, kelainan

reproduksi, kelainan ginjal, dan fungsi imun.[5]

2

Setiap individu memiliki kemampuan beradaptasi terhadap adanya paparan

logam berat yang berbahaya ini. Salah satu gen yang mengontrol metabolisme Pb

didalam tubuh adalah ALAD. ALAD merupakan enzim yang berfungsi mengkatalis

langkah ke – 2 dalam proses pembentukan heme, yaitu mengubah 2 molekul

aminolevulinic acid menjadi monopyrrole porphobilinogen.[6] Interaksi antara Pb

dengan tubuh dapat memunculkan adanya variasi genetik ALAD.[7] Variasi genetik

dalam sebuah populasi sebanyak 1% atau lebih disebut dengan polimorfisme.[8, 9]

Gen yang mengkode pembentukan ALAD terletak pada kromosom 9q34 dan

diekspresikan di seluruh jaringan tubuh, namun memilki kadar lebih tinggi pada

eritrosit dan hati.[10]

Studi epidemiologi yang dilakukan di Eropa, Asia, dan Amerika

menyatakan bahwa proporsi ALAD berbeda antar populasi.[11] Variasi yang terjadi

pada gen ALAD memungkinkan seseorang mengalami gangguan terhadap

metabolisme Pb didalam tubuh. Penumpukan Pb didalam jaringan tubuh diduga

dapat menyebabkan kelainan pada organ dan penyakit.[12] Pb berkompetisi dengan

Zn pada active site enzim ALAD sehingga dapat mengganggu proses sintesis heme.

Sifat toksik Pb terhadap eritrosit sangat besar, karena 90% Pb dalam darah terikat

oleh hemoglobin. Proses sintesis heme yang terganggu menyebabkan munculnya

anemia mikrositik hipokromik. Banyak etiologi penyebab anemia mikrositik

hipokromik salah satunya adalah thalassemia dan anemia defisiensi besi.[5, 12]

Karena pentingnya peranan gen ALAD dalam perjalanan biologis Pb, maka

perlu adanya identifikasi polimorfisme genetik ALAD sehingga diharapkan dapat

meminimalisasi kemungkinan anemia dan penyakit lain yang ditimbulkan oleh

polimorfisme genetik tersebut.

1.2. Rumusan Masalah

a. Apakah terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa

PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ?

b. Apakah terdapat hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan

kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ?

3

1.3. Hipotesis

a. Terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa

PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

b. Terdapat hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan

kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

1.4. Tujuan Penelitian

1.4.1. Tujuan Umum

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya

polimorfisme genetik ALAD dan hubungannya dengan kejadian anemia.

1.4.2. Tujuan Khusus

Tujuan khusus dari penelitian ini adalah:

1. Untuk mengetahui adanya polimorfisme genetik ALAD pada Mahasiswa

PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014

2. Untuk mengetahui kejadian anemia pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif


3. Untuk mengetahui hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan

kejadian Anemia pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

1.5.Manfaat Penelitian

1.5.1. Manfaat bagi Peneliti

Manfaat penelitian ini bagi peneliti adalah menambah ilmu pengetahuan

tentang gen ALAD dalam bidang penelitian biomolekular.

1.5.2. Manfaat bagi Institusi

Penelitian ini dapat digunakan sebagai referensi penelitian di Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan juga dapat

digunakan sebagai bahan untuk melakukan penelitian lebih dalam bagi peneliti

yang lain.

4

1.5.3. Manfaat bagi masyarakat

Penelitian ini dapat memberikan informasi tentang polimorfisme genetik

ALAD yang dapat memengaruhi perbedaan perjalanan biologis Pb di dalam tubuh.

1.5.4. Manfaat klinis

Penelitian ini dapat memberikan informasi bahwa dengan mengetahui

adanya polimorfisme genetik ALAD dapat menjadi informasi / pengetahuan

tentang kepekaan seseorang terhadap toksisitas Pb dengan variasi pada gen

Diharapkan kedepannya dapat dikembangkan kegiatan berupa penyuluhan dan

pencegahan terhadap toksisitas Pb untuk mengurangi angka penyakit yang

ditimbulkan karena paparan Pb.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan Teori

2.1.1. Pencemaran Logam Berat Pb

Pb merupakan logam berat yang sangat toksik dan dapat menyebabkan

kontaminasi lingkungan. Karena sifatnya yang toksik tersebut, Pb dapat

menyebabkan munculnya masalah kesehatan di seluruh dunia.[1] Pb dapat masuk ke

dalam tubuh melalui proses pencernaan, pernapasan, dan paparan langsung

terhdapat kulit. Pb yang masuk ke dalam tubuh akan menyebar melalui aliran

darah.[4] Pada orang dewasa rata – rata Pb yang terabsorbsi dapat mencapai 10 –

15% dari total Pb yang masuk. Sedangkan pada bayi, anak, dan wanita hamil Pb

yang terabsorbsi dapat meningkat hingga 50%. Selain itu, kadar Pb dalam darah

juga meningkat pada anak yang mengalami kekurangan konsumsi besi, kalsium,

fosfor, dan zink.[13] Pb adalah logam yang dapat teroksidasi apabila kontak dengan

udara. Sumber Pb berasal dari bahan bakar minyak, cat rumah, pipa air, kran air,

baterai, dan juga mainan.[1]

Setelah Pb memasuki aliran darah, 99% Pb yang bersirkulasi akan berikatan

dengan eritrosit dan bertahan 30 hingga 35 hari. Pb yang bersirkulasi di dalam tubuh

ini akan tersebar ke beberapa jaringan yaitu hati, korteks ginjal, otak, paru, limpa,

gigi, dan tulang selama 4 – 6 minggu. Karena waktu paruh yang sebentar di dalam

pembuluh darah, kadar Pb dalam darah tidak dapat digunakan sebagai alat

diagnostik ketika paparan telah terjadi lebih dari 6 minggu. Pada orang dewasa 80

– 95% Pb yang masuk akan disimpan di dalam tulang. Sedangkan pada anak hanya

70% Pb saja yang disimpan di dalam tulang. Hal ini menunjukkan bahwa kadar Pb

yang berada di dalam jaringan lunak lebih besar pada anak dibandingkan dengan

dewasa. Pb disimpan di dalam tulang untuk waktu yang cukup lama yaitu 20 – 30

tahun.[14]

Studi sebelumnya mengatakan bahwa lebih dari 1/3 masa tulang orang

dewasa mengandung Pb karena adanya paparan pada masa anak dan remaja,

meskipun terdapat mekanisme bone turnover pada masa tersebut. Dari bukti

6

tersebut dapat disimpulkan bahwa kadar Pb yang berada di dalam tulang bertambah

seiring dengan bertambahnya usia. Kadar Pb di dalam tulang tibia pada usia remaja

3 µg/g, pada dewasa usia 30 – 50 tahun 17 µg/g, dan pada dewasa usia lebih dari

75 tahun mencapai 30 µg/g. Beberapa keadaan seperti kehamilan, menyusui,

osteoporosis pasca menopause, hipertiroid, dan kemoterapi sisplatin, menunjukkan

adanya peningkatan level Pb dalam darah. Hal ini terjadi akibat adanya mekanisme

bone turnover yang terjadi pada keadaan tersebut. Pb dalam tulang ibu juga dapat

ditransfer ke dalam tulang bayi melalui plasenta saat masa kehamilan.[14, 15] Pb

dapat melalui barier plasenta dimulai pada minggu ke 12 kehamilan dan terus

berlanjut hingga kelahiran. Kadar Pb di darah korda umbilikus mencapai 80 – 100%

kadar Pb darah maternal.[13]

Pb inorganik tidak dimetabolisme, namun langsung diekskresikan tanpa

diubah utamanya melalui urin. Pb dapat diekskresikan dalam jumlah sedikit melalui

feses, kuku dan keringat, sedangkan 1/3 Pb dari dalam tubuh dapat diekskresikan

melalui empedu, cairan lambung, dan saliva.[8] Pb organik atau alkyl-lead akan

dimetabolisme menjadi metabolit yang neurotoksik melalui proses dealkilasi

oksidatif. Di hati, reaksi ini dikatalis dengan sitokrom P450 – dependent

monooxygenase system.[4]

Pada tahun 2012 CDC (Centers for Disease Control and Prevention) dan

APA (American Pediatric Association) melakukan studi terkait kadar Pb dalam

darah manusia. Mereka menyimpulkan bahwa adanya peningkatan kadar Pb dalam

darah anak hingga 5 µg/dl dapat mengindikasikan anak tersebut telah terpapar oleh

Pb melebihi batas normal paparan Pb pada anak.[14, 16] Batas normal paparan Pb

pada anak didapat berdasarkan data dari NHANES (National Health and Nutrition

Examination Survey) tahun 2007 – 2008 dan 2009 – 2010.[9] Anak lebih rentan

terkena paparan Pb karena aktivitas anak yang cenderung hand-to-mouth dan

tingginya kemampuan absorbsi saluran cerna pada anak. Hingga tahun 2012, CDC

masih menetapkan bahwa kadar normal Pb dalam darah anak adalah < 10 µg/dl.[16,

17] Ketetapan tersebut juga berlaku pada bayi dan ibu hamil. Pada pekerja yang

terpapar Pb, kadar Pb dalam darah menjadi tidak aman apabila > 30 µg/dl.[14, 16]

7

Kadar Pb yang melebihi batas normal dalam darah dapat mengganggu

perkembangan dan fungsi organ tubuh. Organ yang paling sering terganggu adalah

darah, saraf, hati, dan ginjal. Pb dapat memengaruhi sintesis heme melalui 3 enzim

yaitu, ALAD (Delta Aminolevulinic Acid Dehydratase), ALAS (Delta

Aminolevulinic Acid Synthase), dan Ferrochelatase. Inhibisi enzim ALAD dimulai

dari minimal kadar Pb dalam darah 5 µg/dl. Pada kadar Pb dalam darah 16 µg/dl,

sebanyak 50% enzim ALAD menjadi tidak teraktivasi, sedangkan pada kadar Pb

dalam darah sebanyak 55 µg/dl, sebanyak 90% enzim ALAD menjadi tidak

teraktivasi. Ferrochelatase merupakan enzim yang mengkatalis pengikatan zat besi

(Fe) ke dalam cincin phorphirin. Sebagai hasil dari toksisitas Pb ini, kerja enzim

Ferrochelatase dapat terhambat dan jalur pembentukan Hb akan terganggu, atau

apabila zat besi yang adekuat tidak tersedia, zink dapat menggantikan zat besi ini

dan kadar zink-protoporphirin akan meningkat. Akibatnya adalah penurunan level

Hb yang bisa kita sebut sebagai anemia.[10, 18]

Selain memengaruhi fungsi darah, munculnya Pb dapat memengaruhi

sistem saraf pusat secara langsung. Umumnya gangguan terhadap sistem saraf

terjadi pada masa anak, saat terjadi berbagai proses pertumbuhan sel – sel saraf. Pb

dapat memengaruhi pelepasan neurotransmitter, merusak fungsi sistem

GABAergik, dopaminergik, dan kolinergik dengan cara menginhibisi kanal ion

NMDA (N- Methyl D- Aspartate) saat fase neonatus. Sebuah studi in vitro

menunjukkan bahwa Pb dapat mengaktivasi protein kinase C di sel kapiler serta

menginhibisi Na+/K+ - ATPase di membran sel sehingga mengganggu proses

metabolisme yang terjadi. Di dalam sel, Pb dapat memengaruhi pelepasan kalsium

dari mitokondria sehingga menyebabkan terbentuknya ROS (reactive oxygen

species), hal ini dapat mempercepat kematian sel.[18] Akibat dari adanya kerusakan

di dalam sel ini, dapat memengaruhi fungsi sel – sel saraf, mulai dari neuron sebagai

unit fungsional saraf, dan juga sel penyokong saraf seperti sel schwann, astrosit,

dan oligodendrosit.[19]

Pengaruh paparan Pb terhadap sel tidak hanya terjadi pada sel saraf saja

namun dapat juga memengaruhi fungsi sel di organ lainnya, salah satunya adalah

ginjal. Efek akut yang terjadi akibat paparan Pb terhadap ginjal adalah kerusakan

struktural tubulus proksimal. Dalam proses yang lebih lanjut, paparan Pb juga dapat

8

merusak struktur glomerulus, tubulus distal, dan sistem renin-angiotensin yang

sangat memengaruhi fungsi ginjal dalam mengatur cairan dalam tubuh.[20, 21]

Gambar 2.1. Mekanisme Multi-organ Failure Akibat Paparan Pb [14]

Hati merupakan organ yang memiliki fungsi detoksifikasi. Fungsi

detoksifikasi ini ditunjukkan dengan adanya CYP450 yang tersedia di dalam sel

hati. Secara umum fungsi detoksifikasi bertujuan untuk menjaga tubuh dari

9

komponen xenobiotik (bahan kimia berbahaya dari luar tubuh) yang bersifat toksik.

Paparan Pb dapat menginhibisi aktivitas CYP450, sehingga menyebabkan fungsi

detoksifikasi hati menurun. Hal ini dapat menyebabkan kerusakan pada sel hati

akibatnya dapat menurunkan berbagai fungsi hati yang sangat penting bagi

tubuh.[14, 20] Mekanisme secara ringkas dapat dilihat pada gambar 2.1

2.1.2. Polimorfisme Gen ALAD

Gen adalah unit dasar fisik dan unit herediter. Gen terbentuk dari beberapa

DNA yang berfungsi sebagai penyandi pembentukan molekul protein. Sedangkan

genom adalah suatu kesatuan gen yang secara alami dimiliki oleh organisme

prokariot maupun eukariot.[22] DNA (deoxyribonucleic acid) merupakan material

herediter pada manusia dan organisme pada umumnya. DNA terletak di 2 tempat

yaitu di dalam nukleus (nuclear DNA) dan di dalam mitokondria (mitochondrial

DNA). Informasi di dalam DNA disimpan sebagai kode yang terdiri atas 4 basa

kimia yaitu adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Basa DNA tersebut

saling berpasangan, A berpasangan dengan T, dan C berpasangan dengan G untuk

membentuk sebuah unit yang disebut pasangan basa. Setiap basa juga berpasangan

dengan molekul gula dan satu molekul fosfat yang kesatuan ini disebut sebuah

nukleotida. Nukleotida ini tersusun menjadi 2 rantai panjang berbentuk spiral yang

disebut dengan double helix. Informasi di dalam DNA dapat diperbanyak melalui

proses replikasi sel.[24]

Informasi genetik yang terkandung di dalam DNA ini akan diekspresikan

menjadi bentuk protein yang dapat meregulasi berbagai aktivitas di dalam tubuh.

Sebuah sel memiliki kemampuan untuk mengatur mana saja informasi genetik yang

akan diterjemahkan menjadi sebuah protein. Selanjutnya bagian informasi yang

sudah terpilih untuk diterjemahkan akan ditranskripsi menjadi single strain RNA

(ribonucleic acid). Kemudian RNA ini akan ditranspor ke sitoplasma untuk

mengikuti proses translasi, RNA ini disebut mRNA (mesengger ribonucleic acid).

mRNA yang sudah berada di dalam sitoplasma, tidak langsung ditranslasi begitu

saja, namun akan diseleksi mana saja mRNA yang bisa ditranslasi menjadi protein

atau didegradasi menjadi mRNA inaktif oleh ribosom. Setelah proses seleksi,

mRNA yang terpilih akan ditranslasi menjadi protein. Di dalam tubuh, protein ini

10

akan disimpan dan akan diaktivasi sesuai dengan kebutuhan tubuh. [25, 26] (Gambar

2.2)

Gambar 2.2. Proses Pembentukan Protein [25]

Gen ALAD pada manusia terletak di kromosom 9q34. ALAD memiliki

polimorfisme genetik yang memodifikasi perjalanan toksik dari Pb.[27]

Polimorfisme adalah sebuah variasi sekuens DNA yang terjadi di dalam sebuah

populasi dengan frekuensi sebanyak 1% atau lebih. Tingginya kejadian pada

populasi menunjukkan bahwa polimorfisme terjadi secara natural. Polimorfisme

dapat bersifat netral sebagai variasi saja, atau dapat bermakna sebagai alasan

munculnya permasalahan kesehatan di dalam populasi tersebut.[28]

Polimorfisme ALAD muncul dari transversi G menjadi C pada posisi basa

ke 177. Transversi ini menyebabkan munculnya 2 alel yaitu ALAD-1 dan ALAD-

2 serta munculnya 3 fenotip yaitu ALAD-1, ALAD-1/2, dan ALAD-2. Alel ALAD-

2 mengandung substitusi asam amino asparagin menjadi lisin. Enzim ALAD yang

terbentuk dari kedua alel ini memiliki fungsi yang sama, namun memiliki muatan

elektron yang berbeda. Asparagin merupakan asam amino yang bersifat netral,

sedangkan lisin merupakan asam amino yang lebih bermuatan positif. Oleh karena

itu, gen ALAD-1/2 (heterozigot) memproduksi enzim yang lebih tinggi

keelektronegatifannya dibandingkan dengan ALAD-1 (homozigot), selain itu

ALAD-2 (homozigot) memproduksi enzim yang lebih elektronegatif dibandingkan

dengan ALAD-1/2.[29]

11

Subyek yang memiliki genotip ALAD-1/2 dan ALAD-2 memiliki

kerentanan yang lebih tinggi terhadap peningkatan level Pb dalam darah

dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip ALAD-1.[30] Hal ini

dikarenakan Pb akan lebih kuat terikat dengan ALAD yang memiliki muatan

elektronegatif yang tinggi. Ikatan yang kuat menyebabkan Pb lebih lama bertahan

di dalam darah, sehingga efek toksik Pb akan lebih berat. Saat Pb mengikat ALAD

dan menghambat aktivitasnya, subjek yang memiliki genotip ALAD-2 lebih baik

dalam mengkompensasi Pb dibandingkan dengan ALAD-1. Hal ini lebih jelas

terjadi pada populasi dengan paparan Pb yang tinggi dan lama. Ketika Pb mengikat

active site enzim ALAD, maka ALAD akan berespon dengan cara meningkatkan

produksinya. Dengan adanya mekanisme kompensasi tersebut, pada populasi

dengan paparan Pb tinggi dan lama akan ditemukan inhibisi sintesis heme yang

lebih ringan dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip ALAD-1. Dapat

kita lihat bahwa kadar ALAD yang terhambat oleh karena aktivitas toksik Pb

berbanding lurus dengan kadar ALA (aminolevulinic acid) yang tidak di proses di

dalam sitoplasma sel. Sehingga dapat disimpulkan bahwa makin sedikit enzim

ALAD yang tidak aktif, maka makin banyak kadar ALA yang beredar di

sitoplasma. ALA merupakan asam yang bersifat toksik bagi tubuh.[11, 29, 30]

Studi epidemiologi yang dilakukan di Eropa, Asia, dan Amerika

menyatakan bahwa frekuensi genotip ALAD-2 tertinggi terdapat pada ras kaukasia

dengan proporsi ALAD-1/2 hanya 18% dan ALAD-1 hanya mencapai 1% saja dari

total populasi. Sebaliknya, pada populasi ras afrika dan asia sedikit ditemukan

subjek dengan genotip ALAD-2.[11] Pada subjek yang memiliki genotip ALAD-2

dan ALAD-1/2 ditemukan adanya penurunan kadar zink-protoporphirin di dalam

darah akibat afinitasnya yang lebih tinggi terhadap molekul Pb. Selain itu karena

ikatan yang lebih kuat ini menyebabkan Pb lebih banyak disimpan di dalam tulang.

Hal ini diperkuat dengan meningkatnya kadar Pb di dalam matriks tulang

dibandingkan dengan kadar Pb di korteks tulang.[11, 31]

ALAD merupakan enzim yang sangat penting bagi tubuh sehingga apabila

enzim ini tidak berfungsi akan menyebabkan munculnya manifestasi klinis yang

cukup berat bagi tubuh. ALAD merupakan enzim ke-dua dalam jalur pembentukan

heme. Enzim ini mengkatalis kondensasi 2 molekul ALA untuk membentuk 1

12

molekul PBG (phorphobilinogen).[6,10] Fungsi ALAD di dalam proses

pembentukan heme akan dijelaskan pada gambar (Gambar 2.3)

Gambar 2.3. Proses Pembentukan Heme [10]

ALAD merupakan enzim yang terletak di dalam sitoplasma. Enzim ALAD

merupakan enzim tetramer homodimer yang memiliki 8 subunit yang identik

dengan 1 active site di setiap dimernya. Enzim ini mengikat 8 atom zink di setiap

subunitnya. 4 molekul zink berfungsi sebagai katalisator dan 4 molekul zink sisanya

berfungsi sebagai stabilisator struktur tersier enzim ALAD. Setiap active site akan

mengikat 2 molekul ALA di 2 posisi yang berbeda. Satu molekul ALA

berkontribusi sebagai sisi asam asetat dan grup amino-metil dari PBG, sedangkan

satu molekul ALA yang lain berkontribusi sebagai sisi rantai propionat dan nitrogen

pirol (Gambar 2.4). Pb menginhibisi aktivitas enzim ALAD dengan cara mengganti

13

posisi atom zink dari active site enzim ALAD. Sehingga aktivitas enzim ALAD

akan terganggu. Sebagai hasilnya adalah adanya penumpukan ALA di dalam

plasma darah.[10]

Gambar 2.4. Proses Pembentukan PBG (Phorpobilinogen) dari 2 molekul ALA

(Aminolevulinic Acid) yang dikatalis oleh enzim ALAD (delta-Aminolevulinic

Acid Dehydratase) [10]

2.1.3. Efek Terganggunya Enzim ALAD

ALAD merupakan enzim yang sangat penting dalam proses sintesis

hemoglobin. Hemoglobin adalah komponen yang berfungsi sebagai alat

transportasi oksigen dan karbon dioksida. Hb tersusun dari globin (4 rantai protein

yang terdiri atas 2 unit alfa dan 2 unit beta) dan heme (mengandung atom Fe (besi)

dan porfirin yang mengandung pigmen merah darah) (Gambar 2.5). Satu gram

hemoglobin akan mengikat oksigen sebanyak 1,34 ml. Kapasitas pengangkutan

oksigen ini bergantung pada kadar hemoglobin, bukan kadar sel darah merah.

Proses pembentukan heme mayoritas berada di mitokondria dengan berbagai reaksi

kimia yang diawali dengan kondensasi glisin dengan suksinil-koA. Vitamin B6

merupakan koenzim untuk reaksi pembentukan heme ini, vitamin B6 distimulasi

oleh eritropoietin.[32, 33]

Hemoglobin berada di dalam eritrosit. Setiap eritrosit mengandung kurang

lebih 280 juta molekul hemoglobin. Eritrosit hidup hanya sekitar 120 hari karena

ketebalan membran plasma yang makin berkurang akibat adanya kemampuan

14

eritrosit untuk diapedesis atau menembus kapiler pembuluh darah. Eritrosit tidak

memiliki nukleus dan organel sehingga tidak dapat menyintesis komponen yang

dibutuhkan untuk memperbaiki bagian eritrosit yang rusak. Sehingga eritrosit akan

dihancurkan dan dibentuk kembali menjadi eritrosit yang baru.[34] (Gambar 2.6)

Gambar 2.5. Molekul Hemoglobin [34]

Anemia adalah penurunan kadar hemoglobin di bawah batas normal

menurut usia dan jenis kelamin. Penurunan kadar hemoglobin biasanya disertai

dengan turunnya kadar eritrosit dan volume sel namun bisa saja normal pada

beberapa subjek dengan kadar hemoglobin yang dibawah nilai normal. Penurunan

kadar volume plasma (pada kasus dehidrasi) dapat memunculkan anemia palsu,

sebaliknya peningkatan volume plasma (pada penderita splenomegali atau pada

kehamilan) dapat menyebabkan anemia bahkan dengan kadar eritrosit dan massa

hemoglobin yang normal bersirkulasi.[32, 35] Secara umum, jumlah hemoglobin

kurang dari 12 mg/dl menunjukkan anemia. Pada penentuan status anemia, jumlah

total hemoglobin lebih penting daripada jumlah eritrosit. Nilai normal hemoglobin

menurut Kementrian Kesehatan Republik Indonesia tahun 2011 adalah untuk pria :

13 – 18 g/dl; sedangkan pada wanita : 12 – 16 g/dl.[36]

15

Gambar 2.6. Proses Pembentukan dan Degradasi Eritrosit [34]

Selain diklasifikasikan menurut kadar Hb, klasifikasi anemia yang lebih

banyak digunakan adalah dengan mengukur indeks eritrosit. Menurut indeks

eritrosit, anemia diklasifikasikan menjadi 3 jenis yaitu, mikrositik, normositik, dan

makrositik (gambar 2.7). Metode klasifikasi menurut indeks eritrosit juga lebih

memperjelas bagaimana patofisiologi anemia tersebut.[32]

Gambar 2.7. Klasifikasi Anemia Berdasarkan Indeks Eritrosit [32]

16

Dari tabel tersebut dapat kita ketahui bahwa paparan Pb dapat menyebabkan

terjadinya anemia mikrositik hipokromik. Hal ini berhubungan dengan proses

inhibisi aktivitas ALAD oleh Pb. Secara etiologi anemia akibat paparan Pb lebih

sedikit dibandingkan dengan anemia defisiensi besi. Namun gambaran anemia

defisiensi besi sama dengan anemia akibat paparan Pb, yaitu anemia mikrositik

hipokromik. Selain itu thalassemia juga memberikan gambaran yang sama berupa

anemia mikrositik hipokromik (Gambar 2.8).[6, 32, 37] Dengan berbagai etiologi

penyebab anemia mikrositik hipokromik tersebut, dapat kita simpulkan bahwa

penanganan anemia mikrositik hipokromik harus disesuaikan dengan etiologinya.

Contohnya pada kasus anemia mikrositik hipokromik dengan etiologi defisiensi

besi tentunya memerlukan penanganan berupa suplemen besi, namun berbeda

dengan anemia mikrositik hipokromik dengan etiologi keracunan Pb yang tidak

membutuhkan suplemen besi. Apabila penanganan tidak sesuai dengan etiologinya

dapat menimbulkan komplikasi yang cukup berat. Pemberian suplemen besi pada

pasien anemia bukan karena defisiensi besi akan menimbulkan penyakit lain yang

disebut iron overload. [38, 39]

Gambar 2.8. Etiologi Anemia Mikrositik Hipokromik [32]

17

2.1.4. Spektrofotometri UV

Spektrofotometri adalah metode yang bekerja berdasarkan prinsip

kemampuan sebuah molekul untuk menyerap sinar UV. Spektrofotometri dapat

digunakan untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA dan RNA sebelum

dilakukan PCR. Purin dan pirimidin yang terkandung dalam asam nukleat DNA

atau RNA dapat mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang 260 nm.

Absorbsi 1A unit setara dengan konsentrasi DNA sebanyak 50 µg/ml dan setara

dengan konsentrasi RNA sebanyak 40 µg/ml. Sehingga dapat disimpulkan

konsentrasi DNA (µg/ml) adalah hasil perkalian Abs260 (daya serap molekul

terhadap sinar UV dalam satuan A) dikalikan 50.[40]

DNA memiliki kemampuan untuk menyerap sinar UV (Ultra Violet)

dengan baik pada panjang gelombang 260 nm. Pada panjang gelombang 280 nm

kemampuan DNA untuk menyerap sinar UV menurun hingga setengah dari

penyerapan pada panjang gelombang 260 nm (Gambar 2.9). Selain DNA, molekul

protein dan RNA juga dapat terdeteksi saat proses deteksi DNA genom

menggunakan spetrofotometer ini. Protein dapat menyerap sinar UV dengan baik

pada panjang gelombang 230 nm dan 280 nm. Ikatan peptida yang terdapat pada

molekul protein akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 230 nm,

sedangkan asam amino aromatik (triptofan, tirosin, dan fenilalanin) akan menyerap

sinar UV pada panjang gelombang 280 nm (Gambar 2.9).[41]

Gambar 2.9. Perbandingan Kadar DNA dan Protein dengan Panjang Gelombang

Pada Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV [41]

18

RNA memiliki basa nitrogen Urasil yang dapat menyerap sinar UV dengan

baik pada panjang gelombang 259 nm, sedangkan DNA memiliki basa nitrogen

Timin yang dapat menyerap sinar UV dengan baik pada panjang gelombang 265

nm. Karena selisih yang tidak jauh antara panjang gelombang Urasil (256 nm) dan

Timin (265 nm) menyebabkan RNA dan DNA sulit dibedakan menggunakan

spektrofotometri UV. Selain itu perbedaan jumlah basa nitrogen yang terkandung

di dalam RNA dan DNA dapat mempengaruhi panjang gelombang pada

spektrofotometri UV (Gambar 2.10).[42]

Gambar 2.10. Perbandingan Kadar U (Urasil), MU (Metil-Urasil), DMU (Dimetil-

Urasil), FU (Fluoro-Urasil), dan Timin dengan Panjang Gelombang Pada

Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV [42]

Pada penjelasan sebelumnya diketahui bahwa DNA genom akan terdeteksi

dengan baik pada 2 panjang gelombang spektrofotometri yang berbeda yaitu 260

nm dan 280 nm. Sehingga dapat digunakan rasio A260/A280 sebagai indikator

kemurnian DNA. Apabila tidak terdapat kontaminasi protein dalam hasil isolasi

DNA genom, maka nilai target pada rasio A260/280 adalah 1.8, karena pada panjang

gelombang 260 nm konsentrasi DNA terdeteksi lebih banyak ±1,8 kali

dibandingkan pada panjang gelombang 280 nm. Selain itu, karena pada panjang

gelombang 280 nm terdapat peningkatan absorbsi UV oleh protein, maka deteksi

adanya kontaminasi protein dapat diketahui melalui peningkatan pembacaan A280

namun sedikit berefek pada pembacaan A260, sehingga rasio A260/280 akan terbaca

19

lebih rendah dari 1,8. Apabila pembacaan kadar kemurnian DNA pada rasio A260/280

lebih tinggi dari 2, terdapat kemungkinan sudah terjadi degradasi DNA.[40, 41]

Selain itu, diketahui protein juga mengabsorbsi sinar UV dengan baik pada

panjang gelombang 230 nm. Sehingga dapat disimpulkan bahwa rasio A260/230 dapat

digunakan sebagai indikator adanya kontaminasi protein. Namun terdapat beberapa

perancu yang memengaruhi hasil pemeriksaan pada rasio A260/230, karena ada

molekul lain seperti Tris Buffer yang juga mengabsorbsi sinar UV pada panjang

gelombang 230 nm. Sehingga rasio A260/230 jarang digunakan untuk mendeteksi

kontaminasi protein. Faktor lain yang dapat memengaruhi perhitungan kadar

kemurnian DNA dengan spektrofotometri ini adalah fenol yang dapat

mengabsorbsi sinar UV secara maksimal pada panjang gelombang 270 nm.

Sehingga dapat memengaruhi hasil perhitungan kadar kemurnian DNA pada rasio

A260/280.[41]

2.1.5. Aplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction

(ARMS-PCR)

PCR merupakan teknik yang digunakan dalam bidang biomolekular untuk

mengamplifikasi satu atau beberapa salinan dari 1 potong sekuens DNA. Saat ini

PCR merupakan teknik umum dan sangat dibutuhkan untuk berbagai penerapan

penelitian medis dan biomolekular. Terdapat 3 langkah utama yang terkandung

dalam teknik PCR yaitu denaturation, annealing, dan extension.[43] Terdapat

berbagai macam metode PCR yang sering digunakan yaitu Amplification

Refractory Mutation System (ARMS), Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP), dan sekuensing. Apabila dilihat dari segi biaya ARMS merupakan metode

yang membutuhkan biaya lebih murah dibandingkan dengan RFLP dan sekuensing.

Selain biaya yang murah ARMS membutuhkan waktu yang lebih singkat jika

dibandingkan dengan RFLP dan sekuensing. ARMS dan RFLP merupakan metode

yang memiliki sensitifitas tinggi dan banyak digunakan. Namun RFLP memiliki

kekurangan yaitu dapat terjadi misdiagnosis karena enzim restriksi yang tidak

sempurna memotong produk PCR, selain itu RFLP membutuhkan jumlah sampel

DNA yang lebih banyak. [44, 45, 46, 47]

20

ARMS adalah metode PCR yang menggunakan primer alel spesifik. Metode

ini menggunakan sebuah primer oligonukleotida yang memiliki terminal-3’. Primer

ini akan menjadi pelengkap atau pasangan untuk sekuens DNA spesifik yang terjadi

mutasi atau polimorfisme dan ditambahkan dengan primer common (primer umum)

yang digunakan dalam satu reaksi PCR.[48] ARMS PCR membutuhkan 2 macam

primer yaitu primer common dan primer ARMS. Primer common didesain seperti

primer PCR lainnya. Namun primer ARMS memiliki syarat tertentu yaitu :

1. Primer ARMS merupakan oligonukleotida yang memiliki panjang 30

basa.

2. Untuk primer mutant (M), terminal-3’ dari primer ARMS harus dapat

berpasangan dengan point mutasi, untuk primer normal (N) terminal-3’

harus berpasangan dengan sekuens normal. (Gambar 2.11)

Gambar 2.11. Desain Primer pada ARMS PCR [49]

3. Penambahan desain mismatch dapat dilakukan pada basa ke-dua

sebelum terakhir (penultimate) pada primer ARMS untuk menaikkan

spesifitas reaksi ARMS. Karena mismatch yang berbeda ditemukan

dapat memiliki efek kestabilan yang berbeda. Hal ini dibutuhkan untuk

menjaga ikatan pada terminal-3’. Apabila ikatan pada terminal-3’ kuat,

maka dibutuhkan mismatch pada basa penultimate yang ikatannya lebih

lemah, demikian pula sebaliknya. (Gambar 2.12)

21

Gambar 2.12. Tabel Pasangan Basa pada Desain Primer ARMS [49]

4. Sisa dari primer ARMS yang tidak spesifik harus berpasangan dengan

sekuens target.

5. Desain primer common harus memiliki panjang 30 basa; memiliki

kurang lebih 50% pasangan basa G-C; tidak memiliki pasangan

terminal-3’ yang sama dengan primer ARMS; dan tidak memiliki

sekuens yang berulang; karena fungsinya sebagai primer kontrol maka

harus dapat menghasilkan produk PCR 150 – 250 bp.[49, 50]

Sensitifitas dan spesifitas pada teknik ARMS PCR dipengaruhi oleh

beberapa kondisi yaitu, desain primer yang bagus; temperatur annealing yang

tinggi; dan jumlah siklus yang cukup penting untuk mengurangi hasil positif palsu.

Jumlah siklus yang terlalu banyak dapat memunculkan hasil positif palsu.[51]

Saat ini bayak penelitian yang menggunakan teknik ARMS PCR. Hal ini

menunjukkan bahwa teknik ARMS PCR cocok untuk semua jenis mutasi, selain itu

teknik ARMS PCR ini relevan untuk penelitian dengan jumlah sampel yang banyak

dan untuk mendeteksi 1 atau lebih titik mutasi. ARMS PCR dapat secara spesifik

mengamplifikasi sekuens mutan yang jarang di dalam sebuah populasi. Sehingga

teknik ARMS PCR ini cocok digunakan untuk skrining titik spesifik DNA yang

mengalami mutasi atau polimorfisme.[44]

22

Proses identifikasi polimorfisme genetik ALAD dengan menggunakan metode

ARMS-PCR dan elektroforesis dapat secara ringkas ditunjukkan pada gambar 2.13.

Gambar 2.13. Tahap identifikasi polimorfisme genetik ALAD dengan ARMS-

PCR dan elektroforesis [53]

23

2.2. Kerangka Teori

Pencemaran

lingkungan oleh Pb

Pb masuk ke dalam

tubuh

Pb diabsorbsi dan

beredar ke dalam

darah

Pb mensubtitusi Zn

pada active site

ALAD

ALAD-1/2 (GC) ALAD-1 (GG) ALAD-2 (CC)

Elektronegatif

rendah

Elektronegatif

sedang

Elektronegatif

tinggi

Afinitas ALAD-2

untuk mengikat Pb

lebih kuat (Pb

bermuatan postitif)

Pb menimbulkan

stress oksidatif

Enzim ALAD tidak

bekerja

Pembentukan heme

terhambat

Hemoglobin tidak

terbentuk

Anemia mikrositik

hipokromik

Kerusakan selular

Akumulasi ALA di

dalam darah dan

urin

Neurotoksik

Hepatotoksik

Nefrotoksik

24

2.3. Kerangka Konsep

2.4. Definisi Operasional

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah – istilah yang

didefinisikan sebagai berikut.

Tabel 2.1. Definisi Operasional

No. Variabel Definisi Cara Ukur Skala

1 Gen ALAD

(ALAD-1,

ALAD-1/2,

dan ALAD-2)

ALAD merupakan

enzim ke-dua dalam

jalur pembentukan

heme. Enzim ini

mengkatalis kondensasi

2 molekul ALA untuk

membentuk 1 molekul

PBG

(phorphobilinogen)

Teridentifikasi

adanya pita

DNA melalui

elektroforesis

Nominal

Mahasiswa PSKPD

UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

Angkatan 2012 - 2014

Identifikasi

Polimorfisme Genetik

ALAD

ALAD-1/2 ALAD-2 ALAD-1

Kadar Hemoglobin

25

No. Variabel Definisi Cara Ukur Skala

2 Kadar

Hemoglobin

Kadar metaloprotein

(protein yang

mengandung zat besi)

di dalam sel darah

merah yang berfungsi

sebagai pengangkut

oksigen dari paru ke

seluruh tubuh.

Dinyatakan dalam

satuan g/dl.

Strip dan Alat

cek kadar Hb

(Easy Touch®

GCHb meter)

Ordinal

26

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode deskriptif analitik dengan desain cross

sectional.

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Agustus 2015 hingga Maret 2016.

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Sel, Biokimia, dan Biologi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, serta

Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Negeri Jakarta.

3.3. Sampel Penelitian

Sampel pada penelitian ini adalah responden laki – laki dan perempuan

mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta angkatan 2012 – 2014.

3.4. Besar Sampel

Besar sampel pada penelitian ini ditentukan menggunakan rumus besar

sampel deskriptif analitik sebagai berikut,

N = Zα2 x P x Q

d2

N = (1,96)2 x 0,5 x 0,5

(0,1)2

N = 96,04 → 97

Keterangan :

N = besar sampel

Zα = deviasi baku alfa

P = proporsi kategori variabel yang diteliti

Q = (1 – P)

d = presisi

27

Pada penelitian ini peneliti menetapkan alfa sebesar 5% sehingga nilai Zα =

1,96, dengan kesalahan prediksi yang masih bisa diterima (presisi, d) ditetapkan

sebesar 10%. Untuk nilai P, ditetapkan oleh peneliti sebesar 50% karena belum ada

nilai dari kepustakaan sebelumnya. Nilai P = 50% dipilih karena perkalian antara P

dan Q akan menunjukkan hasil yang maksimal apabila nilai P = 50%. Apabila

prediksi peneliti benar, maka peneliti akan memperoleh prevalensi sebesar 50% ±

10% = 40% - 60%. Apabila dihitung nilai N x P, akan didapatkan minimal 40% x

97 = 38,8 dan maksimal 60% x 97 = 58,2. Nilai keduanya > dari 5. Dengan

demikian, besar sampel 97 boleh digunakan karena memenuhi syarat N x P > 5 dan

N x (1 – P) > 5 dalam penelitian deskriptif analitik.[52]

3.5. Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah Simple Random

Sampling.

3.6. Kriteria Pemilihan Sampel

3.6.1. Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah Mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan 2012 – 2014.

3.6.2. Kriteria Eksklusi

Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah Mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan 2012 – 2014 yang memiliki riwayat

infeksi kronik sebelumnya.

3.7. Cara Kerja

3.7.1. Perizinan Subjek Penelitian

Subjek penelitian diberikan informasi terkait manfaat penelitian dan efek

yang diakibatkan oleh penelitian ini. Informasi diberikan secara tertulis serta

penjelasan secara lisan oleh peneliti. Subjek penelitian juga diberikan lembar

persetujuan tertulis yang menyatakan bahwa subjek tersebut bersedia mengikuti

penelitian ini.

28

3.8. Alur Penelitian

Mahasiswa PSKPD UIN

Syarif Hidayatullah

Jakarta Angkatan 2012 -

2014

Sampel Darah

Isolasi Genom

DNA Genom

ARMS-PCR

Elektroforesis

Interpretasi :

ALAD-1, ALAD-1/2,

ALAD-2

Pemeriksaan kadar Hb

Hubungan Polimorfisme

Genetik ALAD dengan

kejadian anemia

29

3.9. Prosedur Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat di dalam tabel

berikut.

Tabel 3.1. Alat dan bahan penelitian

Alat Bahan Keterangan

Pengambilan sampel (darah)

Spuit 3cc

Torniquet

EDTA tube

Handscoen

Alcohol swab

Pengukuran kadar hemoglobin

Easy Touch® CGHb meter Blood Hemoglobin

Test Strips

Alcohol swab

Isolasi genom DNA dari darah

Microsentrifuge tube 1,5 ml

steril

Whole blood 300 µl

900 µl dan

100 µl

200 µl

Water bath AS ONE TRW-42

TP, 60oC

RBC Lysis Buffer

GB Buffer

GD column Ethanol Absolute 200 µl

2ml Collection tube W1 Buffer 400 µl

Microcentrifuge Eppendorf

5417 R

Wash Buffer

Elution Buffer

Vortex DAAD

Micropipet Nichipet EX

Nichiryo ukuran 2 – 20 µl dan

20 – 200 µl

Micropipet BIORAD ukuran

100 – 1000 µl

30

Bahan

Lanjutan Tabel 3.1

Keterangan Alat

Microtip Biologix ukuran 10

µl, 200 µl, dan 1000 µl

Biomedical freezer SANYO

Aluminium foil

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA

Maestro nano drops Genom DNA 1 µl

Aquadest

Micropipet

Tip

Elektroforesis genom DNA

Elektroforesis ATTO My

Power II 300 AE-8135

Agarose

Ethidium bromide

TAE Buffer 1x

100 bp DNA

Ladder (size

marker)

Wrap plastic

1,5 gram

1 µl

100 ml

5 µl

Microwave SHARP Low

Wattage

Timbangan analitik

Adventure™

Gel doc system

Printgraph ATTO AE-6905

CF CCD camera controller

Penggaris sumur

Gelas kimia

Gelas ukur sibata

Botol reaksi

ARMS PCR

PCR Applied Biosystems 2720

Thermal Cycler

KAPA 2G Fast

ReadyMix 2x

12,5 µl

Primer Forward

(1 pmol)

2 µl

Primer Reverse

(1 pmol)

2 µl

31

Alat

Bahan

Lanjutan Tabel 3.1

Keterangan

Primer Common

(1 pmol)

2 µl

Primer Mutant

(1 pmol)

2 µl

Primer Normal

(1 pmol)

2 µl

DNA Template

(100 ng/µl)

3 µl

ddH2O 5,5 µl

3.10. Cara Kerja Penelitian

3.10.1. Pengumpulan Data

Penelitian ini menggunakan data primer dari responden yang telah mengisi

lembar informed consent. Data responden diperoleh dengan cara tes kadar Hb

menggunakan alat Easy Touch® CGHb meter dan pungsi vena sebanyak 3cc darah.

Kemudian darah yang diambil melalui pungsi vena diletakkan ke dalam tabung

EDTA dan diberi label, selanjutnya disimpan di Biomedical freezer dengan suhu

40C.

3.10.2. Desain Primer

Primer yang kami gunakan merupakan modifikasi dari studi yang dilakukan

oleh Yamashiro[53,59]. Primer yang digunakan ditampilkan dalam tabel berikut.

Tabel 3.2. Primer yang digunakan pada proses PCR

Jenis Primer Susunan Sekuens

Primer ALAD Forward (F) 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’

Primer ALAD Reverse (R) 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’

Primer ALAD Common (C) 5’-TTCTGTCCTGGGGGCTTGAG-3’

Primer ALAD Normal (N) 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGC-3’

Primer ALAD Mutant (M) 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGG-3’

32

3.10.3. Isolasi DNA

Langkah selanjutnya adalah mengisolasi DNA untuk mendapatkan genom

DNA dari sampel darah responden. Isolasi DNA pada penelitian ini menggunakan

Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid GB100 dengan langkah

kerja yang akan kami jelaskan dalam tabel 3.3.

Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya menggunakan

Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 µl, lalu diletakkan di lensa nano,

kemudian ditutup dan dianalisa. Hasil kemurnian dan konsentrasi akan langsung

terbaca di layar dan tersimpan.

Tabel 3.3. Tahapan isolasi genom DNA[54]

Persiapan Sampel 1. Menyiapkan Microsentrifuge tube dan diberi label

sesuai dengan kode sampel

2. Memasukkan darah sampel sebanyak 300 µl ke

dalam Microsentrifuge tube ukuran 1,5 ml

3. Menambahkan 900 µl RBC Lysis buffer kemudian

mengocok Microsentrifuge tube

4. Menyentrifugasi Microsentrifuge tube selama 5

menit dengan kecepatan 3000 rpm

5. Membuang supernatan

6. Menambahkan 100 µl RBC Lysis buffer untuk

mensuspensi endapan leukosit kemudian

mengocok Microsentrifuge tube

Langkah 1

Cell Lysis

7. Menambahkan 200 µl GB buffer ke dalam

Microsentrifuge tube

8. Menginkubasi tabung selama 10 menit pada suhu

600C untuk memastikan bahwa sel telah lisis

9. Menyiapkan tabung berisi Elution buffer sebanyak

50 µl dan inkubasi pada suhu 600C, Elution buffer

akan digunakan pada proses selanjutnya.

10. Mendinginkan Micosentrifuge tube sampel pada

suhu ruangan

33

Lanjutan Tabel 3.3

Langkah 2

DNA Binding

11. Menambahkan 200 µl Ethanol absolute ke dalam

Microsentrifuge tube kemudian mengocok tabung

selama 10 detik

12. Menyiapkan GD column pada 2 ml Collection tube

13. Memindahkan campuran Microsentrifuge tube ke

dalam GD column

14. Menyentrifugasi GD column selama 5 menit pada

kecepatan 14.000 – 16.000 rpm

15. Membuang cairan yang tidak tersaring pada

Collection tube

16. Menempatkan kembali GD column ke Collection

tube

Langkah 3

Wash

17. Menambahkan 400 µl W1 buffer ke dalam GD

column kemudian menyentrifugasi selama 1 menit

pada kecepatan 14.000 – 16.000 rpm


Collection tube


tube

20. Menambahkan 600 µl Wash buffer ke dalam GD

column


kecepatan 14.000 – 16.000 rpm


Collection tube


tube


kecepatan 3.000 rpm untuk mengeringkan matriks

column

34

Lanjutan Tabel 3.3

Langkah 4

DNA elution

25. Memindahkan GD column yang sudah kering ke

dalam Microsentrifuge tube yang steril

26. Menambahkan 50 µl Elution buffer yang telah

diinkubasi ke dalam GD column dan dibiarkan

selama 3 menit

27. Menyentrifugasi Microsentrifuge tube selama 1

menit pada kecepatan 14.000 – 16.000 rpm untuk

mendapatkan hasil.

3.10.4. Amplifikasi Genom dengan ARMS-PCR

Setelah dilakukan isolasi genom DNA, tahap selanjutnya adalah

mengamplifikasi genom DNA. Peneliti menggunakan metode ARMS-PCR yang

terdiri atas 2 tahapan PCR. PCR tahap 1 bertujuan untuk mengamplifikasi fragmen

gen ALAD, menggunakan komposisi primer forward dan reverse (Tabel 3.4)

sedangkan PCR tahap 2 bertujuan untuk identifikasi polimorfisme gen ALAD,

menggunakan primer normal dan mutant (Tabel 3.5).

Tabel 3.4. Komposisi MixPCR pada PCR Tahap 1 [53]

Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan

KAPA 2G Fast ReadyMix 2X 12,5 µl (1x)

Primer forward (1 pmol) 2 µl

Primer reverse (1 pmol) 2 µl

DNA template (100 ng/ µl) 3 µl

ddH2O 55,5 µl

Total volume reaksi 25 µl

Pada PCR tahap 1 berlangsung selama 40 siklus diawali dari fase

predenaturasi pada suhu 940C selama 3 menit, kemudian dilanjutkan pada fase

denaturasi pada suhu 940C selama 30 detik. Tahap berlanjut pada fase penempelan

primer (annealing) pada suhu 600C selama 30 detik. Tahap berikutnya adalah fase

pemanjangan (extension) pada suhu 720C selama 30 detik. Tahap terakhir adalah

35

fase pemanjangan akhir pada suhu 720C selama 1 menit. Produk amplifikasi adalah

306 bp.

Tabel. 3.5. Komposisi MixPCR pada PCR Tahap 2[53]

Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan

KAPA 2G Fast ReadyMix 2X 12,5 µl (1x)

Primer common (1 pmol) 2 µl

Primer normal/mutant (1 pmol) 2 µl

DNA template (100 ng/ µl) 3 µl

ddH2O 55,5 µl

Total volume reaksi 25 µl

PCR tahap 2 menggunakan primer common dan normal untuk

mengidentifikasi sampel normal (GG). Primer common dan mutant untuk

mengidentifikasi sampel mutan (CC). Pada PCR tahap 2 ini 1 sampel DNA dibagi

menjadi 2 bagian yang akan diberikan primer normal dan primer mutant, sehingga

setiap 1 sampel DNA akan memiliki 2 hasil yang dapat dilihat. Untuk

menginterpretasikan hasil PCR tahap 2 dilakukan elektroforesis yang akan

dijelaskan di pembahasan selanjutnya. Sampel DNA yang digunakan merupakan

produk dari PCR tahap 1.

PCR tahap 2 berlangsung selama 32 siklus diawali dengan fase

predenaturasi pada suhu 940C selama 3 menit, dan fase denaturasi pada suhu 940C

selama 30 detik. Selanjutnya memasuki fase annealing pada suhu 600C selama 15

detik. Tahap berikutnya adalah pase extension pada suhu 720C selama 10 detik.

Tahap terakhir adalah fase pemanjangan akhir pada suhu 720C selama 1 menit.

Program PCR ini sudah melalui hasil optimalisasi.

3.10.5. Elektroforesis dan Gel Docummentation System

Setelah dilakukan PCR dengan metode ARMS-PCR, produk PCR

dikategorikan menjadi bentuk normal (Homozigot GG/ ALAD-1), carier

(Heterozigot GC/ ALAD-1/2), dan mutant (Homozigot CC/ ALAD-2)

36

menggunakan elektroforesis. Tahapan elektroforesis akan dijelaskan dalam tabel

3.6.

Tabel 3.6. Tahapan Elektroforesis

Pembuatan Gel

Elektroforesis

1. Mengambil agarose sebanyak 1,5 gram yang

ditimbang menggunakan timbangan analitik

2. Mencampur agarose dengan 100 ml TAE di dalam

botol reaksi untuk mendapatkan gel dengan

konsentrasi 1,5% (konsentrasi 1,5% cocok

digunakan untuk DNA yang memiliki ukuran 300 –

3.000 bp)

3. Memanaskan campuran gel elektroforesis dengan

Microwave low wattage selama 3 menit

Persiapan Tray 4. Menyiapkan tray gel elektroforesis dan

menyediakan cetakan sumur. Karena sampel yang

banyak, peneliti menggunakan cetakan sumur

dengan lubang sebanyak 17 buah agar lebih efektif

5. Menuangkan 1 µl Ethidium bromide ke atas tray

dengan zigzag secara merata menggunakan

micropipet

Pembuatan

Cetakan Gel

Elektroforesis

6. Menuangkan cairan gel elektroforesis ke dalam tray

hingga batas maksimum tray dan memastikan tidak

ada gelembung udara

7. Meratakan Ethidium bromide yang telah dituangkan

sebelumnya menggunakan micropipet

8. Meletakkan cetakan sumur ke dalam tray dan

menunggu selama 20 menit hingga gel

elektroforesis mengeras

37

Lanjutan Tabel 3.6

Memulai

Elektroforesis

9. Setelah gel elektroforesis mengeras, cetakan sumur

diangkat kemudian meletakkan gel elektroforesis ke

dalam kotak elektroforesis yang telah terisi buffer

dengan arah elektroda negatif menuju positif

10. Memasukkan 7 µl produk PCR ke dalam sumur

(Pada sampel ALAD ini tidak menggunakan

Loading dye karena sudah memiliki warna hijau

sebagai penanda)

11. Memasukkan 3 µl DNA ladder 100 bp sebagai

marker

12. Menyalakan mesin elektroforeisis selama 30 menit

dengan tegangan 100 Volt

Gel documment

system

13. Memindahkan gel elektroforesis yang telah

dielektroforesis ke dalam wadah bersih

14. Memindahkan ke dalam Transilluminator untuk

melihat hasil elektroforesis di bawah sinar UV

15. Menginterpretasikan hasil. Gen ALAD akan terlihat

di sepanjang 168 bp

3.11. Analisis Data

Data yang telah diperoleh berupa gen ALAD, usia, jenis kelamin, dan kadar

hemoglobin dianalisis menggunakan software IBM SPSS Statistics 22. Data yang

didapatkan dianalisis menggunakan uji Chi-Square untuk mengetahui frekuensi

polimorfisme genetik ALAD pada mahasiswa PSPD serta hubungannya dengan

kejadian anemia. Data yang didapat disajikan dalam bentuk tabel dan diagram.

3.12. Etika Penelitian

Penelitian ini mendapatkan ethical clearance (lampiran 2) dari Tim Kaji Etik

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi DNA Genom

Jumlah responden yang sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi dalam

penelitian ini adalah sebanyak 102 orang. Hasil isolasi DNA Genom dilihat secara

kuantitatif menggunakan spektrofotometer nano drop (Lampiran 6) dan secara

kualitatif menggunakan elektroforesis (Lampiran 5) untuk melihat kemurnian dan

konsentrasi DNA genom. Hasil kemurnian DNA dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 4.1. Data kemurnian DNA genom mahasiswa program studi kedokteran dan

profesi dokter UIN Syarif Hidayatulah Jakarta angkatan 2012 – 2014

Kategori kemurnian DNA

genom (A260/280)

Frekuensi Persentase (%)

<1,8 48 47,1

1,8 – 2,0 45 44,1

>2,0 9 8,8

Total 102 100

Pada tabel 4.1 terlihat kemurnian DNA dari sampel yang diperiksa dengan

spektrofotometer nano drop. Pada tabel diketahui bahwa dari 102 sampel; 45 orang

sampel memiliki kategori kemurnian 1,8 – 2,0 pada rasio panjang gelombang

A260/280; 9 orang memiliki kemurnian lebih dari 2,0; dan 48 orang memiliki

kemurnian kurang dari 1,8. Nilai kemurnian lebih dari 2,0 dapat disebabkan karena

adanya degradasi DNA, selain itu nilai kemurnian kurang dari 1,8 dapat disebabkan

karena adanya kontaminasi protein, fenol, serta konsentrasi asam nukleat yang

rendah (< 10 ng/µl). Secara keseluruhan, nilai kemurnian terendah adalah 1,102

dan nilai kemurnian tertinggi adalah 2,331 pada rasio panjang gelombang A260/A280

(Lampiran 6).

39

Deteksi selanjutnya dilakukan secara kualitatif menggunakan

elektroforesis. Pada gambar 4.3 terdapat 17 contoh sampel DNA genom hasil

isolasi (nomor sampel 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82,

83) dari total 102 sampel yang diisolasi. Pita yang terlihat pada visualisasi 17

sampel tersebut menunjukkan keberhasilan isolasi DNA genom. Pada penelitian ini

102 sampel yang diisolasi terlihat pita dengan visualisasi Gel docummentation

system. Pada gambar 4.1 pita terlihat tebal dan tidak terdapat smear.

Gambar 4.1. Deteksi kualitatif DNA Genom dengan Elektroforesis

4.2. Identifikasi Genetik ALAD Menggunakan ARMS-PCR

Pada penelitian ini identifikasi polimorfisme genetik ALAD menggunakan

metode 2 tahap ARMS-PCR, yaitu tahap 1 untuk mengamplifikasi genetik ALAD

dan tahap 2 untuk mengidentifikasi polimorfisme genetik ALAD (Gambar 4.2).

Hasil PCR Tahap 1 ditunjukkan pada Gambar 4.2. Pada hasil visualisasi tersebut

ditemukan pita sepanjang 306 bp. Dari 102 sampel yang dilakukan PCR Tahap 1

seluruhnya ditemukan pita sepanjang 306 bp.

Gambar 4.2. Hasil PCR Tahap 1. Terlihat Pita pada 306 bp.

(M adalah marker; Huruf A – K adalah label sampel)

1000 bp

800 bp

500 bp

300 bp

100 bp

306 bp

A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, M

78

62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83

40

Selanjutnya dilakukan PCR tahap 2 bertujuan untuk mengidentifikasi

polimorfisme genetik ALAD. Hasil PCR Tahap 2 disajikan pada Gambar 4.3.

Gambar 4.3. Hasil PCR Tahap 2. Terlihat Pita pada 168 bp

Dari gambar 4.3.didapatkan pita dengan ukuran 168 bp. Apabila pita

muncul pada lajur yang mengandung primer C (mutant) dan tidak muncul pada lajur

yang mengandung primer G (normal) maka dapat diambil kesimpulan bahwa

sampel memiliki genetik ALAD-2. Sebaliknya apabila tidak ditemukan pita pada

lajur yang mengandung primer C (mutant) dan muncul pada lajur yang

mengandung primer G (normal) maka dapat diambil kesimpulan bahwa sampel

memiliki genetik ALAD-1. Apabila pita muncul di kedua lajur yang mengandung

primer C dan G, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa sampel memiliki genetik

ALAD-1/2 (heterozygot). [53]

Pada gambar 4.3 terlihat bahwa pada sampel nomor 28, kedua lajur tidak

ditemukan adanya pita, ini menunjukkan bahwa proses elektroforesis tidak berjalan

dengan baik. Hal ini dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti konsetrasi DNA

yang kurang, dan konsentrasi primer PCR Tahap 2 yang kurang. Untuk mengatasi

hal ini, peneliti mengulang kembali proses PCR Tahap 2 dengan memodifikasi

konsentrasi DNA dan primer PCR Tahap 2. Selanjutnya sampel nomor 28 yang

telah dilakukan proses koreksi ditemukan pita di sepanjang 168 bp. Pada contoh

visualisasi hasil elektroforesis pada gambar 4.3 terlihat smear dengan tipe high

mollecular weight sehingga smear terlihat di bagian atas pita. Hal ini bisa

disebabkan oleh konsentrasi DNA yang terlalu banyak, sehingga migrasi DNA

dalam gel agarose terhambat. [55]

28, 29, 30, 31, 32 M

41

Pada penelitian ini didapatkan adanya smear dengan tipe high mollecular

weight, pada hasil elektroforesis dapat pula ditemukan smear dengan tipe low

mollecular weight yang dapat muncul akibat adanya sisa pemanjangan oleh primer

PCR. Sisa pemanjangan primer ini memiliki berat molekul yang lebih ringan

sehingga dapat terus bermigrasi hingga sepanjang 100 bp. Sisa pemanjangan primer

bisa terjadi akibat adanya sisa primer yang tidak dapat dengan sendirinya berhenti

memanjangkan templatenya, atau karena adanya pemanjangan dengan primer yang

lainnya di dalam sebuah reaksi PCR. Sisa pemanjangan primer yang menumpuk

dan membuat sebuah pita kecil di sepanjang 100 bp disebut dengan primer

dimer.[55,56] Selain itu smear dengan tipe low mollecular weight dapat disebabkan

karena DNA terdegradasi oleh enzim nuklease, adanya kontaminasi RNA (RNA

dapat bermigrasi lebih cepat dibandingkan dengan DNA), dan kondisi

elektroforesis yang tidak tepat sehingga dapat merusak struktur DNA. Gambar 4.3

juga menunjukkan adanya pita DNA hasil elektroforesis yang tervisualisasi tidak

terlalu tebal dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu kurangnya konsentrasi

DNA yang dimasukkan ke dalam gel elektroforesis, kurangnya pewarnaan pada

DNA, adanya DNA yang keluar saat elektroforesis, dan DNA yang berdifusi di

dalam gel elektroforesis. [55. 57]

Selanjutnya identifikasi polimorfisme genetik ALAD pada Mahasiswa

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

angkatan 2012 – 2014 disajikan dalam tabel 4.2.

Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD Pada Mahasiswa

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Angkatan 2012 – 2014.

Genotip Frekuensi Persentase (%)

ALAD-1 22 21,6

ALAD-1/2 71 69,6

ALAD-2 9 8,8

Total 102 100

42

Dari tabel tersebut diketahui bahwa sampel yang memiliki genetik ALAD-

1 sebesar 21,6 %, genetik ALAD-1/2 sebesar 69,6 %, dan ALAD-2 sebesar 8,8 %.

Hasil ini sesuai dengan studi epidemiologi yang telah dilakukan sebelumnya yang

menyatakan bahwa secara umum, ras kaukasia memiliki frekuensi genotip ALAD-

2 tertinggi dengan proporsi ALAD-1/2 hanya 18% dan ALAD-1 hanya mencapai

1% saja dari total populasi ras kaukasia. Sebaliknya, pada populasi ras afrika dan

asia sedikit ditemukan subjek dengan genotip ALAD-2.[11]

4.3. Karakteristik Sampel

4.3.1. Karakteristik Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin

Sampel penelitian ini berjumlah 102 orang yang terdiri atas 37 orang laki –

laki dan 65 orang perempuan.

Tabel 4.3. Deskripsi Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin

Jenis Kelamin Frekuensi Persentase (%)

Laki – Laki 37 36,3

Perempuan 65 63,7

Total 102 100

Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa perempuan memiliki proporsi

lebih banyak dibandingkan dengan laki – laki. Dengan persentase perempuan 63,7

% dan laki – laki 36,3 %.

4.3.2. Karakteristik Sampel Berdasarkan Usia

Sampel pada penelitian ini diikuti oleh mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dari 3 angkatan

yang berbeda yaitu angkatan 2012, 2013, dan 2014. Usia sampel paling rendah

adalah 18 tahun berjumlah 27 orang, dan paling tinggi 23 tahun berjumlah 3 orang.

43

Tabel 4.4. Deskripsi Sampel Berdasarkan Usia

Usia (Tahun) Frekuensi Persentase (%)

18 27 26,5

19 23 22,5

20 33 32,4

21 16 15,7

23 3 2,9

Total 102 100

Dari data tersebut diketahui bahwa sampel didominasi oleh usia 20 tahun

sebanyak 33 orang. Selain itu dari 102 sampel tidak terdapat sampel dengan usia

22 tahun.

4.3.3. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin

Pada penelitian ini selain dilakukan pengambilan darah vena, dilakukan

juga pemeriksaan kadar Hb responden melalui darah perifer. Kemudian peneliti

mengelompokkan kadar Hb menjadi Anemia dan Normal sesuai dengan kriteria

Kementrian Kesehatan Republik Indonesia yaitu untuk Laki – Laki dikelompokkan

sebagai Anemia apabila Hb kurang dari 13 g/dl, dan Perempuan dikelompokkan

sebagai Anemia apabila Hb kurang dari 12 g/dl.[36]

Tabel 4.5. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin

Kriteria Hb Frekuensi Persentase (%)

Normal 41 40,2

Anemia 61 59,8

Total 102 100

44

Dari tabel 4.5 dapat diketahui bahwa dari 102 sampel terdapat 41 orang

(40,2 %) yang memiliki Hb normal, dan terdapat 61 orang (59,8%) yang mengalami

anemia menurut kriteria Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.

4.3.4. Hubungan Polimorfisme ALAD dengan Jenis Kelamin

Polimorfisme yang didapatkan dapat dihubungkan dengan jenis kelamin,

hasil ditampilkan dalam gambar 4.4.berikut

Gambar 4.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin

Pada Gambar 4.4 dapat diketahui bahwa pada sampel laki – laki terdapat 10

orang yang memiliki genotip ALAD-1, 25 orang memiliki genotip ALAD-1/2, dan

2 orang memiliki genotip ALAD-2. Sedangkan pada sampel perempuan terdapat

12 orang yang memiliki genotip ALAD-1, 46 orang memiliki genotip ALAD-1/2,

dan 7 orang memiliki genotip ALAD-2.

Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa pada jenis kelamin laki – laki

dan perempuan ALAD-1/2 memiliki proporsi paling banyak.

1012

25

46

2

7

0

10

20

30

40

50

60

Laki - Laki Perempuan

Mah

asis

wa

(Ora

ng)

Polimorfisme ALAD

ALAD-1 ALAD-1/2 ALAD-2

45

4.3.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia

Gambar 4.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia

Pada Gambar 4.5 dapat diketahui bahwa pada genotip ALAD-1 terdapat 9

orang yang masuk dalam kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 13 orang yang

masuk dalam kriteria anemia. Kemudian pada genotip ALAD-1/2 terdapat 29 orang

yang masuk dalam kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 42 orang yang masuk

dalam kriteria anemia. Selanjutnya pada genotip ALAD-2, terdapat 3 orang yang

memiliki kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 6 orang yang masuk dalam kriteria

anemia.

Telah diketahui sebelumnya bahwa ALAD adalah enzim yang berperan

penting terhadap proses pembentukan heme, sehingga mengidentifikasi adanya

hubungan polimorfisme genetik ALAD dengan kadar Hb penting untuk menunjang

diagnosis pasien. Dari hasil uji Chi-Square didapatkan nilai harapan (expected

count) < 5 adalah 16,7 % (di bawah 20 %), sehingga nilai signifikansi dari Pearson

Chi-Square dapat digunakan. Nilai signifikansi yang didapat adalah 0,908 (p value

> 0,05).[58] Sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat hubungan yang

9

13

29

42

36

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Normal Anemia

Mah

asis

wa

(Ora

ng)

Polimorfisme ALAD

ALAD-1 ALAD-1/2 ALAD-2

46

signifikan antara polimorfisme genetik ALAD dengan kejadian anemia (Lampiran

10).

Tidak adanya hubungan yang bermakna antara data polimorfisme genetik

ALAD dengan kejadian anemia ini dapat mengindikasikan adanya mekanisme

adaptasi dari tubuh terhadap perubahan lingkungan terutama yang diakibatkan oleh

Pb. Individu dengan genotip ALAD-2 memiliki kemampuan mengikat Pb lebih

kuat sehingga Pb tetap terikat pada siklus aktif enzim ALAD. Kondisi ini

berdampak pada proses penghambatan Pb selanjutnya terhadap enzim

ferrochelatase. Sehingga individu dengan genotip ALAD-2 memiliki kemampuan

lebih baik terhadap penggunaan ion besi (Fe) pada sintesis Hb. Berbeda halnya pada

individu dengan genotip ALAD-1 yang memiliki ikatan terhadap Pb lebih lemah,

sehingga Pb yang masuk ke dalam tubuh akan lebih banyak menghambat kerja

enzim ferrochelatase. Oleh karena itu perlu adanya pemeriksaan kadar Pb dalam

darah pada penelitian selanjutnya.

Untuk menentukan tata laksana anemia perlu memperhatikan faktor – faktor

yang berkaitan dengan jumlah dan morfologi eritrosit seperti hematokrit, hitung

eritrosit, MCH (Mean Cell Haemoglobin), MCV (Mean Cell Volume), MCHC

Mean Cell Haemoglobin Concentration), dan hitung jenis retikulosit. Selain itu

untuk membedakan dengan diagnosis anemia karena defisiensi besi dan defisiensi

asam folat perlu adanya pemeriksaan tambahan seperti kadar Fe serum, TIBC

(Total Iron – Binding Capacity), ferritin serum, Vit. B12 serum, asam folat serum,

dan Red Cell Folate.[32]

47

4.4. Keterbatasan Penelitian

Penelitian ini memiliki keterbatasan antara lain :

1. Tidak diukurnya kriteria diagnosis lain untuk menentukan anemia dan non

- anemia seperti pemeriksaan hapusan darah tepi, dan pemeriksaan

hematologi eritrosit.

2. Tidak mencari data Pb serum dan data paparan Pb pada responden untuk

mengetahui hubungan paparan Pb terhadap kriteria kadar Hb (anemia dan

non – anemia).

3. Tidak mencari data mengenai status menstruasi pada responden perempuan

untuk mengetahui kemungkinan penyebab lain terjadinya anemia.

48

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

1. Terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa PSKPD

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

2. Genotip ALAD-1/2 memiliki proporsi terbanyak dengan frekuensi

sebanyak 71 orang dari 102 sampel pada populasi mahasiswa PSKPD UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.

3. Tidak terdapat hubungan yang signifikan antara polimorfisme gen ALAD

dengan kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif


5.2. Saran

1. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk diagnosis anemia seperti

hapusan darah tepi dan pemeriksaan hematologi eritrosit.

2. Diperlukan pemeriksaan kadar Pb serum untuk mengetahui hubungannya

dengan polimorfisme genetik ALAD.

3. Diperlukan kuesioner tambahan terkait gaya hidup dan siklus menstruasi

responden untuk menunjang diagnosis anemia.

4. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan jumlah sampel yang lebih

banyak.

49

PERNYATAAN PENELITIAN

Penelitian ini adalah bagian dari kerjasama penelitian antara Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Negeri

Jakarta dengan tema penelitian Hemoglobinopati dan Genetik.

50

DAFTAR PUSTAKA

[1] Jaishankar M, Tseten T, Anbalagan N, Matthew B, Beeregowda KN. Toxicity,

mechanism and health effects of some heavy metals. Interdiscip Toxicol.

2014;7:60-72.

[2] Suherni. Keracunan timbal di Indonesia. 2010 Sept 16 [diakses tanggal 23

Agustus 2016]. Tersedia di www.lead.org.au/

[3] Gusnita D. Pencemaran logam berat timbal (Pb) di udara dan upaya

penghapusan bensin bertimbal. LAPAN. 2010:1-7.

[4] Santi DN. Pencemaran udara oleh timbal (Pb) serta penanggulangannya. USU

Digital Library. 2001:1-6.

[5] Warrington NM, Zhu G, Dy V, Heath AC, Madden PAF, Hemani G, et.al.

Genome-wide association study of blood lead shows multiple associations

near ALAD. Hum Mol Genet. 2015;13:3871-9.

[6] Sakamoto D, Kudo H, Inohaya K, Yokoi H, Narita T, Naruse K, et.al. A

mutation in the gene for ẟ-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) causes

hypochromic anemia in the medaka, Oryzas latipes. Mech Dev.

2004;121:747-52.

[7] Karki R, Pandya D, Elston RC, Ferlini C. Defining mutation and polymorphism

in the era of personal genomics. BMC Med Genom. 2015;8:37.

[8] Huijun Z. Delta amino levulinic acid dehydratase (ALAD) polymorphism and

its effect on human susceptibility to renal toxicity by inorganic lead [tesis].

[Lower Kent Ridge Rd]: National University of Singapore; 2005.

[9] van Bemmel DM, Li Y, McLean J, Chang MH, Dowling NF, Graubard B, et.al.

Blood lead levels, ALAD gene polymorphisms, and mortality. Epidemiology.

2011;22:273-8.

[10] Ajioka RS, Philips JD, Kushner JP. Biosynthesis of heme in mammals.

Biochemica et Biophysica Acta. 2006;1763:723-36.

http://www.lead.org.au/

51

[11] Kelada SN, Shelton E, Kaufmann RB, Khoury MJ. ẟ-Aminolevulinic acid

dehydratase genotype and lead toxicity: A HuGE Review. Am J Epidemiol.

2001;154:1-13.

[12] van Bemmel DM, Boffetta P, Liao LM, Berndt SI, Menashe I, Meredith Y,

et.al. Comprehensive analysis of 5-aminolevulinic acid dehydrogenase

(ALAD) variants and renal cell carcinoma risk among individuals exposed to

lead. PLoS ONE. 2011;6:1-7.

[13] Papanikolau NC, Hatzidaki EG, Belivanis S, Tzanakakis GN, Tsatsakis AM.

Lead toxicity update. A brief review. Med Sci Monit. 2005;11:329-36.

[14] Patrick L. Lead toxicity a review of the literature. Part 1: Exposure, Evaluation

and Treatment. Altern Med Rev. 2006;11:2-22.

[15] Patocka J. Organic lead toxicology: Review Article. Acta Medica (Hradec

Kralove). 2008;51:209-13.

[16] Centers for Disease Control and Prevention. Blood lead levels in children.

2017 May 17 [diakses tanggal 20 Mei 2017]. Tersedia di

www.cdc.gov/nceh/lead/acclpp/blood_lead_levels.htm

[17] Shah F, Kazi TG, Afridi HI, Baig JA, Khan S, Kolachi NF, et.al.

Environmental exposure of lead and iron deficit anemia in children age ranged

1-5 years: A Cross Sectional Study. Sci Total Environ. 2010;408:5325-30.

[18] Mason LH, Harp JP, Han DY. Pb neurotoxicity: Neurophysiological effects of

lead toxicity. BioMed Res. 2014;10:1-8.

[19] Yun L, Zhang W, Qin K. Relationship among maternal blood lead, ALAD

gene polymorphism and neonatal neurobehavioral development. Int J Clin

Exp Pathol. 2015;8:7277-81.

[20] Wan H, Wu J, Sun P, Yang Y. Investigation of delta-aminolevulinic acid

dehydratase polymorphism affecting hematopoietic, hepatic, and renal

toxicity from lead in Han subjects of southwestern China. A Physiol.

2014;1:59-66.

http://www.cdc.gov/nceh/lead/acclpp/blood_lead_levels.htm

52

[21] Neslund-Dudas C, Levin AM, Rundle A, Dimmer JB, Bock CH, Nock NL,

et.al. Case-only gene-environtment interaction between ALAD tagSNPs and

occupational lead exposure in prostate cancer. Prostate. 2014;74:637-46.

[22] Lister Hill National Center for Biomedical Communications. Help me

understand genetics: Cells and DNA. 2016 May 16 [diakses tanggal 19 Mei

2016]. Tersedia di: https://ghr.nlm.nih.gov/

[23] US National Library of Medicine. Your guide to understanding genetic

conditions: Genetics Home Reference. 2016 Aug 16 [diakses tanggal 18

Agustus 2016]. Tersedia di https://ghr.nlm.gov/gene/ALAD/

[24] Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB.

Genetics. The molecular basis inheritance. In: Campbell Biology. Edisi ke –

9. San Francisco: Pearson; 2011. h. 305 – 340.

[25] Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson AD, Lewis J, Raff M, et.al. Control of

gene expression chapter 8. In: Essential Cell Biology. Edisi ke-4. Garland

Science; 2016. h. 261-86.

[26] Susman M. Genes: Definition and Structure. Encyclopedia of Life Sciences.

2001;1-7.

[27] Scinicariello F, Murray HE, Moffet DB, Abadin HG, Sexton MJ, Fowler BA.

Lead and ẟ-aminolevulinic acid dehydratase polymorphism: Where Does It

Lead? A Meta-Analysis. Environ Health Perspect. 2007;115:35-41.

[28] Scripichai O, Fucharoen S. Genetic polymorphisms and implications for

human diseases. J Med Assoc Thai. 2007;90:394-8.

[29] Yang Y, Wu J, Sun P. Effects of delta-aminolevulinic acid dehydratase

polymorphisms on susceptibility to lead in Han subjects from southwestern

China. Int J Environ Res Public Health. 2012;9:2326-38.

[30] Miyaki K, Lwin H, Masaki K, Song Y, Takahashi Y, Muramatsu M, et.al.

Association between a polymorphism of aminolevulinate dehydrogenase

(ALAD) gene and blood lead levels in Japanese subjects. Int J Environ Res

Public Health. 2009;6:999-1009.

https://ghr.nlm.nih.gov/

https://ghr.nlm.gov/gene/ALAD/

53

[31] Rajan P, Kesley KT, Schwartz JD, Bellinger DC, Weuve J, Sparrow D, et.al.

Lead burden and psychiatric symptoms and the modifying influence of the ẟ-

aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) polymorphism: The VA Normative

Aging Study. Am J Epidemiol. 2007;166:1400-108.

[32] Hoffbrand AV, Moss PAH. Essential haematology. Edisi ke-6. Oxford: Wiley-

Blackwell; 2011. H. 1-47.

[33] Weaver VM, Schwartz BS, Jear BG, Ahn KD, Todd AC, Lee SS, et.al.

Association of uric acid with polymorphisms in the ẟ-aminolevulinic acid

dehydratase, vitamin D receptor, and nitric oxide synthase genes in Korean

lead workers. Environ Health Prespect. 2005;11:1-7.

[34] Tortora GJ, Derrickson B. Development of blood vessels and blood. In:

Principles of Anatomy & Physiology. Edisi ke-14. USA: John Wiley & Sons;

2014. h. 791-2.

[35] Hattangadi SM, Wong P, Zhang L, Flygare J, Lodish HF. From stem cell to

red cell: Regulation of Erythropoiesis at Multiple Levels by Multiple Proteins,

RNAs, and Chromatin Modifications. Blood. 2011;118:6258-68.

[36] Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Pedoman interpretasi data klinik.

Jakarta; 2011. h. 8-27.

[37] Lambert JF, Beris P. Pathophysiology and differential diagnosis of anaemia:

Chapter 4. In : The Handbook Disorders of Erythropoiesis, Erythrocytes, and

Iron Metabolism. Pagina; 2009. h. 108-141.

[38] Souza RM, Freitas LAR, Lyra AC, Moraes CF, Braga EL, Lyra LGC. Effect

of iron overload on the severity of liver histologic alterations and on the

response to interferon and ribavirin theraphy of patients with hepatitis C

infection. Braz J Med Biol Res. 2006;39:79-83.

[39] Siddique A, Kowdley KV. Review Article: The iron overload syndromes.

Aliment Pharmacol Ther. 2012;35:876-93.

[40] GE Healthcare Life Sciences. Spectrophotometry handbook.

Buckinghamshire: GE Company; 2013. h. 1-10.

54

[41] Rothman R. Determination of DNA concentration and purity by ultraviolet

spectrophotometry. 2015 Jan 4 [diakses tanggal 6 Juni 2017]. Tersedia di

https://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/

[42] Gustavsson T, Banyasz A, Lazzarotto E, Markovitsi D, Scalmani G, Frisch

MJ, et.al. Singlet excited-state behavior of uracil and thymine in aqueous

solution: A Combined Experimental and Computational Study of 11 Uracil

Derivatives. J Am Chem Soc. 2006;128:607-619.

[43] Joshi M, Deshpande JD. Polymerase chain reaction: Methods, Principles, and

Application. Int J Biomed Res. 2010;1:81-97.

[44] Duta-Cornescu G, Simon-Gruita A, Constantin N, Stanciu F, Dobre M, Banica

D, et.al. A comparative study of ARMS-PCR and RFLP-PCR as methods for

rapid SNP identification. Rom Biotechnol Lett. 2009;14:4845-50.

[45] Caren H. ARMS test for analyzing SNPs and association study of SPINK5

polymorphisms in an asthma material [tesis]. [Gothenburg]: Goteborg

University; 2002.

[46] Ye S, Dhillion S, Ke X, Collins AR, Day INM. An efficient procedure for

genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 2001;88:1-

8.

[47] Fateh A, Aghasadeghi M, Siadat SD, Vaziri F, Sadeghi F, Fateh R, et.al.

Comparison of three different methods for detection of IL28 rs12979860

polymorphisms as a predictor of treatment outcome in patients with hepatitis

C virus. Osong Public Health Res Perspect. 2016;7:83-9.

[48] Zhang C, Liu Y, Ring BZ, Nie K, Yang M, Wang M, et.al. A novel multiplex

tetra-primer ARMS-PCR for the simultaneous genotyping of six single

nucleotide polymorphisms associated eith female cancers. PLoS ONE. 2013;

8:1-8.

[49] Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point

mutation. Hum Genet. 2000;9.8:1-12.

https://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/

55

[50] Medrano RFV, de Oliveira CA. Guidelines for the tetra-primer ARMS-PCR

technique development. Mol Biotechnol. 2014;56:599-608.

[51] Najmabadi H, Teimourian S, Khatibi T, Neishabury M, Pourfarzad F, Jali-

Nejad S, et.al. Amplification refractory mutation system (ARMS) and reverse

hybridization in the detection of beta-thalassemia mutation. Arch Irn Med.

2014;4:165-70.

[52] Dahlan MS. Penelitian Deskriptif. In: Besar Sampel dan Cara Pengambilan

Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. Edisi ke-3. Jakarta:

Salemba Medika; 2013. h. 56-60.

[53] Yamashiro Y, Hattori Y, Ferania M, Kentaro M. Delta-aminolevulinic acid

dehydratase (ALAD) gene amplification by PCR and amplification-refractory

mutation system (ARMS). Materi dipresentasikan pada kegiatan UNJ

Workshop of Molecular Genetics, Universitas Negeri Jakarta, Jakarta. 25

Maret 2014.

[54] Geneaid. Blood/ cell DNA mini kit (GB100/GB300). 2017 Feb 10 [diakses

tanggal 30 Juni 2017]. Tersedia di

http://www.geneaid.com/products/genomic-dna-purification/dna-extraction-

kit-blood-cultured-cell-miniprep.

[55] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting

and Optimization Startegies. J Vis Exp. 2012;63:1-15.

[56] Thermo fisher scientific. Troubleshooting guide for DNA electrophoresis.

2012 [diakses tanggal 7 Juni 2017]. Tersedia di www.fermentas.com

[57] Magdeldin S. Gel electrophoresis: Principle and Basics. Croatia: In Tech;

2012. h. 25-41.

[58] Tantur S. Panduan penelitian untuk skripsi kedokteran & kesehatan. Jakarta;

2017. h. 102-5.

http://www.geneaid.com/products/genomic-dna-purification/dna-extraction-kit-blood-cultured-cell-miniprep

http://www.geneaid.com/products/genomic-dna-purification/dna-extraction-kit-blood-cultured-cell-miniprep

http://www.fermentas.com/

56

[59] Firdausi A. Identifikasi polimorfisme gen levulinat dehydratase (ALAD) pada

populasi anak yang mengalami anemia dan non anemia di Sekolah Dasar

Negeri 03 Kalideres, Jakarta Barat [skripsi]. [Rawamangun, Jakarta Timur]:

Universitas Negeri Jakarta; 2017.

57

Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden

SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN

IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA – AMINOLEVULINIC ACID

EHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN

ANEMIA PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN

PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANGKATAN 2012 – 2014

Saya Moch Rizki Ramadhan mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

angkatan 2014 sedang melakukan penelitin dengan judul “Identifikasi

Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALAD) dan

Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada Mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Angkatan 2012 – 2014”. Pada penelitian ini saya akan melakukan dua kali

pemeriksaan. Pemeriksaan pertama dilakukan dengan mengukur Hb darah

menggunakan alat Easy Touch® GCHb. Pemeriksaan ke dua dilakukan

pengambilan darah sebanyak 3 cc darah. Darah tersebut akan dibawa ke

laboratorium untuk dilakukan identifikasi polimorfisme gen ALAD. Pengambilan

darah dilakukan sesuai standar oleh analis yang sudah berpengalaman.

Pengambilan darah dapat menimbulkan komplikasi berupa nyeri dan hematoma.

Keluhan yang muncul setelah pengambilan darah akan ditatalaksana langsung.

Peneliti sudah mempersiapkan perangkat pencegahan dan pengobatan apabila

komplikasi muncul. Komplikasi Untuk itu, dengan hormat saya memohon

kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini.

Setelah membaca penjelasan di atas, bahwa yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : ______________________________________________

Umur : ________________________________________ Tahun

Alamat :______________________________________________

Dengan sukarela ikut serta dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut

kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti.

Ciputat, Mei 2015

Moch Rizki Ramadhan

Peneliti

No. Telpon : 085606644465

_________________

Mahasiswa

58

Lampiran 2. Lembar Persetujuan Etik

59

Lampiran 3. Gen ALAD pada Manusia[53]

agacgtcgtggcagaggctgttgcagaagggagctgaactgcagatgggagttca

aaaagagggcctcgaaggagccttccacagccgaattccggagctctgctactca

ggGCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGTggatgcatccctgccccttctgtcctgg

gggcttgagccctcctggtgccatatgcagcttggtttctaacagaggcacacag

tgtggtggggtccggaggaccgttgcctgggacctgccttccttcaacccctcta

cccacacccacacagGTATGGTGTGAAGCGGCTGGAAGAGATGCTGAGGCCCTTG

GTGGAAGAGGGCCTACGCTGTGTCTTGATCTTTGGCGTCCCCAGCAGAGTTCCCA

AGgtgaagAATCAAAGGAAGGGCTAAGAAGGGAggttgcgctcacgcccgtaatc

ccagcactttgggaggccaaagtgggtggatcacttgagcccaggattttgagac

cagcctggacaacatggcaaaacccatctctacaaaaaatacaaa

Primer PCR

Primer ALAD Forward : 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’

Primer ALAD Reverse : 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’

60

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian

Easy Touch® GCHb

Hemoglobin Strip Test dan Blood

Lancets

Biomedical freezer

Vertical Laminar Flow Cabinet

ESCO Airstream

Timbangan Analitik Adventurer™

Microwave SHARP Low Wattage

Elektroforesis ATTO My Power II 300

AE-8135

Tray and Comb Elektroforesis

61

Printgraph ATTO AE-6905 CF CCD

Camera Controller

PCR Applied Biosystems 2720

Thermal Cycler

Microtip dan Microsentrifuge Tube

Microsentrifuge Eppendorf 5417 R

Waterbath AS ONE TRW-42 TP

Micropipet

Vortex

Genomic DNA Mini Kit Geneaid GB

100

62

Lampiran 5. Hasil Isolasi DNA Genom

63

Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel

No. A230 A260 A280 A260/230 A260/280 Konsentrasi

1 0,262 0,515 0,251 1,963 2,053 25,77

2 1,209 2,18 1,108 1,802 1,968 108,99

3 0,177 0,348 0,166 1,97 2,094 17,4

4 0,899 2,267 1,129 2,523 2,007 113,35

5 0,242 0,337 0,234 1,395 1,438 16,86

6 0,588 1,105 0,587 1,881 1,881 55,25

7 -0,062 0,57 0,307 -9,226 1,858 28,51

8 -0,042 0,426 0,232 -10,04 1,835 21,32

9 0,129 0,413 0,213 3,208 1,935 20,64

10 -0,076 0,125 0,063 -1,66 1,986 6,27

11 -0,196 0,18 0,086 -0,921 2,089 9,02

12 0,457 0,923 0,499 2,019 1,849 46,13

13 -0,017 0,279 0,128 -16,772 2,175 13,95

14 -0,007 0,107 0,061 -14,587 1,775 5,37

15 -0,203 0,288 0,141 -1,423 2,042 14,42

16 -0,151 0,306 0,178 -2,028 1,72 15,32

17 -0,301 0,12 0,063 -0,4 1,912 6,01

18 0,054 0,496 0,352 9,182 1,409 24,79

19 -0,225 0,235 0,119 -1,043 1,973 11,75

20 -0,219 0,2 0,105 -0,914 1,898 10

21 -0,001 0,723 0,392 -847,665 1,845 36,13

22 -0,012 0,828 0,421 -71,179 1,964 41,38

23 0,22 0,951 0,504 4,325 1,887 47,55

24 0,247 1,097 0,621 4,438 1,768 54,87

25 -0,22 0,237 0,141 -1,081 1,684 11,87

26 -0,163 0,441 0,197 -2,704 2,235 22,06

27 -0,25 0,195 0,107 -0,782 1,827 9,75

28 0,425 0,982 0,739 2,31 1,329 49,08

29 0,097 1,009 0,485 10,382 2,081 50,46

30 0,143 0,801 0,532 5,609 1,505 40,05

31 2,57 2,265 1,623 0,881 1,395 113,23

32 0,867 1,46 1,039 1,684 1,406 73,01

33 0,092 0,836 0,463 9,122 1,805 41,78

34 1,256 3,73 2,151 2,971 1,734 186,52

35 0,111 1,081 0,53 9,734 2,04 54,05

36 1,202 2,128 1,364 1,771 1,56 106,42

37 0,842 1,627 1,113 1,933 1,462 81,35

64

Lanjutan


38 0,211 0,715 0,558 3,387 1,281 35,73

39 0,097 1,013 0,511 10,468 1,98 50,63

40 0,186 1,19 0,601 6,385 1,98 59,49

41 0,868 1,481 1,056 1,707 1,403 74,07

42 -0,17 0,347 0,195 -2,042 1,78 17,36

43 0,143 1,101 0,544 7,681 2,022 55,04

44 1,015 2,162 1,376 2,129 1,571 108,1

45 -0,147 0,356 0,212 -2,418 1,679 17,81

46 -0,118 0,414 0,252 -3,51 1,641 20,7

47 -0,099 0,648 0,309 -6,562 2,1 32,42

48 0,722 1,304 0,867 1,804 1,503 65,18

49 0,969 1,121 0,838 1,157 1,339 56,06

50 0,277 1,253 0,648 4,532 1,934 62,66

51 -0,144 0,302 0,153 -2,105 1,972 15,1

52 0,461 1,444 0,796 3,131 1,815 72,22

53 0,272 0,965 0,559 3,554 1,725 48,24

54 0,636 1,285 0,878 2,019 1,464 64,24

55 0,575 1,94 0,944 3,371 2,054 96,98

56 -0,29 0,047 0,022 -0,162 2,11 2,35

57 -0,283 0,016 0,009 -0,055 1,654 0,78

58 -0,333 0,011 0,009 -0,034 1,247 0,57

59 -0,309 0,118 0,05 -0,381 2,331 5,88

60 1,302 1,541 1,398 1,183 1,102 77,03

61 -0,288 0,22 0,105 -0,765 2,102 11

62 0,468 1,783 1,01 3,81 1,766 89,14

63 0,149 0,945 0,548 6,324 1,724 47,27

64 0,32 1,008 0,614 3,145 1,642 50,4

65 0,306 1,261 0,686 4,118 1,838 63,03

66 0,194 1,021 0,593 5,251 1,72 51,05

67 0,271 1,214 0,662 4,474 1,835 60,72

68 0,603 1,356 0,942 2,248 1,439 67,78

69 0,217 1,095 0,586 5,05 1,869 54,73

70 -0,132 0,407 0,229 -3,076 1,775 20,35

71 0,082 0,852 0,51 10,417 1,671 42,62

72 -0,004 0,757 0,42 -186,279 1,804 37,87

73 0,236 0,992 0,581 4,2 1,709 49,61

74 -0,02 0,683 0,378 -33,861 1,806 34,16

75 -0,122 0,473 0,246 -3,872 1,92 23,64

65

Lanjutan


76 0,08 0,816 0,487 10,173 1,676 40,8

77 0,114 0,86 0,548 7,513 1,571 43,01

78 0,017 0,685 0,47 39,492 1,459 34,27

79 0,178 0,988 0,715 5,564 1,382 49,4

80 0,211 0,937 0,541 4,446 1,732 46,86

81 0,416 1,207 0,697 2,899 1,733 60,37

82 0,587 2,023 0,96 3,448 2,108 101,16

83 2,678 5,249 3,034 1,96 1,73 262,43

84 1,137 1,644 0,909 1,446 1,808 82,2

85 0,625 1,182 0,821 1,892 1,44 59,1

86 0,038 0,911 0,427 23,765 2,136 45,56

87 0,072 0,874 0,418 12,113 2,092 43,72

88 0,279 0,992 0,507 3,557 1,958 49,6

89 2,394 3,807 3,01 1,591 1,265 190,37

90 1,004 1,619 1,134 1,613 1,428 80,95

91 0,199 1,149 0,608 5,783 1,891 57,47

92 0,669 1,39 0,842 2,078 1,652 69,51

93 0,547 1,19 0,626 2,177 1,901 59,5

94 1,508 1,979 1,113 1,313 1,778 98,96

95 0,195 0,943 0,459 4,829 2,055 47,14

96 0,764 2,306 1,11 3,02 2,077 115,31

97 0,437 1,697 0,788 3,885 2,152 84,84

98 0,501 0,842 0,519 1,681 1,622 42,08

99 0,019 0,707 0,347 37,568 2,038 35,36

100 1,247 2,727 1,524 2,186 1,79 136,37

101 0,247 1,117 0,59 4,521 1,893 55,83

102 -0,191 0,251 0,129 -1,311 1,944 12,53

66

Lampiran 7. Hasil PCR Tahap 2

67

Lanjutan

68

Lanjutan

69

Lampiran 8. Karakteristik Sampel

No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD

1 Perempuan 21 14,0 Normal GG ALAD-1

2 Perempuan 21 12,7 Normal GC ALAD-1/2

3 Perempuan 20 9,3 Anemia GC ALAD-1/2



6 Laki-Laki 21 11,7 Anemia GG ALAD-1

7 Laki-Laki 21 15,2 Normal GC ALAD-1/2

8 Perempuan 20 10,5 Anemia GG ALAD-1



11 Laki-Laki 20 14,9 Normal CC ALAD-2


13 Laki-Laki 21 15,3 Normal GG ALAD-1




70

Lanjutan







22 Laki-Laki 20 18,5 Normal CC ALAD-2

23 Laki-Laki 20 10,0 Anemia GC ALAD-1/2









32 Perempuan 21 9,5 Anemia CC ALAD-2

71

Lanjutan


















72

Lanjutan


















73

Lanjutan

















80 Perempuan 18 12,8 Normal CC ALAD-2

74

Lanjutan


















75

Lanjutan








Keterangan :

Kriteria Kadar Hb Menurut Kementrian Kesehatan Republik Indonesia 2011 [36]

Jenis Kelamin Pria Wanita

Hb Normal 13 – 18 g/dl 12 – 16 g/dl

76

Lampiran 9. Hasil Analisis Statistik

A. Jenis Kelamin

Statistics

Jenis_Kelamin

N Valid 102

Missing 0

Jenis_Kelamin

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid Laki-Laki 37 36.3 36.3 36.3

Perempuan 65 63.7 63.7 100.0

Total 102 100.0 100.0

B. Usia (Tahun)

Statistics

Usia

N Valid 102

Missing 0

Usia


Cumulative

Percent

Valid 18 27 26.5 26.5 26.5

19 23 22.5 22.5 49.0

20 33 32.4 32.4 81.4

21 16 15.7 15.7 97.1

23 3 2.9 2.9 100.0

Total 102 100.0 100.0

Descriptive Statistics

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Usia 102 18 23 19.49 1.208

Valid N (listwise) 102

77

Lanjutan

C. Hemoglobin (g/dl)

Statistics

Hemoglobin_Kadar

N Valid 102

Missing 0

Hemoglobin_Kadar


Cumulative

Percent

Valid 8.0 2 2.0 2.0 2.0

8.1 1 1.0 1.0 2.9

8.2 1 1.0 1.0 3.9

8.4 2 2.0 2.0 5.9

8.6 2 2.0 2.0 7.8

8.7 2 2.0 2.0 9.8

8.8 2 2.0 2.0 11.8

8.9 1 1.0 1.0 12.7

9.3 2 2.0 2.0 14.7

9.5 2 2.0 2.0 16.7

9.7 2 2.0 2.0 18.6

9.8 2 2.0 2.0 20.6

9.9 1 1.0 1.0 21.6

10.0 3 2.9 2.9 24.5

10.1 2 2.0 2.0 26.5

10.2 1 1.0 1.0 27.5

10.4 3 2.9 2.9 30.4

10.5 3 2.9 2.9 33.3

10.7 1 1.0 1.0 34.3

10.9 1 1.0 1.0 35.3

11.0 3 2.9 2.9 38.2

11.1 5 4.9 4.9 43.1

11.2 4 3.9 3.9 47.1

11.3 1 1.0 1.0 48.0

11.4 3 2.9 2.9 51.0

11.6 1 1.0 1.0 52.0

78

11.7 1 1.0 1.0 52.9

11.8 1 1.0 1.0 53.9

11.9 1 1.0 1.0 54.9

12.0 6 5.9 5.9 60.8

12.1 2 2.0 2.0 62.7

12.3 2 2.0 2.0 64.7

12.6 4 3.9 3.9 68.6

12.7 3 2.9 2.9 71.6

12.8 2 2.0 2.0 73.5

12.9 2 2.0 2.0 75.5

13.1 6 5.9 5.9 81.4

13.2 2 2.0 2.0 83.3

13.3 1 1.0 1.0 84.3

13.8 2 2.0 2.0 86.3

13.9 1 1.0 1.0 87.3

14.0 1 1.0 1.0 88.2

14.1 1 1.0 1.0 89.2

14.6 1 1.0 1.0 90.2

14.7 1 1.0 1.0 91.2

14.8 1 1.0 1.0 92.2

14.9 1 1.0 1.0 93.1

15.0 1 1.0 1.0 94.1

15.1 1 1.0 1.0 95.1

15.2 1 1.0 1.0 96.1

15.3 1 1.0 1.0 97.1

15.7 1 1.0 1.0 98.0

16.4 1 1.0 1.0 99.0

18.5 1 1.0 1.0 100.0

Total 102 100.0 100.0

Descriptive Statistics

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Hemoglobin_Kadar 102 8.0 18.5 11.627 2.0708

Valid N (listwise) 102

Lanjutan

79

Lanjutan

D. Hemoglobin Kategori

Statistics

Hemoglobin_Kategori

N Valid 102

Missing 0

Hemoglobin_Kategori


Cumulative

Percent

Valid Normal 41 40.2 40.2 40.2

Anemia 61 59.8 59.8 100.0

Total 102 100.0 100.0

E. Alel ALAD

Statistics

Gen

N Valid 102

Missing 0

Gen


Cumulative

Percent

Valid GG 22 21.6 21.6 21.6

GC 71 69.6 69.6 91.2

CC 9 8.8 8.8 100.0

Total 102 100.0 100.0

80

F. Gen ALAD

Statistics

Gen

N Valid 102

Missing 0

Gen


Cumulative

Percent

Valid ALAD-1 22 21.6 21.6 21.6

ALAD-1/2 71 69.6 69.6 91.2

ALAD-2 9 8.8 8.8 100.0

Total 102 100.0 100.0

G. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin

Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

Gen * Jenis_Kelamin 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%

Gen * Jenis_Kelamin Crosstabulation

Jenis_Kelamin

Total Laki-Laki Perempuan

Gen ALAD-1 Count 10 12 22

% within Gen 45.5% 54.5% 100.0%

% within Jenis_Kelamin 27.0% 18.5% 21.6%

ALAD-1/2 Count 25 46 71

% within Gen 35.2% 64.8% 100.0%


ALAD-2 Count 2 7 9

% within Gen 22.2% 77.8% 100.0%


Total Count 37 65 102

% within Gen 36.3% 63.7% 100.0%


81

H. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Usia

Gen * Usia Crosstabulation

Usia

Total 18 19 20 21 23

Gen ALAD-1 Count 4 4 5 8 1 22

% within Gen 18.2% 18.2% 22.7% 36.4% 4.5% 100.0%

% within Usia 14.8% 17.4% 15.2% 50.0% 33.3% 21.6%

ALAD-1/2 Count 18 19 25 7 2 71

% within Gen 25.4% 26.8% 35.2% 9.9% 2.8% 100.0%

% within Usia 66.7% 82.6% 75.8% 43.8% 66.7% 69.6%

ALAD-2 Count 5 0 3 1 0 9

% within Gen 55.6% 0.0% 33.3% 11.1% 0.0% 100.0%

% within Usia 18.5% 0.0% 9.1% 6.3% 0.0% 8.8%

Total Count 27 23 33 16 3 102

% within Gen 26.5% 22.5% 32.4% 15.7% 2.9% 100.0%

% within Usia 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%


Cases

Valid Missing Total


Gen * Usia 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%

82

I. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia


Cases

Valid Missing Total


Gen * Hemoglobin_Kategori 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%

Gen * Hemoglobin_Kategori Crosstabulation

Hemoglobin_Kategori

Total Normal Anemia

Gen ALAD-1 Count 9 13 22

% within Gen 40.9% 59.1% 100.0%

% within

Hemoglobin_Kategori 22.0% 21.3% 21.6%

ALAD-1/2 Count 29 42 71

% within Gen 40.8% 59.2% 100.0%

% within


ALAD-2 Count 3 6 9

% within Gen 33.3% 66.7% 100.0%

% within


Total Count 41 61 102

% within Gen 40.2% 59.8% 100.0%

% within


Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square .193a 2 .908

Likelihood Ratio .197 2 .906

Linear-by-Linear Association .084 1 .772

N of Valid Cases 102

a. 1 cells (16.7%) have expected count less than 5. The minimum

expected count is 3.62.

83

Lampiran 10. Nilai Normal Pemeriksaan Hematologi Eritrosit [32, 36]

Pemeriksaan

Indikator Normal Dewasa

Laki – Laki Perempuan Laki – Laki

dan

Perempuan

Hemoglobin (g/dl) 13 – 18 12 – 16

Hematokrit (%) 40 – 50 35 – 45

Eritrosit (sel/mm3) 4,4 x 106 –

5,6 x 106

3,8 x 106 –

3,5 x 106

MCV (fL) 80 – 100

MCH (pg/sel) 28 – 34

MCHC (g/dl) 32 – 36

Retikulosit (%) 0,5 – 2

Ferritin Serum (µg/L) 40 – 340 14 – 150

Fe Serum (µmol/L) 10 – 30

TIBC (µmol/L) 40 – 75

Transferrin (g/L) 2 – 4

Vit. B12 serum (ng/L) 160 – 925

Asam Folat serum

(nmol/L)

3 – 15

Red Cell Follate (µg/L) 160 – 640

84

Lampiran 11. Curriculum Vitae Peneliti

CURRICULUM VITAE

A. Identitas Diri

Nama : Moch Rizki Ramadhan

Jenis Kelamin : Laki – Laki

Tempat, Tanggal Lahir : Sidoarjo, 8 Januari 1998

Glongan Darah : B +

Agama : Islam

E-mail : [email protected]

Alamat : Perum Jala Griya TNI – AL Blok C10 No.

25, RT.27, RW.08, Kedung

Kendo, Candi, Sidoarjo, Jawa Timur.

B. Pendidikan

Sekolah Dasar : MI Maarif Candi, Sidoarjo, Jawa Timur

Sekolah Menengah Pertama : MTs Unggulan Prog. Akselerasi Ponpes.

Amanatul Ummah, Kembang Belor, Pacet,

Mojokerto Jawa Timur.

Sekolah Menengah Atas : MA Unggulan Prog. Akselerasi Ponpes.

Amanatul Ummah, Kembang Belor, Pacet,

Mojokerto Jawa Timur.

Universitas : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

C. Pengalaman Organisasi

1. Sekretaris HMPS PD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2015 – 2017

2. Wakil Ketua CSSMoRA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2016 – 2017

3. Kadiv Scientech MERCY UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2015 – 2017

D. Penghargaan

1. Juara 1 Try Out SD Se – Kab. Sidoarjo 2010

2. 20 Besar Try Out SD/MI Se – Gerbangkertasusilapas 2010

3. Juara Harapan 3 Try Out SMP/MTs Se – Jawa Timur 2012

4. Delegasi International Indonesian Medical Olympiad FK UPH 2016

Cabang Neuropsikiatri.

mailto:[email protected]

identifikasi polimorfisme gen delta- …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... ·...

Documents