identificare cosa?m.docente.unife.it/.../dispense-corsi/casiraghiferrara.pdfmaurizio casiraghi...
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Identificare cosa?
Le entità biologiche nell'era della Next Generation
Maurizio Casiraghi
Università degli Studi di Milano-BicoccaZooPlantLab - Dip. Biotecnologie e Bioscienze
Piazza della Scienza 2 – 20126 [email protected]
www.zooplantlab.btbs.unimib.itSocietà Italiana di
Biologia Evoluzionistica
giovedì 30 ottobre 14
Il processo di identificazione di una specie
Il processo di identificazione include due fasi:
1. il riconoscimento: le “cose” sono differenti;
2. la classificazione: alcune di queste “cose”
condividono tratti comuni che giustificano la
loro riunione in un unico gruppo
giovedì 30 ottobre 14
Identificare le specie
Il riconoscimento è “reale”, mentre classificazione “non
è reale”: è una costruzione
IL PRIMO PUNTO
giovedì 30 ottobre 14
Identificare le specie
Il riconoscimento è (in generale) “reale”, mentre (la
maggior parte della) classificazione “non è reale”: è una
costruzione (umana)
IL PRIMO PUNTO
giovedì 30 ottobre 14
Identificare le specie
Il riconoscimento è (in generale) “reale”, mentre (la
maggior parte della) classificazione “non è reale”: è una
costruzione (umana)
IL PRIMO PUNTO
in cucina “pesce” è un termine...
...”molto generale”
giovedì 30 ottobre 14
riconoscere
identificazione
raggruppare
classificazione
Identificare le specie
giovedì 30 ottobre 14
raggruppare
classificazione
DNA barcoding
riconoscere
identificazione
Identificare le specie
giovedì 30 ottobre 14
raggruppare
classificazione
DNA barcoding
riconoscere
identificazione
Identificare le specie
DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
Identificare le specieLA DOMANDA
Che cos’è questo mostro?(se non sono uno zoologo o un pescatore)
giovedì 30 ottobre 14
Carl Woese15 luglio 1928 - 30 dicembre 2012
Identificare le specieIL DNA BARCODING
giovedì 30 ottobre 14
When fully developed, a COI
identification system will provide a
reliable, cost-effective and
accessible solution to the current
problem of species identification
Identificare le specieIL DNA BARCODING
Paul DN Hebert
Univ. of Guelph
Canada
giovedì 30 ottobre 14
“Il DNA barcoding è la soluzione per il problema
dell’identificazione delle specie?”
giovedì 30 ottobre 14
Le specie in certe parti del Tree of Life possono
essere facilmente identificate come queste
nuvole in un cielo blu
Identificare le specie
giovedì 30 ottobre 14
Ma in una grande parte del Tree of Life
“l’identifcazione delle nuvole”non è così facile, perché il cielo non è così
blu come mostrato nei quadri di Joseph Mallord
William Turner
Identificare le specie
J.M.W. Turner, 1833 - Quillebeuf, at the mouth of Seine
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding
Ma allora a cosa serve il DNA barcoding?
Il DNA barcoding serve per identificare
(idealmente) le specie, ma NON E’ LA
“solution to the species problem”
giovedì 30 ottobre 14
“Può il DNA barcoding essere utile nel complesso mondo della identificazione
delle specie?”
giovedì 30 ottobre 14
animali
piante
“procarioti”
DNA barcoding- Frammenti standardizzati (semplificato) -
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
mtDNA marcatore ideale perché i mitocondri:
1) sono considerati marcatori neutrali;
2) sono trasmessi solo dalle femmine;
3) sono omoplasici;
4) ...e il mtDNA non ricombina
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
mtDNA marcatore ideale perché i mitocondri:
1) sono considerati marcatori neutrali;
2) sono trasmessi solo dalle femmine;
3) sono omoplasici;
4) ...e il mtDNA non ricombina
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
citocromo ossidasi: 13 subunità
3 codificate
nel mt
10 codificate
nel nucleo
almeno altri 20
fattori codificati
nel nucleo+
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
citocromo ossidasi: 13 subunità
3 codificate
nel mt
10 codificate
nel nucleo
almeno altri 20
fattori codificati
nel nucleo+
come può tutto ciò essere neutrale?
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
mtDNA marcatore ideale perché i mitocondri:
1) sono considerati marcatori neutrali;
2) sono trasmessi solo dalle femmine;
3) sono omoplasici;
4) ...e il mtDNA non ricombina
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
DUI, Doubly Uniparental Inheritance nei bivalvi
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
stadio a
70-100 cellule
nell’uomo
# cellule
nel topo
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcodingil problema dei marcatori!
mtDNA marcatore ideale perché i mitocondri:
1) sono considerati marcatori neutrali;
2) sono trasmessi solo dalle femmine;
3) sono omoplasici;
4) ...e il mtDNA non ricombina
giovedì 30 ottobre 14
Comunque il DNA barcoding è oggi estremamente
popolare e sono in corso grandi progetti internazionali
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
1) Pochi primers per amplificare i frammenti dal maggior numero di
diversi organismi possibile
sequenza di DNA
giovedì 30 ottobre 14
2) Pochi metodi di analisi bioinformatica del dato [...]
DNA barcoding key points
giovedì 30 ottobre 14
2) Pochi metodi di analisi bioinformatica del dato [...]
UTOPIA?!?
DNA barcoding key points
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding- Analisi standardizzata II -
Neighbour joining dopo la correzione di Kimura, uno “standard di fatto” con molti problemi teorici
Evoluzione molecolare dei marcatori...
Tanti metodi di ricostruzione filogenetica, ma quale è “il migliore” (= veloce, efficiente, potente...)?
2) Pochi metodi di analisi bioinformatica del dato [...]
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
3) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
pochi marcatori per il maggior
numero di specie possibile
Mantieni il sistema semplice ed economico!
3) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
una considerazione importante: un esperto di un certo
gruppo tassonomico probabilmente
NON NECESSITA DEL DNA BARCODING
PER IL SUO LAVORO
3) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
MA un esperto di un certo gruppo tassonomico, E’
FONDAMENTALE per fornire alla comunità scientifica un
sistema di DNA barcoding per quel gruppo di organismi
3) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
pochi marcatori per il maggior
numero di specie possibile
Mantieni il sistema semplice ed economico!
1) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
4) il DNA barcoding introduce una standardizzazione negli approcci al modo
di collezionare, di trattare i campioni, di analizzare e interpretare i dati
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
metodi comuni,
lo stesso laboratorio può lavorare su diverse tematiche.
Di nuovo, il DNA barcoding è per tutti
4) il DNA barcoding introduce una standardizzazione negli approcci al modo
di collezionare, di trattare i campioni, di analizzare e interpretare i dati
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
5) il DNA barcoding si basa sulla informatizzazione e sul networking
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
la standardizzazione e la computerizzazione
rappresentano uno degli sforzi più grandi nella
“democratizzazione” del mondo della ricerca
5) il DNA barcoding si basa sulla informatizzazione e sul networking
giovedì 30 ottobre 14
DNA barcoding key points
DNA barcoding
Sistema di identificazione generalistico
StandardizzazioneDatabase
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Ricordate la domanda iniziale?
“Cosa sono queste cose?”
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
protozoo del genere Stentor
Silurus glanis
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
specie, siamo felici!
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
genere, abbiamo ridotto
l’incertezza
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
Eukaryota; Metazoa;
Bilateria; Protostomia; Arthropoda; Mandibulata;
Diptera; Nematocera; Culicimorpha; Culicoidea; Culicidae; Anophelinae; Anopheles;gambiae species complex; Anopheles gambiae gambiae
Hexapoda;
Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota;
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
Eukaryota; Metazoa;
Bilateria; Protostomia; Arthropoda; Mandibulata;
Diptera; Nematocera; Culicimorpha; Culicoidea; Culicidae; Anophelinae; Anopheles;gambiae species complex; Anopheles gambiae gambiae
Hexapoda;
Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota;
il DNA barcoding
non identifica
questo rango
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
Eukaryota; Metazoa;
Bilateria; Protostomia; Arthropoda; Mandibulata;
Diptera; Nematocera; Culicimorpha; Culicoidea; Culicidae; Anophelinae; Anopheles;gambiae species complex; Anopheles gambiae gambiae
Hexapoda;
Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota;
MA questo rango è
definito su base
molecolare!!!
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
il tricorder
giovedì 30 ottobre 14
2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
il tricorder
il DNA barcoder
giovedì 30 ottobre 14
Linneo con il suo
DNA barcoder
personale
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi
14 marzo 2007giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi
giovedì 30 ottobre 14
3) il DNA barcoding è rappresentato da degli alberi filogenetici
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
3) il DNA barcoding è rappresentato da degli alberi filogenetici
giovedì 30 ottobre 14
to tree or not to tree...
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
3) il DNA barcoding è rappresentato da degli alberi filogenetici
giovedì 30 ottobre 14
un albero, nella nostra mente, è sinonimo di una
ricostruzione filogenetica, ma, in senso stretto, il DNA
barcoding non è una ricostruzione filogenetica
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
3) il DNA barcoding è rappresentato da degli alberi filogenetici
giovedì 30 ottobre 14
4) il DNA barcoding è solo Neighbour Joining dopo la correzione di Kimura
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
3) DNA barcoding is only Neighbour Joining following Kimura’s correction
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
3) DNA barcoding is only Neighbour Joining following Kimura’s correction
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
3) DNA barcoding is only Neighbour Joining following Kimura’s correction
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
giovedì 30 ottobre 14
BOLD IDS usa il NJ con un approccio soglia:
ogni cosa con una variabilità inferiore all‘1%
è la stessa unità molecolare
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
4) il DNA barcoding è solo Neighbour Joining dopo la correzione di Kimura
giovedì 30 ottobre 14
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
4) il DNA barcoding è solo Neighbour Joining dopo la correzione di Kimura
giovedì 30 ottobre 14
è ben noto: il NJ è approssimativo, ma veloce
[in BOLD IDS al 30/10/2014
sono disponibili 3,473,518 sequenze]
Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding
4) il DNA barcoding è solo Neighbour Joining dopo la correzione di Kimura
giovedì 30 ottobre 14
Data analysis in DNA barcoding
DNA barcodingdata analyses
Distance Matrices
Character status based
Phylogenetics
Hybrid systems
Alignment-free
giovedì 30 ottobre 14
Data analysis in DNA barcoding
ci sono tanti metodi per analizzare i dati.
L’importante è tenere bene a mente la domanda
corretta: “Cosa voglio fare con questi dati?”
Sto facendo un vero lavoro di DNA barcoding?
Probabilmente nella maggior parte
dei casi il NJ è sufficiente
giovedì 30 ottobre 14
Data analysis in DNA barcoding
ci sono tanti metodi per analizzare i dati.
L’importante è tenere bene a mente la domanda
corretta: “Cosa voglio fare con questi dati?”
Sto facendo lavoro filogenetico?
Il NJ è in genere una pessima scelta!
giovedì 30 ottobre 14
Data analysis in DNA barcoding
Sto facendo lavoro filogenetico?
Il NJ è in genere una pessima scelta!
giovedì 30 ottobre 14
Molecular biology and informatics joined to generate big data
High throughput sequencing - HTS(Next Generation Sequencing - NGS)
giovedì 30 ottobre 14
Cosa facciamo noi con ilDNA metabarcoding
Honey bee,
Apis mellifera
Mite,
Varroa destructor
giovedì 30 ottobre 14
African bush elephant(Loxodonta africana)
African forest elephant(Loxodonta cyclotis)
Ci si può fidare di “quello che appare”?
giovedì 30 ottobre 14
Ma che cosa identifichiamo tramite il DNA barcoding
(ma più in generale usando un approccio molecolare)?
giovedì 30 ottobre 14
Name-users
• small but powerful tribe;
• found in several scattered
ivory towers
• huge but poor tribe;
• found in the swamps
around the towers
two tribes live in Bioutopia
Real taxonomists
A tale from Bioutopia
giovedì 30 ottobre 14
• they both worshipped Names, but with different rites.
• the Name-users peacefully adored a huge book made of
granite, in which billions of Names were inscribed for
Eternity.
• the cruel Real-taxonomists sacrifice a name each day after the consulting of their oracle: Phylogenia
A tale from Bioutopia
Name-users
two tribes live in Bioutopia
Real taxonomists
giovedì 30 ottobre 14
• suddendly, the oracle Phylogenia starts to worship a
new God, called DNA.
• the Real-taxonomists change a lot of name following the
new God, and a war starts in Bioutopia between Name-
users and Real-taxonomists
A tale from Bioutopia
Name-users
two tribes live in Bioutopia
Real taxonomists
giovedì 30 ottobre 14
• to solve the war, it was consulted another Oracle, called Logic,
and she dictated: “Get rid of the binomial.”
• Every species in Bioutopia will be designated by a single epithet:
a number, or a barcode, the best food for computers:
“It’s an X157YR22297!”
A tale from Bioutopia
Name-users
two tribes live in Bioutopia
Real taxonomists
giovedì 30 ottobre 14
The Real Taxonomists could then concentrate on more
important matters than scraping Names off granite, and
Phylogenia would be free to change her mind whenever she
liked.
The Name would remain the same, and the Name-users will
be happy too.
Peace would return to Bioutopia
A tale from Bioutopia
Name-users
two tribes live in Bioutopia
Real taxonomists
giovedì 30 ottobre 14
Conclusioni (forse...)
Identificazione e classificazione sono due processi indipendenti
HTS (e le tecniche moleculari in genere) sono un supporto a questa divisione
Le Specie esistono davvero e/o sono ancora l’unità fondamentale della biologia?
giovedì 30 ottobre 14
forse sarebbe davvero più opportuno pensare (soprattutto) in termini di
unità in evoluzione e unità osservabili (che non sono necessariamente la stessa cosa)
Conclusioni (forse...)
giovedì 30 ottobre 14
Andrea Galimberti
Maurizio Casiraghi
Monica Pozzi
Valerio Mezzasalma
Antonella BrunoAnna Sandionigi
Ilaria Bruni
Fabrizio De Mattia
Emanuele Ferri
Massimo Labra
Michela Barbuto
giovedì 30 ottobre 14
Grazie. time for questions?
Maurizio Casiraghi
Università degli Studi di Milano-BicoccaZooPlantLab - Dip. Biotecnologie e Bioscienze
Piazza della Scienza 2 – 20126 [email protected]
www.zooplantlab.btbs.unimib.itSocietà Italiana di
Biologia Evoluzionistica
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTUMolecular Operational Taxonomic
Units (MOTUs) are clusters of molecular variability.
Individual specimens were considered to belong to the same MOTU when the
sequenced segment of 450 bases was > 99.5% identical
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individuals
morphotypes
Single approach taxonomy
species
Specie
MOTUs
UCSs
Osservato
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
Groups of individualswithin nominal species showing
large genetic distances,but without further information, are considered Unconfirmed
Candidate Species (UCS) deserving further study
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCL
Integrative taxonomyOsservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCL
Integrative taxonomy
When additional data indicate that these genealogical units are not
differentiated at the species level, they are flagged as Deep
Conspecific Lineages (DCL)
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCL
Integrative taxonomy
IOTU
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCLs
Integrative taxonomy
IOTU
Integrated Operational Taxonomic Units (IOTUs) are entities defined by the
congruence of two or more entries of the so called “taxonomic circle”
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
morphotypes
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTUs
UCSs
DCLs
Integrative taxonomy
IOTUs
Osservato
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCL
Integrative taxonomy
IOTU
CCS
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCSs
DCLs
Integrative taxonomy
IOTU
CCS
Confirmed Candidate Species (CCS), applies to those deep
genealogical lineages that can be considered good species
following standards of divergence for the group under study but that
have not yet been formally described and named
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14
individui
Single approach taxonomy
specie
Specie
MOTU
UCS
DCL
Integrative taxonomy
IOTU
CCS
contenuto informativo
Osservato
morfotipi
giovedì 30 ottobre 14