こんな時どうする！！ hplcトラブルシューティング...lc基礎講座 1...

LC基礎講座

1

こんな時どうする！！HPLCトラブルシューティング

⽇本ウォーターズ株式会社第23回最新科学機器展最新技術セミナー

©2015 Nihon Waters K.K. 1

第23回最新科学機器展最新技術セミナJune 2015

Content

LC装置の構成溶液とサンプル調製の注意事項トラブルシューティングトラブルシューティングよくあるトラブルと対処⽅法

– ゴーストピーク– 保持時間変動– ベースライン異常– ピーク形状の異常

分析終了後の注意事項


分析終了後の注意事項 LC消耗部品

LC基礎講座

2

LC装置の構成クロマトグラフ（装置）

④検出器分離成分の検出検出⽅法の異なる検出器を複数接続することも可能

②インジェクター試料の注⼊

③カラム（分離）

①ポンプ移動相の送液


⑤データ処理装置データの解析と保存

溶媒 ①ポンプ ②インジェクター ③カラム ④検出器 ⑤データ処理

トラブルシューティングには流路と装置構造の把握も⼤切！

ポンプ脈流がなく安定した送液ができること⼗分な脱気が必要

o 移動相は脱気（デガス）しておく移動相は脱気（デガス）しておくo 気泡がポンプヘッド内に残らないようにする

構造上注意すべき点– チェックバルブ（逆流防⽌弁）のつまり

o ポンプヘッドの⼊⼝や出⼝には、ヘッドから押し出された液が逆流して移動相のリザーバーに戻らないようにチェックバルブが取り付けられている

o チェックバルブはシールの上にボールが乗っていて下からの流れではボールが浮き上がり液が流れる上からの流れはボルが抑えつけられて流れない仕組み


り液が流れる。上からの流れはボールが抑えつけられて流れない仕組みo 移動相中のごみがバルブに付くと逆流してしまい、カラムに液を送れなくなるo ろ過したバッファーを使⽤し、使⽤後はバッファーの塩類が残らないように⼗分に⽔洗する

LC基礎講座

3

ポンプ－⼀般的なポンプの構造（ヘッド）

出口のチェックバルブ

フィルターウォッシュホール

2つのヘッドを並列に配置

入り口のチクバルブ

ボール＆シール

プランジャー

プランジャーシール

2つのヘッドを並列に配置•交互に送液

エアーは脈流の原因（溶媒を取り⼊れるときヘッド内の圧は⼤気圧になる）


チェックバルブ溶媒の流れ

⼀定流量が保てる脈流がない送液（圧⼒変動のない送液）

オートインジェクター

再現性の確保– サンプル計量⽤のシリンジに気泡があるとサンプルの吸⼊が不正確になる

シリンジ内の溶媒を置換脱気o シリンジ内の溶媒を置換、脱気o 気泡が⽬で確認できるほど⼊っている場合は、溶媒置換・エア抜きを繰り返す

クロスコンタミの防⽌直前の分析の汚れを持ち越すこと– ニードルや試料注⼊ポートの洗浄機構部分に、サンプルを溶解する適切な洗浄液を設置するo ただし塩類はニードルなどをいためるので使⽤しない


– ウォーターズ2695では緑のチューブが洗浄液の取り⼊れ⼝

注⼊⽅式– ピーク形状に影響

LC基礎講座

4

検出器

⾼感度– ノイズ、ドリフトが⼩さく少量の成分も検出

選択性選択性– 特定の物質だけを検出

少ないセル容量– シャープな定量性に優れた検出

測定濃度に対しての直線性– 定量性に優れた検量線を作成できる

広いダイナミックレンジ


広いダイナミックレンジ– 低濃度から⾼濃度まで幅広く測定できる

使いやすさ– 温度変動など設置環境による影響も受けず常に安定な測定が⾏える

検出器まとめ

Detector RI UV/Vis 蛍光 ECD 電気

伝導度 ELSD MS

選択性汎⽤的選択的(発⾊団)

選択的(蛍光)

選択的(酸化還元)

選択的(イオン) 汎⽤的選択的

(イオン化)

感度 μg ng pg pg pg ng pg

直線性 104 105 103 106 105 103 103


送液の影響 Yes No No Yes Yes No Yes

温度の影響 Yes No No Yes Yes No No

LC基礎講座

5

溶液の調製

移動相– ⽔– 有機溶媒– バッファー

シールウォッシュ液– シールウォッシュはポンプシールに塩が析出するのを防⽌– バッファー系で分析する場合は必須– バクテリア発⽣を防ぐため数％有機溶媒を含む⽔溶液を⽤いる

ニードルウォッシュ液– クロスコンタミ（キャリーオーバ）を防⽌

プ塩液


– サンプルをよく溶かし塩を含まない溶液を選択パージ液

– オートサンプラーの種類によって注⼊補助溶媒が必要

*メーカーによって各種溶液の呼び名は異なる

清浄な溶媒瓶を使⽤する—移動相の継ぎ⾜しはカラムの詰まりやゴーストピークの原因となる

移動相調製の注意点

フレッシュな⽔を使⽤する— Milli-Q⽔やそれに相当する超純⽔のみ使⽤

バッファーの調製—⽔溶液の段階でのｐH調製が望ましい—塩類を使⽤している場合は必ずろ過をする

移動相のろ過移動相中のごみなどをあらかじめ取り除きカラム及び配管の詰まりを防⽌


—移動相中のごみなどをあらかじめ取り除きカラム及び配管の詰まりを防⽌— メンブレンフィルターの材質とポアサイズの確認

・有機溶媒耐性？有機溶媒&⽔溶液耐性？などを購⼊前に確認・HPLCカラムで分析をする場合は、 0.45μmのフィルターでろ過・UPLCカラムで分析をする場合は、 0.20μmのフィルタでろ過

LC基礎講座

6


移動相の脱気—脈流の原因となる気泡を取り除く—装置にセットする前に脱気装置にセットする前に脱気

o 減圧o 超⾳波o 減圧＋超⾳波（最も効果的）

—装置内で⾃動的に脱気o ヘリウムスパージo インラインデガッサー


混合移動相の調製—混合⽅法


MeOH

o メスシリンダーを使⽤し、正確に混合

—混合の順番o ⽔／有機溶媒

• 混合する順番は常に同じ順番o バッファー／有機溶媒

• 塩の析出に注意しながら

400 mL H2O

400 mL H2O

600 mL MeOH

H2O0.4 mL/min


塩の析出に注意しながらバッファーに有機溶媒を加えていく

—混合が先か、ろ過が先か？o 先にバッファーのろ過をする

MeOH 0.6ml/min

H2O

600 mLMeOH

LC基礎講座

7

サンプル調製

必要に応じて除タンパクする– アセトニトリル、アルコールなどモノクル酢酸スルホサリチル酸– モノクロル酢酸、スルホサリチル酸

– 限外ろ過– タンパクは変性し強⼒に詰まってしまう

注⼊前に必ず濾過– メンブレンフィルター 0.45 μm以下のフィルターを使⽤


メンブレンフィルタ 0.45 μm以下のフィルタを使⽤– UPLCカラムで分析する場合は0.20 μmのフィルターを使⽤

サンプル調製: ろ過・遠⼼

フィルターろ過が必要不可⽋な可能性– 常に化学的に適切な0.2 µm フィルターを使⽤する

プレカラムフィルターが有⽤な可能性微粒⼦除去には遠⼼分離が不可⽋なことが多い

– 4,000-12,000 rpmで5-30分遠⼼分離を⾏うことで全ての細かい微粒⼦を除去


フィルターろ過後に12,000 rpmで遠⼼分離した処⽅サンプル澄んだ溶液(good)

0.2 µmフィルターろ過後の処⽅サンプル

⾮常に細かい微粒⼦あり: うっすらと濁った溶液 (still bad)

希釈液に溶かしたDonepezil錠剤サンプル。USPモノグラフ記

載通りに調製。微粒⼦あり(very bad)

LC基礎講座

8

トラブルシューティング

正常時/異常時のクロマトグラムの⽐較分析条件の⽐較

分析条件由来の問題カラムガードカラム

ポンプインジェクター

問題の原因を確認簡単に対処できる原因から対処する

装置由来の問題


ガドカラム移動相添加剤サンプル、バイアル

インジクタ検出器データ取り込み配管接続・配管カラムバイアル

標準品による確認試験⽤の条件を確⽴しておくと分析条件/装置の切り分けが簡単

クロマトグラムの⽐較

‘正常'


‘異常'ピーク⾼さの低下、保持時間異常

ピーク形状の異常（ブロード・テーリング）

LC基礎講座

9

よくあるトラブル

ゴーストピーク圧⼒異常

– 圧⼒が⾼い– 低い– 不安定

ベースラインノイズ保持時間の変動ピク形状が悪い


ピーク形状が悪い

ゴーストピーク

ゴーストピークの原因を突き⽌める– 装置、分析条件いずれが原因かを確認する

E 使⽤時の診断⼿順– Empower使⽤時の診断⼿順


①プレップ注⼊の実⾏：インジェクションの動作を⾏わず、データを取り込む②0 μl注⼊の実⾏：インジェクションの動作を⾏い、ブランク液は注⼊せずにデータを取り込む③④ブランク注⼊：注⼊量を変化させてブランクのデータを取り込む

LC基礎講座

10

ゴーストピーク-原因と対策

動作原因対策

移動相の汚染*移動相の再調整 *移動相容器の汚染*市販の⽔を購⼊し試す（移動相は継ぎ⾜しは汚染の原因となります）

①プレップ注⼊でピーク検出

移動相の汚染 *市販の⽔を購⼊し試す（移動相は継ぎ⾜しは汚染の原因となります。）*別ブランドの溶媒で試す

カラムの汚染 *カラム洗浄を実施する、新品カラムを使⽤する。*分析毎にカラム洗浄の⼯程を追加する

②0μL注⼊でピーク検出

ニードル洗浄液が流れていない

*パージの実施*洗浄液が流れているかを確認

ニードル洗浄液が不適切

*よりサンプルが溶ける溶液に最適化0.1%ギ酸：アセトニトリル：メタノール：イソプロパノｰル=１：１：１：１の溶液で試す


③④ブランク注⼊でピーク検出

ブランクの汚染 *注⼊量に⽐例して強度が変化する場合はブランク溶液を新しくしてみる。溶媒のブランドを変更する、⽔を変更する。

バイアルの汚染 *強度が注⼊量に⽐例しない場合は、バイアルのブランドをかえてみる。*セプタムを使⽤せずに注⼊してみる

圧⼒異常－圧⼒が⾼い

⾼圧の箇所を探す– フィッティングをゆるめて、圧が下がるかどうか調べてみる– ⾼圧個所がフィルターやカラムであれば交換する

原因– 徐々に上昇する場合

• サンプル、移動相中の粒⼦が徐々に蓄積


サンプル、移動相中粒⼦が徐蓄積インラインフィルターまたはカラム

– 急激に上昇する場合• サンプル中の多量の粒⼦がカラムやチューブに詰まった

LC基礎講座

11

圧⼒異常-⾼圧箇所の確認

流路の末端から⾼圧箇所を確認する①移動相

②ポンプ

③インジェクター

④カラム ⑤検出器

⑥廃液

確認箇所原因対策検出器を外して圧⼒低下セルの詰まりセル洗浄


検出器を外して圧⼒低下セルの詰まりセル洗浄カラムを外して圧⼒低下カラムの詰まりカラム交換/カラム洗浄インジェクターを外して圧⼒低下インジェクターの詰まり⾼圧箇所の部品交換

メーカーに問い合わせポンプ部分だけで圧⼒が⾼いソルベントフィルターの詰まりソルベントフィルター交換

インラインフィルターの詰まりインラインフィルターの洗浄または交換

分離条件により圧⼒が違う－溶媒による圧⼒の差

3

各有機溶媒によって粘度が異なります。粘度が⾼いと圧⼒は⾼くなるアセトニトリル50%をメタノール50%に変更した場合のカラム圧は

12345

1

3

4

51.85

0 9

アセトニトリルメタノール

エタノールアセトンTHF

1.85/0.9=2.1倍アップする(20℃)


52

0.9

Vol% Water

THF

LC基礎講座

12

圧⼒異常ー圧⼒が低い・不安定

現象確認事項と対策

溶媒が出から流れか圧⼒が低いまたはゼロ

ポンプが原因

溶媒が出⼝から流れているか溶媒がリザーバーにあるかポンプをプライムし、気泡を追い出すチェックバルブの洗浄または交換

圧⼒が低いまたはゼロ

ポンプ以外が原因カラム温度が⾼すぎないか？溶媒の種類・流量・カラムが正しいかを確認


圧⼒が不安定気泡が原因液漏れがないか確認ポンププライム･移動相脱気チェックバルブの洗浄または交換

ベースラインノイズ

原因が流路系か電気系か特定する– 送液を停⽌し数分間ベースをモニターする

ベースラインノイズが改善– 流路系（ポンプ・移動相・流路・カラム）が原因

ノイズが改善されない– 検出器やデータ処理機の電気的な故障


LC基礎講座

13


短い周期(数秒から数分）

ポンプの圧⼒が⼀定であるか確認する不安定な場合はポンプのパージを実施をかん

ベースラインノイズ流路系

(数秒から数分）エアをかんでいるミキシング不良→⼤容量ミキサーの追加

周期的でない不安定なノイズ(スパイクノイズ）

検出器のセル内の気泡が原因セル内のエア抜きを実施するセルのパージ(UV検出器では0.009インチのチューブを30cm程度つなげ背圧をかける,他の検出器は耐圧に注意して0.04インチのチューブを接続)


⼤容量ミキサーエアをかんでいる

ミキシング不良

ベースラインノイズ


⻑い周期（⼗数分から数時間）

室温が不安定な場合が多い・カラムヒーターの使⽤（⼗数分から数時間）・エアコンの吹出し⼝近くや直射⽇光が当たる場所は避ける

ベースラインドリフト

平衡化不⾜移動相の汚れセルの汚れ/カラムの汚れセル・カラムの汚れの場合は、溶出⼒の強い溶媒で洗浄


⻑い周期のノイズドリフト

LC基礎講座

14

ベースラインドリフト移動相・波⻑によって異なる

10mM Phosphate - Methanol gradient 5-80% in 10 min.

10mM Phosphate - THF gradient 5-80% in 10 min.


25mM Amm. acetate - Methanol gradient 5-80% in 40 min. 50mM Amm. bicarbonate - Methanol

gradient 5-60% in 10 min.

保持時間の変動


保持時間が不安定送液流量の変動や溶媒の混合に問題がある保持時間が不安定圧⼒変動あり

送液流量の変動や溶媒の混合に問題がある不安定な場合はポンプのパージを実施チェックバルブ・ミキサーの確認

保持時間が不安定圧⼒変動なし

カラム平衡化不⾜イオンペア試薬は特に⼗分な平衡化が必要グラジエント分析の場合平衡化時間は⼗分に取るともに、平衡化時間を⼀定にする1回⽬のグラジエント分析は再現が得られない事が多い


保持時間が正しくない

⽇間で再現性がない場合・カラム、カラム温度、移動相の組成、pHが正しいか確認・流量が正しいか確認装置間で再現性がない場合・グラジエントの場合はシステム容量に相違がないかを確認

LC基礎講座

15

保持時間の変動溶媒組成の影響

溶媒組成の変化– 溶媒の組成が1％異なると、保持時間は5-15%変動する可能性がある

プレミックス移動相調製ミスo プレミックス移動相調製ミスo ダイアルミックスポンプのミキシング不良


1 2 3 4 1 2 3 4

保持時間の変動ー温度の影響

温度–温度が⾼くなればピークは早く溶出する温度が⾼くなればピクは早く溶出する–温度が1℃変化すれば、１－２％保持時間が変動する

23.5 °C


26.3 °C

LC基礎講座

16

ピーク形状が異常


カラム劣化によるカラム効率の低下

全てのピークが異常

*ガードカラムの交換*分析カラムの洗浄、交換インジェクターの異常による試料の拡散*溶出の早いピークほど影響されるチューブ内径が⼤きい、フェラルの取り付けが正しくないカラム・システムの汚れ注⼊量・濃度が不適切検出器の取り込みポイントが不適切


特定のピークが異常

溶出の早いピークの異常*インジェクターからカラムまでの間で拡散サンプル溶解溶媒が正しくない*溶出⼒の強い溶媒にサンプルを溶かしている(逆相の場合有機溶媒100％)

*移動相に近い溶液で溶解

カラム・ガードカラムの詰まり・汚れ

ピーク形状が異常カラムの劣化

正常カラム=圧⼒ 800 psi


異常カラム=圧⼒ 2500 psi

LC基礎講座

17

ボイドのできたカラム

ピーク形状が異常カラムのボイド（空隙）

正常カラム


ピーク形状が異常-注⼊溶媒なるべく移動相⼜はそれに近い組成である事

– 100％有機溶媒 →ピークの割れなどの原因– pHの極端な溶媒 →強塩基はカラムをいためる（ODS）

5 1510 Min.

Sample in Water

0.04 AU

1

23 移動相：0.1%TFA/メタノール

（60/40）


下段のクロマトグラムは移動相よりも溶出⼒の強い溶媒を注⼊溶媒として⽤いている

Sample in 80% MeOH 0.02 AU

12

3

LC基礎講座

18

ピーク形状が異常ー注⼊容量

注⼊量はカラムの内容積の1% が⽬安– 注⼊溶媒が移動相の場合⾼さ法検量線を引た場合は飽和するとが多– ⾼さ法で検量線を引いた場合は飽和することが多い

– ⾯積法の場合は 10%程度まで直線性がある

1%を越えると– ピークトップがつぶれてくる– ピークトップが割れる

代表的なカラムの場合


代表的なカラムの場合– 4.6 x 150 mm: 25 μL– 3.9 x 150 mm: 20 μL – 2.1 x 150 mm: 5 μL – 1.0 x 150 mm: 1 μL

ピーク形状が異常ー配管とフィッティング

デッドボリューム

フェラルの取り付けチューブの内径の影響


⻑いチューブもバンドの広がりの原因となる

LC基礎講座

19

ピーク形状が異常

GoodBad

チューブの切断⽅法にも注意をする

GoodBad


チューブ断⾯が斜めにカットされている平らでスムーズなチューブ断⾯

ピーク形状が異常カラム・システムの汚染が原因の場合カラム汚染

– カラムの取扱説明書に沿って洗浄ガドカラムカラムの交換– ガードカラム・カラムの交換

システム汚染– 配管の汚れによりピーク形状が悪くなる場合もある


システム洗浄前/異常時システム洗浄後/正常時

LC基礎講座

20

ピーク形状が異常カラム・システムの汚染が原因の場合 LCシステム洗浄⽅法（例）

– システム洗浄液：4液混合液o ⽔/メタノール/アセトニトリル/イソプロパノール = 1:1:1:1 (0.2%ギ酸含有）o ⽔/メタノル/アセトニトリル/イソプロパノル 1:1:1:1 (0.2%ギ酸含有）

– ⼿順o LCの全てのラインを洗浄液にセットするo バイアルにも洗浄液を取り分けておくo 不要になったカラムを接続する（背圧をかける⽬的）検出器がMSの場合はカラムの出⼝を廃液ラインに接続する

o ポンプの全ラインを通常よりも⻑い時間プライムを実施する


o インジェクターのプライムを実施するo 全ライン同じ⽐率で送液を開始する（例）A/B/C/D=25/25/25/25）o 洗浄溶液を30回注⼊する分析スケジュールを作成し、分析を開始する

*洗浄⽅法は上記の限りではありません、他の洗浄液例）2%アンモニア⽔など


72時間以上装置を停⽌する場合はシステム内は有機溶媒に置換する– バッファーを移動相として⽤いた場合は、⽔で装置内部を置換した後に有機溶媒に置換するする

– ⽔やバッファー100%の状態で装置を保管するとバクテリア発⽣の原因となり装置やカラムの詰まりの原因となる

– カラムは各カラムの説明書に従って、洗浄・保管する


LC基礎講座

21

LCの主な消耗部品

ポンプ– プランジャーシールソルベントフィルタ

プランジャーシール

ソルベントフィルタ

チェックバルブ

– ソルベントフィルター– チェックバルブ– インラインフィルタ

インジェクター– シリンジ– ニードル

カラムシリンジ

インラインフィルタ


カラム– ガードカラム

検出器– ランプ

シリンジ

ランプ

ガードカラム

まとめ

LC装置の構成溶液とサンプル調製の注意事項トラブルシューティングトラブルシューティングよくあるトラブルと対処⽅法

– ゴーストピーク– 保持時間変動– ベースライン異常– ピーク形状の異常



分析終了後の注意事項 LC消耗部品

LC基礎講座

22

ご清聴、ありがとうございました

弊社HPのトラブルシューティング操作ガイド集やウェビナーもご活⽤ください。

ホームページ： http://www.waters.co.jp

トラブルシューティングMassLynx編： http://www.waters.com/japan_masslynx_tips

Empower編： http://www.waters.com/japan_empower_tips

消耗編


カラム・消耗品編： http://www.waters.com/ChemCU

ウェビナー： http://www.waters.com/ondemand

こんな時どうする！！ hplcトラブルシューティング...lc基礎講座 1...

Documents