Il compartimento naturale dell’immunità innata:

I recettori Toll-like (TLRs) e le proteine Nods

Dr. Luigi Lembo FazioSapienza Università di RomaDipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”

Pattern-Recognition Receptors, PRRs1. Sono molecole recettoriali che riconoscono motivi conservati nell’ambito dei microrganismi (PAMPs)

2. Recettori geneticamente determinati nella linea germinale

3. Sono espressi in diversi tipi cellulari (macrofagi, DC, mast-cells, cellule NK, cellule epiteliali, endoteliali, fibroblasti)

4. Possono essere:

a) circolanti (pentraxina PTX3)

b) di membrana (TLRs)

c) citosolici (proteine Nods/RLRs)

Notevoli omologie strutturali e funzionali con i geni R delle piante

Funghi, batteri e virus producono una serie di molecole (PAMPs) che possono essere riconosciute dall’ospite

Prodotti da microrganismi e NON dalle cellule eucariotiche

Conservati tra i microrganismi di una data classe

Essenziali per la sopravvivenza microbica

Prodotti da microrganismi patogeni e NON patogeni (MAMPs: Microbe-Associated Molecular Patterns)

Funzione ed espressione trascrizionale diversa dai fattori di virulenza

PAMPs: Pathogen-Associated Molecular Patterns

Fattori di virulenzaPAMPs

Flagello

PGNCpG DNA

LPS

PAMPs: •si sono evoluti per fornire funzioni fisiologiche essenziali•sono altamente conservati•l’espressione è costitutivaFattori di virulenza: •si sono evoluti per permettere un adattamento microbico ad un determinato ambiente•differiscono tra i differenti ceppi•possono essere inducibili

I PAMPs vs i fattori di virulenzaPAMPs Fattori di virulenza

Batteri Presenti su tutti i microrganismi, patogeni e commensali

Esclusivamente espressi dai patogeni

Espressione Costitutiva Inducibile

Localizzazione Cromosomale Generalmente portati da elementi plasmidici o da elementi genetici mobili

Funzione Strutturale Interazione con l’ospite

Frequenza di mutazione Molto bassa Elevata

Grado di conservazione Molto alto tra i membri di una data classe

Molto basso

PAMPs – ligandi dei PRRs• Componenti della parete cellulare batterica: lipopolisaccaride (LPS),

lipoproteine batteriche (BLPs), acido lipoteicoico (LTA), peptidoglicano

(PGN), sequenze DNA ricco in guanina e citosina ipo-metilato (CpG)

• DNA e RNA virale

• Componenti della parete cellulare dei funghi: zimosani e ife

• Alcuni costituenti dei Protozoi

• Elminti e altri costituenti di parassiti?

• Cellule apoptotiche

• Ligandi endogeni (DAMPs): HSP60

• Auto-antigeni ?

PAMPs-PRRs• I PAMPs possono essere riconosciuti da molecole recettoriali dell’ospite

(PRRs)

• In seguito al riconoscimento dei PAMPs mediato dai PRRs diversi tipi cellulari possono portare ad una potente risposta di tipo protettivo che include:

• Reclutamento di cellule fagocitiche• Secrezione di peptidi anti-microbici• Sintesi e Rilascio di citochine/chemochine pro- e anti-infiammatorie• Istruzione delle cellule dendritiche a promuovere la generazione di una risposta

immunitaria adattativa• Azione diretta sui linfociti B naive (proliferazione e differenziazione)• Azione diretta sui linfociti T effettori e memory

• L’attivazione dei PRRs è un meccanismo di protezione per l’ospite ma l’over-stimolazione dei PRRs può causare malattie gravi

Le proteine NLRs

Struttura delle proteine NLRsLe proteine NLRs presentano un’organizzazione modulare:

1. Dominio amino-terminale EBD [Effector-Binding Domain]

2. Dominio centrale di oligomerizzazione, NOD [Nucleotide-Oligomerization Domain] ora noto come NACHT domain

3. Estremità carbossilica, indicata come LRD [Ligand-Recognition Domain]

Le principali differenze tra le proteine NLRs si riscontrano a livello del modulo EBD, la cui funzione sembra essere quella di riconoscere specifici partners molecolari attraverso interazioni omo ed eterofiliche

PRRs citosolici: la famiglia delle proteine NLR

Caratteristiche comuni dei membri della famiglia NLR:

a) Dominio C-terminale di ripetizioni ricche in leucina (LRR) coinvolto nel riconoscimento dei ligandi

b) Dominio NACHT che media l’oligomerizzazione e che è essenziale per l’attivazione

c) Dominio effettore N-terminale responsabile dell’interazione proteina-proteina con le molecole adattatrici

Kersse et al., 2011

La diversa associazione di/tra proteine NLR e il reclutamento di molecole effettrici (caspasi, molecole adattatrici, etc ) crea delle piattaforme sensibili ai componenti microbiche e a molecole di pericolo in grado di attivare l’immunità innata

NOD-soma, inflammosoma, apoptosoma…

CARD

NOD1

NOD2

CARD

CARD

NACHT

NACHT

LRR

LRR

Le proteine Nod1 e Nod2

• Funzionano come sensori intracellulari• Riconoscono frammenti di PGN mediante il dominio

LRR

Il Peptidoglicano (PGN)

Quali sono i motivi riconosciuti da Nod1 e Nod2?

Quali gli effetti dell’attivazione di Nod1 e Nod2?

• Nelle cellule dendritiche, nei macrofagi e nei monociti si ha la produzione di citochine pro-infiammatorie (TNFa, IL-1b, IL-6, CXCL-8, IL-12p70), ossido nitrico (NO), espressione di molecole co-stimolatorie e molecole di adesione

• Nelle cellule epiteliali si ha la produzione di mediatori pro-infiammatori (TNFa, CXCL-8, MIP2) peptidi antimicrobici (b-defensine)

I Toll-like receptors (TLRs)

I Toll-like receptors (TLRs)

• Ad oggi sono noti 13 TLRs: 10 nell’uomo (hTLRs), 13 nel topo (mTLRs)

• I primi nove TLRs (TLR1-TLR9) mostrano un elevato grado di conservazione strutturale e funzionale tra topo e uomo

• Con eccezione del TLR8 il cui ligando nel topo non è stato ancora identificato

• mTLR10 non è funzionale come conseguenza di un’inserzione retrovirale

• hTLR11 non funzionale a causa di un prematuro codon di stop nella sequenza codificante

I PRRs di membrana: i recettori TLRs

I PRRs di membrana: i recettori TLRs

Struttura dei TLRs

3 domini:

•Extracellulare, LRR

•Transmembrana

•Intracellulare, TIR

Il Recettore Toll di Drosophila

Le mutazioni nel gene Toll determinano la morte del moscerino in seguito a

infezioni fungine

Lemaitre et al., Cell 86: 973–983

Vie di segnalazione attivate dai TLRs

In seguito a dimerizzazione si hanno DUE vie di segnalazione

Via MyD88 dipendente (tutti i TLRs ad eccezione del TLR3): Attivata dalla maggior parte dei TLRs in risposta al legame con un agonista Induce l’attivazione delle MAP chinasi e di NF-kB Attivazione di geni interferonici IRF5 mediati Determina una up-regolazione delle molecole co-stimolatorie e MHC sulla

superficie cellulare

Via MyD88 indipendente (TLR3 e TLR4): Induce l’attivazione di IRF-3 e la produzione di interferon di tipo I Incrementa le molecole co-stimolatorie e MHC sulla superficie cellulare Induce l’espressione di citochine infiammatorie Induce la maturazione di cellule dendritiche

TLRs implicati nel riconoscimento di strutture batteriche

TLR4

• Il primo TLR ad essere stato individuato mediante omologia di sequenza

• Topi C3H/HeJ che presentano una mutazione puntiforme nel dominio TIR di TLR4 sono non-responsivi agli LPS• Cosa riconosce?

– LPS– Ligandi endogeni, Heat shock protein,

oligosaccaridi di acido ialuronico, fibrinogeno– Pneumolisina di S. pneuomoniae

L’LPS: la struttura Regione lipofilica, il Lipide A Regione oligo/polisaccaridica idrofilica legata covalentemente

Porzione oligo/polisaccaridica Lipide A

Stabilizzazione delle molecole di LPS mediante il legame con cationi divalenti

Funzione di barriera impermeabile

(Polimixine, poliamine, peptidi e proteine cationiche, agenti chelanti [EDTA])

Lipide A: struttura delle Enterobacteriaceae

• lo scheletro è costituito da un disaccaride con legame b,1-6

• sono presenti due gruppi fosforici (solitamente il Lipide A è monofosforilato)

• sono presenti fino a 4 catene aciliche che a loro volta possono essere sostituite da ulteriori acidi grassi fino a 7 sostituenti acidi

Legame a-glicosidico

Legameestere

Scheletro di D-glucosamine

Posizione di attacco della regione polisaccaridica

• Per essere attivo il TLR4 necessita di un adattatore, il fattore solubile MD2

• Il complesso TLR4/MD2 si forma a livello del reticolo endoplasmatico e viene successivamente traslocato a livello della membrana citoplasmatica

Adattatori molecolari del TLR4

• Gli LPS nel siero vengono legati da LPS-binding protein (LBP) e trasportati alle cellule target

• Le LBP mediano il trasferimento di monomeri di LPS al CD14 che facilita il riconoscimento da parte del TLR4

L’adattatore MD2 Il corecettore MD2 possiede una tasca, una cavità all’interno della quale vengono alloggiate 5 delle 6 catene aciliche del lipideA Negli LPS esacilati, la sesta catena di acido grasso è all’esterno della tasca, a contatto con l’ambiente esterno Le proprietà agoniste o antagoniste dell’LPS sono dettate dalla stechiometria delle catene aciliche con MD2

TLR2• Riconosce molteplici componenti batteriche:

– Lipoproteine/lipopeptidi– Acidi lipoteicoici– Peptidoglicano G+ (S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae)– Lipoarabinomannani dei micobatteri– Zimosani dei funghi (S. cerevisiae)– LPS atipici (Porphyromonas gingivalis, Helicobacter pylori)– HSV e VZV (varicella-zooster virus)

Come può riconoscere un così vasto spettro di componenti microbici?

1. TLR2 è in grado di formare eterodimeri (con TLR1 o TLR6)

2. Interagisce con altri recettori, per esempio dectin-1 (zimosani)

3. Può interagire anche con il CD14 che induce risposte potenziate verso alcuni PAMPs

Le lipoproteine

lipoproteine

CH2 CH CH2 S Cys

O O NH

(aa)56

Lys NH2

COOH

PEPTIDOGLICANO

XXXXXXXXXXXXXX GlcNAc MurNAc XXXXXXXXXXXXXXXXXX

D-Ala

L-Ala

D-Glu

m-Dap NH2

LIPOPROTEINA

Lipoproteine triacilate

Lipoproteine diacilate

Es: MALP2 (macrophage-activating lipopeptide da Mycoplasma fermentans)

L’eterodimero TLR2/1 riconosce le lipoproteine triacilate

L’eterodimero TLR2/6 riconosce le lipoproteine diacilateTLR6TLR2

TLR1TLR2

Gli eterodimeri di TLR2

TLR5Il motivo batterico riconosciuto è rappresentato da una sequenza altamente conservata tra diverse specie batteriche di 13 amminoacidi della flagellina (D1). Seppur presente nella struttura flagellare, questa sequenza è accessibile al riconoscimento solo quando in forma monomerica.

Ramos et al., Trends Microbiol. 12:509-516 (2004)

Il TLR5 interagisce con una specifica conformazione del dominio D1 della flagellina che assume solo quando questa è in forma monomerica

Alcuni batteri patogeni flagellati hanno evoluto dei meccanismi per eludere la risposta mediata dal riconoscimento della flagellina:Helicobacter pylori: presenta una flagellina funzionale per quanto concerne la motilità ma che presenta una sequenza alterata a livello del dominio riconosciuto dal TLR5Vibrio cholerae e H. pylori: la flagellina è mantenuta strettamente racchiusa nel flagello poiché è ricoperta da un rivestimento membranoso per evitare il rilascio di essa nell’ambiente

TLR9• Riconosce oligonucleotidi CpG ipo-metilati• Questi sono motivi abbondanti nel genoma batterico, mentre nei

mammiferi la frequenza è altamente ridotta e in più quando presenti sono altamente metilati

• Il TLR9 in condizioni fisiologiche si localizza a livello del RE ma agisce a livello endosomiale

• I batteri in seguito a fagocitosi si ritrovano a livello dell’endosoma dove un ambiente acido e riducente porta alla degradazione del DNA batterico in ssCpG

• Il TLR9 sembra essere coinvolto nella patogenesi di alcune malattie autoimmuni attraverso il riconoscimento di strutture cromatiniche

• CpG inducono produzione di IL-6, IL-12 e TNFa e l’attivazione di NF-kB e JNK

• Alcuni DNA virali (HSV, citomegalovirus) inducono attivazione di TLR9• Plasmodio della malaria induce risposta mediata da TLR9

TLRs implicati nel riconoscimento di strutture virali

TLR3• Riconosce dsRNA• Il dsRNA è o il genoma virale (reovirus) o è prodotto da molti virus come

intermedio del loro ciclo repicativo. I dsRNA inducono la sintesi di interferoni di tipo I (IFN-a/b) ad attività anti-virale e immunostimolatoria

TLR7 e TLR8• Presentano un’elevata omologia• Riconoscono:

– ssRNA ricchi in uridina come quelli del virus dell’immunodeficienza umana e del virus dell’influenza

– composti sintetici quali imidazochinoloni– Streptococci di Gruppo B

Sono espressi a livello della membrana endosomiale e questo potrebbe spiegare la mancata attivazione da parte degli RNA normalmente presenti nelle cellule

Malattie associate a NOD1 e NOD2

Malattia Mutazioni CaratteristicheNOD1

Infezione di Helicobacter pylori nessuna mutazione trasporto di PGN nelle cellule epiteliali attraverso sistema di secrezione di tipo IV

Infezione di Chlamidia pneumoniae nessuna mutazione Attivazione di NF-kB nelle cellule endoteliali

Infiammazioni croniche dell’intestino polimorfismi Fattori di rischio per IBD nel dominio LRR

Asma polimorfismi Fattori di rischio nel dominio LRR per l’asma

NOD2Morbo di Crohn Arg702Trp; Gly908Arg difetto

Leu1007fsinsCys nell’attivazione di NF-kB

Blau Syndrome Arg334Trp; Arg334Gln costitutiva attivazione di Leu469Phe NF-kB

Morbo di Crohn• Processo infiammatorio transmurale e discontinuo• Presenza di granulomi• Ascessi fistolosi e aree di ulcerazione • Dolori addominali associati a diarrea• Ispessimento dell’intestino• Febbre• Manifestazioni extraintestinali a carico delle articolazioni, della cute, del

fegato e degli occhi

Nei malati di Crohn si ha un’incidenza dell’80% di un polimorfismo in Nod2

Effetti della mutazione Nod2

In vitro: si osserva una diminuzione dell’attivazione di NF-kB

In vivo: si osserva una over-espressione di NF-kB con conseguente sintesi e rilascio di citochine infiammatorie

a) Un difetto a livello della segnalazione di Nod2 potrebbe portare ad una proliferazione incontrollata di microorganismi nell’intestino e conseguentemente una prolungata infiammazione (es: assenza di peptidi antimicrobici a livello delle cripte)

b) Nod2 alterato potrebbe non indurre la secrezione di molecole anti-infiammatorie quali IL-10

c) Alcuni autori riportano un ruolo negativo di Nod2 sul TLR2; in assenza di Nod2 si potrebbe avere una continua stimolazione del TLR2 e quindi un’induzione di molecole infiammatorie

TLRs Diseases FeaturesTLR-4 Asp299Gly

TLR-4 sequence variant

TLR-5 stop codon

TLR-4 Asp299Gly

Thr399Ile

TLR-2

TLR-3

Alzheimer’s Disease; Diabetes; Coronary Artery Disease

Prostate Cancer

Systemic Lupus erythematosus

Ulcerative colitis/Crohn’s Disease

Atherosclerosis

Lee and Hwang, 2006 Molecules and Cells.

Gene polymorphism is associated with protection from the development of disease

The mutation is increased in patients

Diabetes The treatment with TLR agonist to animals induced experimental disease model