imagerie moléculaire optique de fluorescence jean-marc dinten cea-leti/dtbs

Imagerie moléculaire optique de fluorescence

Jean-Marc DintenCEA-LETI/DTBS

© CEA. All rights reserved

Imagerie Fluo per-op JMD | 11/01/2013 | 2

Plan

Pourquoi l’imagerie optique moléculaire de fluorescence pre-clinique Clinique Son positionnement par rapport aux méthodes d’imagerie

Marqueurs fluorescents Systèmes d’Imagerie de Fluorescence Exemples d’applications :

Imagerie per-opératoire Tomographie optique de fluorescence Aide au dépistage du cancer de la prostate



Principe et objectifs

label

biomarker

Receptor

-antibody-peptides-Saccharides…

Probe,Contrast agent

Targeted

cell

-Organic dyes-Nano-particles-Activable probes…

- To detect - To localize - To quantify



Préclinique : Analyse biologique in situ

Visualiser, les processus biologiques en jeux au niveau cellulaire. suivre pas à pas un médicament pour évaluer ses effets dans le corps d'un animal, mettre en évidence l'expression d'un gène responsable d'une tumeur cancéreuse, localiser

des cellules tumorales… permettre la mise au point des traitements ciblés et personnalisés…



Etude pre-clinique longitudinale

Suivre le développement d’un modèle de pathologie (ex.: cancer du sein, …..)

Développement de médicament Analyser l’effet d’une thérapie



Per-op :marquer les tissus d’intérêt



Why do we address intra-operative imaging

The surgeon is only guided by: •pre surgery imaging•eyesight •and the sense of touch

There is a strong requirement for in situ diagnosis.“Functional and Molecular information”



Per-opératoire : ressection tissus cancéreux

Bouclage ressection/anapathologiste long, risque de marges avec cellules cancéreuses



Diagnostic : cas des biopsies de prostate

Statistics:- Most frequent type of cancer for men- Second cause of mortality by cancer in developed countries - One 50 years old man out of 10 will have this cancer.- Risk of mortality by this type of cancer 3%

Current diagnostic Protocol Routine tests (50 years old men):

Digital rectal examination Dosage of PSA (Prostate Specific Antigen) rate in blood If results are positive:

Biopsy guided by a transrectal ultrasound probe (TRUS)



Difficulté de localiser les tumeurs précoces

Ultrasound lacks contrast to localize early stage tumors and differentiate benign/malignant tumors

Biopsy are performed randomly 10 to 12 biopsies/exam, 1 to 3 exams

Risk of false negativeRisk of disseminationComplications

(hematuria, rectal bleeding, vasovagal episode,…)



Comment l’améliorer MRI imaging before ultrasound guided biopsy :

improves efficiency of biopsies requires access to MRI and coregistration (MRI/US) provides false positive

Elastography

Molecular Imaging : PET Fluorescence Imaging



Positionnement de l’imagerie de fluorescence



The main imaging methods



Les systèmes d’imagerie et leur caractéristiques



Available intra-operative imaging techniques



Need for another modality

The new imaging techniques should:• be affordable for most of the hospitals• not require dedicated infrastructure,• not require a specific skill to be used• give access to molecular and functional information,• give a direct access to this information (no specific skill to provide the diagnosis)• should be completely integrated in the operating room workflow.

The existing intra operative imaging techniques require: heavy and expensive instrumentation, dedicated operating room and contribution of skilled operators



Sensibilité des approches

Les biomarqueurs sont en général en concentration relativement faible. Si on prend une image en microscopie de fluorescence (limite de détection de l’ordre de 10 protéines fluorescentes) on marque avec en gros de qq molécules par cellules à qq 104 molecules par cellules



Sensibilité des approches 105 marqueurs par cellules ciblée. Si on est sensible au

femtomole (PET ou Fluorescence), on est capable de détecter 6,02.108 molécules de marqueurs, soit 6,02. 103 cellules (une cellule ~2 10-6 mm3). Ce qui correspond grosso-modo une sphère de 0,2mm de diamètre.

Si quelques fluorophores par cellules et la même sensibilité : on détecte à partir d’une sphère de 10mm de diamètre.

Attention: La quantité de marqueur impliqué dépend du phénomène observé. On n’est pas dans le cas d’un produit de contraste ou le signal dépend de la concentration du produit de contraste.

Si on veut augmenter la sensibilité, il faut amplifier!!!



Sensibilité des approchesSupposons qu’on utilise une solution de marqueur concentrée à 1µM/l et qu’on veuille détecter cette solution directement

Méthode de mesure Sensibilité Volume de molécule marquée dans une solution au µM/l

Bioluminescence f.molaire 10-3mm3

Fluorescence 2D en surface f.molaire 10-3mm3

PET f.molaire 10-3mm3

SPECT p.molaire 1.mm3

IRM n.molaire 1.cm3 (en fait on utilise des solution plus concentrées, 0,5mmol/ml, 500mol/l)

Rayons X µ.molaire 1.dm3(en fait on utilise des solution plus concentrées 1mol/ml, 1000mol/l)

Ultrasons ? ?



Sensibilité des approches

•Les US et les X ne sont pas adaptés à l’imagerie moléculaire.

•L’IRM est encore trop peu sensible, mais des techniques d’amplification de signal en cours de développement font progresser les choses.

•Aujourd’hui les X, US et IRM sont mieux placées sur des « surrogates » marqueurs de type physiologiques. (qui peuvent être imagés avec des produits de contraste).

•Aujourd’hui le principal outil en clinique pour l’imagerie moléculaire c’est le PET.

•En précliniques les outils de référence sont: la bioluminescence, le PET, le SPECT et la fluorescence.



Why should we use fluorescence

•Reference technique in microscopy to visualize biological pathways

•A lot of probe have already been designed

•Non radioactive

•Low cost

•Not in the scope of the 3 majors of molecular imaging



Marqueurs fluorescents



Les principaux type de processus biologiques visés

Expression d’un gène, activité d’un promoteur

Interaction entre cellules

Interaction entre protéines

Mesure d’activité enzymatique

Surexpression d’une protéine particulière



Types de marquages (avantages et inconvénient)

PET Produit radioactif durée de vie relativement courte 2h pour le 18F. Fortes contraintes sur la pharmacocinétique du produit, il faut développer une chimie rapide.

Le marqueur émet tout le temps (on ne peut pas facilement faire la différence entre signal spécifique et non spécifique)

On peut réaliser des molécules très proches des molécules naturelles

SPECT Produit radioactif, durée de vie de 6h pour le 99mTc. Fortes contraintes sur la pharmacocinétique du produit, il faut développer une chimie rapide (un peu plus simple que la chimie du PET.

Le marqueur émet tout le temps (on ne peut pas facilement faire la différence entre signal spécifique et non spécifique)

IRM On utilise des marqueurs qui modifient les caractéristiques paramagnétiques du milieu (Gd, particules ferromagnétiques).

Effets secondaires. Quantités élevées injectées...

Bioluminescence Résevé aux applications précliniques. permet de voir sur des épaisseurs de l’ordre du cm, l’expression de gènes.

Fluorescence Pour les protéines fluorescentes de type GFP, c’est réservé aux applications précliniques.

Pour les marqueurs extrinsèques, on arrive a construire de très petites molécules qui vont cibler précisément (on se rapproche des caractéristiques du PET.

On peut utiliser des phénomènes de FRET pour activer… Pb on est limité à de très faibles profondeurs (à 1cm de profondeur la sensibilité est de

qq 100pmolaire.)



Structure d’un marqueur pour l’imagerie moléculaire

label

Ligand :biomarqueur

Receptor


Targeted

cell

cargo

Agent assurant la furtivité

-PEG

-Organic dyes-Fluorescent particle-F18,Cu11..-Gd…

Label

-Chanhement de conformation -Molecular beacon-Pont dissulfure+quenching…

Mecanisme d’activation du label

Cible

-Structure peptidique-Nanoparticule-Dendrimer-Polymer….

Cargo

labellabel

Ligand :biomarqueur

Receptor


Targeted

cell

cargo

Agent assurant la furtivité

-PEG

-Organic dyes-Fluorescent particle-F18,Cu11..-Gd…

Label

-Chanhement de conformation -Molecular beacon-Pont dissulfure+quenching…

Mecanisme d’activation du label

Cible

-Structure peptidique-Nanoparticule-Dendrimer-Polymer….

Cargo



Tailles et poids Dalton (D) = 1.6710-24 gramme Cellule: 10µm donc un volume de 3.4 10−9 cm3. Si on suppose

une densité de 1.03 g/ml, la cellule a un poids de 3.5 10−9 g cad 2. 1015D = 2. 1013kD

Bactérie 1µm Virus ~ 100 nm Nanoparticule de 4 à 100nm (1.9 nm gold core, ~50,000 Da.). Anticorps dimmension de l’ordre de 100 Angstrom (150kD) Antigene peut être très petit (juste l’épitope qui est reconnu

par l’anticorps) qq10 KD Fluorophore (GFP: 26kD) Fluorophores organiques type

cyanines (500-1000kD)



Tailles et poids



Les marqueurs cliniques La toxicité / le marché

M€

YearsLab. research Tox.

?

Phase 3FDA AgreementPh.1 Ph.2

0 10 12 20

0.5

10

M€

YearsLab. research Tox.

?

Phase 3FDA AgreementPh.1 Ph.2

0 10 12 20

0.5

10

• Validation (end point) difficile a vérifier et très longue.• Pour du criblage il faut être certain qu’il n’y a aucune toxicité • Pour du diagnostique il faut un marqueur qui soit générique. • Monitoring/imagerie préclinique/imagerie clinique.



Les marqueurs Moleculaires cliniques

Sucre, anticorps ou petites molécules marquées avec du 18F ou du 99mTCAucun traceur fluorescent pour l’imagerie moléculaire n’est encore sur le marché. Quelques uns sont en phase d’essai clinique

Pour le clinique on en est encore à la préhistoire de l’imagerie moléculaire.

Les principales approches

le galacto cRGD (arginine, glycine, acide aspartique)



Les marqueurs précliniques Le pouvoir est à l’imagination !!!

Pas de contraintes fortes au niveau de la toxicité.

Pas de contraintes de marché.

Ce qu’on veut voir c’est le mécanisme biologique.

C’est là qu’on devrait trouver les marqueurs cliniques de demain



Les marqueurs précliniques Marqueurs endogènes (générés par l’animal) Bioluminescence Protéines fluorescentesMarqueurs exogène (on les injecte)

Passif Ciblée Activable

L’amplification du signal in vivo : c’est le prochain défi de l’imagerie moléculaire.



MARQUEUR FLUORESCENT ACTIVABLE



Les grandes familles de marqueurs

Ligands Anticorps/Antigènes Petites molécules Peptides Sucres




Cargo Nano particules

Structures peptidiques




Label Souvent les nanoparticules servent de cargo et de label

simultanément

Les molécules radioactives 99mTc et le 18F souvent encapsulées dans des chélates.

Les fluorophores organiques

Nanoparticules: dans les précédentes celles qui peuvent émettre un signal



Systèmes d’imagerie moléculaire de fluorescence



L' imagerie optique diffuse de fluorescence

excitation 600-800 nm

émission 650-900 nm

Marquage des tumeurs ou de la circulation sanguine par une molécule fluorescente et détection du signal fluorescent.

Détection, localisation et quantification de la cible.

filtres

détecteur



Voir la lumière au travers des tissus biologiques

Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission doivent être dans le rouge / proche infra rouge

Problème 1: Forte absorption de la lumière par les tissus biologiques

Strong heamoglobin attenuation

Strong water attenuation

haemoglobin and water attenuation

0,01

0,1

1

10

100

1000

250 450 650 850 1050 1250

wavelenght (nm)

atte

nuat

ion

(cm

-1)

Hb02 cm-1

Hb cm-1

H2O cm-1



Voir la lumière au travers des tissus biologiquesProblème 2: Diffusion de la lumièreLa lumière ne se propage pas en ligne droite…

Les photons sont diffusés par des structures dont la taille est de l'ordre de celle de la longueur d'onde de la lumière (diffusion de Mie)

µs>>µa

Modèle de propagation de la lumière dans les tissus : équation de diffusion

Source de lumière

Source Détecteur

excitationxx

)()())(( rrr xxaxxx SD



Modèle de l'imagerie optique de fluorescence

Source Détecteur

excitation

fluorophore

xx

)()())(( rrr xxaxxx SD

Source Détecteur

excitation emission

fluorophore

xm

)()()())(( rrrr xmamimmD

CCD

Proportionnel à la concentration de fluorophores

(r) est le facteur de conversion de la lumière d'excitation en un point r en lumière fluorescente.



Principes de l'imagerie optique de fluorescence

Excitation, signal

1

10

100

1000

10000

100000

550 600 650 700 750 800

Wavelength, nm

Arb

itra

ry lo

g s

cale

Cy5 emission

high pass filter

LED

633 nm filter

Séparation des signaux d'excitation et d'émission

Le signal d'excitation est beaucoup plus important que le signal de fluorescence (au moins 106). Le filtre doit être optimisé pour supprimer le signal d'excitation

Dét

ecte

ur

Filtre

Excitation

Echantillon

Imagerie de fluorescence par transmission

Dét

ecte

ur

Filtre

Excitation

Echantillon

Imagerie de fluorescence par reflexion (FRI)



Imaging issues

Constraints:Constraints:

Autofluorescence

Non specific signal

Attenuation

Light scattering



Attenuation

Strong heamoglobin attenuation

Strong water attenuation

haemoglobin and water absorption

0,01

0,1

1

10

100

1000

250 450 650 850 1050 1250

wavelength (nm)

abso

rptio

n (c

m-1

)

Hb02 cm-1

Hb cm-1

H2O cm-1

•Large aperture lenses

•High sensitivity cameras/Detectors

•Wavelength/detector sensitivity

•Long integration time

Select the wavelength 700-850nm Count all the good photons



Imaging issues

Physical IssuesPhysical IssuesProbe characteristics Detector characteristics

Autofluorescence

AttenuationFluorophore wavelength

700<<800Increase sensitivity



Autofluorescence

Select a wavelength > 700nm

Fluorescence ≠ Autofluorescence

Spectral unmixing

Time resolved imaging



Decrease autofluorescence

J. Frangioni, Current Op. in Chem. Biol., 2003

Select a wavelength > 700nm !



Autofluorescence



Spectral unmixing




Spectral unmixing



Autofluorescence



Spectral unmixing




Probe photochemical parameters <

100

mn

Lipid core and

fluorophore

100 dies/NP

maxfluo 666 nmmax

abs 647 nm

Ф = 0,37 τ = 1,8 ns

Ф = 0,29 τ = 1,1 nsDiD0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Nano-ICG Free ICGTumour/ Skin ratio

0,1

1

10

100

1000

10000

3000 5000 7000 9000 11000

Time (ps)

Flu

ore

sce

nce

(a

u)

IRF(/10)DiDDiD-émul

Brightness fluorescence time of life

Quantum yield



Autofluorescence


Fluorescence ≠ Autofluorescence •Brightness•Quantum yield•fluorescence time of life

Spectral unmixing


< 1

00 m

n

Lipid core and

fluorophore




Target

Autofluorescence

Fluorecence signal

Time (ns)few nsTravel time of the photons

Nb

of

ph

oto

ns



AutofluorescenceSelect a wavelength > 700nm

Fluorescence ≠ Autofluorescence •Brightness•Quantum yield•fluorescence time of life

Spectral unmixing


< 1

00 m

n

Lipid core and

fluorophore

Target



Imaging issues


Autofluorescence

Non specific signal

Attenuation

BrightnessQuantum yield

Fluorescence time of life

Fluorophore wavelength700<<800

Increase sensitivity


Spectral information



Non Specific signal

Increasing specificity: activatable probes

Classical probe

RAFT-(cRGD)4-Cy5

Activatable probeRAFT-(cRGD)4-Cy5-S-S-I

Cleavable spacer

InhibitorEnzyme

Label

Non fluorescent

Fluorescent

cRGD biomarker

Boturyn, Coll, Garanger, Favrot, Dumy, JACS 2004, 126 (18), 5730-5739.Texier, Coll, Dumy, Boturyn, EN n°05 07784 .

Vector = RAFT

S-S Q

K

KKKP

G PAK

G

Cy5 + S-QS

K

KKKP

G PAK

G

Cy5

Non fluorescent

Fluorescent

cRGD biomarker

Boturyn, Coll, Garanger, Favrot, Dumy, JACS 2004, 126 (18), 5730-5739.Texier, Coll, Dumy, Boturyn, EN n°05 07784 .

Vector = RAFT

S-S Q

K

KKKP

G PAK

G

Cy5 + S-QS

K

KKKP

G PAK

G

Cy5

Vector = RAFT

S-S Q

K

KKKP

G PAK

G

K

KKKP

G PAK

G

Cy5 + S-QS

K

KKKP

G PAK

G

Cy5



Imaging issues


Autofluorescence

Non specific signal

Attenuation

Light scattering



Activatable probe







Detector

source: =690nm

Fluorescence: = 790nm

Light scattering Enlarge the geometry: increase the distance between excitation points and or measurement points. (scan the source)



Imaging issues


Autofluorescence

Non specific signal

Attenuation

Light scattering



Activatable probe





Enlarge the geometry(scan the source Tomography)



Imagerie moléculaire de fluorescence per-opératoire



Quyen Nguyen, Tsien

VisualisationTissus tumoral


Imagerie Fluo per-op JMD | 11/01/2013 | 63Visualisation Tissus tumoral sous le muscle



Visualisationganglion sentinelle

Quyen Nguyen, Tsien



Tomorow surgery will be guided by molecular imagingTomorow surgery will be guided by molecular imaging



Fluobeam®

Angiostamp®

Sentidye®

•Fluobeam®700 / Fluobeam®800

•Angiostamp®700 /Angisotamp®800

•Sentidye®700 /Sentidye®800

available for animal use: regulatory toxicity study under progess

Products: Imaging instrumentation and probes Products: Imaging instrumentation and probes



The reader Fluobeam®



Technical issues: Work in ambiant lightTechnical issues: Work in ambiant light

•Quality of the filtering is the key•work around 800nm ease the thing

Principle of the optical filtering

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

200 400 600 800 1000

Wavelength (nm)

Tra

ns

mis

sio

n

Lighting filtration

excitation

camera

Eye sensitivity



Technical issues: Selection of the wavelengthTechnical issues: Selection of the wavelength

•ICG

•IRDye800-CW

•Sentidye800

•Zw800-1 (Frangioni)

•…etc.

ICG+Albumine

Angiostamp®800

ICG+eau Glucosée



FluobeamFluobeam®® technical data: technical data:

New features:•Low weight (0.7kg)•Polypropylene housing•Class 1 laser•USB2 driven•IP67 head•IRC>85%•CE medical sterile cover•Compatibility windowsXP and windows7

Fluobeam®700•Excitation 680nm 60mW/cm2•Emission >700nm•FOV: 13.6x10.1 cm•Focus distance 17cm •Resolution 2 lp/mm

Fluobeam®800•Excitation 780nm 100mW/cm2•Emission >830nm•FOV: 10x7.5 cm•Focus distance 22cm•Resolution 2 lp/mm



FluobeamFluobeam®®: limit of detection : limit of detection

Fluorescent probe Fluobeam®700 Fluobeam®800

AngioStamp®800 5 pmoles < 1 pmole

ICG eau glucosée 17 pmoles 8 pmoles

ICG Albumine 3,4 pmoles < 1 pmole

Sentidye®800 <1 pmole 0.1 pmole

Sentidye®700 0.1 pmole

AngioStamp®700 2 pmole



Un exemple d’application La fluorescence pour guider la chirurgie des cancers.

Les structures sont en surface ou proche de la surface En fluorescence on aura un bon rapport signal/bruit La géométrie est quasi indépendante du patient. Le coût des développements technologiques à

réaliser est asez limité.

Le point dur reste le traceur (AMM, FDA Agreement)



Probe issue

Today there is no malecular probe available for intra operative surgery

The only NIR fluorescent molecules that can be used are the Methylene blue and the Indocyanine Green (ICG)

The clinical intra-operative applications rely today on these two fluorescent probes.



AngiostampAngiostamp®800®800

K

AK

P

G

K K

K P

G

O

N

O O

N

O

O

N

O

O

N

O

Df K

RG

OD

fK

RG

O

Df K

RG

O

Df K

RG

O

dye

Extracellular space

intracellular space

Integrin heterodimer

•cRGD have a high affinity with v3 integrin, multimeric molecule have a better specificity.

•About 25% of the cancer cell lines over express the avb3 integrin

•Detect neo-angiogenesis

•The level of internalization is higher with multimeric cRGD probes



Tumor Detection and Margin Identification



Applications : Angiostamp®800Applications : Angiostamp®800

K

A

K

P

G

K

K

K

P

G

O

N

O

O

N

O

O

N

OO

N

O

D

fK

R

G

O

D

fK

R

G

O

D

fK

R

G

O

D

fK

R

G

O

N

O

N+

O

SO3-

NaSO3

NaSO3

NaSO3

Tumor

Healthy tissues

Make the difference between healthy tissues and cancerous tissues

Tumors



Translation to surgerySuivi du drainage lymphatique



Angiosta

mp®

Translation to surgeryCiblage intégrine v3



Un autre exemple d’application La chirurgie vasculaire et cardiovasculaire.

Visualiser la perfusion dans une artère après anastomose

Contrôler la qualité d’un pontage Vérifier la bonne perfusion d’un lambeau Fournir des paramètres hémodynamiques



Vascular Imaging

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64

x=459 y=139 Mean

x=237 y=385 Mean



Vascular Imaging

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 30 59 88 117 146 175 204 233 262 291 320 349 378 407 436 465 494

upstream

downstream

shift

Carotide with stenosis (diameter divided by 4.7)

Artery diameter: 6.76mmStenosis diameter: 1.45mm Spasms and accumulation of ICG can be seen upstream of the carotid. The flow is established by burst after the stenosis

Hemodynamics data computed on fluorescence sequences:distance between ROIs: 12.66mmtime shift: 14 framesaverage speed: 0.045m/secflow: 96ml/mn



What can we see :

An in situ biological analysis in order to visualize the status of the tissues.

Morphological and physiological informations such as the functionality vascular bypass



Tomographie optique de fluorescence

Intestinal metastasis localizationOvarian peritoneal metastasis

Kidneys-bladder

(Results by courtesy of Jean-Luc Coll)

IAB

IAB

Gre

nobl

e



Fluorescence diffuse optical tomography



Principe de la tomographie planaire

Caméra de haute sensibilité

lentille

100 200 300 400 500 600

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

100 200 300 400 500 600

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

100 200 300 400 500 600

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500



Diseased mouse Healthy mice

Experiment Day 10 Day 12 Day 14 H1 H2 1st inj

H2 2nd inj H3 1st inj

H3 2ndinj

Fluorescence yield amount 0.071 0.095 0.130 0.035 0.041 0.040 0.041 0.033

day 10 day 14day 12

IAB IAB IAB

IAB IAB IAB

Applications: oncology (breast cancer) 2/2

Comparison with FRI

IAB

Gre

nobl

e(R

esu

lts b

y co

urt

esy

of

Jea

n-L

uc

Co

ll)

FRI

fDOT



Aide au diagnostic du cancer de la prostate



Prostate : a dedicated US/optical probe

Illumination fiberéDetection fiber

US tranducer : 128 points; 6,5 MHz

Bimodal TR probe

Ultrasound system

Time-resolveddetection

Dedicated laser



Prostate : 3D fluorescence reconstructionReconstructed inclusion

Bimodal probe

Excitation (laser) fiber

Detection fiber

Acquisition timeAcquisition time

1mn1mn

Reconstruction timeReconstruction time

1mn1mn

Accuracy : 1.5mmAccuracy : 1.5mm

Precision : 1mmPrecision : 1mm



Prostate : Results Prostate mimicking phantom

Central zone

Surrounding tissues

Rectum

Preclinical

Prostate mimicking phantom

(Polymer, silice beads, TiO2, ink)

Fluorescence yield co-registered in US image

Depth 2 cm Resolution 1mm

100 200 300 400 500 600 700 800 900

50

100

150

200

250

300

350

400

450

mouse

tumor

probephantom

Merci de votre attention

imagerie moléculaire optique de fluorescence jean-marc dinten cea-leti/dtbs

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