immobilized carbohydrases in the beverage industry

7/24/2019 Immobilized Carbohydrases in the Beverage Industry

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4. Immobilized Carbohydrases in the Beverage Industry

Many criteria should be adopted to choose supports for use in industrialprocesses, such as atoxicity (food grade, lo! cost and ready availability,ease of use, chemical inertia (under conditions of use, non"biodegradability

and, lastly, the ability of the support to react either directly or via a simpleand inexpensive activation method. #everal precursors of the aromaticcomponents of !ines, $uices, musts and other alcoholic drin%s aremonoterpenes (geraniol, nerol, citronellol, linalool, &"terpineol, etc. in di"glycosidic form. 'hey contain ")"glucopyranose bound directly to aglyconand*or other sugars, including &"+"rhamnopyranose and &"+"arabinofuranose. 'hese con$ugate compounds are not volatile and aregenerally soluble in !ater, being perceived only by the consumers olfactorymucosa follo!ing removal of the carbohydrate moiety, by acid or enzymatichydrolysis, that releases the volatile part (terpenols, ses-uiterpenes, nor"

isoprenoids, etc.. lycosidases are used to increase the aroma of !ines andother $uices by se-uential hydrolysis of the glycosides bound to the volatilecompounds. #pagna et al. immobilized several glycosidases (")"glucopyranosidase, &"+"arabinofuranosidase, &"+"rhamnopyranosidase,puri/ed from an 0spergillus niger enzyme preparation by entrapment inchitosan gels and subse-uent cross"lin%ing !ith glutaraldehyde. 'he authorsaimed to assess the feasibility of applying the immobilized biocatalyst in the!ine"ma%ing and fruit"$uice processing industry. 'he authors tested theaddition of various agents in order to improve physical and mechanicalproperties of the gel, decrease enzyme lea%age and increase the

immobilization yields and the operational stability. 'he best results !ereachieved using as additives gelatin and silica gel. 'he immobilizedglycosidases !ere used to increase the aroma in a model !ine solution. 'heauthors established that both free and immobilized enzymes led to a four"fold increase in the concentration of several of the more fragrant volatilecompounds found in !ine, particularly in Moscato !ine. #u et al.immobilized "glucosidase on alginate by combining cross"lin%ing !ithentrapment and, again, cross"lin%ing. 0fter optimization of theimmobilization conditions, an activity recovery of "glucosidase of 41.23!as obtained. 'he authors investigated the properties of the immobilized "glucosidase. 'he optimum p remained unaltered, !hile the optimumtemperature !as 45 6C, !hich !as 72 6C lo!er than that of free enzyme.

'his particular feature can, ho!ever, be ta%en advantage of in tea beverageprocessing. 'hus, the treatment !ith immobilized "glucosidase can becarried out at a lo!er temperature than !ith the free enzymes, hence thehigh temperature, resulting in bro!nness of the tea infusion, can beavoided. Immobilization also resulted in an enhancement in the thermalstability. Moreover, the immobilized enzyme !as more stable underextreme p conditions. 'he 8m value for immobilized "glucosidase !asestimated to be 7.9: ; 72


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results sho!ed that in tea beverages processed !ith immobilized "glucosidase, the total amount of essential oil in green tea, oolong tea andblac% tea increased by >2.193, 72.=23 and 1.:93, respectively.Immobilization increased the storage stability of "glucosidase, since :=.=3activity retention !as observed after 4> days storage at 4 6C, !hereas for

the free enzyme, only 5.73 activity retention !as observed after >2 daysstorage. Moreover, the immobilized enzyme displayed a residual activity of9=.13 after being repeatedly used 52 times. ?igueira et al. screened varioussupports for the immobilization of a partially purified extract of "glucosidase from 0spergillus sp. 'he immobilization in sol"gel and in+enti%ats allo!ed the higher activity retention after immobilization and !asthus further characterized. Immobilization did not alter the p*activitypro/le, !hereas the temperature*activity pro/le !as improved !hen sol"gelsupport !as assayed. Both thermal and p stability !ere improved as aresult of immobilization. 0n increase in the apparent 8m (Michaelis

constant !as observed follo!ing immobilization, suggesting di@usionlimitations. Aectic enzymes have long been used in the beverage industry toincrease $uice yield and to clarify $uices. 0n example is pectinlyase, !hichhas received gro!ing attention for its potential application in the foodprocessing industry, due to its ability to depolymerize pectins in a singleenzyme process, doing a!ay !ith the need to use pectinesterase, andpolygalacturonase. 'he latter process releases methanol and leads to theformation of colloidal precipitates in the system, bet!een the de"esteri/edpectin and the endogenous calcium ion. #pagna et al. used immobilizedpectinlyase for the depectinization of fruit $uice. 'he authors performed the

immobilization on three synthetic polymers upergit C, Dylon 1 activated!ith glutaraldehyde and E0): activated !ith trichlorotriazine. #uitableactivity results !ere obtained only !ith activated Dylon 1 and E0): (772and ==5 F*g, respectively. 0n increase in stabilization !as obtained by therigidi/cation of the enzyme structure through cross"lin%ing !ithglutaraldehyde. 'he p pro/le remains unaltered, ho!ever, the optimumtemperature of the immobilized enzyme !as higher (GH72 6C than that ofthe free enzyme. 0l%orta et al. immobilized the enzyme pectin lyase AD+,poly(methoxygalacturonide lyaseJ .C. 4.>.>.72K from Aenicillium italicurnby covalent binding to Dylon 1 in order to compare physical"chemical and

%inetic properties of the free and immobilized enzymes. 'he authorsevaluated the optimum conditions for the immobilization process, %ineticparameters and p and temperature behavior of the enzyme. 'he pactivity curve of the immobilized enzyme shifted to!ard a lo! p compared!ith that of the soluble one. #imilarly, the immobilized AD+ !as more stableat lo!er p values than the free enzyme. 'he immobilization caused amar%ed increase in both thermal and storage stability of the enzyme. Doloss of activity !as observed !hen the immobilized enzyme !as used for 7>consecutive cycles of operation. 'he decrease in viscosity of pectin solutionsprocessed !ith immobilized AD+ !as lo!er than that of solutions processed

!ith free AD+. Lhen fruit $uices !ere used, ho!ever, the decrease inviscosity throughout processing !as as mar%ed as that observed !hen the


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free enzyme !as used to clarify pectin solutions. iven the results obtained,the authors suggested that Dylon"immobilized AD+ provided a promising toolfor the clari/cation of fruit $uices at 42 6C and an approximate p of =.2.

5. Immobilized Carbohydrases in the Aroduction of Arebiotics

5.7. alactooligosaccharides

alactooligosaccharides (# are an example of functional foods. # areprebiotic, because they are not digested by humans or other animals, andselectively increase the bene/cial microNora of the intestine, leading tohealth bene/ts. # can be synthesized by highly speci/cglycosyltransferases, !hich use sugar donors containing a nucleosidephosphate or a lipid phosphate remaining group. o!ever, these enzymesare barely available, are extremely expensive and re-uire speci/c sugarnucleotides as substrates. 'herefore, they are not used in realistic, cost"

e@ective processes for # production. 'hus, # molecules are typicallysynthesized by the enzymatic activity of "galactosidase on lactose in areaction %no!n as transgalactosylation. 'he composition of # producedfrom lactose by "galactosidase usually has the structure alnHlc, !here nindicates the degree of polymerization ()A and is typically !ithin 7H5. 'heprocess is %inetically controlled and involves competition bet!een hydrolysisand transgalactosylation. 'he former, !hich is thermodynamically favoredand leads to the production of )"galactose and )"glucose, competes !iththe transferase activity, !hich leads to the production of the complexmixture of alnHlc saccharides. 8no!ledge of the time course of the

reaction or of lactose conversion is needed to establish !hen the maximumyield of a given product is achieved. 'he process is -uite complex, and theoutput clearly depends on the origin of the enzyme and on its properties.#everal models have been proposed to describe oligosaccharide synthesisand simultaneous lactose hydrolysis, ultimately pointing for the need of ahigh initial lactose concentration, viz. 423 !*v and above. 'he recent/ndings of Oera and co"!or%ers established that an increase in the initiallactose concentration only inNuences positively the maximum product yield,provided the lactose remains dissolved 1K. 'hese authors also highlight thecomplex interaction bet!een temperature and initial lactose concentration

in the reaction of synthesis. osling and co"!or%ers also produced insight onthe phenomenon underlying the need for the highest possible lactoseconcentration to achieve high # levels. iven the results obtained in their!or%, these authors suggested that such an outcome is due to increases inthe reactions that lead to oligosaccharides instead of decreases in thecompeting reactions, !hich degrade oligosaccharides. aur et al.immobilized 0spergillus oryzae "galactosidase by three differenttechni-ues adsorption on Celite, covalent coupling to chitosan andaggregation by cross"lin%ing (C+0s. Do signi/cant changes in temperatureand p optima resulted from immobilization, ho!ever, an increase in 8m

!as observed, as compared to the free form. Immobilization on chitosangave the maximum enzyme activity yield and oligosaccharide synthesis.


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Immobilization enhanced the thermal stability of both chitosan immobilizedenzyme and C+0s. Lhen a >23 (!*v lactose solution !as used assubstrate, the chitosan"immobilized enzyme led to a maximumoligosaccharide yield, corresponding to 7:.=3 of the total sugar, !hereasthe use of the free enzyme only allo!ed an oligosaccharide yield

corresponding to 72.23 of the total sugars, after > h of operation at 42 6C.n the other hand, C+0s proved instead e@ective in lactose hydrolysis,yielding :G3 monosaccharide after 7> h of operation.alactooligosaccharides !ere continuously produced using lactose and "galactosidase from Bullera singularis 0'CC >479= immobilized in ChitopearlBCL =572 beads. Do activation or cross"lin%ing agents !ere used before orafter immobilization. 'he preparation !as used directly for continuousreaction in a pac%ed bed reactor, yielding 553 (!*! oligosaccharides and aproductivity of 4.4 g*+ h, from a 723 (!*v lactose solution during a 75"dayoperation. Batch productivity !as 1.5 g galactooligosaccharides *+ h from a

2.=3 (!*v lactose solution. Magnetic polysiloxane"polyvinyl alcohol provedto be an ade-uate support for the immobilization of 0spergillus oryzae "galactosidase and its concomitant application on galactooligosaccharideproduction using lactose as substrate. 'he support !as easily recovered byapplying a magnetic /eld, !hich contributed to achieving the retention ofG43 of the initial enzyme activity after 72 reaction cycles. 'hegalactooligosaccharides production !as performed at temperatures varyingfrom =2 6C to 12 6C and p from =.5 to 5.5, !ith either free or immobilizedenzyme preparations, yet # production remained relatively unaltereddespite such variations of operational condition. Magnetite particles

obtained by coprecipitation of ?e>P and ?e=P and coated !ith polyaniline!ere activated !ith glutaraldehyde in order to covalently immobilize0spergillus oryzae"galactosidase. 'he methodology allo!ed for theimmobilization of >.24 mg of enzyme per g of support, !hich the authorsclaimed to be the best of the values reported in the literature. 'his magneticenzymatic derivative !as able both to hydrolyze lactose into glucose andgalactose and to produce tri" and tetra"galactosides from lactose bytransgalactosylation, and, overall, its performance !as a%in to that of thefree enzyme. 'hus, for lactose concentrations up to 722 g*+, the speci/cactivities of both forms !ere similar, but for higher lactose concentrations,

the initial speci/c reaction rate of the immobilized enzyme !as a@ected aslactose concentrations increased. # production by both forms of theenzyme !as una@ected !ithin =2 to 12 6C. 'he immobilized biocatalyst !asrecycled 72 times, at >5 6C and using a >23 (!*v lactose solution in eachcycle. 0t the end of the /nal cycle, the activity of the immobilizedbiocatalyst !as G53 of the initial value. 0nother magnetic type of support!as used for the covalent immobilization of 8luyveromyces fragilis "galactosidase. 'he magnetic nanobeads !ere prepared from glycidylmethacrylate, ethylene glycol dimethacrylate and hydroxyethylmethacrylate, via emulsi/er"free emulsion polymerization. Binding to the

enzyme molecules !as formed through the epoxy groups on the surface ofthe beads. 'he maximum amount of enzyme attached to the support !as of


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745.1 mg*g, corresponding to an activity recovery of :>.13. 'heimmobilized enzyme displayed high catalytic activity for # synthesis andproduced a total of >.>42 g # per gram of immobilized enzyme during 72consecutive batch reactions. 0fter these cycles, the immobilized biocatalystretained G7.53 of its original activity. 0 novel method of enzyme

immobilization using 0spergillus oryzae "galactosidase involvingpolyethyleneimine"enzyme aggregate formation and gro!th of aggregateson individual /brils of cotton cloth leading to multilayer immobilization ofthe enzyme !as developed by 0lbayra% and Qang 7>GK. 0 large amount ofenzyme !as immobilized, >52 mg*g support, !ith about 923H953eRciency. 0 maximum galactooligosaccharides production of >53H>13(!*! !as achieved at near 523 lactose conversion from 422 g*+ of lactoseat p 4.5 and 42 6C. 'ri" and tetra"saccharides !ere the ma$or types ofgalactooligosaccharides formed, accounting for about :23 and >53 of thetotal galactooligosaccharides produced in the reactions, respectively. 0

mar%ed increase in the thermal stability of the immobilized enzyme !as alsoobserved, as compared to the free form. 'he half"life for the immobilizedenzyme on cotton cloth !as close to one year at 42 6C, but only >7 days at52 6C. 'he immobilized biocatalyst enabled the # production of >13(!*! of total sugars, from a feed lactose solution of 423 (!*v lactose at p4.5 and 42 6C, at 523 lactose conversion. 'he production of # fromlactose !as also carried out using "galactosidase from 0spergillus oryzae,immobilized on a lo!"pressure plasma"modi/ed cellulose acetate. 'he novelmethod developed for multilayer enzyme immobilization involved theformation of a polyethyleneimine (AI"enzyme aggregate and concomitant

gro!th on a cellulose acetate membrane. 0n enzyme load of 9.9: g*m>membrane !as immobilized !ith 113 eRciency. 'he half"life of themembrane immobilized enzyme !as roughly one month at =2 6C, althoughthis decreased to 12 hours at 12 6C. 'he maximum # production of >:3(!*! !as obtained at :23 lactose conversion from a =>3 (!*v lactose atp 4.5 and 12 6C. # !ere mostly composed by trisaccharides, as theseaccounted for roughly :53 of the total #. # production !as alsoachieved using "galactosidase from 'alaromyces thermophilus CB# >=1.5Gimmobilized onto upergit C, both under batch!ise and a continuous modeof operation, the latter in a pac%ed"bed reactor. Maximum yields of # of

7>, =9 and G2 g*+ !as obtained for initial lactose concentrations of 53, 723and >23 (!*v, respectively, for batch conversion experiments. Fndercontinuous operation, a maximum # concentration of about 52 g*+ !asobtained !ith a dilution rate of 2.=:5 h


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alginate, and 0spergillus oryzea immobilized on cotton cloth displayed #productivities of G: and 721 g*+ h, respectively. It has also been reportedthat an improved method developed by the latter authors for "galactosidase immobilization in cotton cloth led to a productivity of 1222 g*+hJ # production in a continuous stirred tan% reactor using B. circulans "

galactosidase immobilized in controlled pore silica gel. 'he yield and theproductivity in # !ere 7.:" and 7.9"fold higher, respectively, !hencompared to those using free enzymes. Da%%harat et al. 7=4K developed anultrafiltration membrane reactor containing 'alaromyces thermophilus "galactosidase, !hich allo!ed for a 5.1"fold increase in # productivity,!hen compared !ith the free enzyme,

5.>. ?ructooligosaccharides

?ructooligosaccharides (?# are also prebiotic substances, calorie"free andnoncariogenic s!eeteners. ?# stimulate the gro!th of bi/dobacteria andhave been claimed to contribute to!ards the prevention of colon cancer andto reduce cholesterol, phospholipid and triglyceride levels in serum. ?#consist of a mixture of fructose oligomers, typically !ith t!o or threefructose units bound to the ">,7 position of sucrose, and they are mainlycomposed of 7"%estose (?>, 7"nystose (?= and 7"fructofuranosyl"nystose (?4. 'hey are found in several vegetables or natural foods,ho!ever, the ?# are produced commercially through enzymatic synthesisfrom sucrose by microbial enzymes !ith fructosyltransferase activity 7=5K.

'he de/nition of transfructosylation still involves some controversy. 0ssummarized recently, !hile some authors classi/ed this reaction as that

catalyzed by "fructofuranosidase or invertase, others classifiedtransfructosylation as a "d"fructosyltransferase reaction 7=1K. Lhen thelatter is considered, fructosyltransferase activity is observed at high sucroseconcentrations, !hereas at lo! sucrose concentration hydrolytic activity ispredominant. 'hus, an array of disproportionate reactions leads to theformation of ?# and glucose, as a by"product from the fructosyltransferaseactivity, !hile fructose and glucose are formed as result of the hydrolyticactivity 7=:,7=GK. ?# are produced according to a chain reaction, !heret!o molecules of sucrose produce one molecule of ?> and one molecule ofglucose. '!o molecules of ?> react to produce one molecule of ?= and

one molecule of sucrose. '!o molecules of ?= react, leading to onemolecule of ?4 and one molecule of ?>. ne molecule of ?= is alsohydrolyzed to ?> and one molecule of fructose. 0 predictive model, !hichincludes substrate and glucose and fructose inhibition, !as developed andprovided a nice /t to the experimental data for ?# production from sucroseusing a fructosyltransferase from Shodotorula sp. 0 MichaelisHMentenbehavior !as observed, !ith substrate inhibition at high sucroseconcentrations (up to :23 !*v alongside !ith glucose competitiveinhibition related to sucrose, ?> and ?= upta%es. Inhibition !as alsonoticed at high fructose concentrations (over 523. ydrolyzing activity

over ?= !as also identi/ed. 'here are di@erent techni-ues to immobilizeenzymes or !hole microbial cells to produce ?#. In particular,


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encapsulation of the cells and enzymes is !idely used. Cell entrapment incalcium alginate has been -uite favored. 'his particular approach !asimplemented by Ding et al. for the entrapment of Eanthophyllomycesdendrorhous cells, because of the relative ease of cell separation from thefermentation broth and the strong tolerance to high concentrations of

substrates and products. 'he cells !ere mixed !ith >3 sodium alginatesolution, and the cell"alginate mixture !as extruded drop!ise through aneedle into a 2.> M CaCl> solution. 'he resulting beads !ere %ept in CaCl>solution at 4 6C for >4 h before use. 'he ?# procution process anchored inthe use of this immobilized biocatalyst allo!ed for a maximum ?# yield of>=1 g*+ after 75 h of reaction. 0spergillus $aponicus mycelia immobilized incalcium alginate beads !ere also used for the production ?#. 'he myceliaof the strain !ere held in 7.53 glutaraldehyde solution at 4 6C for >4 hbefore entrapment !ith calcium alginate. ?# production !as performed ina batch process in a >"+ bioreactor, and the optimum p and temperature

for synthesis !ere 5.2H5.1 and 55 6C, respectively. Maximum production !asachieved using 5.:53 (cellular !eight*volume of mycelia and 153 sucrosesolution (!v for four hours of reaction, at !hich point 17.>G3 of the total?# contained =2.513, >1.453 and 4,>:3 of ?>, ?=, and ?4respectively. 'he immobilized biocatalyst !as used in >= consecutivebatches !ith no signi/cant loss of activity, suggesting the potential for largescale applications. 0ureobasidium pullulans !as immobilized in calciumalginate beads and used for continuous production of fructooligosaccharidesusing a pac%ed"bed reactor. ?or the immobilization procedure, a cellsuspension, containing 43 (v*v dry cells, !as mixed !ith =3 (!*v sodium

alginate solution at 7> (v*v. 'he mixture !as extruded through syringeneedles into a 2.7 M CaCl> solution. 'he resulting beads !ere cured for > hand then hardened overnight at 4 6C. ptimum operation conditions !ereachieved !ith ::2 g sucrose*+, fed at >22 +*h at 52 6C, and allo!ed for aproductivity of 7G2 g ?# *+ h. Moreover, the initial activity !as maintainedfor about 722 days of operation in a 7.> m= reactor, so that a ?# content of5:3 (!*! in the eTuent !as obtained throughout this period.0ureobasidium pullulans cells !ere mixed !ith an alginate solution =3(!*v, and the mixture !as extruded into a 73 (!*v CaCl> solution to formsmall gel beads as hydrated"immobilized cells. 'he immobilized cells !ere

cured at room temperature for > h and then hardened overnight at 4 6C. 'hebeads !ere then placed at 4 h to induce freeze"dehydration.'he freeze"dehydration resulted in shrin%age of the beads as a result of!ater removal. 0s a result, the bead volume !as reduced by G>3 and thebead !eight by G53. 'he dehydrated beads !ere successfully used for theproduction of ?# in a model reactor system. ther techni-ues have beenstudied for enzyme and cell immobilization to produce ?#. 0 crude "fructofuranosidase preparation from 0spergillus a!amori DBSC42== !ascovalently bound to chitosan by glutaraldehyde lin%ages and used for ?#synthesis from sucrose. 'he obtained crude extract, after /ltration and

centrifugation, !as directly used as an enzyme source in the immobilizationprocess. 'his involves /rstly the solubilization and activation of chitosan,


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respectively, !ith acetic acid and glutaraldehyde at 73 (v*v, follo!ed bythe covalent binding of the enzyme to the 0"activated chitosan at p 5.2.In the conditions used, GG3 of the crude extract !as bound, and an activityrecovery of 543 !as reported. Do signi/cant changes !ere observed in thep and temperature optima of the immobilized biocatalyst, as compared to

the free form, yet both p and thermal stability of the former !ereincreased. Immobilization resulted in di@usion limitations, as reNected by a7.="fold increase in 8m. 'ransfructosylation only occurred at high sucroseconcentrations, from 7==.=5 to >=7.94 g*+, !hile at lo!er sucroseconcentrations, 57.> to :4.>9 g*+, hydrolysis too% place. 'he maximumconversion yield of sucrose to ?# !as 553, corresponding to 7>G g*+ of?# and to a calculated productivity of 7G.5= g*h*722 g. 8ovaleva et al. havesho!n that inulinase covalently immobilized on macroporous anion"exchange resin (0O"71"# had higher optimal temperature and p stabilitythan free inulinase. Commercial pectinase preparations !ith

fructosyltransferase activity, Aectinex Fltra #A"+, have also beenimmobilized in #epabeads C"A= and C"A5 carriers and applied to thebatch synthesis of fructooligosaccharides. 0 suRciently high sucroseconcentration, 1=2 g*+, !as used to shift activity to!ardstransfructosylation, in detriment of hydrolysis. 'he reaction !as faster usingC"A5 carriers, possibly because of reduced di@usion limitations presentedby this support, given its morphology. 'he ?# concentration reached amaximum value of =G: g*+ after =1 h (>42 g*+ ?>, 744 g*+ ?> and = g*+?4, !hich corresponds to 17.53 (!*! of the total carbohydrates in themixture. 'he features of these immobilized biocatalysts are very attractive

for their application in batch and /xed"bed bioreactors. 'hefructosyltransferase produced by Shodotorula sp. !as immobilized in aninorganic support consisting of a niobium and graphite alloy. 'heimmobilization of the enzyme !as by ionic binding to the surface of theparticles, since the support is a charged and compact solid, !ith negligibleporosity. 'he immobilized fructosyltransferase in niobium allo!ed for ?#yields of around 413 from sucrose concentrations of 523 and :23 (!*v,after 91 h of synthesis. ?> !as the predominant fructan produced, !ith?= and ?4 present in smaller amounts. 0 predictive model of ?#production !as developed, !hich provided a close /t to experimental data.

1. ther Immobilized Carbohydrases

1.7. )airy Aroducts

'he enzyme "galactosidase (=.>.7.>= is classified as a hydrolase, !ithtransferase capacity for galactosyl groups, catalyzing the hydrolysis of theterminal residue "galactopyranosyl from lactose (al 7H4lc to form anisomolecular mixture of glucose and galactose >2K. "alactosidase is animportant enzyme in the food industry and has found signi/cantapplications in enhancing s!eetness, solubility, Navor and digestibility of

dairy products 74:K. uidini et al. 74GK studied the immobilization processof 0spergillus oryzae "galactosidase using the ionic exchange resin )uolite


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051G as a carrier for lactose hydrolysis. 'he immobilization process by ionicbinding !as studied through a central composite design (CC). 'hesimultaneous inNuences of the enzyme concentration and p on theimmobilization medium !ere analyzed by the authors. 'he results sho!edthat the retention of enzymatic activity during the immobilization process

!as strongly dependant on those variables, being maximized at p 4.5 andan enzyme concentration of 71 g*+. 'he immobilized enzyme obtained underthe previous conditions !as sub$ected to a cross"lin%ing process !ithglutaraldehyde, and the conditions that maximized the activity consisted ofa glutaraldehyde concentration of =.G= g*+ and a cross"lin%ing time of 7.G:h. 'he glutaraldehyde cross"lin%ing increased the initial activity, retaining923 of its initial activity. 'he authors related that the enzyme !as verystable on p ranges of =.5HG.2, being appropriate for application in products!ith lo! p values, such as acid !hey, since the enzyme activity !asmaximized at p 4.5. Aessela et al. 749K performed the immobilization of "

galactosidase from 'hermus sp. '> via ionic adsorption onto t!o di@erentsupports a ne! anionic exchanger resin, based on the coating of #epabeadsinternal surfaces !ith polyethylenimine (AI polymers (M! >5,222, andtraditional )0"agarose. 'he adsorption strength !as much higher in thecase of AI"#epabeads than in )0"supports at both p 5 and :. +ess than53 of enzyme !as eluted from AI"support, !hile more than :23 protein!as eluted from )0"agarose at p : and 2.4 M DaCl. 'he AI"derivativesremained almost fully active at p 5 and : after several !ee%s of incubationat 52 6C, and their thermal stability !as enhanced as compared to that ofthe free form. In particular, the derivative !as used to perform the

hydrolysis of 53 lactose solution for 52 h at p : and 52 6C, !ith nonoticeable shift in the pattern of the reaction. Moreover, it !as establishedthat after such a cycle, the derivative could be fully removed from thesupport and the latter re"loaded. iven these features, the authorssuggested the immobilized biocatalyst presents a promising candidate forindustrial use as a biocatalyst in the hydrolysis of lactose in di@erent dairyproducts and could be coupled !ith the antimicrobial treatment usuallyperformed. Moreover, Aessela and co"!or%ers !ere able to establish thatcovalent immobilization of "galactosidase from 'hermus sp. '> onboronate"epoxy"#epabeads and on chelate"epoxy"#epabeads reduced

signi/cantly the inhibition by glucose (non"competitive and by galactose(competitive observed for the free form 752K. 0t the same time, the 8m forlactose only increased by t!o"fold as an outcome of immobilization. 'heauthors associated these outcomes to small modi/cations in the activecenter conformation that may have occurred after immobilization onto theheterofunctional epoxy"#epabeads, !hich led to a more mar%ed decrease inthe aRnity of the enzyme to the inhibitor than that to the substrate. 'hus,using either immobilized enzyme preparation for the hydrolysis of a 53(!*v lactose solution, the reaction proceeded up to a hydrolysis yield over993, !hereas for the free enzyme, only G53 hydrolysis could be achieved.

0 rather similar observation !as reported by Mateo and co"!or%ers !henimmobilizing "galactosidase from 8luyveromyces lactis in agarose"glyoxyl,


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glutaraldehyde"agarose and glutaraldehyde"upergit C supports 757K. Qet,in these supports, only the non"competitive inhibition by glucose !assigni/cantly reduced, !hile both the aRnity of the enzyme to thecompetitive inhibitor (galactose and to the substrate (lactose remainedunaltered, as compared to the free form, possibly due to steric hindrances to

the access of glucose to the binding site. #omeho!, curiously, theimmobilization to an upergit"boronate derivative led to no changes in thenon"competitive inhibitor. 'his !as considered the result of binding ta%ingplace through the sugar chains, thus leaving the inhibition site exposed.0ctually, no modi/cations !ere noticed regarding the aRnity of the enzymeto lactose and galactose as a result of immobilization. Moreover, theglyoxyl"agarose derivative !as for >2 reactions !ith a marginal decreaseenzyme activity and allo!ing for almost full hydrolysis of a 53 (!*v lactosesolution at the end of the /nal batch. 'anriseven and )ogan 75>Kimmobilized "galactosidase from 0spergillus oryzae in fibers composed of

alginate and gelatin cross"lin%ed !ith glutaraldehyde to avoid lea%ing out ofthe enzyme. 'he immobilization yield !as of 513, and the activity of theimmobilized biocatalyst remained stable for =5 days. 'he optimum p andtemperature !ere not a@ected by immobilization and remained at 4.5 and52 6C, respectively. Qet, higher activity retention at extreme p andtemperature !as observed for immobilized "galactosidase. 0 7.>"foldincrease in 8m as a result of immobilization suggests a typical di@usionlimitations increase, and the maximum speci/c reaction rate decreasedalmost by half, suggesting structural changes in the enzyme. "galactosidase !as immobilized by adsorption on a mixed"matrix membrane

containing zirconium dioxide 75=K. Fp to 7.1 g "galactosidase could beabsorbed per m> of membrane. o!ever, maximal activity !as achieved atan enzyme load of around 2.5 g*m>. 0lthough the optimum p for activity!as shifted from 1.5 to :.2, due to immobilization, no signi/cant change !asobserved in the optimum temperature. 0ctivity retention !as, ho!ever,more e@ective at lo!er temperatures, !ithin the range tested (5 to 42 6C.Moreover, an eight"fold increase in the apparent 8m !as observed afterimmobilization, although Omax remained unaltered. 'he authors suggestthe feasibility of the immobilized biocatalysts for application to #synthesis.

1.>. Isomaltulose Aroduction

Isomaltulose is a monosaccharide that presents remar%able applications inthe food industry. 'his sugar is an interesting substitute for sucrose,considering that it is approximately 523 as s!eet as sucrose 754K, it is non"carcinogenic 755K and it has a lo! glycemic index 751K. In addition,isomaltulose can be converted into sugar alcohol, IsomaltU, !hich has otheruseful properties for foods. Isomaltulose can be industrially obtained bytransglycosylation, catalyzed by the intracellular glucosyltransferaseproduced by some bacteria strains. 'here are several !or%s on the

immobilization of bacterial cells to produce isomaltulose. Qet, consideringthe advantages of the use of enzyme extracts, mainly the reduced level of


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microbial contamination of the product, the immobilization of the extractedglucosyltransferase can be attractive if an eRcient immobilization method isdeveloped. In the !or% of 8a!aguti and #ato GK, isomaltulose production!as studied in a repeated"batch process using immobilizedglucosyltransferase. 'he highest conversion rate of sucrose into

isomaltulose !as obtained in the /rst batches, being 4=.73. It !as observedthat after the /rst batch, the conversion rates decreased -uic%ly, and in thesecond batch, an isomaltulose production rate of :.=3 !as obtained. 'hesame research group reported the immobilization of glucosyltransferaseextracted from the cells of r!inia sp. onto Celite 545. 'he authors observedthat the optimal conditions for immobilization !ere at p 4.2 and 7:2 F ofglucosyltransferase*g of Celite 545. Fsing these conditions, more than 123conversion of sucrose into isomaltulose could be obtained. 'he enzyme !asalso immobilized in microcapsules of lo!"methoxyl pectin and fat (butterand oleic acid. 'he non"lyophilized microcapsules of pectin containing the

glucosyltransferase and fat converted =23 of sucrose into isomaltulose inthe /rst batch 75:K.

:. Conclusions

0s reported in this revie!, di@erent types of carbohydrases have hugepotential for application in the food industry. o!ever, because of the costfor the application of these biocatalysts, many studies should focus on thedevelopment of cheap and eRcient immobilization methods. Consideringthat the application is for the food industry, di@erent parameters areconsidered. ?or example, most of the steps !here these enzymes are

applied are in an a-ueous solution. 'hus, if the enzyme is !ea%ly adsorbedinto the support, it can easily desorb from the matrix. n the other hand, ifadsorption*desorption occurs in di@erentiated and !ell"controlledenvironments, carrier reuse, once enzymatic activity is exhausted, isfeasible. Fn!anted enzyme desorption can be avoided !ith the covalentbonding of the enzyme into the support. But, extreme caution should beta%en considering that this techni-ue needs extremely toxic reagents, suchas glutaraldehyde. #igni/cant advances have been made in this /eld !iththe introduction of pre"activated hetero"functional supports, !hich someho!simplify the methodology and, moreover, allo! the site"directed

rigidi/cation of the enzyme. 'he feasibility of the method re-uires,nevertheless, %no!ledge of the residues of the catalytic site to preventdra!bac%s similar to those in random binding. Moreover, extremerigidi/cation may be a dra!bac% for enzymes displaying largeconformational changes during catalysis. ?inally, the entrapment of theenzyme into some gels or synthetic polymers has to be very !ell studied,ta%ing into consideration the porosity of the matrix and the size of theenzyme (molecular !eight and of the substrate*product. o!ever, ifade-uately identi/ed and implemented, the immobilization methods canenhance enzyme stability, activity and selectivity. In the design of the

immobilization methods, it should be brought to mind that the selection ofthe immobilization method must ta%e in to consideration the speci/c nature


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of the reaction to be catalyzed and the reactor con/guration and not onlyconsider the highest stabilization and activity of the enzyme. 'his is ofrelevance, since successful industrial applications of the immobilizedbiocatalysts re-uire not only that it is stable and active, but also that it haslo! cost, can undergo repeated re"use and is compatible !ith the intended

set"up. ro!ing %no!ledge on the =) structure of enzymes and in theirsurface composition provides a po!erful tool for a more rational design ofimmobilization, but this has to be combined !ith insight on the physical andchemical properties of the support. 'he application of molecular simulationmethods has been contributing to the rational development ofimmobilization strategies, but this approach is still limited. ?urtherexperimental evidence on the structure of the enzyme after immobilizationis still re-uired to better understand the outcome of immobilization and,thus, help the development of suitable models. iven the large number ofenzymes !ith interest for the food and feed industry, along !ith that of

promising available supports, and the vast resources re-uired for theirmolecular characterization and development of predictive models, it can beforeseen that the random, trial and error approach !ill still be used in thenear future, at least in a screening role. 'he current high throughputplatforms currently available allo! for the evaluation of a large number ofvariables in a timely, cost"e@ective manner. 0 ma$or challenge is also thedevelopment of tailor"made carriers displaying tunable binding, geometricand mechanical properties, so that they can be used in di@erent reactorcon/gurations and, so, allo! a more eRcient and cost e@ective continuoususe or reuse of the biocatalysts. 'he successful accomplishment of such an

endeavor is clearly a multidisciplinary tas%, since it involves computationalmodeling of materials, life science and computational scientists, alongside!ith biochemical engineers

0c%no!ledgments

'he authors are grateful to ?undaVWo de 0mparo X Aes-uisa do stado de#Wo Aaulo (?0A#A (Arocesses numbers >229*29>>4"= and >277*7>=94"G,Conselho Dacional de )esenvolvimento CientY/co (CDA- and CoordenaVWode 0perfeiVoamento de Aessoal de DYvel #uperior (C0A# (Brazil for their/nancial support. Le !ould li%e to than% Aedro Carlos de Barros ?ernandes,

one of the co"authors, !ho, !ith his experience, contributed immensely tothe preparation of this article.

ConNict of Interest

'he authors declare no conNict of interest.

4 . Carboidrases imobilizadas na IndZstria de Bebidas

Muitos crit[rios devem ser tomados para escolher suportes para utilizar emprocessos industriais, como atoxicidade (grau alimentYcio, baixo custo epronta disponibilidade, facilidade de uso, a in[rcia -uYmica (em*sob


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condiV\es de uso , nWo"biodegradabilidade e, por Zltimo, a capacidade dosuporte para reagir , -uer diretamente -uer atrav[s de um m[todo simplese barato de ativaVWo . O]rios precursores dos componentes arom]ticos devinhos, sucos, mostos e outras bebidas alco^licas sWo monoterpenos(geraniol , nerol , citronelol , linalol , & "terpineol , etc em forma di"

glicosYdica . les cont_m " ) " glucopiranose ligados diretamente aaglicona e*ou outros aVZcares, incluindo & " + " rhamnopyranose e & " + "arabinofuranose. stes compostos con$ugados nWo sWo vol]teis e sWogeralmente solZveis em ]gua, sendo percebido apenas pela mucosa olfativado consumidor depois da remoVWo da fraVWo de hidratos de carbono, porhidr^lise ]cida ou enzim]tica, -ue liberta a parte vol]til ( terpenols ,ses-uiterpenos , nor"isopren^ides , etc . licosidases sWo utilizadas paraaumentar o aroma dos vinhos e outros sucos por hidr^lise se-uencial dosglic^sidos ligados aos compostos vol]teis . #pagna et al . imobilizada v]riasglicosidases ( " ) " glucopyranosidase , & " + " arabinofuranosidase , & " + "

rhamnopyranosidase , puri/cados a partir de um 0spergillus nigerpreparaVWo enzim]tica por aprisionamento em g[is de -uitosano esubse-uente reticulaVWo com glutaraldeYdo . s autores ob$etivam avaliar aviabilidade de aplicar o biocatalisador imobilizado na indZstria deprocessamento de vini/caVWo e sumos de fruta . s autores testaram aadiVWo de v]rios agentes , a /m de melhorar as propriedades fYsicas emec`nicas do gel , diminuir vazamento enzima e aumentar o rendimento deimobilizaVWo e da estabilidade operacional . s melhores resultados foramobtidos utilizando , como aditivos de gelatina e de gel de sYlica . 0sglicosidases imobilizadas foram usadas para aumentar o aroma de uma

soluVWo de vinho modelo . s autores estabelecido -ue as enzimas , tantolivres e imobilizadas conduziu a um aumento de -uatro vezes naconcentraVWo de v]rios dos compostos vol]teis mais perfumadasencontrados no vinho , particularmente em vinhos Moscato . #u et al .imobilizada " glicosidase sobre o alginato por combinaVWo de reticulaVWocom o aprisionamento e , mais uma vez , a ligaVWo cruzada . 0p^s aotimizaVWo das condiV\es de imobilizaVWo , uma recuperaVWo de "glicosidase de 41,23 atividade foi obtida. s autores investigaram aspropriedades do " glicosidase imobilizada . p ^ptimo permaneceuinalterada , en-uanto -ue a temperatura ^ptima foi de 45 6 C, a -ual foi de

72 6 C mais baixa do -ue a da enzima livre . sta caracterYstica particularpode, entretanto, ser aproveitado no processamento de bebidas de ch] .0ssim , o tratamento com imobilizada " glucosidase pode ser realizada auma temperatura mais baixa do -ue com as enzimas livres ,conse-uentemente, a temperatura elevada , resultando em bro!nness dainfusWo de ch] , pode ser evitada . 0 imobilizaVWo resultou tamb[m umaumento na estabilidade t[rmica . 0l[m disso , a enzima imobilizada foimais est]vel em condiV\es de p extremas . valor de 8m para imobilizada " glicosidase foi estimada em 7,9: ; 72"= mol * + , cerca de 5 vezes menordo -ue a da enzima livre , o -ue foi atribuYdo a alteraV\es estruturais na

estrutura da enzima como um resultado da imobilizaVWo . 0 possibilidade deutilizar a enzima imobilizada como um aroma " potenciador de bebidas de


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ch] , tamb[m foi avaliada . s resultados mostraram -ue em bebidas dech] processados com imobilizada "glicosidase , a -uantidade total de ^leoessencial no ch] verde , ch] oolong e ch] preto aumentou >2,193 , 72,=23e 1,:93 , respectivamente. ImobilizaVWo aumentou a estabilidade dearmazenamento de " glucosidase , uma vez -ue :=,= 3 de retenVWo de

actividade foi observada ap^s 4> dias de armazenagem a 4 6 C , en-uanto-ue para a enzima livre , apenas 5,7 3 de retenVWo de actividade foiobservada ap^s >2 dias de armazenamento . 0l[m disso , a enzimaimobilizada mostrou uma actividade residual de 9=,1 3 depois de ter sidousada 52 vezes repetidamente . ?igueira et al . rastreados v]rios suportespara a imobilizaVWo de um extracto parcialmente purificado de "glucosidase de 0spergillus sp . 0 imobilizaVWo de sol"gel e em +enti%atspermitiu a retenVWo de actividade mais elevada ap^s a imobilizaVWo e foiassim caracterizado mais . 0 imobilizaVWo nWo alterou o per/l de p *actividade , ao passo -ue o per/l de temperatura * actividade foi melhorada

-uando o suporte de sol"gel foi ensaiado . 'anto a estabilidade t[rmica e dep foram melhoradas como resultado da imobilizaVWo . bservou"se umaumento do ( constante de Michaelis 8m aparente ap^s imobilizaVWo ,sugerindo limitaV\es de difusWo. nzimas p[cticas t_m sido muito utilizadasna indZstria de bebidas para aumentar a produVWo de sumos e de clari/carsucos . Fm exemplo [ pectinlyase , -ue tem recebido cada vez maisatenVWo para o seu potencial de aplicaVWo na indZstria de processamento dealimentos, devido X sua capacidade de despolimerizar pectinas em umprocesso enzim]tico Znico , acabando com a necessidade de usarpectinesterase e poligalacturonase . Zltimo processo liberta metanol e

conduz X formaVWo de precipitados coloidal no sistema , entre a pectinaesteri/cada "de e o iWo de c]lcio end^geno . #pagna et al . pectinlyaseimobilizado utilizado para a despectinizaVWo de suco de frutas. s autoresrealizaram a imobilizaVWo em tr_s polYmeros sint[ticos upergit C , Dylon 1ativadas com glutaraldeYdo e E0): ativado com triclorotriazina . Sesultadosda actividade ade-uados foram obtidos apenas com activada de nylon 1 eE0): ( 772 e ==5 F * g , respectivamente . Fm aumento na estabilizaVWofoi obtida pelo endurecimento da estrutura da enzima atrav[s de ligaVWocruzada com glutaraldeYdo . per/l de p mant[m"se inalterado , noentanto , a temperatura ^ptima do enzima imobilizada foi maior ( G"72 6 C

do -ue a da enzima livre . 0l%orta et al . imobilizada a enzima pectina liasede Aenicillium italicurn por ligaVWo ao nylon 1 , a /m de comparar aspropriedades cin[ticas das enzimas livres e imobilizadas fYsico " -uYmica ecovalente . s autores avaliaram as condiV\es ideais para o processo deimobilizaVWo , par`metros cin[ticos e p e comportamento da temperaturada enzima. 0 curva da enzima imobilizada de actividade do p deslocadopara um p baixo, comparado com o de um solZvel . )a mesma forma , oAD+ imobilizada foi mais est]vel a valores de p mais baixos do -ue aenzima livre . 0 imobilizaVWo causou um aumento marcado na estabilidadet[rmica e de armazenamento tanto da enzima . DWo foi observada nenhuma

perda de actividade -uando a enzima imobilizada foi usada para 7> ciclosconsecutivos de operaVWo . 0 diminuiVWo da viscosidade de soluV\es de


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pectina transformados com imobilizada AD+ era menor do -ue a dassoluV\es transformados com livre AD+ . uando foram usados sumos defruta , no entanto , a diminuiVWo da viscosidade ao longo doprocessamento , como foi marcado como a observada -uando a enzimalivre foi utilizado para esclarecer as soluV\es de pectina . ?ace aos

resultados obtidos , os autores sugeriram -ue Dylon " imobilizada AD+fornecida uma ferramenta promissora para a clari/caVWo de sumos de frutaa 42 6 C e um p aproximado de =,2 .

5 . Carboidrases imobilizadas na AroduVWo de prebi^ticos

5.7. galactooligossacarYdeo

alacto (# sWo um exemplo de alimentos funcionais . # sWoprebi^tico , por-ue eles nWo sWo digeridos pelos seres humanos ou outrosanimais , e aumentar selectivamente a microNora ben[/ca do intestino ,

conduzindo a benefYcios para a saZde . # pode ser sintetizado porglicosiltransferases altamente especY/cos , -ue utilizam os dadores deaVZcar -ue cont_m um nucle^sido fosfato ou um grupo restante fosfatolipYdico . Contudo , estas enzimas sWo apenas disponYvel , sWo extremamentecaros e re-uerem nucle^tidos de aVZcar especY/cas como substratos .Aortanto, eles nWo sWo usados em processos realistas de baixo custo para aproduVWo de # . 0ssim, as mol[culas de # sWo tipicamentesintetizados pela actividade enzim]tica da " galactosidase em lactose ,numa reacVWo conhecida como transgalactosilaVWo . 0 composiVWo de #produzidos a partir da lactose por " galactosidase tem geralmente a

estrutura aln " lc , em -ue n indica o grau de polimerizaVWo ( )A e [tipicamente de 7"5 . processo [ controlado cineticamente e envolve acompetiVWo entre hidr^lise e transgalactosilaVWo . 0 primeira, -ue [termodinamicamente favorecida e leva X produVWo de ) " galactose e ) "glucose , compete com a actividade de transferase , -ue leva X produVWo damistura complexa de sacarYdeos aln " lc . necess]rio o conhecimentoda evoluVWo no tempo da reacVWo de conversWo ou a lactose paradeterminar -uando a produVWo m]xima de um dado produto [ conseguido . processo [ bastante complexo , e a saYda depende claramente da origemdo enzima e sobre as suas propriedades . O]rios modelos foram propostos

para descrever a sYntese de oligossac]rido e a hidr^lise da lactose emsimult`neo , em Zltima an]lise, -ue aponta para a necessidade de umaconcentraVWo inicial de lactose elevada , viz . 42 3 ! * v e acima . 0srecentes constataV\es de Oera e colaboradores estabeleceram -ue umaumento na concentraVWo inicial de lactose apenas inNuencia positivamenteo rendimento m]ximo do produto , desde -ue a lactose permanecedissolvido . stes autores tamb[m realVar a interacVWo complexa entre atemperatura e a concentraVWo inicial de lactose na reacVWo de sYntese .osling e colaboradores tamb[m produziu uma visWo sobre o fen^meno -uerealVa a necessidade para a concentraVWo mais elevada de lactose possYvel

conseguir nYveis elevados de # . ?ace aos resultados obtidos no seutrabalho , os autores sugeriram -ue este resultado [ devido ao aumento das


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reacV\es -ue conduzem a oligossac]ridos em vez de decr[scimos nasreacV\es concorrentes , -ue degradam oligossacarYdeos . aur et al .imobilizada 0spergillus oryzae " galactosidase por tr_s t[cnicasdiferentes adsorVWo em Celite , o acoplamento covalente a -uitosana e aagregaVWo por ligaVWo cruzada ( cleas . DWo ocorreram alteraV\es

signi/cativas na temperatura e p ^ptimos resultou de imobilizaVWo , noentanto , foi observado um aumento no 8m , em comparaVWo com a formalivre . 0 imobilizaVWo em -uitosana deu o rendimento m]ximo a atividadeenzim]tica e sYntese de oligossacarYdeos . 0 imobilizaVWo melhorada aestabilidade t[rmica de ambos enzima imobilizada -uitosano e cleas .uando um >2 3 ( ! * v de soluVWo de lactose foi usada como substrato , aenzima imobilizada " -uitosano conduziu a um rendimento m]ximo deoligossac]rido , o -ue corresponde a 7:,= 3 do total de aVZcar , ao passo-ue a utilizaVWo da enzima livre apenas permitiu um rendimentocorrespondente oligossac]rido a 72,2 3 de aVZcares totais, ap^s > horas de

operaVWo , a 42 6 C. Aor outro lado , em vez cleas mostrou e/caz nahidr^lise da lactose , obtendo"se :G 3 de monossac]rido ap^s 7> horas deoperaVWo . alacto foram produzidos continuamente usando lactose e "galactosidase de Bullera singularis 0'CC >479= imobilizada em ChitopearlBCL =572 gr`nulos . Denhuma ativaVWo ou agentes de reticulaVWo foramusados antes ou ap^s a imobilizaVWo . 0 preparaVWo foi usada directamentepara a reacVWo contYnua num reactor de leito empacotado , dando origem a55 3 ( ! * ! de oligossacarYdeos e uma produtividade de 4,4 g * + h , apartir de 72 3 ( ! * v de lactose , durante uma operaVWo de 75 dias .Arodutividade do lote era de 1,5 g de galacto * + h a partir de um 2,= 3 ( ! *

v de lactose . Magn[tica ]lcool polivinYlico " polissiloxano provou ser umsuporte ade-uado para a imobilizaVWo de 0spergillus oryzae "galactosidase e a sua aplicaVWo na produVWo concomitantegalactooligossacarYdeo usando lactose como substrato . suporte foifacilmente recuperado pela aplicaVWo de um campo magn[tico , o -uecontribuiu para atingir a retenVWo de G4 3 da actividade da enzima inicialap^s 72 ciclos de reacVWo . 0 produVWo galacto foi realizada a temperaturas-ue variam de =2 6 C a 12 6 C e p =,5 a 5,5 , com as preparaV\es deenzimas livres ou imobilizadas , mas a produVWo de # permaneceurelativamente inalterada , apesar de tais variaV\es de condiV\es de

funcionamento . )e partYculas de magnetite obtidos por co"precipitaVWo de?e> P e ?e= P e revestidos com polianilina foram activadas comglutaraldeYdo , a fim de imobilizar covalentemente 0spergillus oryzae "galactosidase . 0 metodologia permitiu a imobilizaVWo de >,24 mg deenzima por grama de apoio, -ue os autores a/rmavam ser o melhor dosvalores reportados na literatura. ste derivado enzim]tico magn[tica foicapaz de hidrolisar tanto de lactose em glicose e galactose, para produzir etri" e tetra" galactosidos de lactose por transgalactosilaVWo , e , em geral , oseu desempenho era semelhante X da enzima livre . 0ssim , paraconcentraV\es de lactose superior a 722 g * + , as actividades especY/cas de

ambas as formas eram semelhantes , mas para concentraV\es de lactosemais elevados , a taxa de reacVWo especY/ca inicial da enzima imobilizada


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foi afectado em termos de concentraVWo de lactose aumentada . AroduVWode # por ambas as formas da enzima nWo foi afectada dentro de =2 a 126 C. biocatalisador imobilizado foi reciclado 72 vezes , a >5 6 C eutilizando um >2 3 ( ! * v de soluVWo de lactose em cada ciclo . Do /nal dociclo /nal , a actividade do biocatalisador imobilizado foi de G5 3 do valor

inicial . utro tipo de suporte magn[tica foi usada para a imobilizaVWocovalente de 8luyveromyces fragilis " galactosidase . s nanobeadsmagn[ticas foram preparados a partir de metacrilato de glicidilo , etilenoglicol dimetacrilato e hidroxietil metacrilato , atrav[s de polimerizaVWo ememulsWo isenta de emulsionante . 0 ligaVWo a mol[culas de enzima foiformada atrav[s dos grupos epoxi sobre a superfYcie dos gr`nulos . 0-uantidade m]xima de enzima ligada ao suporte era de 745,1 mg * g,correspondendo a uma recuperaVWo de :>,1 3 de actividade . 0 enzimaimobilizada apresenta alta actividade catalYtica para a sYntese de # eproduziu um total de >.>42 g de # por grama de enzima imobilizada

durante 72 reacV\es lotes consecutivos . 0p^s estes ciclos , o biocatalisadorimobilizado retido G7,53 de sua atividade original . Fm novo m[todo deimobilizaVWo de enzimas utilizando 0spergillus oryzae " galactosidase -ueimplica a formaVWo e o crescimento de agregados em /brilas individuais detecido de algodWo -ue conduzem a imobilizaVWo de mZltiplas camadas daenzima agregado polietilenoimina " enzima foi desenvolvida por 0lbayra% e

Qang 7>G K . Fma grande -uantidade de enzima foi imobilizada , >52 mg *g de suporte , com cerca de 92 3 "95 3 de e/ci_ncia . 0 produVWo m]ximade galacto >5 3 ">1 3 ( ! * ! foi conseguida em cerca de 52 3 deconversWo para a lactose a partir de 422 g * + de lactose , p 4,5 e 42 6 C.

'ri"e tetra "sacarYdeos foram os principais tipos de galacto" formados , o -uerepresenta cerca de :2 3 e >5 3 do total de galacto produzidos nasreacV\es , respectivamente . 'amb[m foi observado um aumento marcadona estabilidade t[rmica da enzima imobilizada , em comparaVWo com aforma livre . 0 meia " vida para a enzima imobilizada sobre um pano dealgodWo foi pr^xima de um ano a 42 6 C , mas apenas >7 dias a 52 6 C. biocatalisador imobilizado permitiu a produVWo de # de >1 3 ( ! * ! deaVZcares totais , a partir de uma soluVWo de alimentaVWo de lactose de 42 3( ! * v de lactose , p 4,5 e 42 6 C , em 52 3 de conversWo de lactose . 0produVWo de # da lactose tamb[m foi realizada utilizando "

galactosidase de 0spergillus oryzae , imobilizada sobre um acetato decelulose modi/cado com plasma a baixa pressWo . novo m[tododesenvolvido para imobilizaVWo de enzimas envolvidos na formaVWo decamadas mZltiplas de uma polietilenoimina ( AI com enzima deagregaVWo e crescimento concomitante sobre uma membrana de acetato decelulose . Fma carga de enzima de membrana 9,9: g*m> foi imobilizadacom uma e/ci_ncia de 113. 0 semi " vida da enzima imobilizada membranafoi de cerca de um m_s a =2 6 C , embora esta diminuiVWo de 12 horas a 126 C. 0 produVWo m]xima de # de >: 3 ( ! * ! foi obtido em :2 3 deconversWo para a lactose a partir de um => 3 ( ! * v de lactose , p 4,5 e

12 6 C. # foram principalmente composta por trissac]ridos , tal comoestes foram respons]veis por aproximadamente :5 3 do total de # .


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AroduVWo de # foi tamb[m conseguido usando " galactosidase de'alaromyces thermophilus CB# >=1,5G imobilizada sobre upergit C , tantosob forma descontYnua e um modo contYnuo de operaVWo , o Zltimo em umreactor de leito empacotado . 0s produV\es m]ximas de # de 7> , =9 eG2 g * + foi obtido em concentraV\es iniciais de lactose a 53 , 72 3 e >2 3 (

! * v , respectivamente , para as experi_ncias de conversWo de lote . DaoperaVWo contYnua , uma concentraVWo m]xima de # de cerca de 52 g * +foi obtido com uma taxa de diluiVWo de 2,=:5 h " 7 em um reactor de leitoempacotado , para uma concentraVWo inicial de lactose de >2 3 ( ! * v . 0composiVWo da mistura de # foi tamb[m demonstrado ser inNuenciadopelo modo de operaVWo . 0ssim , -uando o contYnuo de leito empacotado foiutilizado , mais trissac]ridos e menos dissacarYdeos foram formados , emcomparaVWo com a operaVWo em lote . O]rios outros estudos forampublicados , centrou"se na utilizaVWo de diferentes con/guraV\es dereactores para a produVWo de # , usando imobilizada " galactosidase .

0ssim , os reactores de leito embalado contendo imobilizada "galactosidase de 0spergillus candidus adsorvido em resina )77= eencapsulada em alginato de c]lcio , e 0spergillus oryzea imobilizado sobrepano de algodWo exibida produtividades # de G: e 721 g * l h,respectivamente . 'amb[m tem sido relatado -ue um m[todo melhoradodesenvolvido pelos Zltimos autores para imobilizaVWo " galactosidase emtecidos de algodWo levou a uma produtividade de 1222 g * l h J produVWo de# em um reactor de tan-ue com agitaVWo contYnua usando B. circulans " galactosidase imobilizada gel de sYlica de poro controlado . rendimento ea produtividade , em # foram 7,: e 7,9 vezes superior ,

respectivamente , -uando comparados com a-ueles -ue utilizam enzimaslivres . Da%%harat et al . 7=4 K desenvolvido um reactor de membrana deultrafiltraVWo contendo 'alaromyces thermophilus " galactosidase , o -uepermitiu um aumento de 5,1 vezes na produtividade de # , -uandocomparado com a enzima livre ,

5.> . frutooligossacarYdeos

s frutooligossacarYdeos (?# tamb[m sWo subst`ncias prebi^ticas , livrede calorias e adoVantes nWo cariog[nicas . ?# estimulam o crescimento debi/dobact[rias e foram reivindicados para contribuir para a prevenVWo de

c`ncer de c^lon e reduzir o colesterol, fosfolipYdios e triglic[rides no soro .?# consistem de uma mistura de olig^meros de frutose , tipicamente comduas ou tr_s unidades de frutose ligadas a " > , uma posiVWo de sacarose ,e -ue sWo compostos principalmente de 7" cestose ( ?> , 7 " nistose ( ?= e 7 " fructofuranosil " nistose ( ?4 . les sWo encontrados em v]riosvegetais ou alimentos naturais , no entanto , os ?# sWo produzidoscomercialmente por sYntese enzim]tica a partir de sacarose por enzimasmicrobianas com actividade frutosiltransfer]sica 7=5 K . 0 de/niVWo detransfrutosilaVWo ainda envolve alguma controv[rsia. Como resumiurecentemente, en-uanto alguns autores classi/caram esta reaVWo como

a-uela catalisada pela " frutofuranosidase ou invertase , outrostransfrutosilaVWo classificado como um " d frutosiltransfer]sica reaVWo


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7=1K . uando esta Zltima [ considerada , a actividade defrutosiltransferase [ observada em concentraV\es elevadas de sacarose ,en-uanto -ue a baixa concentraVWo de actividade hidrolYtica de sacarose [predominante . 0ssim , uma s[rie de reacV\es desproporcionadas leva XformaVWo de ?# e de glucose , como um subproduto da actividade de

frutosiltransferase , en-uanto frutose e glicose sWo formados comoresultado da actividade hidrolYtica 7=:,7=G K . ?# sWo produzidos deacordo com uma reacVWo em cadeia , em -ue duas mol[culas de sacaroseproduzir uma mol[cula de ?> e uma mol[cula de glicose . )uas mol[culasde ?> reagir para produzir uma mol[cula de ?= e uma mol[cula desacarose . )uas mol[culas de ?= reagir , levando a uma mol[cula de ?4 euma mol[cula de ?> . Fma mol[cula de ?= tamb[m [ hidrolisado para?> e uma mol[cula de frutose . Fm modelo de previsWo , o -ual inclui osubstrato e de glucose e frutose inibiVWo , foi desenvolvido e fornecido umbom a$uste para os dados experimentais para a produVWo de ?# a partir de

sacarose utilizando uma frutosiltransferase a partir de Shodotorula sp . Fmcomportamento de Michaelis " Menten foi observado , com a inibiVWo dosubstrato em concentraV\es elevadas de sacarose ( at[ :2 3 ! * v

$untamente com a inibiVWo competitiva da glicose relacionada com sacarose, e as absorV\es ?> ?= . 0 inibiVWo tamb[m foi observado emconcentraV\es elevadas de frutose (mais de 52 3 . 0tividade hidr^lisesobre ?= tamb[m foi identi/cado . xistem diferentes t[cnicas paraimobilizar enzimas e c[lulas microbianas inteiras para produzir ?# . mparticular , a encapsulaVWo das c[lulas e enzimas [ amplamente usado .ncarceramento celular em alginato de c]lcio foi bastante favorecida. sta

abordagem particular foi implementado por Ding et al. para oaprisionamento de c[lulas dendrorhous Eanthophyllomyces , devido Xrelativa facilidade de separaVWo de c[lulas a partir do caldo de fermentaVWoe a forte toler`ncia a altas concentraV\es de substratos e produtos . 0sc[lulas foram misturadas com uma soluVWo de alginato de s^dio a > 3 , e amistura de c[lulas " alginato foi extrudido , gota a gota por meio de umaagulha, uma soluVWo 2,> M de CaCl> . s gr`nulos resultantes forammantidas em soluVWo de CaCl> a 4 6 C durante >4 h antes da utilizaVWo . processo procution ?# baseada no uso deste biocatalisador imobilizadopermitido para um rendimento m]ximo de ?# de >=1 g * +, ap^s 75 h de

reacVWo . Mic[lio 0spergillus $aponicus imobilizadas em esferas de alginatode c]lcio tamb[m foram utilizados para a produVWo de ?# . s mic[lios daestirpe foram realizados em soluVWo de glutaraldeYdo a 7,5 3 a 4 6 Cdurante >4 h antes de aprisionamento com alginato de c]lcio . AroduVWo de?# foi realizada num processo por lotes num biorreactor de > + , e o p^ptimo e a temperatura para a sYntese foram 5,2"5,1 e 55 6 C ,respectivamente . 0 produVWo m]xima foi conseguida utilizando 5,:53( peso celular * volume de mic[lio e a soluVWo de sacarose 15 3 ( ! v ,durante -uatro horas de reacVWo , no ponto em -ue 17,>G 3 do total de ?#continham =2,51 3 , >1,45 3 e 4,>: 3 de ?> , ?= , e ?4 ,

respectivamente . biocatalisador imobilizado foi usado em >= lotesconsecutivos sem perda signi/cativa de actividade , sugerindo -ue o


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potencial para aplicaV\es em larga escala . 0ureobasidium pullulans foiimobilizada em contas de alginato de c]lcio e usado para a produVWocontYnua de fruto"oligossacarYdeos , utilizando um reactor de leitoempacotado . Aara o procedimento de imobilizaVWo , uma suspensWo dec[lulas , contendo 4 3 ( v * v de c[lulas secas , foi misturada com = 3 ( ! *

v de soluVWo de alginato de s^dio a 7> ( v * v . 0 mistura foi submetida aextrusWo atrav[s de agulhas de seringa para uma soluVWo a 2,7 M de CaCl> .s gr`nulos resultantes foram curados durante > h e , em seguida,endurecido durante a noite a 4 6 C. 0s condiV\es de operaVWo ^ptimasforam alcanVados com ::2 g de sacarose * + , alimentado a >22 + * h a 52 6C , e permitiu uma produtividade de 7G2 g ?# * + h . 0l[m disso , aactividade inicial foi mantida durante cerca de 722 dias ap^s a operaVWo ,num reactor de 7,> m= , de modo -ue um teor de 5: 3 de ?# ( ! * ! noeNuente foi obtida ao longo deste perYodo . C[lulas de 0ureobasidiumpullulans foram misturados com uma soluVWo de alginato = 3 ( ! * v , e a

mistura foi submetida a extrusWo para um 7 3 ( ! * v de soluVWo de CaCl>para formar as pe-uenas p[rolas de gel como as c[lulas hidratadasimobilizado . 0s c[lulas imobilizadas foram curados X temperatura ambientedurante > h e , em seguida, endurecido durante a noite a 4 6 C. 0s esferasforam , em seguida, colocado a "75 6 C, durante 1">4 h para induzir acongelaVWo" desidrataVWo . congelamento "secagem resultou na retracVWodas p[rolas como um resultado da remoVWo de ]gua . Como resultado , ovolume do gr`nulo foi reduzida em G> 3 e o peso do gr`nulo de G5 3 . sgr`nulos desidratados foram utilizados com _xito para a produVWo de ?#num sistema de reactor de modelo . utras t[cnicas foram estudadas por

enzima e imobilizaVWo de c[lulas para a produVWo de ?# . Fma preparaVWoem bruto " frutofuranosidase de 0spergillus a!amori DBSC42== foi ligadocovalentemente a -uitosana por ligaV\es de glutaraldeYdo e usados para asYntese de ?# a partir de sacarose . extracto bruto obtido , ap^s a/ltraVWo e a centrifugaVWo , foi usado directamente como fonte de enzimano processo de imobilizaVWo . Isso envolve , em primeiro lugar asolubilizaVWo e activaVWo de -uitosano , respectivamente , com ]cidoac[tico e glutaraldeYdo a 7 3 ( v * v , seguido pela ligaVWo da enzima ao-uitosano 0 " activada a p 5,2 covalente . Das condiV\es utilizadas , GG3do extrato bruto foi obrigado , e uma recuperaVWo de 543 a atividade foi

relatada . DWo se observaram alteraV\es signi/cativas no p e temperatura^ptimos do biocatalisador imobilizado , em comparaVWo com a forma livre ,no entanto, ambos o p e a estabilidade t[rmica do ex foram aumentadas .0 imobilizaVWo resultou em limitaV\es de difusWo , tal como reNectido porum aumento de 7,= vezes na %m . 'ransfrutosilaVWo ocorreu apenas aconcentraV\es elevadas de sacarose , 7==,=5">=7,94 g * +, en-uanto -ue aconcentraV\es mais baixas de sacarose , 57,>":4,>9 g * + , a hidr^lise tevelugar . rendimento m]ximo de conversWo de sacarose para ?# foi de 553 , o -ue corresponde a 7>G g * + de ?# e uma produtividade calculado de7G,5= g*h*722 g . 8ovaleva et al . demonstraram -ue inulinase

covalentemente imobilizada sobre resina de troca ani^nica macroporosa( 0O " 71 " # tinham temperatura e p maior estabilidade ^ptima de


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inulinase livre . AreparaV\es comerciais com pectinases actividadefrutosiltransfer]sica , Aectinex Fltra #A " , tamb[m foram imobilizadas emtransportadores #epabeads C" A= e C " A5 e aplicado para a sYntese delote de fruto"oligossacarYdeos . Fma concentraVWo de sacarosesu/cientemente elevada , de 1=2 g * + , foi utilizado para transferir a

actividade no sentido de transfrutosilaVWo , em detrimento de hidr^lise . 0reacVWo foi mais r]pida utilizando transportadores C " A5 , possivelmentepor causa de limitaV\es de difusWo reduzidas apresentadas por este apoio ,devido X sua morfologia . 0 concentraVWo de ?# atingiu um valor m]ximode =G: g * +, ap^s =1 h ( >42 g * + ?> , 744 g * + ?> e = g * + ?4 , o -uecorresponde a 17,5 3 ( ! * ! do total de hidratos de carbono em a mistura. 0s caracterYsticas destes biocatalisadores imobilizados sWo muito atraentespara a sua aplicaVWo em lote e de leito /xo biorreatores . 0frutosiltransferase produzida por Shodotorula sp . foi imobilizado em umsuporte inorg`nico -ue consiste de uma liga de ni^bio e gra/te . 0

imobilizaVWo da enzima foi de i^nico -ue se ligam X superfYcie das partYculas, uma vez -ue o suporte [ um s^lido carregada e compacta , comporosidade negligenci]vel . 0 frutosiltransferase imobilizada em ni^biopermitiu rendimentos ?# de cerca de 41 3 de concentraVWo de sacarosede 52 3 e :2 3 ( ! * v , ap^s 91 h de sYntese . ?> foi o frutano produzidopredominante , com ?= e ?4 presentes em -uantidades menores . Fmmodelo preditivo de produVWo ?# foi desenvolvido , -ue teve um boma$uste aos dados experimentais.

utras carboxilases imobilizadas

0 enzima " galactosidase [ classificada como uma hidrolase , comcapacidade de transferase para grupos de galactose , -ue catalisa ahidr^lise do resYduo " galactopiranosil terminal a partir da lactose , paraformar uma mistura isomolecular de glucose e galactose . " galactosidase[ uma enzima importante na indZstria de alimentos e tem encontradoaplicaV\es importantes no aumento da doVura, solubilidade, sabor edigestibilidade de produtos l]cteos . uidini et al . estudou o processo deimobilizaVWo de " galactosidase de 0spergillus oryzae (um fungo usandoa resina de troca i^nica )uolite 051G como um portador (suporte para ahidr^lise da lactose . processo de imobilizaVWo por ligaVWo inica foi

estudada atrav[s de um plane$amento composto central (ACC . 0sinNu_ncias simult`neas de a concentraVWo de enzima e o p no meio deimobilizaVWo foram analisados pelos autores . s resultados mostram -ue aretenVWo de atividade enzim]tica durante o processo de imobilizaVWo foifortemente dependente destas vari]veis , sendo maximizada a um p de4,5 e uma concentraVWo de enzima de 71 g * +. 0 enzima imobilizada obtidasob as condiV\es anteriores, foi submetida a um processo de ligaVWocruzada com glutaraldeYdo (como agente reticulante , e as condiV\es deforma a maximizar a atividade era uma concentraVWo de glutaraldeYdo de=,G= g * + e um tempo de reticulaVWode 7,G: h . glutaraldeYdo ligaVWo

cruzada aumentou a atividade inicial , retendo 92 3 da sua atividade inicial(enzima imobilizada com reticulaVWo (tratada com glicoraldeido foi de 923


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da inicial. s autores relatam ainda -ue a enzima era muito est]vel nagama de p =,5"G,2 (0s condiV\es operacionais sWo consideravelmente maisbrandas com p de =,5 a G,2 e temperatura de 5 a 126C, o -ue reduz nWo s^a possibilidade de alteraVWo de compostos sensYveis ao calor, bem como asnecessidades energ[ticas, os efeitos de corrosWo do processo sobre

e-uipamentos e a formaVWo de subprodutos indese$]veis,sendo ade-uadopara a aplicaVWo em produtos com baixos valores de p , tais como soro deleite ]cido , uma vez -ue a atividade da enzima foi maximizada a p 4,5 .Aessela et al . realizada a imobilizaVWo de " galactosidase a partir de

'hermus sp . '> via adsorVWo i^nica em dois suportes diferentes um novopermutador de resina ani^nica , com base no revestimento de superfYciesinternas de #epabeads com polYmeros (M! de >5.222 de polietilenimina(AI , e tradicional )0 " agarose . 0 forVa de adsorVWo [ muito maior nocaso de AI " #epabeads -ue em )0 " suportes, em ambos p 5 e : .Menos de 5 3 da enzima foi eluida a partir de AI H apoio (suporte ,

en-uanto -ue mais de :2 3 de proteYna foi eluYda (decantada a partir de)0 " agarose , a p :, e 2,4 M de DaCl . s derivados de AIpermaneceram -uase totalmente ativos a p 5 e : , ap^s v]rias semanasde incubaVWo a 52 6 C , e a sua estabilidade t[rmica foi aumentada -uandocomparada com a de forma livre . m particular, o derivado foi utilizadopara realizar a hidr^lise da soluVWo de lactose a 5 3 durante 52 horas a p: e 52 6 C , sem -ual-uer mudanVa not]vel no padrWo da reaVWo. 0l[mdisso, foi estabelecido -ue, depois de um tal ciclo , o derivado pode sercompletamente removido do suporte, o ultimo recarregado . )adas estascaracterYsticas, os autores sugeriram -ue o biocatalisador imobilizado

apresenta um candidato promissor para uso industrial como umbiocatalisador na hidr^lise da lactose em v]rios produtos l]cteos e pode seracoplado com o tratamento antimicrobiano geralmente realizado. 0l[mdisso, Aessela e colaboradores foram capazes de demonstrar -ue aimobilizaVWo covalente de " galactosidase a partir de 'hermus sp . '> emboronato "epoxi" #epabeads e em -uelato " epoxi " #epabeads reduziusigni/cativamente a inibiVWo pela glicose (nWo competitivo e por galactose (competitiva observadas para a forma livre. 0o mesmo tempo, o 8m para alactose aumentou apenas duas vezes como um resultado da imobilizaVWo .s autores associaram estes resultados para pe-uenas modi/caV\es no

centro de conformaVWo ativa -ue podem ter ocorrido ap^s a imobilizaVWopara as heterofuncional ep^xi " #epabeads , o -ue levou a uma diminuiVWomais acentuada na a/nidade da enzima para o inibidor do -ue a dosubstrato. 0ssim , usando a preparaVWo de enzima imobilizada para ahidr^lise de um 5 3 ( ! * v, soluVWo de lactose , a reacVWo procedeu "se aum rendimento de hidr^lise superior a 99 3 , en-uanto -ue para a enzimalivre , apenas G5 3 de hidr^lise pode ser conseguida . Fma observaVWobastante similar foi reportado por Mateo e colaboradores -uandoimobilizando " galactosidase de 8luyveromyces lactis em agarose " glioxilo, glutaraldeYdo " agarose e glutaraldeYdo " upergit C suporta . Do entanto ,

nestes suportes , apenas a inibiVWo nWo " competitiva por glicose foisigni/cativamente reduzida , en-uanto -ue tanto a a/nidade da enzima


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para o inibidor competitivo ( galactose e o substrato ( lactose permaneceu inalterada , em comparaVWo com a forma livre , possivelmentedevido ao impedimento est[rico para o acesso de glucose para o local deligaVWo . )e alguma forma , curiosamente, a imobilizaVWo de um derivadoupergit " boranato levou a nenhuma mudanVa na inibidor nWo" competitivo.

ste foi considerado o resultado da ligaVWo -ue ocorre atrav[s das cadeiasde aVZcar , deixando assim o site inibiVWo exposto. Da verdade , nWo foramobservadas alteraV\es em relaVWo X a/nidade da enzima para a lactose egalactose, como um resultado da imobilizaVWo . 0l[m disso , o derivadoglioxil " agarose foi de >2 reacV\es , com uma actividade de enzimadiminuiVWo marginal e permitindo a hidr^lise -uase completa de 5 3 ( ! * vde soluVWo de lactose no /nal do lote /nal . 'anriseven e )ogan imobilizada " galactosidase de 0spergillus oryzae , em fibras compostas de alginato egelatina reticulada com glutaraldeYdo , para evitar fugas para fora daenzima . 0 percentagem de imobilizaVWo foi de 51 3 , e a actividade do

biocatalisador imobilizado manteve"se est]vel durante =5 dias. p e atemperatura ^ptima nWo foram afectados pela imobilizaVWo e manteve"seem 4,5 e 52 6 C , respectivamente . Do entanto , uma maior retenVWo deactividade a um p e temperatura extremos foi observado para imobilizada " galactosidase . Fm aumento de 7,> vezes no 8m como resultado daimobilizaVWo sugere uma limitaVWo de difusWo tYpicas aumentar , ea taxa dereaVWo especY/ca m]xima diminuiu -uase pela metade , o -ue sugeremudanVas estruturais na enzima. " galactosidase foi imobilizado poradsorVWo sobre uma membrana de matriz mista -ue cont[m di^xido dezirc^nio . 0t[ 7,1 g " galactosidase pode ser absorvida por m> de

membrana . Do entanto , a actividade m]xima foi conseguida com umacarga de enzima de cerca de 2,5 g*m> . mbora o p ^ptimo para aactividade foi deslocado 1,5":,2 , devido X imobilizaVWo , nWo foi observadadiferenVa signi/cativa na temperatura ^ptima . 0ctividade de retenVWo foi ,no entanto , mais e/caz a temperaturas mais baixas , na gama testada ( 5 a42 6 C . 0l[m disso, observou"se um aumento de oito vezes no 8maparente ap^s a imobilizaVWo , embora Omax permaneceu inalterado . sautores sugerem a viabilidade dos biocatalisadores imobilizados paraaplicaVWo em sYntese # .

1.> . AroduVWo isomaltulose

Isomaltulose [ um monossacarYdeo -ue apresenta aplicaV\es not]veis naindZstria de alimentos . ste aVZcar [ um substituto interessante para asacarose, considerando -ue [ aproximadamente 523 mais doce -ue asacarose, [ nWo"cancerYgeno e tem um baixo Yndice glic_mico. 0l[m disso, aisomaltulose pode ser convertida em ]lcool de aVZcar, isomalteU , o -ualtem outras propriedades Zteis para os alimentos . 0 isomaltulose, pode serobtida industrialmente por transglicosilaVWo , catalisada pelaglicosiltransferase intracelular produzida por algumas estirpes de bact[rias .xistem v]rios trabalhos sobre a imobilizaVWo de c[lulas bacterianas para

produzir isomaltulose . Do entanto , tendo em conta as vantagens do uso deextractos enzim]ticos, principalmente o nYvel reduzido de contaminaVWo


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microbiana do produto , a imobilizaVWo da glicosiltransferase extraYdo podeser atraente se um m[todo de imobilizaVWo e/ciente [ desenvolvido . Dotrabalho de 8a!aguti e #ato G K , a produVWo de isomaltulose, foi estudadanum processo de lote repetido utilizando glicosiltransferase imobilizada . 0maior taxa de conversWo de sacarose em isomaltulose foi obtido nos

primeiros lotes , sendo de 4=,7 3 . bservou"se -ue, ap^s o primeiro grupo ,as taxas de conversWo diminui rapidamente , e no segundo lote , uma taxade produVWo de isomaltulose, de :,=3, foi obtido . mesmo grupo deinvestigaVWo relataram a imobilizaVWo de glicosiltransferase extraYdo dasc[lulas de r!inia sp . em Celite 545 . s autores observaram -ue ascondiV\es ideais para a imobilizaVWo foram em p 4,2 e 7:2 F deglicosiltransferase * g de Celite 545 . Fsando estas condiV\es , a conversWode mais de 12 3 de sacarose em isomaltulose poderia ser obtida . 0 enzimatamb[m foi imobilizada em microc]psulas de pectina de baixo metoxilo egordura ( manteiga e ]cido oleico . 0s microc]psulas nWo lio/lizadas de

pectina contendo a glicosiltransferase e gordura convertido =2 3 desacarose em isomaltulose no primeiro lote .

:. conclus\es

Conforme relatado nesta revisWo, diferentes tipos de carboidrases t_m umenorme potencial para aplicaVWo na indZstria de alimentos. Do entanto, porcausa do custo para a aplicaVWo destes biocatalisadores, muitos estudosdevem se concentrar no desenvolvimento de m[todos de imobilizaVWobaratos e e/cientes. Considerando -ue a aplicaVWo [ para a indZstria dealimentos, diferentes par`metros sWo considerados. Aor exemplo, a maioria

dos passos em -ue as enzimas sWo aplicadas encontram"se numa soluVWoa-uosa. 0ssim, se a enzima [ fracamente adsorvido no suporte, -ue podefacilmente desadsorver a partir da matriz. Aor outro lado, se a adsorVWo *dessorVWo ocorre em ambientes diferenciados e bem controlados,reutilizaVWo transportadora , uma vez -ue a atividade enzim]tica este$aesgotado , [ vi]vel . )essorVWo enzima indese$ada pode ser evitada com aligaVWo covalente da enzima ao suporte. Mas , muito cuidado deve sertomado uma vez -ue esta t[cnica necessita de reagentes extremamentet^xicos , como o glutaraldeYdo. 0vanVos signi/cativos t_m sido realizadosneste campo com a introduVWo de suportes de hetero"funcional pr["

ativadas, o -ue de algum modo simpli/car a metodologia e, por outro lado,permitem o endurecimento dirigida a um local da enzima . 0 viabilidade dom[todo re-uer, no entanto, do conhecimento dos resYduos do sYtio catalYticopara evitar -uais-uer efeitos semelhantes aos de ligaVWo aleat^ria. 0l[mdisso, a extrema enri$ecimento pode ser uma desvantagem para as enzimasexibem grandes mudanVas conformacionais durante a cat]lise. ?inalmente,o aprisionamento da enzima em alguns g[is ou polYmeros sint[ticos tem deser muito bem estudada, considerando a porosidade da matriz e dotamanho da enzima (peso molecular e de substrato*produto. Do entanto, seade-uadamente identi/cadas e implementadas, os m[todos de imobilizaVWo

pode melhorar a estabilidade da enzima, atividade e seletividade. DaconcepVWo dos m[todos de imobilizaVWo deve ser trazido X mente -ue a


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escolha do m[todo de imobilizaVWo deve levar em consideraVWo a naturezaespecY/ca da reaVWo a ser catalisada e da con/guraVWo do reator e nWoapenas considerar o maior estabilizaVWo e X atividade da enzima. Isto temuma import`ncia, uma vez -ue aplicaV\es industriais bem sucedidos dosbiocatalisadores imobilizados exigem nWo s^ -ue ele [ est]vel e ativa, mas

tamb[m -ue ele tem baixo custo, pode sofrer re"uso repetido e [ compatYvelcom o pretendido set"up. Conhecimento crescente sobre a estrutura =) deenzimas e na sua composiVWo da superfYcie proporciona uma ferramentapoderosa para a concepVWo racional de imobilizaVWo, mas esta tem de sercombinado com o conhecimento sobre as propriedades fYsicas e -uYmicas dosuporte. 0 aplicaVWo de m[todos de simulaVWo molecular tem contribuYdopara o desenvolvimento racional de estrat[gias de imobilizaVWo, mas estaabordagem ainda [ limitada. vid_ncia experimental sobre a estrutura daenzima ap^s a imobilizaVWo [ ainda necess]ria para entender melhor oresultado da imobilizaVWo e, assim, contribuir para o desenvolvimento de

modelos ade-uados. )ado o grande nZmero de enzimas com interesse paraa indZstria de alimentaVWo humana e animal, $untamente com a de suportesdisponYveis promissores, e os vastos recursos necess]rios para a suacaracterizaVWo molecular e desenvolvimento de modelos de previsWo, pode"se prever -ue a abordagem aleat^ria, tentativa e erro ainda vai ser utilizadono futuro pr^ximo, pelo menos em um papel de triagem. 0s atuaisplataformas de alto rendimento disponYveis atualmente permitem aavaliaVWo de um grande nZmero de vari]veis em um tempo h]bil rent]vel.Fm desa/o importante [ tamb[m o desenvolvimento de transportadores Xmedida -ue exibem propriedades de ligaVWo, geom[tricas e mec`nicas

a$ust]veis , de modo -ue eles podem ser usados em diferentescon/guraV\es do reator e, assim, permitir uma utilizaVWo e/caz e contYnuamais e/ciente e de custo ou a reutilizaVWo dos biocatalisadores. 0 realizaVWobem sucedida de tal esforVo [ claramente uma tarefa multidisciplinar, umavez -ue envolve a modelagem computacional de materiais, ci_ncias da vidae cientistas computacionais, $untamente com os engenheiros bio-uYmicos.

0gradecimentos

s autores agradecem a ?undaVWo de 0mparo X Aes-uisa do stado de #WoAaulo ( ?0A#A ( Arocessos nZmeros >229*29>>4"= e >277*7>=94"G ,

Conselho Dacional de )esenvolvimento CientY/co (CDA- e CoordenaVWo de0perfeiVoamento de Aessoal de DYvel #uperior ( C0A# (Brasil pelo apoio/nanceiro. ostarYamos de agradecer a Aedro Carlos de Barros ?ernandes,um dos co"autores, -ue, com sua experi_ncia, contribuiu imensamente paraa elaboraVWo deste artigo.

ConNito de interesses

s autores declaram -ue nWo h] conNito de interesses.

immobilized carbohydrases in the beverage industry

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