UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 – 2015

IMMUNITEITSOPBOUW TEGEN GIARDIA SPP.

Door

Bob SMARIUS

Promotor: Prof. Dr. Geldhof, P. Literatuurstudie in het kader

van de Masterproef

© 2015 Bob Smarius

 

 

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

 

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014 – 2015

IMMUNITEITSOPBOUW TEGEN GIARDIA SPP.

Door

Bob SMARIUS

Promotor: Prof. Dr. P. Geldhof Literatuurstudie in het kader

van de Masterproef

© 2015 Bob Smarius

 

VOORWOORD Op de eerste plaats wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Geldhof, bedanken voor alle hulp die ik heb

gekregen tijdens deze literatuurstudie. Ondanks zijn drukke agenda was hij altijd in staat snel te

reageren en inhoudelijke feedback te geven over mijn ingezonden werk.

Daarnaast wil ik mijn vriendin bedanken voor alle hulp en steun die ze mij geboden heeft tijdens het

tot stand brengen van deze opdracht.

Als laatste wil ik mijn ouders bedanken voor de onvoorwaardelijke steun en hulp die ze mij altijd

geven.

INHOUDSOPGAVE VOORBLAD

TITELBLAD

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING…………………………….………………………………………......p. 1 INLEIDING………………………………………….…………………………………..…p. 2 LITERATUURSTUDIE…………………………………...…………………...…..……..p. 3 1. Nomenclatuur en Taxonomie……………………………….………….…………..…p. 3

2. Prevalentie………………………………………………………….……………..…....p. 6

3. Giardia spp. levenscyclus…………………...…….…….…………………….……...p. 8

4. Pathologie……………………………………………………………………………..p. 10

4.1. Pathogenese…………….……………………………….…………………p. 10

4.2. Symptomen……………………………….…………….…………..…...….p. 12

5. Immuunrespons………………………………….…………………..….……………p. 14

5.1 Antigenen………………………….………….………………..…………….p. 14

5.2 Anti-Giardia immuunrespons…………………….…………………...……p. 17

5.2.1. Mens………………………………….……….…………...………p. 17

5.2.2. Herkauwers……………………………………….………………p. 17

5.2.3. Rodentia………………………….……………………….……….p. 19

5.3. De rol van IL-17………………………………………………………….…p. 21

BESPREKING………………………………………………...…………………………p. 28 REFERENTIELIJST……………………………………………………….……………p. 29

  1  

SAMENVATTING Giardia valt onder te verdelen in verschillende species die allen een ander repertoire aan gastheren

besmetten. Zo is er G. agilis (amfibieën), G. muris (knaagdieren), G. duodenalis (zeer veel

verschillende zoogdieren), G. psittaci (vogels), G. ardeae (vogels) en G. microti (rodentia).

Prevalentiestudies bij de verschillende gastheren resulteren in zeer uiteenlopende resultaten. De

celcyclus is voor de verschillende Giardia species nagenoeg identiek. Door middel van excystering en

encystering is Giardia in staat zich afwisselend tot een geflagelleerde trofozoiet of een infectieuze

cyste om te vormen naargelang de omgeving waar het zich in bevindt. Hierdoor is Giardia zeer goed

in staat lang te overleven in ongunstige omstandigheden. Wanneer de trofozoiet in het intestinaal

lumen aanwezig is, zorgt het voor vele intra- en extracellulaire veranderingen als enterocyt apoptose,

dysfunctie van mucosale barrière, lymfocyten activatie, borstelzoom vermindering, disaccharide

deficiëntie, malabsorptie en hypersecretie van anionen in de dunne darm. Dit resulteert voornamelijk

in symptomen als diarree, dehydratatie, braken, steatorree en malaise maar ook enkele extra-

intestinale symptomen zijn beschreven. Er zijn nog veel vraagtekens over de immuunrespons bij

Giardia. Het is dan ook nog onduidelijk welke antigenen de grootste trigger zijn voor de activatie van

de immuunrespons. Door beperkt onderzoek heeft men enkel bij de mens, rund, muis en gerbils een

gedeeltelijke opheldering weten te verschaffen. Zo ziet men bij mensen een stijging van: IL-1β, IL-5,

IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α, IgA, IgE en IgG, daar men bij muizen IL-4, IL-5, Il-17, IFN-γ, IgA, IgG en IgM

ziet stijgen. Bij herkauwers blijkt naast IgG en IgA, net als bij de muis, het IL-17 een belangrijke rol te

spelen. Het daadwerkelijk mechanisme is onbekend, maar onderzoek heeft uitgewezen dat het een

essentiële rol heeft.

Key words: Gastro-intestinaal, Giardia, G. duodenalis, IL-17, Immuniteit

  2  

INLEIDING Giardia is een parasiet, behorend tot de protozoa, die overal ter wereld te vinden is en een groot

repertoire aan gastheren kan infecteren. Hierbij ontstaan voornamelijk gastro-intestinale problemen,

waaronder diarree. Ondanks het veelvuldig voorkomen in de verschillende populaties gastheren,

heerst er nog veel onduidelijkheid omtrent deze parasiet. Vooral op immunologisch vlak moet nog veel

opgehelderd worden. Het is dan ook nog niet gekend waarom bij runderen chronische infecties

voorkomen en bij de muis de infectie beperkt blijft tot enkele weken. Deze literatuurstudie heeft dan

ook als hoofdzakelijk doel een goed beeld te geven over de immuunrespons tegenover de Giardia

parasiet voor zover bekend.

Er zullen in deze literatuurstudie verschillende aspecten van Giardia besproken worden. In het eerste

gedeelte zullen algemene zaken als de nomenclatuur, taxonomie, prevalentie, celcyclus en pathologie

belicht worden. Hieropvolgend zal de immuunrespons uitgebreid besproken worden waarbij onder

meer de verschillen tussen gastheren aan bod komen. Tenslotte zal er dieper ingegaan worden op het

IL-17, dat zowel bij de muis als bij het rund een belangrijke rol zou vertolken met betrekking tot de

verwijdering van de Giardia trofozoieten uit de gastheer.

  3  

LITERATUURSTUDIE 1. NOMENCLATUUR EN TAXONOMIE De eerste beschrijving van Giardia dateert uit het jaar 1681, daar Antonie van leeuwenhoek (Delft;

1632 – 1723), een bekende Nederlandse microscopist en ook bedenker van de Leeuwenhoeks-

microscoop, onderzoek ging doen op zijn eigen ontlasting (tijdens een episode van diarree). Op

microscopisch beeld zag van Leeuwenhoek bewegende ‘animalcules’ (oude term voor microscopische

dieren of protozoa) van verschillende grootte doch eenzelfde structuur. Dat de gevonden ‘animalcules’

de oorzaak waren van de diarree, was niet bekend voor van Leeuwenhoek (Dobell, 1920). In 1859,

bijna 200 jaar later, werd Giardia herontdekt door de Tsjech Vilem Lambl (1824 – 1895) die in een

kinderziekenhuis in Praag de ontlasting van kinderen met dysenterie onderzocht en het in eerste

instantie Cercomonas intestinalis noemde. Deze naam was echter al gegeven aan een ander

organisme (Boreham et al., 1990). Jaren later vond Grassi een organisme in knaagdieren die hij

Dimorphus muris noemde (1879). Grassi was echter nog niet op de hoogte van de ontdekking van

Lamb en was daarom ook niet bewust dat het hier over een Giardia species ging . De eerste keer dat

Giardia officieel werd gebruikt als genus naam was in 1882 en 1883, toen Kunstler bij het onderzoek

van kikkervissen organismen beschreef die hij Giardia noemde (Adam, 2001). De huidige naam

Giardia werd gekozen als eerbetoon aan de Belgische taxonomist Alfred Mathieu Giard (Andersen et

al., 2007).

Het aantal species en de nomenclatuur ervan

heeft eveneens tot veel discussie geleid. Zo zijn er

tot 40 species voorgesteld op basis van de

gastheer waarin ze gevonden werden. In 1952

besloot Filice de Giardia species te onderscheiden

op basis van hun morfologie. Hierbij werd gekeken

naar de ‘median bodies’ en naar de ventrale schijf

(aanhechtings orgaan). Het resulteerde in een

onderscheid van drie species: G. agilis

(amfibieën), G. muris (knaagdieren) en G.

duodenalis (synoniemen: G. lamblia en G.

intestinalis) (Adam, 2001). De G. duodenalis

species die Filice beschreef kunnen daarentegen

op elektronen microscopisch beeld opgedeeld

worden op basis van de ventrolaterale richel,

‘marginal groove’, ventrale schijf en flagellum, in

de volgende species: G. psittaci (vogels) , G.

ardeae (vogels) , G. microti (muskusratten en

veldmuizen) en G. duodenalis (zeer grote

verscheidenheid aan zoogdieren). Figuur 1. Morfologisch beeld Giardia species: G. agilis, G. muris en G. intestinalis (naar: Monis et al., 2003).

  4  

De werkelijke G. duodenalis kan eveneens weer opgedeeld worden gebaseerd op de verschillen in

sequentie van bijvoorbeeld de glutamaat dehydrogenase (GDH), triosefosfaat isomerase (TPI of TIM)

en β-giardine (genen). Er zijn door de jaren heen verschillende pogingen gedaan om G. duodenalis op

te delen (Plutzer et al., 2010). Zo is G. duodenalis in te delen in 2 verschillende genotypes, namelijk

het Poolse en het Belgische (Homan, 1992) op basis van de hierboven genoemde gensequenties. Met

behulp van zymogeen analyse is G. duodenalis eveneens op te delen in groepen 1, 2 en 3 (waar 3

zeer veel afwijkt van groep 1 en 2) wanneer er gekeken wordt naar de grootte, de structuur en het iso-

elektrisch punt van 6 metabolische enzymen. De Nash groepering is gebaseerd op de sequentie van

kleine subunit rRNA, TIM en GDG (Adam, 2001).

Een laatste opdeling en eveneens de meest gebruikte is de opdeling van Mayrhofer in verschillende

assemblages. Door verschillende G. duodenalis isolaten te nemen en te vergelijken kwam men tot de

conclusie dat naast de assemblages A en B, nog andere assemblages te onderscheiden waren.

Ondanks dat deze isolaten ogenschijnlijk nauw verwant zijn met mekaar, zijn er toch biologische

karaktereigenschappen en epidemiologische significante verschillen gebaseerd op metabolisme,

biochemie, in vitro groei, infectiviteit, duur en karakter van infectie, medicijngevoeligheid, pH-

prevalentie en vatbaarheid voor infectie met een dsRNA Giardia virus. Het resulteert uiteindelijk in een

opdeling van assemblages A t/m H waarbij ieder assemblage een andere gastheerspecificiteit heeft.

De grote discussie omtrent deze assemblage indeling is of het hier daadwerkelijk gaat om een

subspecies of juist om een aparte species. Hierbij zou de species naam gebaseerd zijn op de

gastheer die ze besmetten: G. duodenalis (A), G. enterica (B), G. canis (C en D), G. bovis (E), G. Cati

(F), G. simondi (G) (Plutzer et al., 2010). Assemblage H is er recentelijk bijgekomen voor G.

duodenalis bij zeezoogdieren (Lasek-Nesselquist et al., 2010).

De fylogenetische relatie tussen stammen van Giardia zegt evenwel niets over de fylogenetische

relatie tussen de gastheren. Daar grote verschillen zijn tussen G. duodenalis en G. ardeae zou men

eventueel foutief kunnen concluderen dat G. lamblia en G. ardeae de splitsing van vogels en

zoogdieren hebben meegevolgd (Adam, 2001).

Tabel 1. Taxonomische indeling Giardia op basis van morfologie of structuur, genetica en biochemie (naar: Plutzer et al., 2010).

Morfologisch Structuur, genetisch en biochemisch

Phylum Sarcomastigophora Metamonada

Subphylum Mastigophora Trichozoa

Superklasse Mastigophora Eopharyngia

Klasse Zoomastigophora Trepomonadea

Subklasse Diplomonadida Diplozoa

Orde Diplomonidida Giardiia

Familie Hexamitidae Giardiidae

  5  

Tabel 2. Giardia species en assemblages

Species Assem-

blage

Gastheer Licht-microscopisch Elektronen - microscopisch

G. agilis Amfibieën Lang en slank met

traanvormige ‘median

body’

G. muris Rodentia Kort en rond met ronde

‘median body’

G. duodenalis

- ‘G. duodenalis’

- ‘G. enterica’

- ‘G. canis’

- ‘G. bovis’

- ‘G. cati’

- ‘G. simondi’

A

B

C/D

E

F

G

H

Primaten,

herkauwers,hond,

kat, vee, paard,

rodentia, wild,

buideldieren,

alpaca’s, fret,

varken, andere

Primaten,

vleesvee, hond,

paard, konijn,

bever, muskusrat

Hond en

hondachtigen

Herkauwers,

varken

Kat

Muis en rat

Zeevertebraten

Peervormig met

klauwvormig ‘median

body’

G. ardeae Vogels Identiek aan G.

duodenalis

Ventrale en caudale schijf identiek aan die

van G. muris

G. psittaci Vogels Identiek aan G.

duodenalis

Incomplete ventrolaterale richel, geen

‘marginale groove’

G. microti Rodentia Identiek aan G.

duodenalis

Trofozoiet identiek aan G. duodenalis, enkel

cyste bevat volledig gedifferentieerde

trofozoieten

(naar: Adam, 2001; Lasek-Nesselquist et al., 2010; Monis et al., 2008)

  6  

2. PREVALENTIE Giardia kan overal ter wereld gevonden worden. Ruim 280 miljoen mensen in Zuid-Amerika, Azië en

Afrika lijden aan symptomatische giardiasis (Jiménez et al., 2014). Daarbij is volgens een onderzoek

naar reis- en migratieziektes Giardia na de Shigella spp. bacteria de meest voorkomende pathogene

oorzaak van gastro-intestinale klachten en daarbij dus de belangrijkste parasiet (Field et al., 2010).

Wanneer men de prevalentie van Giardia bij de mens bekijkt, is er zeer veel variatie in de resultaten

van de onderzoeken. In het algemeen kun je stellen dat de prevalentie in ontwikkelde landen lager is

dan in ontwikkelingslanden. Bij ontwikkelde landen hebben verschillende onderzoeken resultaten

bevonden die gaan van 1% tot 17,6% in Europa (daar de 17,6% wel een onderzoek was op kinderen

in Albanië en dus een vertekend beeld geven aangezien kinderen tot een risico groep behoren).

Fletcher et al. (2012) beschrijft een prevalentie tussen de 2 en 7% in goed ontwikkelde landen. Dit wil

echter niet zeggen dat er geen gebieden zijn in ontwikkelde landen waar geen hoge prevalentie is. Zo

is er in Italië (prevalentie landelijk beschreven van 0,4 tot 6,2% (Feng et al., 2011)) een prevalentie

gedetecteerd van 42,9% in een minder ontwikkeld gebied (Marangi et al., 2010). In de echte

ontwikkelingslanden zijn prevalenties beschreven variërend van 20 tot 30%. Deze hoge prevalentie

cijfers zijn vooral te wijten aan de overbevolking, slechte sanitaire voorzieningen en waterkwaliteit.

Toch is de drinkwaterkwaliteit ook in niet alle Europese landen even goed. Zo kan in 25,4% van de

drinkwaterstalen in Portugal Giardia aangetoond worden (Plutzer et al., 2010). Enkel Giardia

duodenalis assemblages A en B zijn in staat mensen te infecteren. Heel sporadisch zijn er gevallen

beschreven met een ander assemblage Giardia (C en D) (Traub et al., 2009). Zowel in ontwikkelde

landen als de minder ontwikkelde landen heeft assemblage B een iets hogere prevalentie dan

assemblage A.

Net zoals bij de cijfers van de mens zijn er veel verschillen in de resultaten van prevalentie onderzoek

bij de verschillende productiedieren en gezelschapsdieren. Bij runderen varieert de prevalentie van

3,7% in een studie in Taiwan (Hsu et al., 2007) tot 73% in België (Geurden et al., 2008). Wanneer

men naar de leeftijd kijkt van het dier ziet men dat de prevalentie bij kalveren van 1 tot 6 maand het

hoogst is. Mogelijke andere oorzaken voor deze verschillen zijn: huisvesting, praktijkmanagement,

voeding, klimaat en verschil in detectie methodes. Op bedrijfsniveau zijn er percentages gevonden die

lopen van 45% tot 100% (Geurden et al., 2008). Assemblage E is het dominerende assemblage in

Europa (75%) alsook in Amerika en Australië. Eveneens zijn assemblages A en B beschreven bij het

rund, waar assemblage A (23%) meer voorkomt dan assemblage B (2%) (Sprong et al., 2009). In

Nieuw Zeeland is gebleken dat assemblage A en B de meest voorkomende types zijn en assemblage

E grotendeels afwezig is (Feng et al., 2011). Leeftijdsafhankelijke verschillen zijn er beschreven

wanneer rundvee in 4 groepen wordt verdeeld (zuigelingen, gespeenden, vaarzen en volwassenen).

Daar zag men een stijgende procentuele verdeling van E t.o.v. A (beginnend van 85-15, 87-13, 91-9

tot 94-6) (Trout et al., 2004; 2005; 2006; 2007). Daarnaast zijn er ook studies die beschrijven dat

assemblage A minder gevonden wordt in vleesvee dan in melkvee (Feng et al., 2011 ; Geurden et al.,

2008).

  7  

Studies bij schapen resulteren wederom in uiteenlopende resultaten, met een Italiaanse studie van

1,5% (Giangaspero et al., 2005) tot een Mexicaanse studie van 55,6% (Di Giovanni et al., 2006). Bij

geiten werd een prevalentie van 12,3% beschreven in Uganda (Johnston et al., 2010) tot 42,2% in een

Spaanse studie (Ruiz et al., 2008). Net zoals bij het rund vindt men bij het schaap en de geit

hoofdzakelijk assemblages E en A terug, waarbij assemblage E een dominantere rol (82%) heeft dan

assemblage A (17%) (Sprong et al. 2008). Prevalentiestudies bij het varken in Denenmarken en

Australië vonden een infectie percentage van 17,4% en 31,1% respectievelijk (Maddox-Hyttel et al.,

2006; Armson et al., 2009 resp.). Wederom is assemblage E het dominerende type (78%) waar ook

assemblage A (21%) en zelfs B & D (beide 0,7%) waargenomen worden (Sprong et al., 2009).

Een Europese studie in meerdere landen (Epe et al., 2010) die de prevalentie onderzocht bij de hond

en kat kwam tot prevalenties van 24,8% bij de hond en 20,3% bij de kat. Andere studies hebben zoals

verwacht een brede variatie in de resultaten. Daar het bij de hond loopt van 1,9 % (Polen) (Solarczyk

et al., 2010) tot 56,8 % (Thailand) (Traub et al., 2009), loopt het bij de kat van 2% (Australië) (Palmer

et al., 2008) tot 44,4% (Verenigde Staten) (Fayer et al., 2006). Ook hierbij zijn de uiteenlopende

resultaten mogelijk te verklaren door leeftijd, diagnostische technieken en gezondheidsstatus (Feng et

al., 2011). De hond is het meest besmet met de gastheerspecifieke assemblages C (32%) en D (36%)

maar ook assemblages A en B (23% en 9%) kunnen worden teruggevonden (Sprong et al., 2009).

Recent zijn er indicaties over het feit dat bepaalde leefomstandigheden invloed hebben op de

verdeling van assemblages bij de hond. Zo zou er sprake zijn van 2 transmissie kringlopen bij honden

in gedomesticeerde milieus. Enerzijds die van de gastheerspecifieke assemblages tussen honden

onderling en anderzijds de niet-gastheerspecifieke assemblage A tussen mens en hond. Wanneer er

intens contact is tussen een groot aantal honden (in een kennel bijvoorbeeld) zullen assemblages C &

D dominant zijn (93,9%). Bij individueel gehouden honden werd voor 80,5% assemblage A

gedetecteerd (Claerebout et al., 2009). Doordat ook infecties gevonden worden met zowel

assemblage A als C zijn er indicaties dat de twee transmissie kringlopen tegelijk doorgaan in een

bepaald milieu maar dat tijdens intens hond-tot-hond contact het gastheer adaptieve genotype, het

assemblage A wegconcurreert (Feng et al., 2011). Bij de kat spreken we vooral over assemblage A en

F die met respectievelijk 43% en 49% overheersend zijn (Sprong et al., 2009).

Tijdens een studie in Italië met traditionele microscopie methodes, werd bij 2% van de paarden

Giardia gevonden. Gebruikte men echter een directe fluorescentie antilichaamtest kwam men tot de

prevalentie van 13,33%. Ook bij het paard hebben jongere dieren een verhoogde prevalentie. Zo

kwam uit het onderzoek dat veulens een infectie ratio hebben van 23,33%. Het zou hier vooral gaan

om assemblage A en B, alsook E (Veronesi et al., 2010).

  8  

3. GIARDIA SPP. LEVENSCYCLUS

 Figuur 2. Levencyclus Giardia spp. (uit: O’Handley et al., 2006)

Giardia heeft een directe levenscyclus waarin door middel van excystering en encystering afwisselend

een infectieuze cyste en een geflagelleerde trofozoiet gevormd wordt (figuur 2). Door deze biologische

veranderingen is Giardia in staat om zowel binnen als buiten de gastheer goed te overleven (Svärd et

al., 2003). Na uitscheiding van de cyste met de feces, is de cyste onmiddellijk infectieus en in staat

zeer lang in de omgeving te overleven. Een met feces bedekte cyste kan zo tot 77 dagen infectieus

blijven in een koele, dampige omgeving bij minder dan 10 graden (Dawson, 2005). De infectie gebeurt

op een fecaal-orale manier tussen de individuen. Infectie kan zowel op een directe als indirecte

manier gebeuren van mens op mens, dier op dier, dier naar mens, mens naar dier (zoönose) of eten

en drinken van besmet water. Wanneer er zich veel vee en schapen rond een waterbron bevinden,

kunnen deze, indien geïnfecteerd, een belangrijke bron van watercontaminatie vormen (Plutzer et al.,

2010). Een niet te verwaarlozen groep zijn de wilde dieren die een belangrijke bijdrage aan de

contaminatie kunnen leveren. Zo zou de bever (prevalentie Giardia: 30%) verantwoordelijk zijn voor

humane Giardia epidemieën in Noord-Amerika na het opnemen van besmet water (Dunlap et al.,

2002). Er zijn eveneens vermeldingen dat watervogels, waar in 5 – 49% van de mest Giardia

aangetoond kan worden, een aandeel hebben in de watercontaminatie (Plutzer et al., 2010).

Wanneer de cyste opgenomen wordt, gaat deze via een proces dat excystering wordt genoemd, terug

ontwikkelen naar de vegetatieve vorm. Waar er over de stimuli van encystering veel opgehelderd is,

zijn er nog veel onduidelijkheden over de mechanismen van excystering. Men vermoedt dat de zure

pH van de maag, gevolgd door een alkalische oplossing van pancreas proteasen, de excystering in

gang doet zetten (Svärd et al., 2003). De sterk gecoördineerde fysiologische, structurele en

moleculaire respons gebeurt wanneer er veranderingen in de omgeving gedetecteerd worden

doorheen de cystewand, daar een te vroege excystering in de zure pH van de maag nefast is voor de

trofozoiet (Hetsko et al., 1998). Naast de pH hebben calmoduline en Proteïne Kinase A ook een

  9  

invloed op de excystering, wat erop zou kunnen wijzen dat de calcium signaaltransductie essentieel is

voor de cyste (Bernal et al., 1998; Abel et al., 2001). De vrijgelaten lysosomale AcPh (Acid

Phosphatase) zorgt voor defosforylatie van de proteïnes in de wand van de cyste (CWP’s). In de

gefosforyleerde vorm zou de cystewand bestand zijn tegen proteolyse van de externe pancreas

protease daar het nu wel onderhevig is aan de inwerking hiervan (Slavin et al., 2002). De lyzosome-

like perifere vacuolen die interne cysteïne proteasen, die tot de cathepsine B familie behoren,

bevatten, worden geledigd in de peritrofische ruimte (Ward et al., 1997). Dit alles zorgt ervoor dat de

peritrofische ruimte steeds ruimer wordt en de trofozoiet zo loskomt van de cystewand. Nadat de

flagellen doorheen één van de cyste polen breken, zal de trofozoiet vrij in het lumen van de darm

komen. De recent geëxcysteerde ovale trofozoiet, excyzoiet genaamd, met 4 kernen en 8 flagellen

gaat steeds ronder worden en zal cytokinese ondergaan met uiteindelijk twee (Adam, 2001) of vier

(Svärd et al., 2003) tweekernige trofozoieten. Vrij in het intestinale lumen zal er vegatieve groei

ontstaan met kolonisatie op de dunne darm mucosa. Met de vier paar flagellen is de trofozoiet in staat

zich doorheen de vloeibare inhoud van het lumen te verplaatsen en met de ventrale disc kan het zich

vasthechten aan de darmmucosa (Adam, 2001).

De trofozoiet zal steeds verder door de dunne darm migreren waar het uiteindelijk weer een

metamorfose zal ondergaan in de vorm van encystering. Opnieuw is de pH een belangrijke trigger

voor het in gang zetten van dit proces. Op het einde van de dunne darm heerst er een neutrale tot

basische pH. In vitro proeven hebben aangetoond dat trofozoieten, blootgesteld aan een pH van 7,8 in

combinatie met een hoge concentratie aan galzouten en vetzuren, encystering in gang zetten (Reiner

et al., 1992). Daarnaast zijn er aanwijzingen dat ook een tekort aan cholesterol een trigger is (Luján et

al., 1996). Alvorens de trofozoiet in encystering gaat, wordt de celdeling geblokkeerd met als resultaat

dat het aantal cellen in de G1-fase zullen dalen en het aantal cellen in de G2 en M-fase zullen stijgen.

Naar alle waarschijnlijkheid zit er in de G2/M-fase een restrictie punt vanaf waar de trofozoiet kan

differentiëren naar de cyste. Wanneer je de encystering in het geheel bekijkt, kun je deze verdelen in

een vroege en een late fase. In de vroege fase zijn er veranderingen te detecteren in celdeling,

metabolisme, ultrastructuur, proteïne transport en genexpressie. Zo zal de trofozoiet een rondere

vorm krijgen en door de vormverandering van de ventrale disc zal de aanhechting aan de

darmmucosa uiteindelijk in het gedrang komen. De specifieke genen van de trofozoiet worden minder

tot expressie gebracht. Op microscopisch beeld verschijnen er Golgi-achtige structuren. Naast deze

structuren zijn ook grote ESV’s (encystation-specific vesicles) zichtbaar. In deze ESV zitten wand-

proteïnes (onder andere CWP-1 en CWP-2 (cysteine-rich wall proteines)) die tijdens het transport nog

onder meer gefosforyleerd worden en door middel van disulfidebruggen een stabiel complex vormen

(Slavin et al., 2002). Naast de CWP’s bevat de wand van de cyste een grote hoeveelheid aan

koolhydraten waarvan 90% aan galactosamine toebedeeld wordt. Galactosamine synthese wordt

onder meer gereguleerd door glucosamine-6-fosfaat-isomerase en UDP-N-acetylglucosamine

pyrofosforylase. In de late fase van de encystering ziet men endoreplicatie, worden er grotere

proteines op de wand gezet, gaat de cyste ronder en filamenteuzer worden en uiteindelijk niet meer

hechten aan de darmmucoasa om nadien met de feces uitgescheiden te worden (Adam, 2001; Svärd

  10  

et al., 2003). De combinatie van de onmiddellijke infectiviteit van de cyste, lage infectiedosis (volgens

Rendtorff (1954) enkel 10–100 cyste bij humane infectie) en het hoog aantal uitgescheiden cysten in

de feces, zorgt ervoor dat de infectiedruk in een beperkte tijd zeer snel kan stijgen en snelle spreiding

kan bewerkstellen.

4. PATHOLOGIE 4.1. PATHOGENESE Wanneer de excystering voltooid is en de trofozoiet vrijlevend is in het gasto-intestinaal kanaal, zal de

trofozoiet zich vasthechten door middel van de ventrale disc aan de darmwand. Deze sterke interactie,

waar parasitaire oppervlaktemoleculen als giardine, lectine, VSP’s (variant surface proteins), cysteïne

protease en contractiele proteïnes bij betrokken zijn, zorgt voor een trigger in de enterocyt voor vele

intra- en extracellulaire veranderingen zoals enterocyt apoptose, dysfunctie in de mucosale barrière

van de dunne darm, lymfocyten activatie, verminderen van de borstelzoom (eventueel met villi atrofie),

disaccharidase deficiëntie, malabsorptie en hypersecretie van anionen in de dunne darm. Al deze

verandereringen gebeuren zonder dat de trofozoiet het epitheel, de bloedstroom of omgevende

weefsels binnendringt.

Apoptose is een natuurlijk proces in de darm, dat hiermee de homeostatische turnover van het

epitheel garandeert. In normale omstandigheden heeft deze geprogrammeerde celdood geen invloed

op de integriteit van het intestinaal epitheel (Cotton et al., 2011). Tijdens een Giardia infectie is er een

sterke verhoging van het aantal enterocyten die in de dunne darm in apoptose gaan. Volgens Troeger

(2007) is het aantal enterocyten die in apoptose gaan gestegen met 50%. Bij een Giardia infectie is er

een belangrijke opregulatie van genen in de enterocyt die geassocieerd wordt met apoptose

(Roxström-Lindquist et al., 2005). Het cysteïne protease caspase speelt een belangrijke regulerende

rol in het proces van apoptotische celdood. Caspases 3,6,8 en 9 hebben allen een rol in de apoptose

geïnduceerd door de Giardia trofozoiet (Figuur 3). Eveneens heeft de verhoogde expressie van het

pro-apoptotische proteine Bax, de verlaagde expressie van het anti-apoptotische Bcl-2 en de klieving

van Poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) een aantoonbare rol in de apoptose. De caspase

geïnduceerde celdood kan zowel op de intrinsieke weg als extrinsieke weg in gang gezet worden. Via

de extrinsieke weg kan caspase 8 geactiveerd worden. Deze activatie gebeurt na binding op de ‘death

domain-associated receptors’ van de enterocyt (Panaro et al., 2007). Deze binding en dus triggering,

kan gebeuren door verschillende stimuli daar de exacte producten nog niet gedefinieerd zijn. Caspase

8 kan eveneens geactiveerd worden door caspase 6, een stroomafwaarts target van caspase 3 (Slee

et al., 1999). Het is echter nog steeds onduidelijk of caspase 8 activatie direct of indirect gebeurt

(Cotton et al., 2011). Een verhoogde permeabiliteit van de mitochondriën tijdens het apoptotisch

proces resulteert in de vrijstelling van cytochroom C dat een activerende werking heeft op caspase 9

alsook op caspase 3. Naast cytochroom C zal het mitochondriaal verval ook resulteren in de

vrijstelling van het proteïne AIF (apoptosis inducing factor) dat onafhankelijk van caspase reacties

apoptose veroorzaakt door fragmentatie van het DNA (Cotton et al., 2011; Candé et al., 2002).

  11  

Figuur 3. Cascade van de geprogrammeerde celdood. Zowel de intrinsieke (mitochondriaal) als de extrinsiek (Death Domain- associated Receptors: TNFr & CD95) weg zorgt voor activatie van de caspase cascade wat resulteert in apoptose. Het mitochondriale AIF is onafhankelijk van caspase in staat apoptose te induceren. Eveneens zijn er verschillende inhibiterende (⊥) en activerende (!) mechanismen aanwezig (uit: Cotton et al., 2011).

 Apoptose van de enterocyten heeft een invloed op de verhoging van permeabiliteit van de darmwand.

In normale toestand is het darmepitheel een goed afgesloten geheel zodat het externe milieu

gescheiden kan worden van het interne milieu. Deze strikte scheiding is het resultaat van de

‘adherens junctions’ en de ‘tight junctions’. Adherens junctions zorgen voor stevigheid betreffende het

cel-cel contact waar ‘tight junctions’ primair hun invloed uitoefenen op de paracellulaire uitwisseling

van ionen en opgeloste stoffen. Het zijn ook juist de ’tight junctions’ waar een Giardia infectie zijn

inwerking op heeft. Proteïnes behorend tot de ‘tight junctions’ zijn onder meer het transmembranair

occludine, claudine, cinguline en het perifere membraan proteïne zonula occludens (ZO) (Hartsock et

al., 2009, Stevenson et al., 1989). ZO-1 heeft ter hoogte van de N-terminus een interactie met

occludine en ter hoogte van de C-terminus een connectie met het cytoskelet proteïne F-actine (Chin et

al., 2002). Afbraak of verplaatsing naar het cytosol van ZO-1, claudine-1, alfa-actine alsmede de

flocculatie van F-actine resulteert in een verhoogde intestinale permeabiliteit (Cotton et al., 2011). Er

zijn verschillende initiators die dit fenomeen zullen bewerkstellen. Caspase 3 werkt volgens Chin

(2002) in op de ZO-1 en F-actine daar MLCK (myosine light chain kinase) zijn werking daar ook op

uitoefent (Scott et al., 2002). Er heerst dan ook onduidelijkheid of de caspase-3 gemedieerde stoornis

van F-actine en ZO-1 het resultaat zijn van caspase-3 zelf of van activatie van MLCK en/of ROCK

(Rho kinase) door caspase. De achterliggende pathogenese van de stoornis van alfa-actine en

claudine-1 is nog niet opgehelderd (Cotton et al., 2011).

  12  

Een reductie van het opname oppervlak ter hoogte van de darm is een andere belangrijke

waarneming. Door verkorting van de microvilli, met of zonder atrofie van de villi, reduceert het

oorspronkelijke oppervlak tot 75% (Troeger et al., 2007). Dit is het resultaat van geactiveerde CD8+

lymfocyten. Deze CD8+ lymfocyten zijn eveneens de oorzaak van een deficiëntie in het enzym

disaccharidase (Scott et al., 2004). Het resultaat van een gedegradeerd opname oppervlak en de

deficiëntie in disaccharidase is malabsorptie en maldigestie. De verhoogde secretie van anionen, in

het bijzonder Cl-, in het lumen zorgt voor een osmotische gradiënt dat vocht naar het lumen van de

dunne darm zal trekken. Door mastceldegranulatie gaan de gladde spiercellen van het intestinaal

kanaal contraheren wat een verhoogde transit en dus een verminderde tijd voor absorptie en

reabsorptie van water en nutriënten in de darm tot gevolg heeft (Li et al., 2007). Het is eveneens

beschreven dat Giardia de vorming van stikstofmonoxide kan onderdrukken door het consumeren van

het substraat arginine. Stikstofmonoxide heeft de eigenschap om de groei van Giardia te inhiberen.

Het resulterende arginine tekort voor de enterocyt is eveneens een gekende trigger dat apoptose in

gang kan zetten (Eckmann et al., 2000).

Zoals eerder vermeld is er nog veel onbekend over de daadwerkelijke toxines die de pathogenese in

gang zetten. Een belangrijk gegeven is dat er op het moment dat de Giardia trofozoiet contact maakt

met het darmepitheel een significante verandering te detecteren is in expressie van genen in de

trofozoiet. Dit resulteert in productie van vele metabolische enzymen (Ringqvist et al., 2011). Zo

beschrijft Shant et al. (2002) een enzym van 58 kDa, behorend tot de lectine familie, die de verhoogde

ionsecretie zou bewerkstellen. Verschillende enzymen tussen de 32 en 200 kDa veroorzaakten bij

proeven op gerbils disaccharidase deficiëntie (Mohammed et al., 1995). Gesecreteerde proteinasen,

als cysteine- en thiol-, binden op de PAR (proteine activated receptors). Deze receptoren, behorende

tot de G-proteine-gekoppelde signaal receptoren, induceren via caspase-3 afhankelijke weg de

apoptose en verhoging van de epitheliale permeabiliteit (North et al., 1990; Parenti, 1989; Chin et al.,

2003).

4.2. SYMPTOMEN Wanneer men kijkt naar de aard van de infectie ziet men dat er een sterke variatie heerst tussen

individuen daar het asymptomatisch kan verlopen alsook acuut tot chronisch. Waarom er een grote

variatie is in de duur van een infectie, is te wijten aan de vele multifactoriële invloeden tijdens een

infectie van zowel de gastheer als de parasiet. Voorbeelden hiervan zijn: assemblage, genotype,

synergetische werking van andere aanwezige assemblages en infectiedruk (Robertson et al., 2010).

De voornaamste symptomen van een Giardia infectie zijn intestinaal gerelateerd. Het meest bekende

symptoom is uiteraard diarree maar ook misselijkheid, gewichtsverlies, opzwelling, abdominale pijn,

dehydratatie, braken, flatulentie, steatorree en malaise kunnen als symptomen waargenomen worden

(Cotton et al., 2011; Roxström-Lindquist et al., 2005; Troeger et al., 2006). In de meeste gevallen is

een Giardia infectie zelflimiterend maar in sommige gevallen kan het een langdurige infectie worden.

Bij deze chronische infecties zijn er een aantal extra-intestinale consequenties die veroorzaakt kunnen

  13  

worden door Giardia. Bij de meeste van deze aandoeningen is de achterliggende pathologie niet

bekend en is deze gebaseerd op studies bij de mens. Zo linkt men oculaire pathologieën, artritis,

voedselallergie, urticaria, hypokaliaemische myopathie aan Giardia. Op metabolisch gebied zijn er ook

gevolgen aan een Giardia infectie, daar de malabsorptie, maldigestie en malnutritie een tekort aan

bouwstoffen, zoals vitamines en koolhydraten, bewerkstellen. Zo zijn er vooral bij groeiende individuen

problemen te detecteren. Hierbij moet men denken aan groeiachterstand, gewichtsverlies en

cognitieve stoornissen. Door activatie van het immuunsysteem kan er CFS (chronic fatigue syndrome)

en IBS (irritable bowel syndrome) ontstaan. Tot slot zou Giardia een verhoogde prevalentie aan

pancreas- en galblaaskanker geven (Halliez et al., 2013; Robertson et al., 2010).

Daar bij de mens een Giardia infectie asymptomatisch kan verlopen, ziet men bij herkauwers enkel

chronische infecties die eventueel intermitterende symptomen kunnen geven. Meer specifiek op

herkauwers gericht, is diarree het grootste probleem, daar deze niet door antibiotica en coccidiostatica

behandeld kan worden en daaropvolgend een verlaagde voederconversie en lager karkasgewicht

veroorzaakt (O’Handley et al., 2006; Koudela et al., 1998; Sweeny et al., 2011).

Net als bij de mens is een Giardia infectie bij de gezelschapsdieren, hond en kat, vaak

asymptomatisch en/of zelflimiterend. Net als bij de andere species is waterige diarree, frequent nog

met mucus bedekt, samen met malabsorptie, gewichtsverlies en abdominale pijnen het voornaamste

probleem (Tangtrongsup et al., 2010).

  14  

5. IMMUUN RESPONS 5.1 ANTIGENEN Het is een lange tijd onduidelijk geweest welke antigenen daadwerkelijk een rol spelen in de

immuniteit ten opzichte van de Giardia trofozoiet. De moeilijkheid zat hem vooral in het gegeven dat

de Giardia trofozoiet het epitheel van de darm niet binnendringt, wat resulteert in een lokale stimulatie

van het immuunsysteem. Het gebruik van verschillende isolaten, analyse technieken voor immuun-

responsen, antilichaam-responsen en de antigeenvariatie hebben eveneens een bijdrage geleverd tot

de moeilijkheid om antigenen te identificeren. Toch is er de laatste jaren veel opheldering gekomen in

welke antigenen een rol hebben in het opwekken van een immuunrespons tegenover Giardia. In een

onderzoek van Palm (2003) werden 16 immunoreactieve proteïnes beschreven. Desbetreffende

proteïnes zijn GTA-1 en 2, verschillende tubulines en giardines, SALP-1, enolase, OCT, ADI, UPL-1,

FBA en tot slot TSA. De tubulines, alfa-2 en beta, gevonden in de membraam van de trofozoiet, zijn

van een andere aard dan tubulines in de microtubuli. Giardine is een proteïne van rond de 30 kDa die

specifiek bij Giardia voorkomt. De gevonden giardines; alfa-1, alfa-2, alfa-7.1 en alfa-7.2, hebben een

homogeniteit op nucleotide level van 81% en op aminozuur level van 77%. Daar giardines zich

bevinden op het aanhechtingsapparaat van de trofozoiet, zijn ze waarschijnlijk het eerste antigeen

waarmee het lokale immuunsysteem in contact komt. Faubert (2000) spreekt daarbij ook van HSP

(heat shock proteins), die verschijnen tijdens periodes van stress, en het lectine tagline.

Desalniettemin blijken beide proteïnes geen invloed te hebben op de immuniteit.

Het fenomeen antigeenvariatie door ‘variant specifieke proteïnes’ (VSP) werd als eerste beschreven

bij Giardia als een in vitro fenomeen waar het later ook in vivo erkend werd. Trofozoieten die

aanvankelijk VSPH7 tot expressie brachten, geïnoculeerd bij muizen, brachten na 10-17 dagen een

compleet ander VSP tot expressie aan het oppervlak. Dit switchen van hoog immuun reactieve

oppervlakte antigenen, dat ook voorkomt bij virussen, bacteriën en andere parasieten, zorgt ervoor dat

de antistoffen die aanvankelijk werden aangemaakt tegen VSPH7 niet meer werken aangezien deze

VSPH7 vervangen is door een ander proteïne (Nash, 2002). In normale toestand wordt er slechts één

VSP tot expressie gebracht over het gehele oppervlak van de trofozoiet, inclusief ventrale disc en

flagellen. Uitzonderlijk, zoals bij VSP switching en encystering/excystering, worden er twee

verschillende VSP’s tot expressie gebracht (Prucca et al., 2009). De switching van VSP bij encystering

en excystering gebeurt niet in ieder isolaat. Zo zal het in WB-isolaten wel gebeuren maar in GS-

isolaten niet. Daarbij zijn er aanwijzingen dat dit mechanisme een bijdrage levert aan de diversiteit van

VSP’s. Het repertoire aan verscheidene VSP’s is per isolaat verschillend daar men meestal spreekt

van een 150-tal (Nash, 2002). De frequentie van switching is naast isolaat-afhankelijk ook VSP-

afhankelijk en deze varieert van 6,5 tot 13,5 generaties. Desbetreffende VSP’s zijn cysteïne-rijke (11-

12%) type 1 integraal membraanproteïnes met een moleculaire massa variërend van 20 tot 200 kDa.

Wanneer men de N-terminus bekijkt, ziet men het CXXC motief frequent voorkomen (waar C cysteine

is en X elk ander aminozuur). In vergelijking met andere VSP’s, ziet men grote variatie in het N-

terminaal gedeelte van het proteïne. Het is ook de extracellulaire N-terminus waar de interactie met de

gastheer gebeurt. De C-terminus van 38 aminozuren daarentegen heeft een hoge graad aan

  15  

homogeniteit (± 90%). In deze C-terminus zit een hydrofoob transmembranair domein van 23-25

aminozuren en CRGKA staart. Het GGCY motief zal voornamelijk te vinden zijn in het extracellulair

gedeelte van de C-terminus. Wanneer gekeken wordt naar de driedimensionale structuur van VSP’s,

ziet men dat er ‘RING’ en ‘LIM Zinc finger’ motieven voorkomen. Er zijn zelfs gevallen beschreven dat

deze bivalente metaalbinding zinkdeficiënties veroorzaakt in geïnfecteerde individuen. Deze

thiolgroepen vormen niet altijd cysteïne-metaal complexen maar kunnen ook disulfidebruggen

onderling vormen met als resultaat dat er geen vrije thiolgroepen voorkomen. Door deze disulfide

binding zijn de VSP’s zeer resistent tegen de proteolytische werking van intestinale proteases. Tevens

gebeurt er enige posttranslationele modificatie van het VSP. Er is wat onenigheid over het feit of er

daadwerkelijk glycosylering plaatsvindt daar de aanwezige koolhydraten tijdens onderzoeken

eventueel toegewezen konden worden aan contaminatie. Volgens Samuelson et al. (2005) is Giardia

enkel in staat de eerste twee stappen van de N-glycosylering te voldoen. Een ander belangrijk proces

is palmitoylatie, waar vetzuren met behulp van palmitoyl acyltransferase (gPAT) toegevoegd worden

aan de C-terminus. Deze toegevoegde vetzuren dienen als extra stevigheid voor de VSP op de

plasmamembraan. Een laatste posttranslationele modificatie die gezien wordt, gebeurt door de

Giardia arginine deiminase (gADI). Deze gADI zorgt, naast zijn rol in het energie metabolisme, voor

citrulline vorming uit arginine ter hoogte van de staart (Prucca et al., 2009). Volgens Touz et al. (2009)

hebben reeds genoemde gADI en gPAT een belangrijke rol in signaaltransductie betreffende VSP

switch.

Wanneer er daadwerkelijk een switch van VSP gebeurt, is er nog wat controversie wat er vervolgens

met de VSP gedaan wordt. In sommige gevallen gebeurt er een klieving ter hoogte van de C-terminus

waardoor er een vrijstelling volgt in het medium. Dit gebeurt enkel wanneer er een NKSGLS sequentie

aanwezig is in het extracellulair domein. Deze specifieke klievingssequentie is echter niet aanwezig op

ieder VSP gen. VSP’s zijn eveneens te vinden in lysosome-like perifere vacuoles, wat eventueel kan

wijzen op een afbraakproces door endocytose.

De verschillende VSP genen zijn verspreid tussen alle chromosomen. Vsps (VSP encoding genes)

hebben geen introns en zijn zeer kort daar vele vsps wel tandem repeats hebben van een bepaalde

basenpaarsequentie (Prucca et al., 2009). Giardia trofozieten hebben in het uiterste geval een

tetraploide verschijning. Dit betekent dat er van ieder gen 4 allelen aanwezig zijn. Deze allelen zijn

nagenoeg identiek aan mekaar, daar er een verschil kan zijn in het aantal tandem repeats in het allel.

Ondanks het ‘open reading frame’ en de identieke flank regio’s wordt enkel het allel met de meeste

tandem repeats tot expressie gebracht (Adam, 2001). Eveneens kan er veel gelijkenis zijn tussen de

VSP genen van verschillende VSP wat het resultaat kan zijn van divergentie en recombinatie. Er is

een mogelijkheid dat dit resulteert in kruisreactiviteit tussen verschillende VSP’s ten opzichte van een

antistof.

De daadwerkelijke regeling van VSP’s is tot op heden nog niet volledig opgehelderd. Zoals hierboven

vermeld zou het aantal ‘tandem repeats’ een invloed hebben maar bovenal spreekt men over een

  16  

epigenetisch proces in de switch tussen verschillende VSP’s. Eveneens zijn er een aantal

posttranscriptionele mechanismen bij betrokken. Zo zijn er beschrijvingen van snoRNA, dat veel

overeenkomsten heeft met precursoren van miRNA, die met behulp van Dicer en Argonaute een RNA

interferentie mechanisme vormt en zo de expressie van VSP’s kan onderdrukken. Eveneens wordt er

een RNA-afhankelijk-RNA-polymerase (RdRp) besproken dat enkel geactiveerd wordt in situaties

wanneer er heterogeniteit tussen VSP transcripten aanwezig is. De daaropvolgend gevormde dsRNA

worden herkend door een endonuclease Dicer dat het klieft. Op deze manier wordt de homogeniteit

van het oppervlakte VSP gewaarborgd. ‘Knock-down’ van evenwel RdRp of de Dicer resulteert in

expressie van multipele VSP’s aan het oppervlak. Er is eveneens de mogelijkheid dat de beslissing

van welke VSP mRNA’s translatie en expressie ondergaan concentratie afhankelijk is (Prucca et al.,

2008; 2009).

Naast de onduidelijkheid over de regeling van de VSP expressie, zijn de triggers tot VSP switch

eveneens niet opgehelderd. De meest voor de hand liggende trigger is de immuunrespons, daar

antistoffen gericht tegen VSP’s in vivo een switch in VSP veroorzaken. Ook de aanwezige antistoffen

in de lactogene immuniteit, IgA’s, hebben eenzelfde effect. Wanneer men in vivo serum van

geïnfecteerde mensen of dieren toevoegt, resulteert dit in inhibitie van groei, het doden van de

trofozoieten of expressie van een ander VSP door de trofozoiet. Wanneer men B-cel deficiënte

muizen infecteert met trofozoieten die VSPH7 tot expressie brengen op de membraan, ziet men na 21

dagen nog steeds dezelfde expressie van VSPH7 op de trofozoieten. Hetzelfde resultaat werd

bekomen bij T-cel deficiënte muizen. Hieruit kan men concluderen dat zowel de B-cel als de T-cel een

belangrijke rol spelen in inductie tot switch van VSP’s. Toch gebeurt er eveneens VSP switch in

cultuur zonder aanwezigheid van B- of T-cellen (Nash, 2002). Er is eveneens invloed van intestinale

proteasen. Niet iedere VSP is even resistent tegen deze proteasen, waardoor er een positieve selectie

gebeurt naar trofozoieten die bepaalde VSP’s tot expressie brengen die resistenter zijn tegen deze

proteasen. Er zijn dus twee belangrijke oorzaken van antigeenvariatie: het ontkomen aan de

immuunrespons van de gastheer en aanpassingen om de omstandigheden in de darm te overleven

(Adam, 2001).

Naast trofozoiet antigenen zijn er ook specifieke cyste antigenen. Zo ziet men CWP-1 en CWP-2

verschijnen op de cyste tijdens encystering. Door de korte duur van de excystering blijken deze

antigenen irrelevant te zijn voor de immuunrespons. Doch zullen waarschijnlijk antistoffen gericht

tegenover deze antigenen een vermindering van infectie veroorzaken volgens Faubert (2000).

  17  

5.2. ANTI-GIARDIA IMMUUN RESPONS 5.2.1. Mens Zoals eerder vermeld, heerst er nog veel onduidelijkheid over sommige processen in een Giardia

infectie. Tot op heden is de gehele immuunrespons van de mens op een Giardia infectie dus ook nog

niet geheel opgeklaard. Desalniettemin is er toch wat informatie over de cellulaire immuunrespons en

de cytokineproductie beschikbaar. Matowicka-Karna et al. (2009) onderzocht patiënten die

geïnfecteerd waren met Giardia door het serum te analyseren. De resultaten wezen op een forse

stijging van IL-5, IL-6, IFN-γ en IgE. Waar IgE en IL-5 tweemaal verhoogd waren in geïnfecteerde

patiënten, waren de concentraties IL-6 (tweeënhalf maal verhoogd) en IFN-γ (vier maal verhoogd) nog

aanzienlijker. IL-6 is een factor in de regulatie van het verdedigingsmechanisme, de immuunrespons,

ontstekingsreacties en haematopoiesis. Zo stimuleert het onder meer de regeling van IgA en IgE,

alsook de synthese van acute-fase proteïnen in de lever. Eveneens heeft het een activerende werking

op het beenmerg en zorgt het voor differentiatie van megakaryocyten en productie van trombocyten.

De door de T-helpercellen geproduceerde IL-5 stimuleert de proliferatie en differentiatie van

precursoren van B-lymfocyten, cytotoxische T-lymfocyten, basofielen en eosinofielen. Eveneens zijn

er beschrijvingen van stijgingen van IL-1β, IL-8 en TNF-α (Lee et al., 2012), waarbij IL-8 productie

geïnduceerd wordt door excretie- en secretieproducten van G. duodenalis via de NFκB, AP-1,

MAPK’s, p38 of ERK1/2 weg. In vitro werden bij dentritische cellen die geïncubeerd werden met G.

duodenalis in het bijzijn van Toll-like receptoren 2 een verhoogde expressie van CD25, CD83 en

CD86 gerapporteerd met eveneens een verhoogde secretie van IL-12, IL-23 en IL-10 (Obendorf et al.,

2013). Zowel in het serum als in de mucosale secreties zijn door B-cel geproduceerde

parasietspecifieke IgA, IgM en IgG’s te vinden. De belangrijke rol van antistoffen gericht tegen Giardia

wordt bevestigd wanneer men kijkt naar hypogammaglobulinemie patiënten die een hogere

prevalentie hebben aan symptomatische Giardia dan patiënten met een goed werkend immuun-

systeem. Kinderen met het Di George syndroom, en door thymusatrofie een T-cel deficiëntie hebben,

hebben geen verhoogde vatbaarbaarheid voor symptomatische Giardia. Aidspatiënten hebben een

laag gehalte aan CD4+ T-lymfocyten en eveneens geen verhoogd risico op symptomen. Ondervoede

patiënten hebben een verlaagd gehalte aan secretie IgA en zijn daarom dus meer vatbaar (Faubert,

2000).

5.2.2. Herkauwers Verschillende onderzoeken bij herkauwers waren gericht op de humorale respons na een Giardia

infectie. O’handley (2003) schreef de langdurige chronische infecties bij kalveren toe aan het

onvermogen om een humorale respons op te wekken, daar het gehalte aan parasietspecifieke

antilichamen in het serum niet veranderde tijdens het onderzoek. Het niet verminderen van het aantal

gesecreteerde cysten bevestigde het idee dat de kalveren geen immuniteit verkregen. Er zijn data

beschikbaar dat cyste uitscheiding kan optreden tot 112 dagen na infectie (Taminelli et al., 1989).

Resultaten uit een microarray analyse naar de effecten van Giardia infectie op kalveren kwamen tot

de conclusie dat naast de onderdrukking van de immuunrespons ook de inflammatie en de migratie

van immuuncellen onderdrukt werd. Daarnaast werd ook opgemerkt dat er een transcriptionele

  18  

neerregulatie was van IL-13, IL-17 en IL-1β. Bij het cytologisch onderzoek van de jejunale mucosa van

geïnfecteerde kalveren zag men geen afwijkende waardes van T-cellen, B-cellen, mastcellen,

eosinofielen, verkorte villi of het aantal cellen in apoptose. Een mogelijke oorzaak van de beschreven

onderdrukking zou de activatie zijn van PPAR-α en -γ. Deze peroxisoomproliferatorgeactiveerde

receptoren (PPAR) worden in een groot arsenaal aan cellen tot expressie gebracht waaronder

endotheel- en epitheelcellen alsook immuuncellen zoals lymfocyten, dentritische cellen en

macrofagen. Of het anti-inflammatoire effect van PPAR daadwerkelijk de oorzaak is van de

immunosuppressie is nog onduidelijk. Deze onderdrukking zou zowel het chronisch karakter als de

gebrekkige inflammatie in intestinaal weefsel bij een Giardia infectie in runderen kunnen verklaren. De

achterliggende regulatie blijft echter nog onbekend.

Eveneens weet men niet of infecties in een andere gastheer of met andere Giardia assemblages

eenzelfde respons zouden veroorzaken (Dreesen et al., 2012). Nochtans zijn er aanwijzingen dat

enkele weken na infectie cellulaire infiltratie en inflammatie optreden. In een andere studie op kalveren

zag men na 15 weken een gedaalde cyste uitscheiding, wat veroorzaakt kan worden door immuniteit.

Zes weken na infectie kon men in vitro de PBMC (peripheral blood mononuclear cell), zoals

monocyten, lymfocyten en macrofagen, stimuleren tot proliferatie na contact met Giardia trofozoieten.

Bij deze proliferatie kon men het merendeel van de cellen toewijzen tot CD4+ α-β T-cells. Deze T-

cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van infectie door onder meer een verhoogde

transcriptie van IL-17 en FoxP3. IL-17 speelt een rol in de immuniteit ter hoogte van de epitheliale en

mucosale barrière. Th-17 cellen induceren de productie van chemokines en cytokines die effector-

cellen als neutrofielen en macrofagen kunnen rekruteren waardoor ze een pro-inflammatoire functie

hebben. Er wordt geopperd dat IL-17, net als bij muizen, een essentiële functie zou hebben in het

overwinnen van de infectie (zie 5.3). Cytokines TNF-alfa, IL-15, en IL-2 waren ook verhoogd maar

weliswaar niet significant. IL-6 zou essentieel zijn in de regulatie van de respons, al werd het niet

gedetecteerd. Volgens de onderzoekers zou dit eventueel te wijten zijn aan het tijdstip van monster-

afname (Grit et al., 2014). De antigeen-presenterende cellen die in staat zijn de T- en B-cel respons in

gang te zetten, zijn nog niet gedefinieerd. Onderzoek wees uit dat dendritische cellen evenals B-cellen

niet de hoofdrolspelers zijn in de inductie van de immuunrespons. Wel werd gevonden dat MHC-II een

belangrijke rol heeft, maar men heeft nog niet met zekerheid kunnen vaststellen welke MHC-II

presenterende cel een dominerende rol heeft (Grit et al., 2014; 2014). Op serologisch onderzoek zag

men een verhoging van IgG1 en IgA. Beide antistoffen waren gericht tegen zowel assemblage A als

assemblage E, waar het merendeel van de antistoffen gericht was tegen assemblage E en de IgA

respons net iets hoger was dan de IgG1. Een hypothese voor het chronische karakter van de infectie

komt doordat de immuunrespons pas zijn klarende werking kan doen wanneer alle VSP’s herkend zijn

door antilichamen (Grit et al., 2014). Een onderzoek bij lammeren kwam daarentegen weer tot het

resultaat dat er geen noemenswaardige stijging was van antilichamen in het serum van geïnfecteerde

lammeren (Yanke et al., 1998).

  19  

5.2.3. Rodentia Rodentia, en dan vooral de muis, zijn in vele proefopstellingen bij onderzoek naar immuniteit

tegenover Giardia de gekozen diersoort. Naast G. duodenalis is er ook onderzoek gedaan naar de

immuunrespons tegen Giardia muris, een soort die specifiek knaagdieren gaat infecteren. Wanneer

men G. duodenalis infecties vergelijkt met een G. muris infectie zal men op het punt van levenscyclus

en infectieproces weinig verschillen detecteren behalve dat de meeste muizenstammen in staat zijn

een G. muris infectie op te ruimen 3 tot 6 weken na infectie (Dreesen et al., 2014). Een belangrijke rol

in de controle en opruiming van G. muris blijkt weggelegd te zijn voor de T-lymfocyten. Bij athymische

muizen werd een verlengde infectie gedetecteerd. Het toevoegen van lymfocyten resulteerde daarbij

in een eliminatie van G. muris in 7 weken. Meer specifiek konden BALB/c muizen, gedepleteerd voor

CD4+ T-cellen, de G. muris trofozieten niet elimineren. Muizen met een depletie van CD8+ T-cellen

waren hiertoe wel in staat. Dit is in tegenstelling met de situatie bij de mens, waar depletie van CD4+

T-cellen nagenoeg geen invloed heeft op de vatbaarheid en klaring van een individu (Faubert, 2000).

Bij onderzoek naar de Peyerse platen van geïnfecteerde muizen zag men een verdubbeling van

leukocyten. De percentages CD4+ T-cellen en T-supressor cellen bleven echter wel gelijk. Het aantal

secretorische B-cellen stegen naargelang de fase van infectie (Carlson et al., 1986). Tijdens de

latentie periode zijn de secretorische IgM-producerende B-cellen op hun maximum. In de

daaropvolgende acute fase zijn het de secretorische IgA-producerende B-cellen die een maximum

bereiken. Deze isotype switch, wat belangrijk is voor de eliminatie, bevestigt de belangrijke rol die

Th2- en mastcellen hebben, die door cytokineproductie van onder meer IL-5 de switch promoten.

Wanneer er lymfocyten, bekomen uit de mesenteriale lymfeknoop van G. muris geïnfecteerde muizen,

gestimuleerd worden door conA (concanavalin A), krijgt men bij resistente muizenstammen secretie

van IL-5 en IFN-γ. Bij vatbare stammen ziet men enkel IFNγ-, dat mogelijk een verklaring is voor de

vatbaarheid aangezien IFN-γ naast proliferatie van B-cellen ook een rol speelt in de switch van

isotype. Stimulatie van T-cellen uit de Peyerse platen en milt met conA resulteert naast IL-5 en IFN-

gamma ook in een verhoogde IL-4 release (Faubert, 2000). Net als bij het rund blijkt IL-17 een

belangrijke rol te hebben in de immuunrespons. IL-17 receptor A knock-out muizen zijn incapabel om

de infectie te bestrijden (Dreesen et al., 2014). De centrale rol van B-cellen in de immuniteit tegenover

G. muris wordt benadrukt door het feit dat B-cel deficiënte muizen niet in staat zijn een G. muris

infectie te overwinnen daar IgG, IgM maar vooral IgA een belangrijke rol spelen hierin. IgA deficiënte

muizen zijn dan logischerwijs niet goed in staat de trofozoiet te overwinnen. Nochtans zijn er B-cel

afhankelijke maar IgA onafhankelijke mechanismen die in staat zijn G. muris op te ruimen, al moeten

deze nog opgehelderd worden (Langford et al., 2002). Muizen deficiënt aan de pIgR (polymeric

immunoglobulin receptor), verantwoordelijk voor het transport van IgA en IgM naar het intestinale

lumen, hebben echter wel problemen met het verwijderen van een G. muris infectie (Davids et al.,

2006).

G. duodenalis daarentegen komt in natuurlijke omstandigheden niet voor in rodentia, desalniettemin

wordt deze species vaak gebruikt voor onderzoek naar de interactie tussen gastheer en parasiet.

Vaak worden gerbils gebruikt in de plaats van muizen omdat deze een hoge graad van vatbaarheid

  20  

hebben voor infectie bij orale inoculatie van zowel een cyste als trofozoiet. Daarbij is de eliminatie van

de cyste en de pathologische wijzigingen vergelijkbaar als bij de mens (Amorim et al., 2010). In het

merendeel van de gevallen wordt er gebruik gemaakt van assemblage A, maar ook assemblage B en

zelfs assemblage E kunnen tot infectie leiden (Bénéré et al., 2010). Onderzoek door Amorim (2010)

naar de humorale immuniteit tijdens een G. duodenalis infectie rapporteerde dat vanaf 7 dagen na

infectie er fecaal IgA te detecteren was, wat het resultaat was van de snelle lokale IgA productie. Een

interessante bevinding is dat de hoeveelheid geproduceerde secretorische IgA evenredig is met de

parasitaire load van de infectie. De uitgescheiden cysten zijn kwantitatief gezien gelijk voor alle

individuen, onafhankelijk of de dieren nu door een hoge of een lage dosis geïnfecteerd werden. Hieruit

zou men eventueel kunnen concluderen dat het mogelijk is dat individuen een gelijke kans op infectie

hebben onafhankelijk van de infectiedosis. In de derde week na infectie verschijnen de IgA’s ook in

het serum gevolgd door IgG1 en IgG2a. IgM heeft vooral in het begin van de infectie een hoog niveau

in het serum maar zal na 2-3 weken snel dalen. Er wordt gesuggereerd dat IgM niet actief deelneemt

aan de opruiming van de parasiet maar een inductieve rol heeft (Amorim et al., 2010). In een andere

studie waar de intestinale wand onderzocht werd, beschrijft men dat er naast een hoger gehalte aan

mastcellen ook een stijging is in het aantal slijmbekercellen met eveneens een grotere productie van

mucus. Een hypothese voor deze verhoogde mucusproductie zou zijn dat dit een beschermlaag is

tegenover mucosale adhesie van pathogenen als Giardia (Ventura et al., 2013).

Muizen zijn moeilijker te infecteren met G. duodenalis waardoor infectie met trofozoieten of het

humane GS(M) isolaat (assemblage B) noodzakelijk via een maagsonde moet gebeuren (Byrd et al.,

1994). Net als bij een G. muris infectie is de respons op G. duodenalis bij muizen T-cel afhankelijk. Zo

hebben zowel scid muizen als muizen behandeld met anti-CD4 en muizen zonder T-cell receptorgen

een chronisch verloop van de infectie, wat de essentiële rol van T-cellen bevestigd. Wanneer er naar

de cytokineproductie gekeken wordt, ziet men dat muizen deficiënt aan IL-4 of IFN-γ geen verschil

vertonen op eliminatie niveau, vergeleken met wild-type muizen (Singer et al., 2000). Een deficiëntie

aan TNF-α en IL-6 zorgde echter wel voor een vertraagde uitdrijving. In vitro toonde Kamda et al.

(2009) aan dat BMDC’s (bone-marrow derived dentritic cell) van de muis, geïnhibeerd worden door

Giardia trofozoieten of Giardia proteïne fracties met als gevolg dat de productie van IL-10 werd

verhoogd en die van IL-12 werd onderdrukt. Li (2004) bewees door c-kitw/wv muizen, die geen mastcel

respons opwekken, te infecteren dat de mucosale mastcellen eveneens een belangrijke rol spelen in

eliminatie daar dergelijke muizen niet in staat waren dit te doen. Er is nog wat controversie over de

daadwerkelijke rol van B-cellen en antistoffen in de controle van de infectie. IgA deficiënte muizen zijn

niet in staat de eradicatie van de infectie te bewerkstellen (Faubert, 2000). Daarentegen hebben

muizen met een deficiëntie aan de pIgR geen problemen met het overwinnen van de infectie, al moet

hierbij wel vermeld worden dat er potentieel bij dit onderzoek nog IgA antistoffen in het intestinale

lumen aanwezig waren wat de resultaten enigszins discutabel maken. De tegenstrijdigheid jegens de

rol van B-cellen ziet men in de variabele uitkomsten van onderzoeken. Zo toonde Li (2004) aan dat

muizen met een deficiëntie aan B-cellen een chronische infectie kregen. Singer en Nash (2000)

  21  

daarentegen toonden aan dat er geen verschil was in het eradiceren van een infectie tussen B-cel

deficiënte muizen en wild-type muizen.

5.3. DE ROL VAN IL-17 Zoals eerder vermeld, hebben onderzoeken bij het rund (Grit et al., 2014) en bij de muis (Dreesen et

al., 2014) uitgewezen dat IL-17 een rol heeft in de respons tegen een Giardia infectie. De IL-17

cytokine familie is op te delen in 6 subgroepen IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL17D, IL-17E (of IL-25) en IL-

17F, die worden geproduceerd door een grote verscheidenheid aan cellen zoals NKT cellen, NK

cellen, neutrofielen, eosinofielen, γδ T-cellen, Th2-cellen, epitheelcellen en Th17-cellen. Functioneel

gezien zijn de verschillende cytokines uit de IL-17 familie niet geheel gelijk. Zo hebben IL-17A en

IL17F vooral een antibacteriële werking en heeft de door Th2-cel geproduceerde IL-17E een anti-

parasitaire werking. IL-17C is voornamelijk van belang bij de regulatie van immuniteit van het epitheel.

Naast de cytokines zijn eveneens de IL-17 receptoren (IL-17R) in te delen in verschillende subunits.

Van de 5 geïdentificeerde receptoren, IL-17RA – E, is enkel IL-17RA in staat met een tweede lid van

de receptor familie een complex te vormen waarbij de tweede subunit de cytokine specificiteit bepaalt

van het heterodimeer. Het IL-17RA – IL-17RC complex is in staat door binding met IL-17A, IL-17F of

IL-17A/F dimeren een antibacteriële werking in gang te zetten. IL-17C en IL-17E binden op de

complexen IL-17RA – IL-17RE en IL-17RA – IL-17RB, respectievelijk. Wat de receptoren voor IL-17D

zijn, is tot op heden nog onbekend. Ook de precieze signaaltransductie die bij de IL-17R binding in

gang wordt gezet, is nog onbekend, al lijkt IL-17 de ‘MAPK pathways’ en de NF-κB te activeren.

Het IL-17RA – IL-17RC complex wordt op verschillende mucosale cellen als fibroblasten en

epitheelcellen tot uiting gebracht met het hoogste potentieel voor de IL-17A homodimeer. Door binding

van IL-17A, IL-17F of IL-17A/F wordt het receptor complex geactiveerd met initiatie van de reparatie

respons en aangeboren afweer. Hierbij worden verschillende chemokines, metalloproteinasen en

cytokines als IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CCL2, CCL7, G-CSF geïnduceerd die onder meer

als chemoattractant werken voor neutrofielen en deze activeren (Pappu et al., 2012; Waite et al.,

2012). Eveneens worden er antimicrobiële peptiden vrijgesteld zoals β-defensine, S100 en ReG3γ die

bij schade aan de darm de spreiding van de commensale bacteriën kunnen tegengaan. Daarbovenop

hebben IL-17A en F een belangrijke rol in het behoud van de integriteit van de mucosale barrière door

de synthese van het ‘tight junctions’ proteïne claudine te stimuleren en zo de barrière te versterken.

Eveneens hebben IL-17A & F een synergistische werking met pro-inflammatoire cytokines als IL-1β

en TNF-α om zo een inflammatoire respons op gang te brengen (Pappu et al., 2012). Wanneer deze

respons niet meer gecontroleerd wordt, kan het auto-immuun worden en veel schade veroorzaken. Zo

worden onder meer auto-immuunziekten als multiple sclerose, RA, SLE, psoriasis, IBD en de ziekte

van Crohn in verband gebracht met een verhoogde productie van IL-17 (Waite et al., 2012).

IL-17C heeft naast de vele functionele overeenkomsten met IL-17A & F, zoals synergisme met pro-

inflammatoire cytokines, protectie tegen bacteriële infectie en behoud van intestinale microflora en

homeostasis, ook noemenswaardige verschillen. Zo is IL-17C minder actief en heeft het een minder

  22  

arsenaal aan cellen waarop het inwerkt door het beperkt voorkomen van de IL-17RE. Daarbij werd

gedemonstreerd dat IL-17C een bemiddelende rol heeft in de Th17 respons daar er een opregulatie is

van de IL-17RE. IL-17C, wat voornamelijk geproduceerd wordt door epitheelcellen, initieert op een

autocriene wijze de aangeboren immuunrespons in het epitheel na een bacteriële infectie. Hierdoor

wordt, zonder inflammatie, een tijdelijk verdedigingsmechanisme in het epitheel tewerkgesteld wat

voldoende is voor lokale, zwakkere pathogenen.

Het primaire doelwit van IL-17E zijn de leukocyten waardoor het een anti-parasitaire werking heeft

door inductie van een type-II immuun respons. Daarbij heeft het eveneens een inhiberende functie op

de IL-17A & F productie in leukocyten. Hiernaast werkt IL-17E in op vele andere cellen zoals CD4+

Th2-cellen, CD4+ Th9-cellen, fibroblasten, basofielen, (iNK)T-cellen ILC2-cellen. Inwerking op Th2-

cellen induceert een cytokine respons met onder meer IL-4, IL-5, IL-9 en IL-13, die naast de invloed

op het isotype switching van IgG1 naar IgE ook inbreng hebben op activatie en rekrutering van

verschillende effectorcellen inclusief mastcellen, CD4+ Th2-cellen, basofielen en eosinofielen. Met

deze initiatie heeft IL-17E een belangrijke rol in de controle op parasitaire infecties.

Zoals eerder vermeld, zijn er verschillende bronnen van IL-17 en speelt de communicatie tussen

epitheliale cellen, microbiële signalen en zowel de aangeboren als de verworven immuniteit een

belangrijke rol in de controle van IL-17 expressie. Door het herkennen van pathogenen zijn epitheliale

cellen en zowel de aangeboren als verworven leukocyten, naast de controle, ook een belangrijke

factor in het promoten van de adaptieve immuunrespons door als directe bron te fungeren van IL-17.

Nadat aangeboren immuunrespons receptoren als PRR (pattern recognition receptors) worden

getriggerd volgt er een inductie van cytokineproductie door de epitheelcellen. Ook de PRR’s op

perifere DC worden geactiveerd waarna ze naar de lymfeknoop migreren. Onder desbetreffende

PRR’s vallen onder meer de TLR’s (Toll-like receptors) die bacteriën, virussen, fungi en parasitaire

pathogenen zullen herkennen. Eveneens kunnen stress en schade van epitheliale cellen een inductie

van cytokines in gang steken. Onder het repertoire aan cytokines die vrijgesteld worden na triggering

vallen onder meer de pleiotropische cytokines TNF-α, IL-1β en IL-6 die allen een functie hebben in de

antimicrobiële respons. Eveneens worden er direct IL-17C en IL-17E geproduceerd door de

epitheelcellen waarbij de IL-17C expressie wordt gecontroleerd door zowel bacteriële als cytokine

signalen. Wanneer de TLR2, TLR4 of TLR5 worden getriggerd door ofwel bacteriën ofwel andere

agonisten, volgt er een snelle expressie van IL-17C, wat epitheliale cellen de primaire bron van IL-17C

maakt. De cytokines TNF-α en IL-1β zijn eveneens promotors van de directe IL-17C expressie in

epitheelcellen (Figuur 4B).

De productie van IL-17E door het epitheel gebeurt na pathogene challenge van virussen, fungi,

bacteriën en protease allergenen. Wat de desbetreffende receptoren zijn voor deze reactie is nog niet

bekend. Het IL-17E zal na inductie inwerken op verschillende immuuncellen als Th2, Th9 en ILC2.

Een opmerkelijk gegeven is dat productie van IL-17E gereguleerd wordt door de bacteriële microflora

daar er geen expressie was van dit cytokine in ‘germ-free’ muizen. Daarbij is eveneens vastgesteld

  23  

dat IL17E een negatieve regulator is van IL-17A en F door IL-13 productie te induceren dat vervolgens

leidt tot de reductie van IL-23, IL-1β en IL-6 met een verminderde productie van IL-17A en F als

gevolg (Figuur 4C).

De productie van IL-17A en F gebeurt daarentegen via een indirect mechanisme, al zijn er

aanwijzingen dat IL-17F onder inflammatoire omstandigheden ook direct door het epitheel

geproduceerd kan worden, door stimulatie van de Th17 differentiatie uit naïeve CD4+ T-helper cellen

(Pappu et al., 2012). Lang heeft men gedacht dat de populatie van T-helpercellen bestond uit de IFN-γ

producerende Th1 en de IL-4 producerende Th2, waarbij Th1 de gastheer beschermt tegen

intracellulaire pathogenen en Th2 de verdediging tegen extracellulaire pathogenen evenals

antistoffenproductie door B-cellen bewerkstelt. Recenter werd een nieuwe T-helpercel subset

beschreven met als functie de productie van cytokines IL-17A, IL-17F, IL-21 en IL-22. Deze T-

helpercel bleek belangrijk te zijn voor het rekruteren van neutrofielen en de respons tegen

extracellulaire pathogenen en werd Th17 genoemd. Deze Th17 wordt net als Th1 en Th2 ontwikkeld

vanuit naïeve CD4+ T-cellen waarbij de differentiatie onder meer afhankelijk is van het specifieke

cytokine milieu. In het geval van Th1 zijn IFN-γ en IL-12 de desbetreffende cytokines, waar dit IL-4 bij

Th2 is. Bij differentiatie tot Th17 ligt het iets ingewikkelder aangezien er meerdere factoren van belang

zijn. Zo zouden IL-1β, IL-6, TGF-β en IL-23 allen een belangrijke rol spelen in zowel de ontwikkeling

als het onderhoud van Th17 (Figuur 4B) (Van de Veerdonk et al., 2009).

   Figuur 3. Mechanisme cytokine geïnduceerde proliferatie IL-17 producerende Th17 cellen uit naïeve CD4+ T-lymfocyten. IL-6 induceert STAT3 wat resulteert in transcriptie van IL-21. Daaropvolgend zorgt IL-21 voor een verhoogde IL-23R expressie waarbij naast STAT3 ook RORγt essentieel zijn. Door de verhoogde expressie van IL-23R is de cel nu vatbaar voor IL-23. Wanneer deze cytokines in combinatie met TGF-β voorkomen zal dit door activatie van RORγt en STAT3 resulteren in de differentiatie tot Th17. Een zeer hoge concentratie aan TGF-β inhibeert echter de IL-23R expressie (uit: Ivanov et al., 2007).

  24  

TGF-β op zichzelf zorgt voor inductie van Foxp3+ bij naïeve T-cellen, wat een transcriptie factor is van

regulatorische T-cellen (Treg). Wanneer men echter IL-6 toevoegt, wordt deze Foxp3+ inductie

geïnhibeerd en worden er Th17-cellen gevormd. Door deze controlerende werking heeft IL-6 een

belangrijke rol in het bepalen of de immuunrespons gedomineerd wordt door Treg’s of door Th17-

cellen. Toch zijn IL-6 KO muizen in staat Th17-cellen te induceren waaruit men kan concluderen dat

IL-6 geen monopolie heeft op de ontwikkeling van Th17. Hierna werd het IL-21, wat tot de IL-2 familie

behoord, geïdentificeerd en net als IL-6 een suppressieve werking heeft op de inductie van Foxp3+ en

samen met TGF-β de Th17 ontwikkeling induceert. IL-21 wordt voor een groot deel door de Th17-

cellen zelf geproduceerd en bevordert zo op autocriene wijze de eigen differentiatie. Deze cytokines,

die bij de muis noodzakelijk zijn voor de ontwikkeling van Th17, bleken in eerste instantie bij de mens

niet identiek te zijn. Daar werd eerst aangetoond dat enkel de combinatie van IL-1β en IL-6 of IL-1β en

IL-23 de benodigde differentiatie factoren zijn. Later werd aangetoond dat ook bij de mens TGF-β een

essentiële rol heeft. TGF-β is noodzakelijk voor de inductie van transcriptiefactor RORc, wat de

humane homoloog is van RORγt, voor de ontwikkeling van Th17. Ook RORα zou eventueel een

gelijkaardige rol vertolken als RORγt daar het vergelijkbare maar niet identieke eigenschappen bezit.

Wanneer enkel TGF-β aanwezig is, wordt deze rol geïnhibeerd. Enkel in combinatie met IL-6 of 21

wordt deze inhibitie op RORc of RORγt opgeheven en kan de differentiatie van Th17 en bijkomende

transcriptie van IL-17 gestart worden. TGF-β op zichzelf zorgt voor activatie van de ‘Smad pathway’

dat de immuunrespons onderdrukt. IL-6 alleen zorgt voor de activatie van STAT3. Wanneer IL-6 en

TGF-β tegelijk voorkomen resulteert dit in de ontwikkeling van Th17. Welk mechanisme de grondslag

hiervan is, is tot op heden nog onduidelijk. Toch zijn er een aantal bevindingen die enigszins

duidelijkheid verschaffen. Zo zou iedere naïeve T-cel een functionele IL-6R tot expressie brengen die

bestaat uit IL-6Rα en signaal subunit gp130. Na blootstelling aan IL-6 of stimulatie van de TCR zal er

echter een neerregulatie voorkomen van IL-6Rα, wat resulteert in een gereduceerde responsiviteit op

IL-6. TGF-β is hierbij van belang, daar het een opregulatie van IL-6Rα induceert en zo de reactiviteit

op IL-6 waarborgt. Daarnaast zorgt binding van IL-6 op de receptor, zoals eerder al gezegd, voor

activatie van STAT3. Deze STAT3 is nodig voor de inductie van RORγt. Dit gebeurt echter enkel in het

bijzijn van TGF-β dat op zichzelf de expressie van RORγt promoot, maar zijn functie onderdrukt. In het

bijzijn van IL-6 of IL-21 wordt deze onderdrukking teniet gedaan. Geactiveerde RORγt zal fysisch

binden op het Foxp3 waardoor het een antagonistische werking heeft en de ontwikkeling van Treg

uitsluit. Er is bewezen dat er een ‘ROR-binding site’ aanwezig is op de IL-17 promotor, al is het tot op

heden nog niet opgehelderd of het hier om een directe of indirecte binding gaat. Daarbij is eveneens

STAT3 in staat rechtstreeks te binden op IL-17 en IL-21 promotors waarbij STAT-3 en RORγt

coöperatief te werk zullen gaan. RORγt blijkt naast STAT-3 nog een coöperatieve werking te hebben

met een tot op heden niet geïdentificeerde transcriptiefactor waarbij IRF4 een belangrijke gegadigde

blijkt te zijn.

Naast transcriptie van IL-17 induceert RORγt eveneens IL-23R, waardoor de prolifererende Th17-

cellen vatbaar worden voor IL-23 die de maturatie promoten. Een zeer hoge concentratie aan TGF-β

  25  

inhibeert echter de expressie van IL-23R. Wanneer IL-23 bindt op de IL-23R zorgt het ervoor dat IL-22

geproduceerd wordt, dat dankzij een stabiliserende functie van groot belang is bij de terminale

differentiatie. In veel gevallen is IL-23 de limiterende factor wat eventueel zou kunnen bepalen of er

een Th17 respons ontstaat of niet. IL-23 kan worden geproduceerd in veel cellen van de aangeboren

immuniteit zoals onder meer DC’s en macrofagen, waarbij afhankelijk van het pathogeen en de

receptor, al dan niet IL-23 vrijgesteld zal worden (Figuur 3).

Het is moeilijk vast te stellen welke bronnen van TGF-β daadwerkelijk van belang zijn in Th17

differentiatie maar er wordt gesuggereerd dat T-cellen en eveneens Treg een belangrijke bron zijn

voor de ontwikkeling van Th17. Daarbij blijken ook DC’s op indirecte manier een aandeel te hebben in

de stijging van TGF-β.

IL-6 is net als TGF-β een pleiotropisch cytokine met vele effecten die door verschillende cellen

geproduceerd kunnen worden en deel is van de acute fase respons tijdens infectie. Zo zijn cellen van

de aangeboren immuniteit als DC, monocyten, macrofagen, B-cellen, mastcellen, geactiveerde T-

cellen maar ook tumorcellen, fibroblasten, keratinocyten en endotheelcellen allen in staat IL-6 te

produceren.

Het cytokine IL-21 wordt eveneens door een groot aantal cellen geproduceerd zoals geactiveerde T-

cellen, NKT cellen, T-follikelcellen, Th2-cellen maar de grootste productie komt van de Th17-cellen

zelf. Het heeft naast zijn rol in de ontwikkeling van Th17 ook een belangrijke invloed in de expansie

van geactiveerde B-cellen en in de switch tussen immunoglobuline isotypes. Desbetreffende IL-21 dat

geproduceerd wordt door Th17, fungeert waarschijnlijk als een positieve feedback in de ontwikkeling

van Th17. Il-6 is een sterke induceerder van IL-21 waarbij deze inductie STAT3 afhankelijk is. Er

wordt gesuggereerd dat IL-21 een belangrijke rol speelt in het behoud van precursoren voor Th17-

cellen doordat het zorgt voor een behoud van het Th17-cel niveau wanneer er geen inflammatie en zo

ook geen IL-6 productie aanwezig is.

Een niet te verwaarloosbaar interleukine dat geproduceerd wordt door Th17 is IL-22, dat

geproduceerd wordt na expressie en triggering van de IL-23R. De IL-22R wordt in een wijd arsenaal

aan cellen tot expressie gebracht maar niet in cellen van het immuunsysteem, waardoor de Th17-cel

in staat is te communiceren met het weefsel zonder invloed te hebben op immunologische tak van het

afweersysteem. De signaaltransductie van de IL-22R gebeurt door activatie van de ‘MAPK pathway’,

STAT1, STAT3 en eveneens STAT5 wat onder meer belangrijk is in het behouden van de endotheel-

en epitheelbarrière (Korn et al., 2009).

  26  

 Figuur 4. Regulatie van IL-17 productie door het epitheel. A) 1. Productie IL-17 A/F door ILC’s na activatie van PRR’s (pattern recognition receptors) door pathogenen. 2. Geproduceerde IL-17 A/F binden op IL-17RA – IL-17RC complexen op het epitheel wat resulteert in een immuunrespons. 3. Schade of het activeren van de PRR’s op de epitheliale cellen door pathogenen resulteert in productie van cytokines IL-1β, IL-6 en TGF-β, die de ontwikkeling van Th17 uit naïeve CD4+ T-cellen induceren. 4. De daaropvolgende geproduceerde IL-17A/F binden op IL-17RA IL-17RC complexen op het epitheel en induceren daarmee de epitheliale immuunrespons. B) 1. Schade of activatie van de PRR’s door pathogenen op de epitheelcellen kan resulteren in een directe productie van IL-17C alsook een indirecte productie door secretie van cytokines IL-1β en TNF-α. 2. De geproduceerde IL-17C induceert de epitheliale immuunrespons na binding op het IL-17RA – IL-17RE complex. C) 1. Activatie via de epitheliale PRR’s door binding van een pathogeen zorgt voor directe productie van IL-17E. 2. Dit IL-17E gaat binden met de IL-17RA – IL-17RE complexen op verschillende cellen van het immuunsysteem (uit: Pappu et al., 2012).

  27  

Het uiteindelijke resultaat is de productie van IL-17, wat ofwel direct ofwel door aantrekken van

neutrofielen, al dan niet door inflammatie, de pathogenen kan elimineren. Toch blijkt dit niet altijd van

toepassing te zijn. Volgens Van de Veerdonk (2009) is IL-17 goed in staat bacteriën en fungi te

verwijderen, maar bij parasieten en virussen zal de eliminatie niet goed lukken en zal er veel

weefselschade ontstaan door inflammatie waardoor er een immunopathologie ontstaat. De

inhiberende werking van IL-17 op apoptose zorgt ervoor dat virusgeïnfecteerde cellen blijven

persisteren in het lichaam in plaats van opgeruimd te worden. Toch blijkt IL-17 een belangrijke factor

te zijn in de overwinning van Giardia. Hoe dit precies te werk gaat, is nog niet geheel duidelijk, maar

zo bewees een onderzoek van Dreesen et al. (2014) dat IL-17RA KO muizen minder goed in staat

waren tot eliminatie van Giardia dan muizen met een intact IL-17RA.

  28  

BESPREKING Wanneer men het bovenstaande in beschouwing neemt, kan men concluderen dat, ondanks er de

laatste jaren veel kennis bijgekomen is, er nog steeds veel onduidelijkheden zijn omtrent Giardia

infecties. De celcyclus en de pathogenese zijn grotendeels opgehelderd. Dit in tegenstelling tot de

immuunrespons van de gastheer waarover nog veel onduidelijkheden zijn. Het doel van deze

literatuurstudie was dan ook een overzicht te geven van de reeds bekende immuunrespons

mechanismen tijdens een infectie van de gastheer. De studies omtrent deze mechanismen zijn echter

beperkt tot enkele species. Zo zijn er enkel bij de mens, rund, muis en gerbils studies gedaan naar de

respons. De grote vraag is dan ook in hoeverre deze resultaten extrapoleerbaar zijn naar andere

species daar er onder meer grote verschillen zijn in het verloop van de infectie tussen de species. Bij

rodentia en de mens ziet men vaak eliminatie van de parasiet binnen enkele weken, daar het bij het

rund vaak een chronische infectie is.

Bij mensen zijn er stijgingen van IL-1β, IL-5, IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α, IgA, IgE, IgG en IgM te

detecteren tijdens een infectie die een rol zouden spelen in de verwijdering van Giardia. In vitro

experimenten resulteerden in een stijging van IL-12, IL-23 en IL-10. Onderzoeken bij runderen en

muizen resulteerden dan weer in nog andere observaties. Daar bij de mens de eliminatie van Giardia

CD4+ T-cel onafhankelijk zou zijn, blijken deze T-cellen bij de muis wel belangrijk te zijn. Eveneens

worden er stijgingen beschreven van IL-4, IL-5, IFN-γ, IgA, IgG, IgM en IL-17 na infectie met G. muris.

Wanneer men muizen infecteert met G. duodenalis ziet men een stijging van IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α

en IgA. G. duodenalis is echter wel geen natuurlijke parasiet van de muis, daar de infectie min of meer

geforceerd wordt door toedieningen via een maagsonde en in een zeer hoge dosis. Het is daarom

voor G. duodenalis discutabel in hoeverre deze resultaten representatief zijn voor andere diersoorten.

Naast IgA en IgG blijkt, net als bij de muis, een belangrijke rol te zijn weggelegd voor IL-17 bij een

Giardia infectie bij het rund. De precieze achterliggende mechanismen van dit IL-17 cytokine jegens

een Giardia trofozoiet moeten nog verder opgehelderd worden. Verder onderzoek naar dit interleukine

en zijn rol in de immuunrespons bij een Giardia infectie is dan ook van essentieel belang om meer

duidelijkheid te verkrijgen in de complete respons van een gastheer.

Een ander aspect waar nog veel onduidelijkheden over heersen, is welke antigenen op een Giardia

trofozoiet nu daadwerkelijk betrokken zijn bij de herkenning door de gastheer. Hoogstwaarschijnlijk

zijn het de VSP’s die bij Giardia dominant aanwezig zijn op het oppervlak van een trofozoiet. Meer

onderzoek naar deze antigenen zou eveneens een belangrijke bijdrage leveren wanneer men meer

opheldering wil verkrijgen in de immuunrespons alsook het ontwikkelen van een vaccin tegenover

Giardia. Ontwikkeling van een goed werkend vaccin zou een uitkomst bieden ter preventie van de vele

negatieve gevolgen van een Giardia infectie zoals bijvoorbeeld de economische verliezen die

optreden bij productiedieren.

  29  

REFERENTIELIJST Abel, E.S., Davids, B.J., Robles, L.D., Loflin, C.E., Gillin, F.D., Chakrabarti, R. (2001). Possible Roles

of Protein Kinase A in Cell Motility and Excystation of the Early Diverging Eukaryote Giardia Lamblia. Journal of Biological Chemistry 276, 10320–10329.

Adam, R.D. (2001). Biology of Giardia Lamblia Biology of Giardia Lamblia. Clinical Microbiology Reviews 14, 447–475.

Amorim, R.M.R., Silva, D.A.O, Taketomi, E.A., Morato, M.G., Mundim, M.J., Ribeiro, D.P., Oliveira, T.C., Viana, J.C., Gomes, M.A., Cury, M.C. (2010). Giardia Duodenalis: Kinetics of Cyst Elimination and the Systemic Humoral and Intestinal Secretory Immune Responses in Gerbils (Meriones Unguiculatus) Experimentally Infected. Experimental Parasitology 125, 297–303.

Andersen, M.D., Neumann, N.F. (2007). Giardia intestinalis: new insights on a old pathogen. Reviews in Medical Microbiology 18, 35-42.

Armson, A., Yang, R., Thompson, J., Reid, S., Ryan, U.M. (2009). Giardia Genotypes in Pigs in Western Australia: Prevalence and Association with Diarrhea. Experimental Parasitology 121, 381–383.

Bénéré, E., Geurden, T., Robertson, L., Van Assche, T., Cos, P., Maes, L. (2010). Infectivity of Giardia Duodenalis Assemblages A and E for the Gerbil and Axenisation of Duodenal Trophozoites. Parasitology International 59, 634–637.

Bernal, R.M., Tovar, R., Santos, J.I., De Lourdes Muñoz, M. (1998). Possible Role of Calmodulin in Excystation of Giardia Lamblia. Parasitology Research 84, 687–693.

Boreham, P.F.L., Upcroft, J.A., Upcroft, P. (1990). Changing approaches to the study of Giardia epidemiology: 1681-2000. International Journal of Parasitology 20, 479-487.

Byrd, L.G., Conrad, J.T., Nash, T.E. (1994). Giardia Lamblia Infections in Adult Mice. Infection and Immunity 62, 3583–3585.

Candé, C., Cohen, I., Daugas, E., Ravagnan, L., Larochette, N., Zamzami, N., Kroemer, G. (2002). Apoptosis-Inducing Factor (AIF): A Novel Caspase-Independent Death Effector Released from Mitochondria. Biochimie 84, 215–222.

Carlson, J.R., Heyworth, M.F., Owen, R.L. (1986). Response of Peyer’s Patch Lymphocyte Subsets to Giardia Muris Infection in BALB/c Mice. I. T-Cell Subsets. Cellular immunology 97, 44–50.

Chin, A.C., Vergnolle, N., MacNaughton, W.K., Wallace, J.L., Hollenberg, M.D., Buret, A.G. (2003). Proteinase-Activated Receptor 1 Activation Induces Epithelial Apoptosis and Increases Intestinal Permeability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 11104–11109.

Chin, A.C., Teoh, D.A., Scott, K.G., Meddings, J.B., Macnaughton, W.K., Buret, A.G. (2002). Strain-Dependent Induction of Enterocyte Apoptosis by Giardia Lamblia Disrupts Epithelial Barrier Function in a Caspase-3-Dependent Manner. Infection and Immunity 70, 3673–3680.

Claerebout, E., Casaert, S., Dalemans, A.-C., De Wilde, N., Levecke, B., Vercruysse, J., Geurden, T. (2009). Giardia and Other Intestinal Parasites in Different Dog Populations in Northern Belgium. Veterinary Parasitology 161, 41–46.

Cotton, J.A., Beatty, J.K., Buret, A.G. (2011). Host Parasite Interactions and Pathophysiology in Giardia Infections. International Journal for Parasitology 41, 925–933.

Davids, B.J., Palm, J.E., Housley, M.P., Smith, J.R., Andersen, Y.S., Martin, M.G., Hendrickson, B.A., Johansen, F.E., Svard, S.G., Gillin, F.D., Eckmann, L. (2006). Polymeric Immunoglobulin Receptor in Intestinal Immune Defense against the Lumen-Dwelling Protozoan Parasite Giardia. Journal of immunology 177, 6281–6290.

Dawson, D. (2005). Foodborne protozoan parasites. International Journal of Food Microbiology 103, 207-227.

Dobell, C. (1920). The Discovery of the Intestinal Protozoa of Man. Proceedings of the Royal Society of Medicine 13, 1–15.

Dreesen, L., Rinaldi, M., Chiers, K., Li, R., Geurden, T., Van den Broeck, W., Goddeeris, B., Vercruysse, J., Claerebout, E., Geldhof, P. (2012). Microarray Analysis of the Intestinal Host Response in Giardia Duodenalis Assemblage E Infected Calves. PloS ONE 7, 1–8.

Dreesen, L., De Bosscher, K., Grit, G., Staels, B., Lubberts, E., Bauge, E., Geldhof, P. (2014). Giardia Muris Infection in Mice Is Associated with a Protective Interleukin 17A Response and Induction of Peroxisome. Infection and Immunity 82, 3333–3340.

Dunlap, B.G., Thies, M.L. (2002). Giardia in Beaver (Castor Canadensis) and Nutria (Myocastor Coypus) from East Texas. The Journal of Parasitology 88, 1254–1258.

Eckmann, L., Laurent, F., Langford, T.D., Hetsko, M.L., Smith, J.R., Kagnoff, M.F., Gillin, F.D. (2000). Nitric Oxide Production by Human Intestinal Epithelial Cells and Competition for Arginine as

  30  

Potential Determinants of Host Defense against the Lumen-Dwelling Pathogen Giardia Lamblia. Journal of immunology 164, 1478–1487.

Epe, C., Rehkter, G., Schnieder, T., Lorentzen, L., Kreienbrock, L. (2010). Giardia in symptomatic dogs and cats in Europe - Results of a European Study. Veterinary Parasitology 173, 32-38.

Faubert, G. (2000). Immune Response to Giardia Duodenalis. Clinical Microbiology Reviews 13, 35–54.

Fayer, R., Santín, M., Trout, J.M., Dubey, J.P. (2006). Detection of Cryptosporidium Felis and Giardia Duodenalis Assemblage F in a Cat Colony. Veterinary Parasitology 140, 44–53.

Field, V., Gautret, P., Schlagenhauf, P., Burchard, G.D., Caumes, E., Jensenius, M., Castelli, F., Gkrania-Klotsas, E., Weld, L., Lopez-Velez, R., de Vries, P., von Sonnenburg, F., Loutan, L., Parola, P. (2010). Travel and Migration Associated Infectious Diseases Morbidity in Europe, 2008. BMC Infectious Diseases 10, 330.

Fletcher, S.M., Stark, D., Harkness, J., Ellis, J. (2012). Enteric Protozoa in the Developed World: A Public Health Perspective. Clinical Microbiology Reviews 25, 420–449.

Geurden, T., Geldhof, P., Levecke, B., Martens, C., Berkvens, D., Casaert, S., Vercruysse, J., Claerebout, E. (2008). Mixed Giardia Duodenalis Assemblage A and E Infections in Calves. International Journal for Parasitology 38, 259–264.

Giangaspero, A., Paoletti, B., Iorio, R., Traversa, D. (2005). Prevalence and Molecular Characterization of Giardia Duodenalis from Sheep in Central Italy. Parasitology Research 96, 32–37.

Di Giovanni, G.D., Betancourt W.Q., Hernandez, J., Assadian, N.W., Flores Margez J.P., Lopez, E.J. (2006). Investigation of Potential Zooanthroponotic Transmission of Cryptosporidiosis and Giardiasis through Agricultural Use of Reclaimed Wastewater. International Journal of Environmental Health Research 16, 405–418.

Grit, G.H., Van Coppernolle, S., Devriendt, B., Geurden, T., Dreesen, L., Hope, J., Vercruysse, J., Cox, E., Geldhof, P., Claerebout, E. (2014). Evaluation of Cellular and Humoral Systemic Immune Response against Giardia Duodenalis Infection in Cattle. Veterinary Parasitology 202, 145–155.

Grit, G.H., Devriendt, B., Van Coppernolle, S., Geurden, T., Hope, J., Vercruysse, J., Cox, E., Geldhof, P., Claerebout, E. (2014). Giardia Duodenalis Stimulates Partial Maturation of Bovine Dendritic Cells Associated with Altered Cytokine Secretion and Induction of T-Cell Proliferation. Parasite Immunology 36, 157–169.

Halliez, M.C.M., Buret, A.G., (2013). Extra-Intestinal and Long Term Consequences of Giardia Duodenalis Infections. World Journal of Gastroenterology 19, 8974–8985.

Hartsock, A., Nelson, W.J. (2009). Adherens and Tight Junctions: Structure, Function and Connections to the Actin Cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 1778, 660–669.

Hetsko, M.L., McCaffery J.M., Svard, S.G., Meng, T,-C., Que, X., Gillin, F.D. (1998). Cellular and Transcriptional Changes during Excystation of Giardia Lamblia in Vitro. Experimental Parasitology 88, 172–183.

Hsu, B.M., Wun, H.Y., Hsu, P.C. (2007). Prevalence and Genotyping of Giardia in Husbandry Systems in Taiwan. Parasitology Research 101, 275–280.

Ivanov, I.I., Zhou, L., Littman, D.R. (2007). Transcriptional regulation of Th17 cell differentiation. Seminars in Immunology 19, 409-417.

Jiménez, J.C., Fontaine, J., Creusy, C. (2014). Antibody and Cytokine Responses to Giardia Excretory/secretory Proteins in Giardia Intestinalis-Infected BALB/c Mice. Parasitology Research 113, 2709–18.

Johnston, A.R., Gillespie, T.R., Rwego, I.B., McLachlan, T.L., Kent, A.D., Goldberg, T.L. (2010). Molecular Epidemiology of Cross-Species Giardia Duodenalis Transmission in Western Uganda. PLoS Neglected Tropical Diseases 4, 9–13.

Kamda, J.D., Singer, S.M. (2009). Phosphoinositide 3-Kinase-Dependent Inhibition of Dendritic Cell Interleukin-12 Production by Giardia Lamblia. Infection and Immunity 77, 685–693.

Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V.K. (2009). IL-17 and Th17 Cells. Annual review of Immunology 27, 485–517.

Koudela, B., Vítovec, J. (1998). Experimental Giardiasis in Goat Kids. Veterinary Parasitology 74, 9–18.

Langford, T.D., Housley, M.P., Boes, M., Chen, J., Kagnoff, M.F., Gillin, F.D., Eckmann, L. (2002). Central Importance of Immunglobulin A in Host Defense against Giardia spp. Infection and Immunity 70, 11–18.

  31  

Lasek-Nesselquist, E., Welch, D.M., Sogin, M.L. (2010). The Identification of a New Giardia Duodenalis Assemblage in Marine Vertebrates and a Preliminary Analysis of G. Duodenalis Population Biology in Marine Systems. International Journal for Parasitology 40, 1063–1074.

Lee, H.Y., Hyung, S., Lee, N.Y., Yong, T.-S., Han, S.-H., Park, S.-J. (2012). Excretory-Secretory Products of Giardia Lamblia Induce Interleukin-8 Production in Human Colonic Cells via Activation of p38, ERK1/2, NF-κB and AP-1. Parasite Immunology 34, 183–198.

Li, E., Zhao, A., Shea-Donohue, T., Singer, S.M. (2007). Mast Cell-Mediated Changes in Smooth Muscle Contractility during Mouse Giardiasis. Infection and Immunity 75, 4514–4518.

Li, E., Zhou, P., Petrin, Z., Singer, S.M. (2004). Mast Cell-Dependent Control of Giardia Lamblia Infections in Mice. Infection and Immunity 72, 6642–6649.

Luján, H.D, Mowatt, M.R., Byrd, L.G., Nash, T.E. (1996). Cholesterol Starvation Induces Differentiation of the Intestinal Parasite Giardia Lamblia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 7628–7633.

Maddox-Hyttel, C., Langkjær, R.B., Enemark, H.L., Vigre, H. (2006). Cryptosporidium and Giardia in Different Age Groups of Danish Cattle and Pigs-Occurrence and Management Associated Risk Factors. Veterinary Parasitology 141, 48–59.

Marangi, M., Berrilli, F., Otranto, D., Giangaspero, A. (2010). Genotyping of Giardia Duodenalis among Children and Dogs in a Closed Socially Deprived Community from Italy. Zoonoses and Public Health 57, 54-58.

Matowicka-Karna, J., Dymicka-Piekarska, V., Kemona, H. (2009). IFN-Gamma, IL-5, IL-6 and IgE in Patients Infected with Giardia Intestinalis. Folia Histochemica et Cytobiologica 47, 93–97.

Mohammed, S.R., Faubert, G.M. (1995). Purification of a Fraction of Giardia Lamblia Trophozoite Extract Associated with Disaccharidase Deficiencies in Immune Mongolian Gerbils (Meriones Unguiculatus). Parasite 2, 31–39.

Monis, P.T., Thompson, R.C.A. (2003). Cryptosporidium and Giardia-zoonoses: fact or fiction. Infection, Genetics and Evolution 3, 233-244.

Nash, T.E. (2002). Surface Antigenic Variation in Giardia Lamblia. Molecular Microbiology 45, 585–590.

North, M.J., Mottram, J.C., Coombs, G.H. (1990). Cysteine Proteinases of Parasitic Protozoa. Parasitology Today 6, 270–275.

O'Handley, R.M., Olson, M.E., Fraser, D., Adams, P., Thompson, R.C. (2000). Prevalence and genotypic characterisation of Giardia in diary calves from Western Australia and Western Canada. Veterinary Parasitology 90, 193-200.

O’Handley, R.M., Ceri, H., Anette, C., Olson, M.E. (2003). Passive Immunity and Serological Immune Response in Dairy Calves Associated with Natural Giardia Duodenalis Infections. Veterinary Parasitology 113, 89–98.

O’Handley, R.M., Olson, M.E., 2006, Giardiasis and Cryptosporidiosis in Ruminants. Veterinary Clinics of North America - Food Animal Practice 22, 623–643.

Obendorf, J., Viveros, P.R., Fehlings, M., Klotz, C., Aebischer, T., Ignatius, R. (2013). Increased Expression of CD25, CD83, and CD86, and Secretion of IL-12, IL-23, and IL-10 by Human Dendritic Cells Incubated in the Presence of Toll-like Receptor 2 Ligands and Giardia Duodenalis. Parasites & Vectors 6, 317.

Palmer, C.S., Traub, R.J., Robertson, I.D., Devlin, G., Rees, R., Thompson, R.C.A. (2008). Determining the Zoonotic Significance of Giardia and Cryptosporidium in Australian Dogs and Cats. Veterinary Parasitology 154, 142–147.

Panaro, M.A., Cianciulli, A., Mitolo, C.I., Acquafredda, A., Brandonisio, O., Cavallo, P. (2007). Caspase-Dependent Apoptosis of the HCT-8 Epithelial Cell Line Induced by the Parasite Giardia Intestinalis. FEMS Immunology and Medical Microbiology 51, 302–309.

Pappu, R., Rutz, S., Ouyang, W. (2012). Regulation of Epithelial Immunity by IL-17 Family Cytokines. Trends in Immunology 33, 343–349.

Parenti, D.M. (1989). Characterization of a Thiol Proteinase in Giardia Lamblia. The Journal of Infectious Diseases 160, 1076–1080.

Plutzer, J., Ongerth, J., Karanis, P. (2010). Giardia Taxonomy, Phylogeny and Epidemiology: Facts and Open Questions. International Journal of Hygiene and Environmental Health 213, 321–333.

Prucca, C.G., Slavin, I., Quiroga, R., Elias, E.V., Rivero, F.D., Saura, A., Carranza, P.G., Lujan, H.D. (2008). Antigenic Variation in Giardia Lamblia Is Regulated by RNA Interference. Nature 456, 750–754.

Prucca, C.G., Lujan, H.D. (2009). Antigenic Variation in Giardia Lamblia. Cellular Microbiology 11, 1706–1715.

  32  

Reiner, D.S., Shinnick, T.M., Ardeshir, F., Gillin, F.D. (1992). Encystation of Giardia Lamblia Leads to Expression of Antigens Recognized by Antibodies against Conserved Heat Shock Proteins. Infection and Immunity 60, 5312–5315.

Rendtorff, R C. (1954). The Experimental Transmission of Human Intestinal Protozoan Parasites. II. Giardia Lamblia Cysts given in Capsules. American journal of hygiene 59, 209–220.

Ringqvist, E., Avesson, L., Söderbom, F., Svärd, S.G. (2011). Transcriptional Changes in Giardia during Host-Parasite Interactions. International Journal for Parasitology 41, 277–285.

Robertson, L.J., Hanevik, K., Escobedo, A.A., Morch, K., Langeland, N. (2010). Giardiasis - Why Do the Symptoms Sometimes Never Stop? Trends in Parasitology 26, 75–82.

Roxström-Lindquist, K., Ringqvist, E., Palm, D., Svard, S. (2005). Giardia Lamblia -Induced Changes in Gene Expression in Differentiated Caco-2 Human Intestinal Epithelial Cells. Infection and Immunity 73, 8204-8208.

Ruiz, A., Foronda, P., Gonzalez, J.F., Guedes, A., Abreu-Acosta, N., Molina, J.M., Valladares, B. (2008). Occurrence and Genotype Characterization of Giardia Duodenalis in Goat Kids from the Canary Islands, Spain. Veterinary Parasitology 154,137–141.

Samuelson, J., Banerjee, S., Magnelli, P., Cui, J., Kelleher, D.J., Gilmore, R., Robbins, P.W. (2005). The diversity of dolichol-linked precursors to Asn-linked glycans likely results from secondary loss of sets of glycosyltransferases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 1548-1553.

Scott, K.G., Meddings, J.B., Kirk, D.R., Lees-Miller, S.P., Buret, A.G. (2002). Intestinal Infection with Giardia Spp. Reduces Epithelial Barrier Function in a Myosin Light Chain Kinase-Dependent Fashion. Gastroenterology 123, 1179–1190.

Scott, K.G.-E., Yu, L.C.H., Buret, A.G. (2004). Role of CD8+ and CD4+ T Lymphocytes in Jejunal Mucosal Injury during Murine Giardiasis. Infection and Immunity 72, 3536–3542.

Shant, J., Bhattacharyya, S., Ghosh, S., Ganguly, N.N., Majumdar, S. (2002). A Potentially Important Excretory-Secretory Product of Giardia Lamblia. Experimental Parasitology 102, 178–186.

Singer, S.M., Nash, T.E. (2000). T-Cell-Dependent Control of Acute Giardia Lamblia Infections in Mice. Infection and Immunity 68, 170–175.

Slavin, I., Saura, A., Carranza, P.G., Touz, M.C., Nores, M.J., Lujan, H.D. (2002). Dephosphorylation of Cyst Wall Proteins by a Secreted Lysosomal Acid Phosphatase Is Essential for Excystation of Giardia Lamblia. Molecular and Biochemical Parasitology 122, 95–98.

Slee, E.A., Harte, M.T., Kluck, R.M., Wolf, B.B., Casiano, C.A., Newmeyer, D.D., Wang, H.-G., Reed, J.C., Nickolson, D.W., Alnemri, E.S., Green, D.R., Martin, S.J. (1999). Ordering the Cytochrome c-initiated Caspase Cascade: Hierarchical Activation of Caspases-2,-3,-6,-7,-8, and -10 in a Caspase-9-dependent Manner. The Journal of Cell Biology 144, 281–292.

Solarczyk, P., Majewska, A.C. (2010). A Survey of the Prevalence and Genotypes of Giardia Duodenalis Infecting Household and Sheltered Dogs. Parasitology Research 106, 1015–1019.

Sprong, H., Cacciò, S.M., Van Der Giessen, J.W.B. (2009). Identification of Zoonotic Genotypes of Giardia Duodenalis. PLoS Neglected Tropical Diseases 3, 1–12.

Stevenson, B.R., Heintzelman, M.B., Anderson, J.M., Citi, S., Mooseker, M.S. (1989). ZO-1 and Cingulin: Tight Junction Proteins with Distinct Identities and Localizations. The American Journal of Physiology 257, C621–628.

Svärd, S.G., Hagblom, P., Palm, J.E. (2003). Giardia Lamblia -- a Model Organism for Eukaryotic Cell Differentiation. FEMS microbiology letters 218, 3–7.

Sweeny, J.P., Robertson, I.D., Ryan, U.M., Jacobson, C., Woodgate, R.G. (2011). Comparison of Molecular and McMaster Microscopy Techniques to Confirm the Presence of Naturally Acquired Strongylid Nematode Infections in Sheep. Molecular and Biochemical Parasitology 180, 62–67.

Taminelli, V., Eckert, J., Sydler, T., Gottstein, B., Corboz, L., Hofmann, M. (1989). Experimental Infection of Calves and Sheep with Bovine Giardia Isolates. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde 131, 551–564.

Tangtrongsup, S., Scorza, V. (2010). Update on the Diagnosis and Management of Giardia Spp Infections in Dogs and Cats. Topics in Companion Animal Medicine 25, 155–162.

Touz, M.C., Ropolo, A.S., Rivero, M.R., Vranych, C.V., Conrad, J.T., Svard, S.G., Nash, T.E. (2009). Arginine Deiminase Plays Multiple Regulatory Roles in the Biology of Giardia Lamblia. 121, 2930–2938.

Traub, R.J., Inpankaew, T., Reid, S.A., Sutthikornchai, C., Sukthana, Y., Robertson, I.D., Thompson, R.C.A. (2009). Transmission Cycles of Giardia Duodenalis in Dogs and Humans in Temple Communities in Bangkok-A Critical Evaluation of Its Prevalence Using Three Diagnostic Tests in the Field in the Absence of a Gold Standard. Acta Tropica 111, 125–132.

  33  

Troeger, H., Epple, H.J., Schneider, T., Wahnschaffe, U., Ullrich, R., Burchard, G.D., Jelinek, T., Zeitz, M., Fromm, M., Schulzke, J.D. (2007). Effect of Chronic Giardia Lamblia Infection on Epithelial Transport and Barrier Function in Human Duodenum. Gut 56, 328–335.

Trout, J.M., Santín, M., Fayer, R. (2007). Prevalence of Giardia Duodenalis Genotypes in Adult Dairy Cows. Veterinary Parasitology 147, 205–209.

Trout, J.M., Santín, M., Fayer, R., Greiner, E. (2004). Prevalence of Giardia Duodenalis Genotypes in Pre-Weaned Dairy Calves. Veterinary Parasitology 124, 179–186.

Trout, J.M., Santín, M., Fayer, R., Greiner, E. (2005). Prevalence and Genotypes of Giardia Duodenalis in Post-Weaned Dairy Calves. Veterinary Parasitology 130, 177–183.

Trout, J.M., Santín, M., Fayer, R., Greiner, E. (2006). Prevalence and Genotypes of Giardia Duodenalis in 1-2 Year Old Dairy Cattle. Veterinary Parasitology 140, 217–222.

Van de Veerdonk, F.L., Gresnigt, M.S., Kullberg, B.J., Van der Meer, J.W.M., Joosten, L.A.B., Netea, M.G. (2009). Th17 Responses and Host Defense against Microorganisms: An Overview. BMB Reports 42, 776–787.

Ventura, L.L., Oliveira, D.R., Viana, J.C., Santos, J.F., Caliari, M.V., Gomes, M.A. (2013). Impact of Protein Malnutrition on Histological Parameters of Experimentally Infected Animals with Giardia Lamblia. Experimental Parasitology 133, 391–395.

Veronesi, F., Passamonti, F., Caccio, S., Diaferia, M., Fioretti, D.P. (2010). Epidemiological Survey on Equine Cryptosporidium and Giardia Infections in Italy and Molecular Characterization of Isolates. Zoonoses and Public Health 57, 510–517.

Waite, J.C., Skokos, D. (2012). Th17 Response and Inflammatory Autoimmune Diseases. International Journal of Inflammation 2012.

Ward, W., Alvarado, L., Rawlings, N.D., Engel, J.C., Franklin, C., McKerrow, J.H. (1997). A Primitive Enzyme for a Primitive Cell: The Protease Required for Excystation of Giardia. Cell 89, 437–444.

Feng, Y., Xiae, L. (2011). Zoonotic Potential and Molecular Epidemiology of Giardia Species and Giardiasis. Clinical Microbiology Reviews 24, 110-140

Yanke, S.J., Ceri, H., McAllister, T.A., Morck, D.W., Olson, M.E. (1998). Serum Immune Response to Giardia Duodenalis in Experimentally Infected Lambs. Veterinary Parasitology 75, 9–19.