impact de l’ajout de polysaccharides dans des matrices
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Impact de l’ajout de polysaccharides dans des
matrices laitières gélifiées acides sur la digestion
gastro-intestinale des protéines et des réponses
métaboliques associées
Thèse
Laure Rinaldi
Doctorat en Sciences et technologie des aliments -
Philosophiae Doctor (PhD)
Québec, Canada
© Laure Rinaldi, 2013
iii
Résumé
Les nutriments des matrices alimentaires doivent être bioaccessibles puis biodisponibles
pour atteindre les organes vitaux et être métabolisés. Les protéines laitières (caséines et
protéines de lactosérum) ont une valeur nutritionnelle importante par leur composition en
acides aminés (AA) essentiels et en acides aminés branchés qui ont un impact sur plusieurs
réponses métaboliques postprandiales. Ces protéines ont aussi un rôle technologique
essentiel dans le processus de fabrication des yogourts. Des polysaccharides (PS) peuvent
être ajoutés dans les yogourts pour les stabiliser. Des études précédentes ont montré que des
amidons, des pectines (PS communs utilisés par les industriels laitiers) et des β-glucans
(stabilisants d‘intérêt comme fibre soluble) pouvaient moduler la digestion des protéines (in
vitro et in vivo) et certaines réponses métaboliques postprandiales. Un modèle de digestion
gastro-intestinale (GI) in vitro a été mis au point pour analyser la digestion des protéines
laitières de yogourts standardisés variant par leur composition en PS (sans PS, 0.75 %
d‘amidon, 0.4 % de β-glucan, 0.2 % de pectine). Les formulations ont montré des viscosités
différentes dans des conditions de cisaillement contrôlées représentant les conditions GI. La
bioaccessibilité des AA a été différente selon le PS ajouté et il n‘y avait pas de corrélation
avec la viscosité du yogourt. Une étude in vivo chez l‘animal réalisée avec les mêmes
yogourts a aussi montré un impact de l‘ajout de PS de nature différente sur la
biodisponibilité de certains AA et sur certaines réponses métaboliques. En particulier,
l‘ajout d‘amidon, par rapport au yogourt sans PS, a significativement diminué la vidange
gastrique et la concentration plasmatique de Phe, un AA associé à l‘incidence du diabète de
type 2. Quinze minutes après l‘ingestion du yogourt avec β-glucan, la glycémie a
significativement diminué et la clairance à l‘insuline a augmenté par rapport aux autres
yogourts. Ces résultats ont permis de mettre en évidence l‘intérêt d‘étudier l‘impact de la
composition de la matrice alimentaire sur son intégrité et sur la cinétique de libération des
nutriments azotés dans l‘appareil GI, et sur des réponses métaboliques associées pouvant ici
être bénéfiques aux diabétiques.
v
Abstract
Nutrients of food matrixes have to be bioaccessible and bioavailable to reach vital organs
and be metabolized. Dairy proteins (caseins and whey proteins) possess an important
nutritional value because of their high content in essential and branched amino acids (AA)
affecting postprandial metabolic responses. These proteins have an essential technical
function in yogurt process. Polysaccharides (PS) can be added in yogurts as stabilizers.
Previous studies showed that starches, pectins (common PS used by the dairy industry), and
β-glucans (stabilizers of interest as soluble fiber) modulated protein digestion (in vitro and
in vivo) and postprandial metabolic responses. An in vitro gastrointestinal (GI) model was
developed to analyze protein digestion in standardized dairy products with different PS
composition (without PS, starch 0.75%, β-glucan 0.4%, pectin 0.2%). The formulations
showed different viscosities under controlled shear representative to GI conditions. AA
bioaccessibility was different depending on the added PS but was not related to the yogurt
viscosity. The in vivo study, realised with animal model, using the same yogurts showed
different impact of added PS on AA bioavailability and on metabolic responses. In
particular, in comparison to the control yogurt the starch supplementation decreased
significantly the gastric emptying and the plasmatic Phe concentration, an AA associated
with incidence of type 2 diabetes. Fifteen minutes after yogurt with β-glucan consumption,
glycemia decreased significantly and insulin clairance increased in comparison to other
yogurts. These results show the interest to study the impact of food matrix composition on
matrix integrity and on release kinetics of nitrogenous nutrients in GI tractus, and on
associated metabolic responses here beneficial for diabetic subjects.
vii
Parce que « La vie ne réside pas dans les
molécules mais dans les liens qui les
unissent » dixit Linus Pauling, cette thèse est
pour tous ceux qui croient en l’importance
des liens entre les gens
ix
Remerciements
Tout d‘abord je souhaiterai remercier ma directrice, Sylvie Turgeon, pour m‘avoir acceptée
dans son équipe de recherche et m‘avoir fait confiance en m‘accordant de travailler sur mon
projet de doctorat. Je la remercie de son support et ses encouragements pendant quatre ans,
et surtout je la remercie de son écoute. Elle m‘a appris à devenir une chercheure, et en
particulier à toujours remettre les choses dans leur contexte. Je lui dois en particulier
l‘aptitude du travail de dernière minute fait de façon efficace en gardant un fort esprit
critique. Enfin l‘optimisme de ma directrice m‘a aidée à affronter les moments difficiles de
ce doctorat.
Je remercie mon co-directeur, Michel Britten, pour son soutien et ses commentaires
toujours très pertinents. Le fait de ne pas se voir souvent et de faire des comptes-rendus de
longue date ont permis d‘apporter un regard quasi-extérieur à ce projet avec une expertise
de qualité. Je le remercie grandement pour les nombreux échanges de courriels durant le
dernier été. D‘autres remerciements vont à Sylvie Gauthier. Je souhaite la remercier pour
m‘avoir initiée à la recherche quelques mois avant mon doctorat et de m‘avoir soutenue
pour commencer cette belle aventure d‘étudiante au doctorat. Je la remercie aussi pour
m‘avoir fortement conseillée avec sa grande expertise de l‘hydrolyse protéique tout au long
du projet et d‘avoir fait la pré-lecture de cette thèse. L‗écoute et le temps qu‘elle a pris pour
me permettre d‘avancer ce projet en bonne réflexion ont aussi été précieux.
Je voudrai aussi remercier les professionnels de recherche de l‘INAF, et en particulier
Diane Gagnon, Ronan Corcuff, et Alain Gaudreau. L‘aide de Diane au laboratoire, ainsi
que ses trouvailles mises au point pour résoudre des petits problèmes mécaniques qui font
arrêter une expérimentation ont toujours été appréciées. Je la remercie aussi pour les
discussions à 7h30 du matin lorsque j‘étais seule au laboratoire, et bien sûr merci pour les
échanges culinaires.
Je tiens à remercier l‘équipe d‘André Marette de l‘Hôpital Laval, sans qui l‘étude in vivo de
ce projet n‘aurait pas pu avoir lieu. Je remercie en particulier Geneviève Pilon pour avoir
x
orchestré ce projet animal avec les différents techniciens et professionnels de recherche
Patricia Pelletier, Bruno Marcotte, et Philippe St-Pierre.
Je dis un grand merci à mon équipe de recherche. Le retour de Laurie-Ève Rioux dans cette
équipe m‘a permis d‘enrichir mes réflexions sur le déroulement des tâches afin de terminer
le projet. Je remercie aussi Laurie-Ève pour ses conseils d‘écriture, statistiques, etc. Bien
sûr je n‘oublie pas les autres, et en particulier Karen Vallverdu-Spitz pour sa bonne humeur
au laboratoire et d‘avoir été mon amie dès mon arrivée à Québec.
Je terminerai par remercier ma famille et mes amis. Mes parents qui ont toujours été là pour
m‘écouter et m‘encourager, merci. Je dis un merci spécial à mon (jeune) frère Nicolas pour
tous les échanges outre-Atlantique à parler de tout et de rien, et de s‘être intéressé à ma vie
Québécoise personnelle et professionnelle pendant ces quatre ans. Béatrice, Bertrand,
Camille, Jean-Loup, Jérémie, Maïa, Maxime, Nellie, Samir, Samuel, Sophie et Virginie je
vous remercie pour les bons moments passés hors du labo à s‘amuser, rigoler mais aussi
pour vos conseils et votre écoute. Je remercie, mes amis connus en France qui ont su
m‘écouter et me soutenir même en étant à 5 000 km ou plus de moi.
xi
Avant-Propos
Les travaux de cette thèse ont fait partie d‘un projet de recherche financé par le Fonds
Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT), Novalait Inc., le
Ministère de l‘Agriculture, des Pêcheries et de l‘Alimentation du Québec (MAPAQ), et
Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC).
Cette thèse a été rédigée sous forme d‘articles scientifiques. Le premier chapitre, intitulé
« Revue de littérature », est une revue de la composition et des propriétés nutritionnelles du
lait, des caractéristiques structurales et nutritionnelles de certains polysaccharides (PS), de
la transformation du lait en produits gélifiés acides, et de l‘importance de l‘étude de la
matrice alimentaire lors de la digestion gastro-intestinale (GI) des protéines laitières in vitro
et in vivo.
Le deuxième chapitre, intitulé « In vitro gastrointestinal digestion of liquid and semi-liquid
dairy matrixes », est un article qui sera soumis au journal Food digestion. Ce chapitre porte
sur la mise au point d‘un modèle de digestion GI pour suivre la digestion des protéines de
matrices laitières liquides et semi-liquides. J‘ai contribué à ce travail en réalisant toutes les
manipulations au laboratoire et en rédigeant entièrement l‘article. Sylvie Turgeon, Michel
Britten, et Sylvie Gauthier ont apporté leur soutien scientifique dans les décisions
expérimentales et lors de la rédaction de l‘article.
Le troisième chapitre, « In vitro bioaccessibility of peptides and amino acids from yogurt
made with starch, pectin, or β-glucan», est un article qui sera soumis à The Journal of
Nutrition. Ce chapitre porte sur la digestion GI in vitro des protéines de yogourts
contenants différents stabilisants (PS). J‘ai contribué à ce travail en réalisant la majorité des
manipulations (production des yogourts, digestions, analyses des produits de digestion) au
laboratoire et en rédigeant entièrement l‘article. Une partie de la production des yogourts et
les digestions correspondantes ont été réalisées par Émilie Turcotte, stagiaire au
baccalauréat que j‘ai encadrée pendant 6 mois. Sylvie Turgeon et Michel Britten ont
apporté leur soutien scientifique dans les décisions expérimentales et lors de la rédaction de
l‘article.
xii
Le quatrième chapitre, intitulé «Use of polysaccharides in yogurt formulation: impact on
glycemia, insulinemia, incretin secretion, and free amino acids in rats», est un article qui
sera soumis à The Journal of Nutrition. Ce chapitre porte sur l‘impact de la composition en
PS de yogourts sur la biodisponibilité des acides aminés et les réponses métaboliques
associées. Le gavage des rats a été fait par l‘équipe d‘André Marette au CRCHUQ, centre
de recherche du centre hospitalier universitaire de Québec (Québec, Canada). Sous la
supervision et avec l‘aide de Patricia Pelletier, j‘ai effectué les dosages d‘insuline et du C-
peptide. Les dosages d‘incrétines ont été effectués par Bruno Marcotte, technicien de
l‘équipe d‘André Marette. Avec les conseils de Philippe St-Pierre pour l‘utilisation du
logiciel de statistiques Sigma-Plot, j‘ai opéré cette partie analytique du 4ème
chapitre. Sylvie
Turgeon, Michel Britten, Geneviève Pilon, Philippe St-Pierre et André Marette ont apporté
leur soutien scientifique dans les décisions expérimentales et lors de la rédaction de
l‘article.
xiii
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. iii Abstract ................................................................................................................................... v Remerciements ....................................................................................................................... ix
Avant-Propos ......................................................................................................................... xi Table des matières .............................................................................................................. xiii Liste des tableaux ............................................................................................................... xvii Liste des figures ................................................................................................................... xix Liste des abréviations ........................................................................................................... xxi
Introduction générale .............................................................................................................. 1 Chapitre I : Revue de littérature .............................................................................................. 5
1.1 Le lait ...................................................................................................................... 6
1.1.1 La composition du lait ........................................................................................ 6 1.1.2 Les protéines du lait ............................................................................................ 6
1.1.2.1 Les caséines ................................................................................................ 6 1.1.2.2 Les protéines du lactosérum ..................................................................... 10
1.1.3 Le lait, ingrédient d‘aliments de structures variées .......................................... 12 1.1.4 L‘impact de la composition et de l‘organisation structurale des nutriments du
lait et des produits laitiers sur leurs propriétés nutritionnelles ..................................... 13 1.1.5 Les peptides bioactifs et les acides aminés marqueurs de réponses
métaboliques du lait et des produits laitiers .................................................................. 14
1.2 Le yogourt ............................................................................................................. 15 1.2.1 La préparation des gels acides .......................................................................... 15
1.2.1.1 La standardisation de la préparation laitière ............................................. 17 1.2.1.2 L‘homogénéisation de la préparation laitière ........................................... 17
1.2.1.3 Le traitement thermique ............................................................................ 18 1.2.1.4 La fermentation lactique ........................................................................... 18
1.2.1.5 Le conditionnement et le stockage ............................................................ 19 1.2.2 Les propriétés rhéologiques des gels ................................................................ 19 1.2.3 Les facteurs influençant les propriétés rhéologiques des yogourts ................... 20
1.2.3.1 Les caractéristiques du mélange laitier ..................................................... 20 1.2.3.2 L‘influence des procédés de fabrication ................................................... 21 1.2.3.3 Les agents stabilisants utilisés dans les yogourts ...................................... 22
1.3 Les polysaccharides .............................................................................................. 22 1.3.1 Les caractéristiques structurales et physico-chimiques de l‘amidon, de la
pectine et du β-glucan ................................................................................................... 23 1.3.1.1 L‘amidon ................................................................................................... 23 1.3.1.2 La pectine .................................................................................................. 26 1.3.1.3 Le β-glucan ............................................................................................... 28
1.3.2 L‘impact nutritionnel de l‘amidon, de la pectine et du β-glucan ...................... 30
1.3.2.1 L‘amidon ................................................................................................... 30 1.3.2.2 La pectine .................................................................................................. 31 1.3.2.3 Le β-glucan ............................................................................................... 32
1.4 La digestion gastro-intestinale .............................................................................. 33
xiv
1.4.1 Les caractéristiques mécaniques et sécrétrices de la digestion gastro-intestinale
34
1.4.1.1 Les caractéristiques de la digestion buccale ............................................. 34 1.4.1.2 Les caractéristiques de la digestion gastrique .......................................... 35 1.4.1.3 Les caractéristiques de la digestion intestinale ........................................ 37
1.4.2 La digestion enzymatique des nutriments essentiels ........................................ 38 1.4.2.1 La digestion enzymatique des glucides .................................................... 38
1.4.2.2 La digestion enzymatique des lipides ....................................................... 39 1.4.2.3 La digestion enzymatique des protéines ................................................... 39
1.4.3 L‘absorption des produits de digestion des nutriments essentiels .................... 40 1.4.3.1 L‘absorption des monosaccharides .......................................................... 40 1.4.3.2 L‘absorption des acides gras .................................................................... 41
1.4.3.3 L‘absorption des tri/di-peptides et des acides aminés .............................. 41 1.4.4 L‘importance de l‘étude de la digestion protéique ........................................... 41 1.4.5 L‘impact de la microstructure de l‘aliment et de la matrice alimentaire sur la
bioaccessibilité et la biodisponibilité des nutriments ................................................... 43
1.4.5.1 L‘impact de la microstructure de l‘aliment .............................................. 43 1.4.5.2 L‘impact de la matrice alimentaire ........................................................... 44
1.4.6 L‘impact de la structure physico-chimique des nutriments et des procédés
technologiques lors du processus de fabrication des aliments sur la bioaccessibilité et
la biodisponibilité des nutriments ................................................................................ 45
1.4.6.1 L‘impact de la structure physico-chimique des nutriments ..................... 45 1.4.6.2 L‘impact des procédés technologiques .................................................... 46
1.4.7 La digestion in vitro des protéines ................................................................... 47
1.5 Les réponses métaboliques suite à la digestion gastro-intestinale ....................... 50
1.5.1 La réponse glycémique ..................................................................................... 50 1.5.2 La réponse insulinémique ................................................................................. 51
1.5.3 La production de C-peptide .............................................................................. 56 1.5.4 La production de glucagon ............................................................................... 56 1.5.5 La production des incrétines ............................................................................ 58
1.5.5.1 Le glucose-dependant insulinotropic polypeptide (GIP) ......................... 59 1.5.5.2 Le glucagon-like peptide 1 (GLP1) .......................................................... 60
1.5.5.3 La ghréline ................................................................................................ 62 1.5.5.4 Le peptide tyrosine-tyrosine (PYY) ......................................................... 64 1.5.5.5 Le polypeptide pancréatique (PP) ............................................................ 66
Hypothèse et objectifs .......................................................................................................... 69
Chapitre II : In vitro gastrointestinal digestion of liquid and semi-liquid dairy matrixes .... 71 2.1 Résumé ................................................................................................................. 72 2.2 Abstract ................................................................................................................ 73
2.3 Introduction .......................................................................................................... 74 2.4 Materials and methods ......................................................................................... 76
2.4.1 Reagents and enzymes ..................................................................................... 76 2.4.2 Commercial milks and yogurt .......................................................................... 77 2.4.3 In vitro GI digestion ......................................................................................... 77
2.4.4 Chemical analysis ............................................................................................. 81 2.4.5 Statistical analysis ............................................................................................ 82
2.5 Results and discussion .......................................................................................... 83
xv
2.5.1 Soluble proteins during in vitro GI digestion of dairy matrixes ....................... 83
2.5.2 Protein profiles during in vitro GI digestion of dairy matrixes ........................ 85
2.5.3 Free amino acids release during in vitro GI digestion of dairy matrixes .......... 89 2.6 Conclusion ............................................................................................................ 92 2.7 Acknowledgement ................................................................................................ 92
Chapitre III : In vitro bioaccessibility of peptides and amino acids from yogurt made with
starch, pectin, or β-glucan ..................................................................................................... 93
3.1 Résumé .................................................................................................................. 94 3.2 Abstract ................................................................................................................. 95 3.3 Introduction ........................................................................................................... 96 3.4 Materials and methods .......................................................................................... 98
3.4.1 Reagents, chemicals and enzymes .................................................................... 98
3.4.2 Powders for yogurt manufacturing ................................................................... 98 3.4.3 Preparation of yogurts ....................................................................................... 99 3.4.4 Yogurt viscosity determination ....................................................................... 100
3.4.5 In vitro GI digestion model ............................................................................. 100
3.4.6 Total soluble protein content of digested samples .......................................... 101 3.4.7 Characterization of soluble protein profile of yogurts and digested samples
using SDS-PAGE ........................................................................................................ 101 3.4.8 Peptide analysis of digested samples using RP-HPLC/MS ............................ 101 3.4.9 Free amino acids analysis of digested samples using GC/FID ....................... 103
3.4.10 Statistical analysis ....................................................................................... 103 3.5 Results ................................................................................................................. 103
3.5.1 Viscosity of yogurts with different PS ............................................................ 103
3.5.2 Soluble protein and peptide content after in vitro GI digestion of yogurts .... 104
3.5.3 Soluble protein and peptide profiles after in vitro GI digestion of yogurts ... 106 3.5.4 Bioaccessible peptides from digested yogurts ................................................ 108
3.5.5 Bioaccessible amino acids from digested yogurts .......................................... 110 3.6 Discussion ........................................................................................................... 111 3.7 Conclusion .......................................................................................................... 114
Chapitre IV : Use of polysaccharides in yogurt formulation: impact on glycemia,
insulinemia, incretin secretion, and free amino acids in rats .............................................. 117
4.1 Résumé ................................................................................................................ 118 4.2 Abstract ............................................................................................................... 119 4.3 Introduction ......................................................................................................... 120 4.4 Animal and methods ........................................................................................... 123
4.4.1 Animal ............................................................................................................ 123 4.4.2 Animal diets: yogurt preparation .................................................................... 124 4.4.3 Yogurt viscosity determination ....................................................................... 125
4.4.4 Experimental protocol of gavage .................................................................... 125 4.4.5 Insulinemia, C-peptide .................................................................................... 126 4.4.6 GIP, PYY ........................................................................................................ 126 4.4.7 Amino acids analysis using GC/FID .............................................................. 126 4.4.8 Calculation and statistical analysis ................................................................. 126
4.5 Results ................................................................................................................. 127 4.5.1 Viscosity of yogurts with different polysaccharides ....................................... 127 4.5.2 Stomach content weight .................................................................................. 128
xvi
4.5.3 Effect of yogurts consumption with different polysaccharides on glucose
tolerance ..................................................................................................................... 128
4.5.4 C-peptide and insulin clearance ..................................................................... 130 4.5.5 GIP, PYY ....................................................................................................... 130 4.5.6 Postprandial plasma amino acids ................................................................... 132
4.6 Discussion .......................................................................................................... 134 4.7 Conclusion .......................................................................................................... 137
Conclusion générale ........................................................................................................... 139 Bibliographie ...................................................................................................................... 145 Annexe 1 : FAA (mg) per g of initial protein at the end of in vitro GI digestion of control
yogurt, yogurts with starch, with β-glucan, and with pectin. ............................................. 169 Annexe 2 : AUC for the 0 – 180 min and 0 – 60 min recovery periods of glucose, insulin,
and C-peptide in plasma. .................................................................................................... 170 Annexe 3 : AUC for the 0 – 120 min recovery period of a) total FAA, b) BCAA, and c) Ala
in plasma. ........................................................................................................................... 171
xvii
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Caractéristiques physico-chimiques des caséines αs1, αs2, β et κ (Debry, 2005).
........................................................................................................................................ 7 Tableau 1.2. Nombre d‘acides aminés dans les différentes caséines et les protéines sériques
majoritaires (* = acides aminés essentiels, Debry, 2005). .............................................. 9 Table 2.1. Constituents and their final concentration
1 in the various synthetic juices used
in the in vitro GI digestion model (adapted from Versantvoort et al., 2005). .............. 79 Table 2.2. Experimental conditions used in the in vitro GI digestion model for milks and
yogurt. ........................................................................................................................... 80 Table 2.3. FAA in dairy matrixes at the end of buccal, gastric and duodenal phases of the
in vitro GI digestion. ..................................................................................................... 90 Table 4.1. Composition of yogurts without stabilizers (control), with starch 0.75 %, pectin
0.2 %, and β-glucan 0.4 %. ......................................................................................... 125
Table 4.2. FAA (fold over basal time, 0 min) 15 min, 30 min, 60 min, and 120 min after
the gavage with different yogurts. .............................................................................. 133
xix
Liste des figures
Figure 1.1. Représentation schématique a) des sous-micelles et b) des micelles de caséines
(Horne, 2006). ................................................................................................................. 8 Figure 1.2. Représentation 3D de la structure moléculaire d‘un monomère de β-
lactoglobuline (Brownlow et al., 1997). ....................................................................... 10 Figure 1.3. Structure secondaire de l‘α-lactalbumine montrant la localisation des ions métal
(Chrysina et al., 2000). .................................................................................................. 11 Figure 1.4. Structures laitières diverses obtenues à partir du lait (Aguilera, 2006). ............ 12 Figure 1.5. Schéma des différentes étapes de fabrication de yogourts fermes et de yogourts
brassés (Tamine and Robinson, 1985). ......................................................................... 16
Figure 1.6. Représentation d‘une molécule d‘amylopectine (Royal Society of Chemistry,
2004). ............................................................................................................................ 24 Figure 1.7. Structure schématique des pectines simples (galacturonane) et complexes
(rhamnogalacturonane)(Seymour and Knox, 2002). .................................................... 27 Figure 1.8. Résidus d‘acide D-galacturoniques formant la chaîne basique des pectines. Des
groupements méthyles peuvent être présents en O-2 et O-3 selon la source de la
pectine (Seymour and Knox, 2002). ............................................................................. 28 Figure 1.9. Représentation d‘une partie de polymère β-D-glucan. (Dais and Perlin, 1982).
...................................................................................................................................... 29 Figure 1.10. Anatomie du système digestif (Widmaier et al., 2011). .................................. 34
Figure 1.11. Représentation schématique de la conformation tridimensionnelle de la
molécule du peptide insuline (Saltiel and Pessin, 2007). ............................................. 53
Figure 1.12. Schéma des voies de signalisation impliquant mTOR dans la régulation de la
synthèse des protéines (Wang and Proud, 2006). ......................................................... 55
Figure 1.13. Principaux peptides hormonaux sécrétés par le tractus GI et impliqués dans la
régulation de la prise alimentaire (Cummings and Overduin, 2007). ........................... 59 Figure 2.1. Soluble proteins (%) in digested matrixes after buccal, gastric and duodenal
phases of in vitro GI digestion ...................................................................................... 83 Figure 2.2. SDS-PAGE analysis of undigested (Ctl) and digested matrixes during buccal,
gastric and duodenal phases of in vitro GI digestion. ................................................... 86 Figure 2.3. FAA (%) pooled in different classes based on their characteristics (acid, basic,
neutral, hydrophobic) in digested matrixes at the end (60 min) of the duodenal phase
of in vitro GI digestion.. ................................................................................................ 91 Figure 3.1. Effect of shear rate on the viscosity of control yogurt, yogurt with starch, with
β-glucan, and with pectin. ........................................................................................... 104 Figure 3.2. Soluble proteins (%) in digested matrixes after buccal, gastric and duodenal
phases of in vitro GI digestion of control yogurt, yogurt with starch, with β-glucan,
and with pectin.. .......................................................................................................... 105
Figure 3.3. SDS-PAGE analysis of undigested matrixes (control yogurt (Ctl), yogurt with
starch, yogurt with β-glucan, and yogurt with pectin). ............................................... 106 Figure 3.4. SDS-PAGE analysis of digested matrixes during buccal (B2), gastric (5 min:
G5, 15 min: G15, 30 min: G30, 60 min: G60) and duodenal (D60) phases of in vitro
GI digestion.. ............................................................................................................... 107
xx
Figure 3.5. Estimated quantity of peptides (MS chromatogram area - %) pooled in
different classes based on their molecular masses at the end of a) gastric digestion, and
b) duodenal digestion, of in vitro GI digestion. ......................................................... 109 Figure 3.6. Total FAA content (mg) per g of initial protein content in yogurt after a) gastric
digestion, and b) duodenal digestion. ......................................................................... 110 Figure 4.1. Viscosity of control yogurt, yogurts with starch, with β-glucan, or with pectin.
.................................................................................................................................... 127
Figure 4.2. Stomach content weight (% ingested yogurt) at the end of the procedure (180
min) with control yogurt (n = 12), yogurts with starch (n = 9), with β-glucan (n = 14),
and with pectin (n = 11).. ........................................................................................... 128 Figure 4.3. Plasma a) glucose concentration (mmol/L), b) insulin concentration (pmol/L),
and c) C-peptide concentration (pmol/L) as a function of time after gavage with
control yogurt (n = 10), starch (n = 13), β-glucan (n = 10), or pectin (n = 10). ......... 129 Figure 4.4. a) GIP and b) PYY in plasma (fold over basal time, 0 min) 15 min, and 30 min
after the gavage of the different yogurts. ................................................................... 131
xxi
Liste des abréviations
α-La α-lactalbumine/ α-lactalbumin
β-Lg β-lactoglobuline/ β-lactoglobulin
α -Cn α -caséine/ α -casein
ARNm acide ribonucléique messager/ribonucleic acid messenger
ATP ade(é)nosine triphosphate
°C degré Celcius/celsius degree
AA acides aminés/amino acids
AUC aire sous la courbe/area under the curve
BCA bicinchoninic acid
BCAA acides aminés branchés/branched-chain amino acids
Blk blanc/blank
BSA albumine sérique bovine/Bovine serum albumin
CVD centre vagale dorsale/center vagal dorsal
Ctl contrôle/control
Da Dalton
GI gastro-intestinal/gastrointestinal
GIP peptide insulinotrope glucodépendant/glucodependent insulinotropic peptide
GLP1 glucagon-like peptide 1
HM hautement méthylée/hight methylated
Ig immunoglobuline
LM faiblement méthylée/low methylated
mTOR cible de la rapamycine chez les mammifères/mammalian target of rapamycin
MW masse moléculaire/molecular weight
N azote/nitrogen
OGTT test de tolérance au glucose oral/oral glucose tolerance test
PAGE électrophorèse sur gel de polyacrilamide/polyacrylamide gel electrophoresis
PL protéines du lactosérum
PP polypeptide pancréatique/pancreatic polypeptide
PYY peptide tyrosine-tyrosine
pI point isoélectrique/isoelectric point
xxii
PI3K phosphatidylinositol-3-kinase
PKB protéine kinase B/Kinase protein B
PS polysaccharides
RM mesures répétées/repeated measures
rpm rotation par minute/rotation per minute
SDS sulfate de sodium dodécyle/sodium dodecyl sulfate
Std standard
T2DM diabète de type 2 mellitus/type 2 diabetes mellitus
UHT ultra haute température/ultra-high temperature
Code des acides aminés
Acide aspartique Asp
Acide glutamique Glu
Alanine Ala
Arginine Arg
Asparagine Asn
Cystéine Cys
Glutamine Gln
Glycine Gly
Histidine His
Isoleucine Ile
Leucine Leu
Lysine Lys
Méthionine Met
Phénylalanine Phe
Proline Pro
Sérine Ser
Thréonine Thr
Tryptophane Trp
Tyrosine Tyr
Valine Val
1
Introduction générale
Les aliments sont la source des nutriments essentiels au maintien de la santé chez l‘humain.
Depuis plusieurs années, des aliments-santé sont développés par l‘ajout de molécules
bioactives à des aliments traditionnels, alors que très peu de travaux s‘intéressent à
l‘importance de l‘organisation moléculaire et structurale des nutriments dans les aliments
sur leurs propriétés santé. La plupart des aliments subissent des traitements industriels
variés pouvant influencer leur valeur nutritive.
Pour qu‘un aliment exerce son effet nutritionnel dans l‘organisme, il doit être libéré de
l‘aliment (bioaccessibilité), transporté à travers la membrane épithéliale de l‘intestin
(biodisponibilité), puis métabolisé par le foie ou autre organe cible (Versantvoort et al.,
2005). La bioaccessibilité, la biodisponibilité et la cinétique de disponibilité d‘un nutriment
varient grandement selon le type d‘aliment et ses constituants, de même que selon son
mode de préparation et son procédé de fabrication (Argov et al., 2008).
Le lait et les produits laitiers peuvent imager la relation entre la structure d‘un aliment et
son impact nutritionnel, car les caractéristiques structurales du lait et des produits laitiers
qui en dérivent influencent la digestion et l‘absorption des macronutriments (glucides,
protéines et lipides) (Aguilera, 2006). Cependant, la plupart des études nutritionnelles dans
la littérature considèrent les produits alimentaires comme des « boîtes noires », négligeant
l‘historique des procédés subis par les ingrédients/aliments. Par exemple, le yogourt, le
fromage, le lait ou autres produits laitiers sont considérés équivalents dans les guides
nutritionnels, alors que des variables de composition, de traitements et de procédés existent
pour chacun de ces produits et peuvent influencer la biodisponibilité de leurs nutriments et
les réponses métaboliques associées (Argov et al., 2008; Lacroix et al., 2008). Par exemple,
il a été démontré que les protéines du lait et les protéines de lactosérum seules diminuent la
concentration postprandiale de glucose sanguin par rapport à celle observée après la
consommation de certains aliments (sirop glucose, poisson), alors que seules les protéines
de lactosérum augmentent significativement l‘insulinémie (Nilsson et al., 2004).
2
Les procédés technologiques ont été jusqu‘à présent étudiés en vue de contrôler la stabilité
et les qualités sensorielles d‘un aliment. Ils doivent maintenant être pris en considération
pour les aspects santé des aliments : favoriser ou retarder la biodisponibilité de certains
nutriments serait souhaitable dans certaines situations, par exemple pour retarder
l‘apparition du glucose sanguin chez des individus atteints de diabètes de type 2. Le
traitement thermique du lait est une opération qui influence la digestion des protéines
laitières et donc module la vitesse d‘absorption des acides aminés (AA) (Lacroix et al.,
2008). Des absorptions différentes d‘AA (ex : les AA branchés) ont été reliées à des
concentrations différentes du glucose sanguin (Nilsson et al., 2007). D‘autre part, les
produits laitiers fermentés peuvent être stabilisés par l‘ajout de polysaccharides (PS). En
solution, il a été démontré que ces biopolymères pouvaient ralentir la digestion de protéines
laitières (Ou et al., 2001; Mouecoucou et al., 2003). Cependant, un tel effet n‘a pas encore
été clairement démontré dans un aliment. Il est donc important d‘évoluer vers la
compréhension du rôle de la matrice alimentaire sur l‘accessibilité des nutriments et sur les
réponses métaboliques postprandiales lors de la digestion gastro-intestinale (GI) des
aliments. En particulier, les matrices laitières gélifiées acides contenant différents PS
représentent un modèle d‘étude intéressant.
Le tractus GI est l‘organe contrôlant la digestion d‘un aliment, l‘adsorption des nutriments
et permettant leur disponibilité pour l‘organisme. Le processus de digestion implique une
série d‘évènements qui modifient la structure de la matrice alimentaire. La vitesse de
digestion de cette matrice dépendra du type et de la concentration des molécules la
constituant, de la nature des liens la stabilisant et de son accessibilité aux enzymes
digestives. Par exemple, pour la nature des protéines, les protéines de lactosérum sont
digérées plus rapidement que les caséines et ont été associées au sentiment de satiété
(Anderson et al., 2004; Luhovyy et al., 2007).
L‘objectif de cette thèse est de comprendre le lien entre l‘ajout de PS dans des produits
laitiers gélifiés acides, et les bioaccessibilité et biodisponibilité des nutriments azotés et
certaines réponses métaboliques associées. Ces travaux permettront d‘évaluer l‘impact
3
d‘ingrédients et de processus de fabrication sur la valeur nutritive de ces produits laitiers et
sur les réponses métaboliques postprandiales.
Chapitre I : Revue de littérature
6
1.1 Le lait
Le lait, composé d‘une grande diversité de nutriments, est le premier aliment consommé
par les nouveau-nés des mammifères. Il joue un rôle très important dans la survie de ces
espèces (Debry, 2005).
1.1.1 La composition du lait
Le lait est majoritairement composé d‘eau (87 g/100 mL). Les glucides représentent 4.9
g/100 mL et sont composés à 99.99 % de lactose, diholoside réducteur de glucose et
galactose. La matière grasse, 4.2 g/100 mL, est à 98 % représentée par des triglycérides, le
reste étant des phospholipides et des composés liposolubles tels que du cholestérol et des
vitamines. Les sources d‘azote (N) sont pour 94 % des protéines (3.2 g/100 mL) dont 80 %
de celles-ci sont des caséines. Le reste des protéines sont les protéines solubles du
lactosérum. L‘ N non protéique se retrouve sous forme d‘urée. Les minéraux ne sont
présents qu‘à 0.72 g/100 mL. Le potassium est le macronutriment le plus important en
quantité avec 0.15 g/100 mL de lait, puis le calcium (0.12 g/100 mL), le phosphore, le
sodium et le magnésium suivent en quantité décroissante. Nous trouvons aussi des micro-
éléments tels le zinc, le fer, le cuivre, etc.
1.1.2 Les protéines du lait
Les protéines du lait se composent de deux groupes : les caséines et les protéines du
lactosérum.
1.1.2.1 Les caséines
Les caséines sont les protéines majoritaires du lait. On distingue 5 formes de caséines :
caséine αs1, caséine αs2, caséine β, caséine κ et caséine γ, représentant 39 - 46 %, 8 - 11 %,
25 - 35 %, 8 - 15 %, 3 - 7 % des protéines du lait, respectivement. La caséine γ résulte de la
protéolyse de la caséine β par la plasmine, une enzyme protéolytique naturellement
présente dans le lait. Le tableau 1.1 présente les caractéristiques principales des caséines
αs1, αs2, β, et κ.
7
Tableau 1.1. Caractéristiques physico-chimiques des caséines αs1, αs2, β et κ (Debry, 2005).
Les caséines se présentent sous forme de micelles (figure 1.1), complexes organiques et
minérals très hydratés. L‘organisation structurale de la micelle fait encore l‘objet de
discussion, mais plusieurs auteurs s‘entendent sur l‘existence probable de sous-micelles
stabilisées par les caséines κ.
Caséine αs1 Caséine αs2 Caséine β Caséine κ
Nombre de résidus d’acides
aminés
199 207 209 169
Masse moléculaire (Da) 23 600 25 200 23 900 19 000
Résidus Cys 0 2 0 2
Groupements phosphorylés 8 10 13 5 1
Sensibilité au calcium ++ +++ + -
Résidus Pro 16 10 35 19
Glucides - - - +
Localisation dans la micelle centre Surface centre surface
% de la micelle 39 46 8 11 25 35 8 15
8
Figure 1.1. Représentation schématique a) des sous-micelles et b) des micelles de caséines
(Horne, 2006).
Sept pour cent de l‘extrait sec des micelles sont composés de sels, principalement du
phosphate de calcium. La composition en acides aminés (AA) des caséines est présentée au
tableau 1.2, les AA majoritaires sont Glu, Leu, Pro, Lys, Tyr, Gln, Ile, Val. Les
groupements acides libres des résidus Glu et Asp, étant en nombre supérieur aux
groupements basiques libres –NH2 des lysines et autres AA diaminés, les caséines ont un
point isoélectrique (pI) de 4.6. Les différentes caséines peuvent s‘associer à pH 7 pour
former, par exemple, des agrégats de caséines β et κ entre 20 et 30 unités liées par des
interactions hydrophobes. Les caséines κ et αs2 peuvent aussi former des polymères liés par
des liaisons disulfures intermoléculaires.
a) b)
9
Tableau 1.2. Nombre d‘acides aminés dans les différentes caséines et les protéines sériques
majoritaires (* = acides aminés essentiels, Debry, 2005).
Acides aminés variants Caséines Protéines sériques
αs1 β Κ αs2 β-Lg α-La
Asp 7 4 4 4 11 9
Asn 8 5 7 14 5 12
Thr* 5 9 14 15 8 7
Ser 8 11 12 7 7 7
Ser-P 8 5 1 10 0 0
Glu 24 18 12 25 16 8
Gln 15 21 14 15 9 5
Pro 17 35 20 10 8 2
Gly 9 5 15 8 14 3
Ala 9 5 15 8 14 3
Val* 11 19 11 14 10 6
Met* 5 6 2 4 4 1
Ile* 11 10 13 11 10 8
Leu* 17 22 8 13 22 13
Tyr* 10 4 9 12 4 4
Phe* 8 9 4 6 4 4
Lys* 14 11 9 24 15 12
His* 5 5 3 3 2 3
Trp* 2 1 1 2 2 4
Arg 6 4 5 6 3 1
PyroGlu 0 0 1 0 0 0
Cys 0 0 2 2 5 8
Total AA 199 209 169 207 162 123
10
1.1.2.2 Les protéines du lactosérum
Les protéines du lactosérum représentent 15 à 28 % des protéines du lait de vache et 17 %
des matières azotées. Ce groupe de protéines est composé majoritairement des albumines
(68.1 %) qui comprennent la β-lactoglobuline (β-Lg), l‘α-lactalbumine (α-La) et la sérum
albumine du lait. Les immunoglobulines (Ig) sont un autre groupe des protéines du
lactosérum.
La β-Lg (43.7 % des albumines), dont le monomère est présenté en figure 1.2, est formée
de 162 AA, les plus abondants étant Leu, Glu, Lys, Ala et Gly (tableau 1.2). Son pI se situe
entre 4.6 et 5.2 (Das and Kinsella, 1989; Bromley et al., 2005; Harnsilawat et al., 2006). Sa
chaîne peptidique possède 4 Cys qui permettent la formation de ponts disulfures
intramoléculaires lui conférant une structure tertiaire compacte stable. Une autre Cys porte
un groupement thiol libre qui donne à la protéine la capacité d‘échanger les liens lors des
traitements thermiques (Hoffmann and van Mil, 1997). Elle se présente sous forme de
dimères liés par des liens hydrogène à température ambiante et au pH physiologique
(Hoffmann and van Mil, 1997).
Figure 1.2. Représentation 3D de la structure moléculaire d‘un monomère de β-
lactoglobuline (Brownlow et al., 1997).
11
L‘α-La (figure 1.3) représente 19.7 % des albumines des protéines sériques et compte 123
AA dont 8 cystéines. La composition en AA de l‘α-La est présentée au tableau 1.2.
Possédant un atome de calcium par mole, elle est une métalloprotéine. Son pI se situe entre
4.5 et 4.8 et sa masse moléculaire est de 14.2 kDa (Debry, 2005).
Figure 1.3. Structure secondaire de l‘α-lactalbumine montrant la localisation des ions métal
(Chrysina et al., 2000).
La sérum albumine est l‘albumine du lait minoritaire (4.7 %) et possède 582 AA. Elle est
identique à l‘albumine du sérum humain : même composition en AA, même masse
moléculaire (66 267 Da) et mêmes propriétés électrophorétiques et immunologiques.
L‘ensemble des protéines du lactosérum sont solubles à pH 4.6 à 20 °C (Debry, 2005). Leur
structure native globulaire les rend plus compactes et plus résistantes à l‘action des
protéases que les caséines et elles fixent peu les ions. Elles sont plus sensibles à la chaleur
que les caséines et sont dénaturées par chauffage à 90 °C ; elles forment alors des flocons
insolubles sauf les protéoses-peptones (18.9 % des protéines du lactosérum). Les protéoses-
peptones sont des peptones issues de la protéolyse de la caséine β par la plasmine et qui ont
les mêmes propriétés que les protéines solubles du lactosérum.
12
Les différents nutriments du lait, ayant des propriétés physico-chimiques différentes, et les
différents procédés de fabrication permettent de fabriquer des produits laitiers de structures
diverses.
1.1.3 Le lait, ingrédient d’aliments de structures variées
Les produits laitiers sont des exemples d‘aliments faits d‘un nombre limité d‘unités
constitutives (Aguilera, 2006). Par différents procédés de fabrication, ces blocs donnent des
produits laitiers de structures finales diverses (figure 1.4). Il est rare que des produits
alimentaires faits à partir du même ingrédient principal chevauchent diverses structures. Le
lait liquide est une émulsion huile dans eau. Par différents procédés de fabrication,
l‘émulsion peut être inversée. D‘autres procédés permettent d‘obtenir des mousses, des gels
ou des particules solides sèches.
Figure 1.4. Structures laitières diverses obtenues à partir du lait (Aguilera, 2006).
Par exemple, la technologie du lait qui consiste à concentrer sa matière grasse par processus
mécanique (écrémage) suivi du barattage de la crème, donne du beurre dont la structure
finale est une émulsion eau dans huile. La dispersion de bulles de gaz par agitation
13
mécanique d‘une phase continue, constituée de lait et crème, donnera une mousse et
correspond au processus de fabrication de la crème fouettée et de la crème glacée.
Lors de la fabrication des yogourts (structure gélifiée) et des fromages (structure solide), la
coagulation des caséines est essentielle, alors que ces produits laitiers sont de structures
différentes. Dans le cas des fromages, la présence de présure permet l‘obtention de caillé et
l‘étape d‘égouttage amène la perte des protéines de lactosérum, alors que la fabrication des
yogourts par fermentation lactique résulte en un produit laitier constitué de la totalité des
protéines laitières.
1.1.4 L’impact de la composition et de l’organisation structurale des nutriments du
lait et des produits laitiers sur leurs propriétés nutritionnelles
Plusieurs exemples permettent d‘imager le lien entre la nature et l‘organisation structurale
des constituants du lait et des produits laitiers et leurs propriétés nutritionnelles.
Le gras du lait, sous forme de globules, est caractérisé par la longueur et le degré
d‘insaturation des acides gras le composant. Ces acides gras ont des propriétés
nutritionnelles différentes et peuvent, par exemple, avoir un effet différent sur la
cholestérolémie (Ney, 1991). Les phospholipides de la membrane des globules de gras sont
importants par leurs propriétés fonctionnelles et physiques, évitant la coalescence des
globules. Ces phospholipides peuvent aussi avoir des effets sur la santé. Par exemple, la
sphingomyéline a des propriétés anticarcinogéniques (Parodi, 1997). Avec d‘autres
composés de la membrane des globules tels que des protéines, des enzymes, du cholestérol,
des glycoprotéines et des vitamines, les phospholipides peuvent moduler la liaison des
lipases gastriques et pancréatiques à celle-ci et ainsi, la digestion enzymatique des lipides
(développée à la section 1.4.2.2) sera affectée (Michalski, 2007; McClements et al., 2008).
Suite à l‘homogénéisation d‘un mélange huile/solution émulsifiante (faite de protéines
laitières), les protéines du lait stabilisent les globules de gras. Les protéines de lactosérum
et les caséinates de sodium permettent un accès plus facile des lipases pancréatiques aux
globules de gras que d‘autres émulsifiants tels que la lécithine (Mun et al., 2007). Ces
14
variations du processus de digestion peuvent entrainer des propriétés nutritionnelles
différentes (développé à la section 1.4).
La haute qualité nutritionnelle des protéines du lait repose sur leur grande digestibilité (la
digestibilité iléale vraie de l‘N est de 95 %) et une composition équilibrée en AA
indispensables (Debry, 2005). Par leur richesse en Pro, les caséines ont peu de structures
secondaire et tertiaire, facilitant l‘accès des enzymes protéolytiques tel que démontré in
vitro (Baglieri et al., 1995). Cependant, physiologiquement, les caséines sont qualifiées de
protéines « lentes » du à leur coagulation au pH acide de l‘estomac, en opposition aux
protéines sériques de lactosérum reconnues comme « rapides ». Cette coagulation réduit
l‘action de la pepsine dans l‘estomac, retarde la vidange gastrique et prolonge la période de
libération des AA dans l‘intestin et leur absorption (Boirie, 2004), donnant aux caséines des
propriétés nutritionnelles différentes de celles des protéines de lactosérum.
Les peptides et les AA issus de la digestion des protéines du lait et des produits laitiers ont
un impact sur des réponses métaboliques.
1.1.5 Les peptides bioactifs et les acides aminés marqueurs de réponses métaboliques
du lait et des produits laitiers
Plusieurs peptides bioactifs issus des protéines du lait ont été identifiés (Haque et al., 2009).
En général, ces peptides sont composés de 3 à 15 AA et sont issus de l‘hydrolyse des
protéines laitières par les enzymes digestives du tractus GI ou bien par des protéases
présentes dans lors de la fabrication du produit laitier. Le caséinomacropeptide (CMP), issu
de l‘hydrolyse de la caséine κ par la présure lors de la fabrication fromagère, est un
exemple de plus gros peptide qui compte 64 AA. Jusqu‘à présent, les principales activités
biologiques associées aux peptides issus des protéines laitières sont les suivantes :
antimicrobienne, antihypertensive, immunomodulatrice, opiacés agoniste et antagoniste,
bifidogène, antithrombotique, antivirale, antifongique. Certains peptides bioactifs sont
multifonctionnels, comme le peptide β-casomorphine de la caséine β auquel sont associées
des activités opiacée et immunomodulatrice (Debry, 2005).
15
Certains AA sont liés à des réponses métaboliques spécifiques, comme les AA branchés
(BCAA : Ile, Leu, Val) qui sont marqueurs des sécrétions d‘insuline et d‘incrétines, et de la
satiété (van Loon et al., 2000; Nilsson et al., 2004; Luhovyy et al., 2007; Veldhorst et al.,
2009). Les protéines de lactosérum et les caséines sont responsables de fortes
augmentations en concentration plasmatique de BCAA et autres AA (Lys, Thr, Pro, Phe,
Tyr) corrélées à une augmentation de la satiété (Nilsson et al., 2004; Veldhorst et al., 2008;
Newgard et al., 2009; Veldhorst et al., 2009). Dans le cas des protéines de lactosérum (en
solution avec du glucose), cette augmentation a été accompagnée d‘une plus forte sécrétion
d‘insuline postprandiale en comparaison avec une solution de glucose pure (Nilsson et al.,
2007). Dans le cas des caséines, une plus forte proportion de ces protéines dans une diète
(25 % vs 10 %) a permis de diminuer la sécrétion d‘insuline postprandiale, et d‘augmenter
le sentiment de satiété (Veldhorst et al., 2009).
L‘intérêt biologique des peptides et des AA du lait justifie l‘étude de leurs bioaccessibilité
et biodisponibilité lors de la digestion des produits laitiers tels que les gels acides (yogourt).
1.2 Le yogourt
Le yogourt est le résultat de la fermentation lente du lactose du lait ou d‘un mélange laitier,
en acide lactique par l‘action de deux bactéries lactiques : Streptococcus thermophilus et
Lactobacillus bulgaricus (Tamine and Robinson, 1985).
1.2.1 La préparation des gels acides
La fabrication des yogourts, fermes et brassés, comporte plusieurs étapes qui sont
présentées à la figure 1.5.
16
Pasteurisation (90 C, 2 min)
Standardisation et
homogénéisation de la préparation
laitière
Mise en pot Gélification en cuve à 42 C
Ajout de ferments
lactiques
Gélification à 42 C
Conditionnement
Mise en pot
Refroidissement à 4 C
Refroidissement à la température
d‘inoculation (42 C)
Refroidissement à 4 C
Yogourt ferme Yogourt brassé
Figure 1.5. Schéma des différentes étapes de fabrication de yogourts fermes et de yogourts
brassés (Tamine and Robinson, 1985).
La première étape est la préparation du mélange laitier où la composition nutritionnelle du
lait est standardisée. Si des stabilisants sont ajoutés, ils sont solubilisés dans le mélange
laitier. Le mélange laitier est maintenu au repos 16 h à 4 °C afin d‘assurer une hydratation
optimale des protéines laitières qui ont pu être ajoutées sous forme de poudre (isolat,
concentré) au lait. Ensuite le mélange subit un traitement thermique de pasteurisation et un
refroidissement, puis les ferments lactiques (Streptococcus thermophilus et Lactobacillus
bulgaricus) sont ajoutés. Dans le cas des yogourts fermes, l‘étape suivante est la mise en
17
pot et la fermentation lactique qui débute à 42 °C. L‘arrêt de la fermentation a lieu lors de
l‘atteinte du pH à 4.6 (3 h 30 - 4 h 00). Les pots sont refroidis et stockés à 4 °C. Les
yogourts brassés suivent un processus de fabrication similaire excepté que la fermentation
se fait en cuve, suivie d‘une étape de conditionnement (brassage et lissage) est ajoutée
avant l‘étape finale de mise en pot.
1.2.1.1 La standardisation de la préparation laitière
La préparation laitière est standardisée selon le type de yogourt fabriqué. En général, les
teneurs en protéines et en lactose sont d‘abord standardisées en utilisant des poudres de lait,
des isolats de lactosérum et du lactose alimentaire. La matière grasse est ajustée par l‘ajout
de crème (Tamine and Robinson, 1985). Les constituants présents jouent tous un rôle dans
la fabrication des yogourts et leur qualité finale. Les protéines laitières sont les éléments
clés d‘obtention du gel qui donnent au yogourt sa texture ferme et plastique. Le lactose est
aussi important, car il est le substrat essentiel à la croissance des bactéries lactiques. Une
croissance bactérienne optimale lors de la fermentation lactique permet la diminution du
pH, responsable de la coagulation des caséines. La matière grasse apporte de l‘onctuosité
au yogourt. Les minéraux aident à stabiliser le réseau protéique.
Les conditions industrielles de fabrication de yogourts correspondent généralement à une
teneur en protéines de 4 %, un ratio caséines/protéines de lactosérum (CN : PL) de 2.8, et
une teneur en matière sèche de 14 % (Tamine and Robinson, 1985).
1.2.1.2 L’homogénéisation de la préparation laitière
L‘homogénéisation est une étape qui diminue la taille des globules de gras de 4 - 5 µm à 1
µm par cisaillement (Amiot et al., 2002). Ainsi les globules de gras ne sédimentent pas et
sont plus hydrophiles, contribuant à une meilleure rétention de l‘eau. La fermeté du réseau
de caséines du yogourt est aussi améliorée (Tamine and Robinson, 1985). L‘efficacité du
traitement dépend de la pression et de la température auxquelles il est fait (entre 500 - 2500
psi et 55 - 65 °C) (Lucey et al., 2004).
18
1.2.1.3 Le traitement thermique
L‘étape du traitement thermique est indispensable pour l‘innocuité du produit laitier. Le
traitement thermique se situe entre 80 et 98 °C pendant une durée variable de 20 s à 30 min
(Lucey, 2004), permettant la destruction des microorganismes pathogènes et indésirables.
De plus, des enzymes responsables de la dégradation du produit laitier, telles que les lipases
(du lait) responsables de l‘oxydation subséquente des lipides, sont inhibées (Walstra et al.,
2006). Lors de la fabrication de yogourt, le traitement thermique est sévère car il permet de
dénaturer irréversiblement les protéines de lactosérum et d‘améliorer la capacité de
rétention d‘eau des gels (Lucey et al., 1999). Ces protéines changent alors de conformation
et les groupements thiol des β-Lg deviennent des sites réactifs (Hoffmann and van Mil,
1997). La β-Lg se lie alors à la caséine κ par un pont disulfure (Sava et al., 2005). Il peut
également y avoir des interactions entre les caséines et l‘α-La (Corredig and Dalgleish,
1996). L‘effet du traitement thermique sur la rhéologie des gels sera développé au
paragraphe 1.2.3.2.
1.2.1.4 La fermentation lactique
La fermentation lactique est l‘étape clé dans la formation du réseau caséique gélifié car elle
permet d‘atteindre un pH acide égal au pI (4.6) des caséines, et elles coagulent. Le lactose
est métabolisé par les bactéries lactiques qui agissent en synergie. Les streptocoques
débutent la fermentation et produisent les composantes nécessaires au développement des
lactobacilles comme l‘acide formique et le gaz carbonique. Les lactobacilles hydrolysent
les caséines et libèrent ainsi des peptides et des AA favorisant la croissance des
streptocoques (Walstra et al., 2006). Des métabolites de dégradation des protéines, du
lactose, et de la matière grasse sont produits, dont ceux responsables des flaveurs du
yogourt (principalement les dérivés carbonés acétaldéhyde, acétoïne et diacétyle, et des
acides volatils et non volatils)(Tamine and Robinson, 1985).
Plusieurs facteurs influencent la croissance de ces bactéries comme le pH, la température et
la composition du milieu de croissance. Le pouvoir tampon, exprimée par la quantité
d‘acide nécessaire pour diminuer d‘une unité le pH du milieu, est important car l‘acide
lactique peut devenir toxique pour la croissance bactérienne (Salaün et al., 2005). Les
19
ferments lactiques ont une température optimale de croissance de 45 °C et cette valeur peut
varier suivant leur pourcentage d‘inoculation (Tamine and Robinson, 1985). Le taux
d‘inoculation des ferments lactiques peut varier entre 2 et 5 % (Clark and Plotka, 2005). À
2 % d‘inoculation, la température de fermentation recommandée est 42 °C (Tamine and
Robinson, 1985). Le lait contient les nutriments carbonés et azotés, les minéraux et les
vitamines nécessaires à la croissance bactérienne (Tamine and Robinson, 1985). Les
industriels recherchent entre 107
et 108 UFC/mL de bactéries pour former des gels de bonne
qualité (Clark and Plotka, 2005).
1.2.1.5 Le conditionnement et le stockage
Le conditionnement des yogourts fermes ne correspond qu‘au refroidissement des pots pour
ralentir la croissance des bactéries lactiques à température inférieure à 10 °C (Tamine and
Robinson, 1985). Pour les yogourts brassés, le conditionnement comprend le
refroidissement, le brassage, le lissage, l‘ajout de fruits suivant la recette et la mise en pot.
Lors des étapes de brassage et de lissage, le réseau caséique est brisé et le produit final
devient alors lisse et homogène (Tamine and Robinson, 1985). Les yogourts sont conservés
à 4 °C entre un et deux mois. Le respect de la chaîne du froid est important pour garder
leurs qualités organoleptiques, texturales et microbiologiques.
1.2.2 Les propriétés rhéologiques des gels
La rhéologie est la réponse d‘un matériau (liquide ou solide) à une contrainte appliquée qui
permet de caractériser sa structure (à faibles déformations) et de l‘étudier dans les
conditions de force et de déformation qui reflètent celles qu‘il subira lors de son utilisation
(à grandes déformations). La relation contrainte/vitesse de cisaillement permet de
déterminer la viscosité apparente de l‘aliment. Le comportement est newtonien lorsque la
contrainte de cisaillement et la vitesse de cisaillement sont proportionnelles et est non-
newtonien lorsque la viscosité varie selon la vitesse de cisaillement. Les yogourts ont un
comportement non-newtonien, et en particulier un comportement dit pseudoplastique ou
rhéofluidifiant. Leur viscosité diminue en fonction de l‘augmentation de la vitesse de
cisaillement (Lucey et al., 2004). La viscosité apparente est une caractéristique rhéologique
intéressante car elle est fonction de l‘état global du gel acide comme la taille des pores, la
20
structuration du réseau caséique et l‘état physique du lactosérum dans les pores (Lucey et
al., 2004). L‘élasticité est un exemple de caractéristique rhéologique qui ne dépend pas de
l‘état global du gel, mais principalement de la force des liens formant le gel.
1.2.3 Les facteurs influençant les propriétés rhéologiques des yogourts
Les propriétés rhéologiques des yogourts permettent de définir des paramètres de
fabrication des yogourts qui donneront un produit acceptable par le consommateur. Les
défauts à éviter sont une mauvaise texture (un gel trop mou ou trop ferme) ou le
phénomène de synérèse. Ce dernier phénomène est majeur et a lieu lorsque le sérum
s‘échappe du réseau caséique et se retrouve en surface des yogourts (Lucey et al., 2004).
Ces défauts sont contrôlés en modifiant la standardisation des mélanges laitiers, en
optimisant le procédé de fabrication ou en ajoutant des agents stabilisants. Les trois
solutions peuvent être combinées, tel que décrit ci-après.
1.2.3.1 Les caractéristiques du mélange laitier
La qualité microbiologique du lait est importante puisqu‘une contamination bactérienne du
mélange laitier peut apporter des défauts de synérèse au yogourt. Des bactéries
psychotropes pourraient hydrolyser les protéines laitières et ainsi diminuer la capacité de
rétention d‘eau des protéines du lactosérum (Tamine and Robinson, 1985).
La teneur en solides totaux du mélange laitier influence la texture du yogourt. Lorsque la
teneur en solides non gras du lait passe de 9 % (lait non transformé et non enrichi) à 10 - 14
%, la rétention du lactosérum et la viscosité sont significativement améliorées (Amiot et al.,
2002). Le changement du ratio CN : PL a aussi un impact sur les propriétés rhéologiques
(Lucey et al., 2004). L‘augmentation de la teneur en protéines sériques (ratio CN : PL entre
2.8 et 0.5) améliore la capacité de rétention d‘eau du lactosérum (Puvanenthiran et al.,
2002) et augmente les interactions des protéines sériques avec les caséines pour renforcer le
réseau caséique (Lucey et al., 2004) ; la fermeté du gel est alors plus élevée. À l‘opposé une
teneur trop élevée en protéines de lactosérum entraine une texture granuleuse du yogourt
(Puvanenthiran et al., 2002). La forme des protéines de lactosérum peut influencer la
rhéologie des yogourts. Bhullar et al. (2002) ont montré qu‘n concentré de protéines
21
sériques (2 % des solides totaux du yogourt) donne un gel plus stable avec un réseau
protéique plus régulier et dense que celui de poudre de lactosérum (2 % des solides totaux
du yogourt), lequel montre plus de vides et d‘espaces interstitiels (Bhullar et al., 2002).
La quantité et la nature des minéraux peuvent influencer la rhéologie du yogourt. Au-delà
d‘une certaine concentration, les minéraux peuvent déstabiliser le réseau caséique jusqu‘à
causer la synérèse (Tamine and Robinson, 1985).
1.2.3.2 L’influence des procédés de fabrication
Le traitement thermique influence fortement la rhéologie du yogourt car il expose le site
réactif thiol des β-Lg qui se lient aux caséines κ, aidant à la gélification. Un yogourt fait
avec un mélange laitier non traité thermiquement montre un réseau caséique large et peu
interconnecté alors que si le même mélange est traité thermiquement le réseau caséique est
homogène et interconnecté (Lucey et al., 1999).
Une homogénéisation du lait ou du mélange laitier, faite avec des barèmes non optimaux,
rend cette étape de fabrication inefficace. Les protéines qui entourent les globules de gras
peuvent être fortement endommagées et le réseau caséique, peut ainsi être déstabilisé
(Tamine and Robinson, 1985; Lucey et al., 2004).
La fermentation est une étape critique du procédé de fabrication. La nature, le taux
d‘ensemencement des souches lactiques et le ratio streptocoques/lactobacilles modulent la
vitesse d‘acidification et ainsi, peuvent influencer la gélification et la rhéologie des
yogourts. Une vitesse d‘acidification rapide donne un caillé peu homogène et donc moins
ferme (Haque et al., 2001). De même, un pH trop élevé empêchera la formation d‘un réseau
caséique stable (Tamine and Robinson, 1985). Les conditions optimales de croissance des
ferments lactiques, dont la température, dépendent de la souche et de l‘espèce. Dans des
conditions de température d‘incubation non optimale, la production d‘acide est lente et la
gélification peut ne pas se faire ou être lente.
22
La température de refroidissement doit être contrôlée car le refroidissement augmente la
fermeté du gel (Lucey et al., 1997) et ce malgré la diminution d‘intensité des interactions
hydrophobes. Des liens non-covalents tels que des liaisons hydrogène, dipolaires et
électrostatiques sont responsables de l‘augmentation de la fermeté du gel (Haque et al.,
2001).
La température et le temps d‘entreposage ont un impact sur la qualité du yogourt. Durant
les 48 h suivant la fabrication du yogourt, des réarrangements ont lieu permettant la
stabilisation du réseau caséique (Tamine and Robinson, 1985).
1.2.3.3 Les agents stabilisants utilisés dans les yogourts
Les agents stabilisants sont utilisés dans la fabrication des yogourts depuis longtemps en
Amérique du Nord afin de contrôler la texture et la synérèse du yogourt (relarguage du
lactosérum) (Tamine and Robinson, 1985). Les stabilisants sont des polysaccharides (PS)
épaississants et gélifiants contribuant aux propriétés rhéologiques des yogourts et à
l‘augmentation de la rétention d‘eau du gel. Les stabilisants sont de plus en plus utilisés
dans des yogourts faibles en gras afin d‘apporter l‘onctuosité perdue en enlevant du gras
(Sandoval-Castilla et al., 2004).
Les PS les plus utilisés (seuls ou en mélange) sont la pectine, la gomme de caroube, la
gomme de xanthane, l‘amidon et la carraghénane (Clark and Plotka, 2005). L‘ajout des PS
doit se faire dans des conditions contrôlées (température donnée, avant ou après certains
ingrédients du mélange laitier). La concentration utilisée est aussi importante. Une quantité
de PS trop ou pas assez importante déstabilise le réseau de caséines (Ramaswamy and
Basak, 1992; Seymour and Knox, 2002) et affecte la viscosité du yogourt (Everett and
McLeod, 2005).
1.3 Les polysaccharides
Les PS sont des polymères constitués d‘unités de monosaccharides dont la nature et le
degré de polymérisation varient selon la source. Les propriétés des PS dépendent de la
nature des monosaccharides, de la liaison glucosidique qui relie ces unités et leur poids
23
moléculaire (Leung et al., 2006a). Les PS sont obtenus de différentes sources telles que les
algues (ex : carraghénanes, agar), les plantes (ex : amidon, pectine), ou encore peuvent être
synthétisés par les micro-organismes (ex : gomme xanthane). On trouve des β-glucans
(polymères de glucose liés en β) issus de plusieurs sources (plantes, micro-organismes). En
alimentaire, la plupart des β-glucans proviennent des plantes et en particulier des sons
d‘orge et d‘avoine (Brennan, 2005a; Makelainen et al., 2006; Panahi et al., 2007;
Rondanelli et al., 2011).
La pectine et l‘amidon étant des PS très utilisés par les industriels (Seymour and Knox,
2002; Eliasson, 2004), leurs propriétés sont bien documentées. Différents amidons sont
particulièrement utilisés dans les recettes de yogourts sans gras car ils apportent un aspect
crémeux (Alexander, 1992; Alting et al., 2009). Les pectines sont utilisées lors de la
fabrication de yogourts pour aider à la stabilisation des gels acides (Tromp et al., 2004). Le
β-glucan est un exemple de PS moins étudié. Il a été en premier lieu étudié pour ses
propriétés santé (Brennan, 2005a), mais il possède aussi le potentiel de stabiliser des
produits laitiers à faible teneur en gras dont les yogourts (Tudorica et al., 2004; Vasiljevic
et al., 2007).
Le β-glucan, l‘amidon et la pectine sont les trois PS étudiés dans ce projet et leurs
caractéristiques structurales et physico-chimiques seront présentées dans les sections
suivantes.
1.3.1 Les caractéristiques structurales et physico-chimiques de l’amidon, de la
pectine et du β-glucan
Les caractéristiques structurales et physico-chimiques des PS définissent leur fonctionnalité
et leur comportement vis-à-vis d‘autres nutriments présents dans une matrice alimentaire.
Les caractéristiques des PS à l‘étude sont présentées dans les sections suivantes.
1.3.1.1 L’amidon
La synthèse de l‘amidon se fait dans les organes de stockage de différentes plantes (fruit ou
graine) lors du développement et de la maturation des tissus. Dans les céréales, principale
24
source des amidons alimentaires, le site principal de synthèse et d‘accumulation de
l‘amidon (sous forme de granules) sont les amyloplastes localisés dans l‘endosperme. Deux
polymères constituent les granules d‘amidon : l‘amylose et l‘amylopectine. L‘amylose est
un polymère linéaire contenant entre 840 et 22 000 unités d‘α-D-glucopyranosyl liées par
des liens α (1 - 4). L‘amylopectine est un polymère de glucoses liés par des liaisons
linéaires α (1 - 4) pour la chaîne principale et par des liaisons α (1 - 6) pour les
ramifications. Quatre à cinq % de ces ramifications peuvent elles-mêmes être ramifiées et
les amylopectines sont alors dites hautement branchées (figure 1.6).
Figure 1.6. Représentation d‘une molécule d‘amylopectine (Royal Society of Chemistry,
2004).
Les granules d‘amidon natif augmentent la viscosité en solution suite au chauffage selon un
processus en 5 phases (Eliasson, 2004) :
- Formation d‘une suspension par agitation de l‘amidon dans l‘eau froide.
- Gonflement des grains d‘amidon lors de la montée en température et l‘atteinte de la
température de gélatinisation : l‘eau pénètre dans les grains et ceux-ci gonflent, puis
la viscosité de la solution augmente. On obtient un empois d‘amidon.
- Perte de la structure granulaire par poursuite du chauffage car l‘amylose sort du
grain pour se solubiliser à l‘extérieur du grain, l‘empois d‘amidon disparait.
25
- Reprise de la viscosité lors du refroidissement de la solution car les molécules
(amylose principalement) se réassocient pour former un gel. Il s‘agit du phénomène
de rétrogradation.
- Augmentation de la fermeté du gel et expulsion de l‘eau incluse entre les chaînes de
macromolécules. Le relargage d‘eau est le phénomène de synérèse.
Les amidons natifs peuvent être utilisés en alimentaire car ils sont fonctionnels et peu
coûteux. Cependant, leur utilisation est complexe et des variables telles que le contenu en
eau, la température, la concentration en sel et le pH ont un effet sur leur fonctionnalité. Par
exemple, il a été démontré que l‘addition de faibles teneurs en sel diminue dramatiquement
la viscosité de gels d‘amidon de pomme de terre (Muhrbeck and Eliasson, 1987).
Les amidons sont souvent modifiés pour améliorer leur utilisation. Ces modifications
altèrent leur structure et affectent plus ou moins leur capacité à créer des liens hydrogène.
La création de liaisons hydrogène est importante pour lier les molécules d‘eau qui hydratent
les PS et apportent ainsi la viscosité aux aliments. La réticulation est la modification
chimique la plus importante en industrie de l‘amidon. Des liens covalents sont formés entre
les groupements OH des unités de glucose par l‘ajout d‘agents chimiques. Le gonflement
des granules d‘amidon est inhibé et prévient leur désintégration lors d‘une attaque acide,
d‘un cisaillement ou de hautes températures. Plus le nombre de liens covalents augmente,
plus l‘amidon est stable à ces attaques. La stabilisation est la seconde modification la plus
importante et est souvent couplée avec la réticulation. Lors de cette modification, des
groupements OH sont estérifiés, phosphorylés, ou subissent une autre modification
chimique. Cette modification permet de freiner la tendance à la dispersion des fragments
linéaires qui s‘aligneraient et rétrograderaient. Elle permet ainsi à l‘amidon de tolérer des
fluctuations de température telles que des cycles de congélation-décongélation. La pré-
gélatinisation est une modification physique qui supprime la nécessité de chauffer les
produits contenant l‘amidon. Elle assure une meilleure dissolution de l‘amidon lors de son
ajout pour obtenir l‘effet viscofluidifiant (Eliasson, 2004).
26
Dans les yogourts, les amidons sont ajoutés pour augmenter la viscosité par lien avec les
molécules d‘eau du lait (Eliasson, 2004; Warrand, 2006; Ares et al., 2007). Cependant les
autres nutriments, comme les protéines, peuvent moduler la fonctionnalité de ces PS. Un
brevet basé sur l‘utilisation d‘amidon d‘avoine réticulé met en évidence que le ratio
amidon : protéines, dans des produits laitiers allégés en gras (beurre, crème glacée), est
important pour obtenir la viscosité désirée (Tarr and Bixby, 1995).
1.3.1.2 La pectine
Les pectines se trouvent dans les parois des cellules des plantes. Elles contribuent à
plusieurs fonctions telles que la détermination de la taille et de la forme des cellules,
définissant ainsi l‘intégrité et la rigidité des tissus de la plante. Les pectines jouent aussi un
rôle dans le transport des ions et la rétention de l‘eau (Seymour and Knox, 2002). La
structure des pectines dépend des réactions enzymatiques et chimiques durant la croissance
de la plante, son vieillissement et le stockage des fruits. Les pectines alimentaires sont
souvent extraites de la peau ou de zeste d‘agrumes et de pépins de pomme.
Les pectines sont constituées d‘acides D-galacturoniques liés en α (1 - 4) en chaînes
linéaires. Des résidus de rhamnose peuvent s‘intercaler entre des acides galacturoniques
pour former des segments de rhamnogalacturonan auxquels s‘associent d‘autres
monosaccharides (arabinose, galactose, arabinogalactose) comme montré à la figure 1.7.
Les groupements COOH de la pectine peuvent être estérifiés en ajoutant du méthanol pour
obtenir des groupements méthyles COOCH3. Ce degré de méthylation (figure 1.8) varie et
influence la fonctionnalité des pectines. Les pectines sont classées en deux groupes : les
pectines hautement méthylées (HM) et les faiblement méthylées (LM) dont le pourcentage
de groupement méthyle est entre 55 et 75 % et 20 et 45 %, respectivement. Les pectines
HM gélifient dans des matrices de pH < 3.2 à forte teneur en solide (> 60 %), alors que les
pectines LM forment un gel sur une large gamme de pH en présence d‘ions calcium (ou
autres ions divalents). Au sein d‘un même groupe de pectines, ayant le même degré de
méthylation et le même contenu en acide galacturonique, les fonctionnalités peuvent varier
à cause de la taille et de la distribution de zones non-estérifiées. Le nombre d‘acides
27
galacturoniques de ces zones peut aussi être responsable de variations de fonctionnalités
(Daas et al., 2001).
La chaine principale linéaire des pectines commerciales compte environ 75 % d‘acides
galacturoniques et entre 30 et 80 % des groupements carboxyliques COOH sont estérifiés
par des groupements méthyles. Pour contrôler les propriétés rhéologiques et physiques des
pectines, il est possible de remplacer le groupe OCH3 en C-6 par un groupe NH2 pour
obtenir des pectines amidées qui se stabiliseront par des interactions hydrophobes entre
zones amidées. Ces zones, en plus des liaisons covalentes dans les zones non méthylées,
stabiliseront des gels.
Figure 1.7. Structure schématique des pectines simples (galacturonane) et complexes
(rhamnogalacturonane). Gal : galactose ; GalA : acide galacturonique ; Rha : rhamnose ;
Ara : arabinose ; Fuc : fucose ; Xyl : xylose ; DHA : acide 3-deoxy-D-lyxo-2-
heptulosarique ; KDO : acide 2-keto-3-deoxy-D-monooctulosonique ; Api : apiose ; AceA :
acide acérique ; GlcA : acide glucuronique ; Ac : groupe acétyle ; Me : ester de méthyle ; 4-
O-Me : 4-O ester de méthyle (Seymour and Knox, 2002).
a) Galacturonans
b) Rhamnogalacturonans
28
Figure 1.8. Résidus d‘acide D-galacturoniques formant la chaîne basique des pectines. Des
groupements méthyles peuvent être présents en O-2 et O-3 selon la source de la pectine
(Seymour and Knox, 2002).
Les pectines HM sont fréquemment utilisées pour stabiliser les breuvages à pH < 4 comme
les laits acidifiés. Pour augmenter la fermeté et la tenue en cuillère des yogourts, les
pectines LM donnent de meilleurs résultats (Seymour and Knox, 2002). Au pH du yogourt
(4.6), les protéines du lait ont une charge nette positive faible et les caséines sont sous
forme de particules insolubles dans l‘eau. Les pectines LM sont chargées négativement et
peuvent alors se lier aux ions Ca2+
du lait ; ainsi elles modifient l‘organisation du réseau
caséique (Matia-Merino et al., 2004). En concentration suffisante, les pectines entourent
entièrement les protéines ; les conditions de répulsion électrostatique résultantes
stabiliseront le yogourt et ainsi il sera stable face à la synérèse et appréciable en bouche
(Ambjerg Pedersen and Jorgensen, 1991; Seymour and Knox, 2002). À des pH légèrement
inférieurs à 4.6, les caséines chargées positivement pourront se lier par interactions
électrostatiques aux pectines LM (Matia-Merino et al., 2004). Les pectines peuvent se lier
aux protéines de lactosérum par le même type d‘interactions (Serov et al., 1985; Girard et
al., 2003).
1.3.1.3 Le β-glucan
Les β-glucans se trouvent dans les cellules des parois de l‘aleurone et l‘endosperme des
grains. Les grains d‘orge, d‘avoine, de riz et de blé contiennent respectivement entre 3 – 11
%, 3 – 7 %, 1 – 2 % et moins de 1 % de ce PS (Skendi et al., 2003). La structure des β-
glucans issus des céréales est (1 - 3) (1 - 4) –β-D-glucan, avec environ 30 % de liaisons (1 -
29
3) et 70 % de liaisons (1 - 4). Certains auteurs les décrivent comme des chaines de
cellulose, avec 70 % d‘unités β-D-glucopyranosyl liées en 4 - O et interrompues par des
unités de β-D-glucopyranosyl liées en 3 - O (30 %) (Wood, 2007) comme le montre la
figure 1.9. Le rapport du nombre de ces deux unités affecte les caractéristiques
rhéologiques des β-glucans telles que l‘élasticité et les caractéristiques de gélification des
systèmes. Ainsi dans un système alimentaire, la structure et la texture seront affectées
(Tosh et al., 2004).
Figure 1.9. Représentation d‘une partie de polymère β-D-glucan. 1 : segment constitué de
résidus substitués 3 - O (b) et CO (c et d) ; 2 : segment constitué de résidus substitués 3 - O
(b) et CO (c, d et e) (Dais and Perlin, 1982).
Les caractéristiques viscoélastiques des gels de β-glucan sont reliées à la masse molaire du
PS. Il a été démontré que le module de stockage (G‘) de gels de β-glucan augmente avec la
diminution de la masse molaire du PS et ainsi, le temps de gel est réduit et la vitesse de
gélification augmente (Lazaridou et al., 2003). Cette variation du module de stockage,
contraire à la plupart des autres PS, s‘explique par l‘agrégation rapide des β-glucans de
faibles poids moléculaires formant ainsi une structure en réseau (Lazaridou et al., 2003).
Les PS ont été associés à différents effets sur la nutrition humaine dont les principaux
seront présentés ici pour les PS à l‘étude.
1
2
30
1.3.2 L’impact nutritionnel de l’amidon, de la pectine et du β-glucan
Plusieurs PS (dont les amidons, les pectines et les β-glucans) sont connus comme
modulateur de la digestion des nutriments et de réponses métaboliques (Acton et al., 1982;
Larsen et al., 1994; Mouecoucou et al., 2003; Kim, 2005; Cani et al., 2006; Leung et al.,
2006a; Lazaridou and Biliaderis, 2007; Polovic et al., 2007; Wood, 2008).
1.3.2.1 L’amidon
Tous les amidons ne sont pas digérés de la même façon et peuvent provoquer des réponses
glycémiques et hormonales différentes. L‘arrangement de l‘amylose et de l‘amylopectine et
leurs interactions avec les autres composés de l‘aliment (protéines, lipides, fibres, etc…)
déterminent leur susceptibilité à l‘enzyme digestive α-amylase, et modulent ainsi
labiodisponibilité du glucose (Eliasson, 2004). L‘α-amylase hydrolyse les liaisons linéaires
α (1 - 4) des chaines linéaires des amyloses et des amylopectines. Son activité est diminuée
par l‘encombrement stérique causé par les ramifications présentes dans les amylopectines.
Ceci explique que l‘augmentation de la concentration du glucose sanguin est moins
prononcée après la consommation d‘aliments contenant des amidons, comparativement à
des aliments contenant des sucres simples (mono et disaccharides) (Eliasson, 2004). De
plus, les amidons réticulés sont plus résistants à l‘hydrolyse et ont un rôle de prébiotiques
au niveau de la microflore colique (Warrand, 2006).
Ou et al. (2001) ont proposé (suite à une étude in vitro) qu‘un amidon riche en amylose et
résistant aux enzymes (modification chimique) ralentissait l‘absorption du glucose selon
trois phénomènes : augmentation de la viscosité du milieu qui retarde l‘action de l‘α-
amylase, interaction du glucose libre avec l‘amidon diminuant la concentration de glucose
disponible à l‘absorption. Ratnayake et al. (2002) ont aussi montré que des amidons de pois
riches en amylose diminuaient le taux d‘apparition du glucose sanguin et l‘indice
glycémique (indice exprimant la concentration de glucose sanguin 2 h après la prise
alimentaire par rapport à une diète de référence).
31
1.3.2.2 La pectine
Les pectines sont des fibres solubles constituées, selon la définition du comité technique de
l‘association américaine des chimistes des céréales, d‘un groupe de substances obtenues des
plantes qui résiste aux enzymes digestives humaines. Elles ont été associées à diverses
activités biologiques telles que des activités immunostimulante, anti-métastasique, anti-
ulcère et anti-néphrotique (Yu et al., 2001; Seymour and Knox, 2002).
Des pectines LM et HM ont diminué significativement l‘absorption intestinale du glucose
et de l‘eau chez des rats perfusés pendant 30 min avec une solution isotonique
d‘électrolytes, du glucose (10 mM/L) et les pectines (10 g/L) (Kim, 2005). Les pectines
HM ont eu un effet plus marqué sur la baisse de l‘absorption du glucose (- 38 %) que la
pectine LM (Kim, 2005). Ces résultats sont en accord avec l‘étude de Sanchez et al. (2008)
qui a montré que la présence d‘une pectine HM dans une diète (10 % de la diète) diminuait
significativement l‘absorption du glucose, la sécrétion d‘insuline et le niveau de cholestérol
en comparaison avec une diète pauvre en fibres. Selon Kim (2005), les pectines
augmenteraient la viscosité au niveau de la muqueuse intestinale où les sites d‘absorption
du glucose se trouvent ; son absorption serait alors diminuée. Fuse et al. (1989) ont aussi
montré dans deux études chez le rat et l‘humain, où les intestins ont été perfusés avec des
solutions d‘acide linoléique et de glucose, que l‘absorption de ces nutriments diminuait
significativement avec l‘augmentation de la concentration en pectine (entre 5 et 15 g/L).
Cette diminution d‘absorption a été expliquée par l‘apparition d‘une couche visqueuse
consituée de pectine au niveau de la muqueuse intestinale (Fuse et al., 1989).
La présence de pectine affecterait aussi la digestion des protéines. Selon la nature des
pectines et leur quantité, la digestion de caséines a été affectée différemment et les
nutriments azotés issus de cette digestion variaient (Kossori et al., 2000). Kossori et al.
(2000) ont montré avec un modèle de digestion in vitro, que la pectine issue de pulpe de
poire permettait un largage plus lent de l‘N (par dialyse) qu‘avec des pectines issues de la
peau ou des pépins de poire, ou encore, issues d‘agrumes. Ces auteurs expliquent que le
ralentissement du largage serait du à l‘interaction des pectines avec les enzymes ou avec les
caséines plutôt qu‘à l‘augmentation de viscosité du milieu. Cependant, Mouecoucou et al.
32
(2003) suggèrent à la fois une influence de la viscosité en présence de pectine et les
interactions pectine-protéines pour expliquer la baisse de digestibilité pepsique, trypsique et
chymotrypsique de la β-Lg en présence de pectine LM.
Au niveau du côlon, les pectines comme toutes les fibres ont un rôle de prébiotiques.
Dongowski et al. (2002) ont montré que la présence de pectines LM et HM (6.5 % dans une
diète) augmentait la production d‘acides gras à courtes chaînes par les bactéries du côlon,
en particulier avec les pectines LM. Ces résultats suggèrent donc un impact des pectines sur
la croissance et le développement du microbiote colique (Dongowski et al., 2002), connu
pour moduler des réponses hormonales postprandiales régulant le métabolisme du glucose
et l‘insulinémie (Cani et al., 2009).
1.3.2.3 Le β-glucan
Les β-glucans sont considérés comme des fibres et ont différents effets biologiques tels que
la prévention de la constipation, la réduction des risques de cancer colorectal, la production
d‘acides gras à courte chaîne et la diminution du cholestérol (Brennan, 2005a).
Les β-glucans augmentent la viscosité du contenu stomacal et ralentissent ainsi le transit
dans le petit intestin (Johansen et al., 1996) en diminuant la diffusion des enzymes et des
nutriments. Il a été démontré que l‘ajout de β-glucan (8 %) diminuait de 50 % la
désintégration de pains (mesurée par % des particules non digérées) lors d‘une digestion
gastrique (30 min) et iléale (120 min) in vitro (Thondre et al., 2010).
Ce PS, ajouté dans une diète, est connu pour diminuer les réponses glycémiques et
insulinémiques (Makelainen et al., 2006; Tosh et al., 2008). Quatre grammes de β-glucan
ajoutés dans des muffins permettraient la diminution (15 %) de la hausse du pic de glucose
et du pic d‘insuline en comparaison avec le même muffin sans PS (Tosh et al., 2008). La
diminution de l‘activité de l‘α-amylase intestinale due à l‘augmentation de la viscosité du
milieu expliquerait la diminution d‘absorption du glucose (Englyst and Cummings, 1985).
La production d‘acides gras à courte chaine produits durant la fermentation colique de
fibres et absorbés au niveau du colon peut influencer le métabolisme du glucose hépatique
33
(augmenter ou diminuer la glycolyse) (Anderson and Bridges, 1984) ce qui pourrait
moduler la réponse insulinémique.
1.4 La digestion gastro-intestinale
Cette section présente les étapes principales de la digestion gastro-intestinale chez
l‘humain.
Les aliments sont ingérés par la bouche, puis digérés tout au long du tractus GI (figure
1.10) selon un processus physiologique complexe, ayant pour but la dégradation de
l‘aliment afin que les nutriments nécessaires à la vie humaine soient accessibles pour leur
absorption. Ensuite, ces nutriments sont absorbés et entrent dans les voies métaboliques de
l‘organisme. Les différentes étapes de digestion, qui précèdent l‘absorption des aliments
par la membrane épithéliale du petit intestin, ont un effet sur la structure de l‘aliment et
modulent la bioaccessibilité des nutriments (Sanz et al., 2007). La bioaccessibilité
représente le relargage des nutriments des aliments pour les rendre disponibles à
l‘absorption intestinale. La proportion de nutriments relargués et ensuite absorbés par la
muqueuse et servant pour le métabolisme cellulaire et les fonctions organiques normales
représente la biodisponibilité des nutriments (Aggett et al., 1997).
Lors de leur transit de la bouche à l‘œsophage, puis de leur passage dans l‘estomac,
l‘intestin grêle et le gros intestin, les aliments subissent des actions mécaniques via la
mastication dans la bouche et les mouvements péristaltiques de l‘estomac et de l‘intestin.
Ils subissent également des actions chimiques par la présence de sels et d‘enzymes.
Différents facteurs propres à la physiologie humaine peuvent influencer la digestion des
aliments : le pH dans le tractus, la vidange gastrique, la durée de la digestion, le taux de
sécrétion des enzymes, la composition de la flore microbienne, etc..
34
Figure 1.10. Anatomie du système digestif (Widmaier et al., 2011).
Les sections 1.4.1. et 1.4.2 présentent les principales caractéristiques mécaniques,
sécrétrices et enzymatiques des différentes étapes de digestion.
1.4.1 Les caractéristiques mécaniques et sécrétrices de la digestion gastro-intestinale
1.4.1.1 Les caractéristiques de la digestion buccale
Le tractus GI commence au niveau de la bouche avec l‘action mécanique de la mastication
qui réduit la taille des aliments en petites particules qui peuvent être dégluties. Cette étape
permet donc le bris de la structure alimentaire (Agrawal et al., 1997) et augmente les
35
chances de solubilisation des ingrédients, et ainsi la bioaccessibilité des nutriments (Sanz et
al., 2007).
La salive est sécrétée par trois paires de glandes localisées dans la tête. La salive est
composée de 99 % d‘eau et de 1 % de substances inorganiques (sels minéraux) et
organiques, dont le mucus qui est composé de glycoprotéines. Ce mucus enveloppe le bol
alimentaire et permet de dissoudre, humecter et lubrifier les particules de nourriture avant la
déglutition. Une enzyme est présente dans la salive, l‘α-amylase, qui digère l‘amidon
(Widmaier et al., 2011). La dissolution des molécules des aliments par la salive permet
aussi de percevoir le goût des aliments. La salive a aussi un rôle antibactérien par la
présence du lysozyme qui attaque les parois bactériennes.
Après la bouche, l‘aliment passe dans le pharynx et l‘œsophage qui ne contribuent pas à la
digestion, mais qui assurent le passage du matériel ingéré à l‘estomac. Les muscles de ces
segments du tractus assurent la déglutition.
1.4.1.2 Les caractéristiques de la digestion gastrique
La digestion gastrique a lieu dans l‘estomac (50 mL vide, jusqu‘à 4 L plein) dont la
fonction est de stocker, dissoudre et digérer partiellement les particules alimentaires et de
réguler la vidange gastrique. Lorsqu‘il est vide, l‘estomac effectue des mouvements de
brassage avec des ondes péristaltiques du haut vers le bas de l‘organe et son pH moyen est
de 1.5 (Hoebler et al., 2002). L‘arrivée du bol alimentaire arrête ces mouvements afin que
le bol se dépose en couches. Cet arrêt est de 30 – 60 min pour un repas complet. Par la
suite, les ondes reprennent dans le but de mélanger le bol alimentaire aux enzymes et autres
constituants du suc gastrique et ce, jusqu‘à ce que le contenu soit à un pH de 2 - 3 (Armand
et al., 1994; Hoebler et al., 2002), que les particules soient inférieures à 2 mm, et que les
gouttelettes lipidiques des émulsions soient inférieures à 100 µm (Mourot et al., 1988;
Armand et al., 1994).
Le phénomène par lequel le contenu de l‘estomac atteint le petit intestin est appelé la
vidange gastrique. Elle contrôle la vitesse d‘apparition des nutriments dans le sang et en
36
particulier celle des AA libres (Gaudichon et al., 1994; Mahe et al., 1996). Cette vidange
est dépendante de la nature des nutriments. Par exemple, les caséines qui coagulent dans
l‘estomac auront une vidange gastrique plus lente comparé aux protéines du lactosérum qui
sont solubles (Boirie et al., 1997).
Tout au long de la paroi stomacale se trouvent des glandes qui sécrètent de l‘acide
chlorhydrique afin de réguler le pH du contenu stomacal. Le pH acide est important
puisqu‘il aide à la dissolution des particules alimentaires (Widmaier et al., 2011) et altère
l‘ionisation des molécules, en particulier celle des protéines. L‘acidité dissocie le réseau
protéique des aliments qui constitue souvent le réseau structural de l‘aliment. L‘acidité
inhibe aussi l‘α-amylase qui avait été sécrétée dans la bouche et a un rôle antibactérien
contre certaines bactéries apportées avec l‘alimentation.
Le mucus sécrété par les cellules à mucus (un type de cellules épithéliales gastriques) est
une substance visqueuse faite de mucines (glycoprotéine), de globules blancs, d‘eau et de
débris cellulaires. Le mucus recouvre la muqueuse épithéliale gastrique et la protège
physiquement et chimiquement contre l‘acidité et les enzymes gastriques.
Tout au long de la paroi stomacale, des glandes sécrètent aussi des pepsinogènes qui sont
convertis dans la lumière de l‘estomac en pepsine (unique protéase stomacale) sous l‘action
de l‘acide. Ces glandes sécrètent aussi la lipase gastrique, laquelle est active en milieu
acide. Les enzymes stomacales sont spécifiques aux nutriments et aux liaisons chimiques
(détaillé à la section 1.4.2). La présence des enzymes peut moduler la digestion des
nutriments dont elles ne sont pas spécifiques. Par exemple, des isoflavones incorporées
dans des globules de gras laitiers avant la fabrication de crèmes seraient moins
bioaccessibles en présence de pepsine (protéase) que sans pepsine (Sanz and Luyten, 2007).
Les pepsines coaguleraient et affecteraient les protéines présentes autour des globules de
gras, lesquels seraient alors déstabilisés et coaguleraient par la suite avec la protéase ; les
isoflavones deviendraient alors inaccessibles (Sanz and Luyten, 2007). Aussi, certaines
isoflavones solubilisées dans le milieu digestif avant la coagulation des pepsines pourraient
coaguler avec les protéases (Sanz and Luyten, 2007).
37
En fin de digestion gastrique, un chyme est obtenu. Le chyme contient des fragments
moléculaires de protéines et d‘amidon (seul PS hydrolysable lors de la digestion gastrique),
des gouttelettes lipidiques, des sels et de l‘eau, ainsi que les autres molécules ingérées avec
les aliments. Seules les molécules d‘eau peuvent traverser l‘épithélium gastrique.
1.4.1.3 Les caractéristiques de la digestion intestinale
Le petit intestin est un tube de 2.4 cm de diamètre et de 3 m de long, allant de l‘estomac au
gros intestin. Le petit intestin se divise en trois parties : le duodénum (le plus court
fragment), le jéjunum et l‘iléum (le plus long fragment). Deux organes majeurs, le pancréas
et le foie, sécrètent des substances qui circulent jusqu‘au duodénum.
Le pancréas est une glande ayant deux fonctions, endocrine et exocrine. Seulement la
fonction exocrine est directement impliquée dans le tractus GI. Le pancréas sécrète les
enzymes digestives et un fluide riche en carbonate (HCO3-). Les enzymes hydrolytiques du
petit intestin coupent les molécules glucidiques, lipidiques et protéiques intactes ou
partiellement digérées dans l‘estomac en monosaccharides, acides gras et peptides et/ou
acides aminés, respectivement (Widmaier et al., 2011). Le fluide permet de neutraliser le
chyme acide venant de l‘estomac, car celui-ci inactiverait la sécrétion d‘enzymes dans le
petit intestin. Le pH de l‘intestin vide est de 8.
Le foie a une variété de fonctions (nommées fonctions hépatiques) telles que des fonctions
endocrines, exocrines, métaboliques (voies glucidique, protéique, lipidique), etc. Au niveau
digestif, la fonction exocrine principale du foie est la sécrétion de bile. La bile contient du
HCO3-, du cholestérol, des phospholipides, des déchets organiques et des traces de métaux,
de même que des sels biliaires dont le rôle est très important dans la digestion lipidique
(Sanz et al., 2007; Sanz and Luyten, 2007). Les sels biliaires solubilisent les diètes
lipidiques et ainsi augmentent le taux de digestion et d‘absorption des lipides. Walsh et al.
(2003) ont montré que la micellarisation d‘isoflavonoides par les sels biliaires est requise
pour une bioaccessibilité optimale.
38
Tout au long du petit intestin, le bol alimentaire (chyme digéré dans l‘intestin) avance grâce
à la contraction des muscles lisses de la paroi intestinale. Ces derniers permettent le
mélange du contenu de la lumière intestinale avec les différentes sécrétions, l‘avancée du
contenu de la lumière à la surface épithéliale où l‘absorption a lieu, et l‘avancée du bol
alimentaire jusqu‘au gros intestin.
En plus des actions mécaniques, l‘action des enzymes digestives sur la matrice alimentaire
est primordiale pour rendre les nutriments bioaccessibles et biodisponibles.
1.4.2 La digestion enzymatique des nutriments essentiels
1.4.2.1 La digestion enzymatique des glucides
Lors d‘une diète équilibrée, deux tiers des glucides de l‘aliment proviennent des PS
végétaux tels que l‘amidon et la cellulose, le tiers restant représente l‘apport en saccharose
et lactose (disaccharides). Seul l‘amidon est hydrolysable avant le gros intestin. Les fibres,
cellulose et PS végétaux non digestibles dans le petit intestin, se retrouvent dans le côlon où
ils pourront être partiellement ou totalement hydrolysés par des bactéries possédant les
enzymes nécessaires (comme les cellulases pour hydrolyser la cellulose) (Grabitske and
Slavin, 2008).
L‘hydrolyse de l‘amidon débute dès l‘étape buccale avec l‘α-amylase salivaire et continue
dans la partie supérieure de l‘estomac. Les amylases hydrolysent les liaisons α (1 - 4) des
amyloses et amylopectines. L‘hydrolyse de l‘amidon s‘achève dans l‘intestin grêle avec
l‘amylase pancréatique. Les produits des amylases sont le maltose (disaccharide) et des
oligosaccharides composés de molécules de glucose et fructose. Ces courtes chaînes
glucidiques et tous les disaccharides présents sont scindés en monosaccharides par des
enzymes (lactase, maltase, etc.) localisées sur les bordures des cellules épithéliales de
l‘intestin.
L‘hydrolyse des PS autres que l‘amidon conduira à la production de monosaccharides
transformés par les bactéries coliques en acides gras volatils à chaîne courte, source
énergétique indispensable à l‘étape digestive dans le côlon. Cette étape comprend le
39
mélange du contenu digestif pour favoriser le processus de digestion colique et l‘absorption
du sodium et de l‘eau, l‘activité propulsive assurant le transit du contenu et le stockage
temporaire des fèces.
1.4.2.2 La digestion enzymatique des lipides
L‘hydrolyse des lipides débute dans l‘estomac. Les lipides des aliments, sous forme de
globules de gras, sont insolubles dans l‘eau. Les globules s‘agrègent pour former des
gouttelettes dans la partie supérieure de l‘estomac et la lipase gastrique peut hydrolyser les
triglycérides à chaînes courtes. La digestion gastrique des lipides est faible (10 – 30 % de la
lipolyse digestive totale). La majorité de la lipolyse a lieu dans l‘intestin grêle par les
lipases pancréatiques. À ce niveau, la désagrégation mécanique des globules de gras et la
présence des sels biliaires et d‘agents émulsifiants, qui empêchent la réagrégation des
gouttelettes, permettent l‘émulsification des graisses et leur digestion. Les lipases
pancréatiques hydrolysent les liaisons esters en positions 1 et 3 des glycérols des
triglycérides à chaîne longue (Widmaier et al., 2011). La lipase, hydrosoluble, a une action
uniquement en surface des gouttelettes ; une colipase aide son adhésion aux gouttelettes
émulsionnées. Les acides gras et les monoacylglycérols obtenus se complexent au
cholestérol et aux vitamines liposolubles pour former des micelles avant leur absorption.
D‘autres lipases sont présentes dans l‘intestin, notamment des phospholipases qui
hydrolysent les phospholipides et des estérases, lesquelles digèrent les esters de cholestérol
alimentaire en cholestérol libre et acides gras libres.
1.4.2.3 La digestion enzymatique des protéines
Les protéines sont scindées en peptides et AA pendant leur passage dans le tractus GI et ce,
quelque soit leur source. L‘hydrolyse des protéines commence dans l‘estomac avec la
pepsine qui coupe les liens peptidiques précédant les AA aromatiques Tyr, Trp et Phe. Au
niveau de l‘intestin, il existe trois endopeptidases. La trypsine coupe les liens peptidiques
qui se trouvent à l‘extrémité COOH (C Terminal = Ct) des AA Lys et Arg, la
chymotrypsine coupe les liens en Ct des AA aromatiques et des Leu et Met, et l‘élastase
scinde l‘élastine et les petits AA hydrophobes en Ct (Ala et Val) et la Gly. Une fois les
protéines scindées en peptides, les carboxypeptidases et les aminopeptidases pancréatiques
40
libèrent les AA des extrémités carboxyles et amines des chaînes peptidiques,
respectivement.
Une fois libérés, les nutriments doivent être absorbés au niveau de l‘épithélium intestinal
pour être biodisponibles. La biodisponiblité représente le résultat final de l‘absorption, de la
distribution et de la conversion métabolique des composés bioactifs dans le corps et leur
élimination via l‘urine et les fécès.
1.4.3 L’absorption des produits de digestion des nutriments essentiels
Les produits de digestion sont absorbés le long des cellules de l‘épithélium intestinal et
entrent dans le sang ou la lymphe. La plupart des chymes entrant dans l‘intestin sont
absorbés dans le premier quart du petit intestin, soit le duodénum et le jéjunum. Avec la
grande capacité d‘absorption du petit intestin, seule une faible partie de l‘eau, des sels et du
matériel non digéré passe dans le gros intestin. La plupart des ions sont absorbés par des
transports actifs et l‘eau diffuse passivement selon les gradients osmotiques. Les
monosaccharides, les acides gras et les AA gagnent le sang par différents types de
transporteurs.
1.4.3.1 L’absorption des monosaccharides
Les monosaccharides libérés dans l‘intestin grêle atteignent le sang par deux voies de
transport successives. Leur entrée dans les cellules épithéliales se fait par transport
spécifique (transporteurs SGLT) selon la nature du sucre. Par exemple, SGLT-1 est le
transporteur du glucose, alors que SGLT-2 est le transporteur du galactose. Ce transport est
actif secondaire (couplée à un transport de Na+). Ensuite, la sortie des cellules épithéliales
pour entrer dans la circulation sanguine se fait par diffusion facilitée (transporteur GLUT).
La majorité des glucides est digérée et absorbée dans les premiers 20 % de l‘intestin grêle
(duodénum et jéjunum). Les autres glucides sont digérés dans le gros intestin par les
bactéries coliques comme mentionné dans la section 1.4.2.1.
41
1.4.3.2 L’absorption des acides gras
Les produits de la digestion des lipides (acides gras, monoglycérides, cholestérol, etc.) sous
forme de micelles sont en équilibre avec les mêmes produits de digestion sous forme libre
dans la lumière intestinale. Les molécules libres sont absorbées par diffusion au niveau du
jéjunum. Lors de leur transport dans les cellules épithéliales, il y a reformation des
triglycérides et les micelles reviennent dans la lumière intestinale. Ces micelles se
complexent avec d‘autres produits de digestion libres qui seront absorbés par diffusion, ou
bien ces micelles sont absorbées dans l‘iléum pour subir un recyclage entéro-hépatique.
1.4.3.3 L’absorption des tri/di-peptides et des acides aminés
Les produits de digestion des protéines sont constitués d‘environ deux tiers de tri/di-
peptides et un tiers d‘AA libres (Adibi and Mercer, 1973). Les peptides de deux ou trois
AA traversent la membrane des cellules épithéliales par un transport actif secondaire couplé
au gradient d‘ions hydrogène. Ce transport actif requière de l‘énergie (ATP = adénosine
triphosphate). Une fois dans la cellule épithéliale, ces courts peptides sont hydrolysés en
AA par des tri- et di-peptidases. Le passage des AA de la lumière intestinale aux cellules
épithéliales se fait par transport actif secondaire couplé au Na+ dans le duodénum. Ensuite
les AA sortent des cellules épithéliales et gagnent la circulation sanguine par un transport
actif. L‘énergie nécessaire est fournie par des pompes Na+/K
+AT-ase. Il existe plusieurs
transporteurs aux spécificités différentes pour les 20 types d‘AA (Widmaier et al., 2011).
1.4.4 L’importance de l’étude de la digestion protéique
Les AA sont importants pour le métabolisme humain car ils servent à la synthèse de
diverses molécules en plus des protéines. Ils servent, par exemple, à la production d‘énergie
sous forme d‘ATP. Les AA contiennent des groupements amide, qui une fois éliminés,
seront métabolisés en composés intermédiaires entrant dans la voie glycolytique ou dans le
cycle de Krebs, deux voies métaboliques (directe ou indirecte) produisant l‘énergie
cellulaire (Widmaier et al., 2011).
Les AA sont en continuel « turn-over » et ainsi, ils sont nécessaires à la synthèse des
protéines corporelles et la synthèse de dérivés d‘AA et constituent une source de substrats
42
pour la conversion en glucides et lipides. L‘alimentation peut fournir les 20 AA principaux
dont 11 sont aussi synthétisés par l‘organisme à partir des groupements amine apportés par
les AA de l‘alimentation. Les 9 AA non synthétisés par l‘organisme sont dits essentiels et
doivent provenir de l‘alimentation. La teneur en protéines d‘une diète est corrélée
positivement au niveau d‘activité des voies métaboliques impliquant des molécules azotées
dans le tractus digestif et dans le reste du corps. Cependant, un taux excessif limite
potentiellement l‘absorption intestinale et réduit ainsi le pourcentage d‘absorption des
peptides et des AA (Ten Have et al., 2007).
La composition des aliments influence les flux endogènes des nutriments. Moughan et al.
(2005) ont observé chez des hommes qu‘une diète contenant des peptides de caséines
augmentait les flux endogènes des AA présents dans l‘iléum et entrant dans le côlon (vs
une diète sans protéines). Ces flux d‘AA viendraient de la sécrétion endogène d‘AA suite à
la présence des peptides dans l‘intestin et ces AA ne seront pas utilisés par l‘organisme
(Moughan et al., 2005). La nature de la protéine influence aussi les mécanismes de
sécrétion des fluides de digestion. Il a été démontré que la perfusion d‘un hydrolysat d‘α-La
stimulait la décharge de mucine dans des jéjunum de rats, alors que la perfusion d‘un
hydrolysat d‘albumine d‘œuf n‘avait pas d‘effet significatif sur cette sécrétion (Claustre et
al., 2002). La nature de la protéine module aussi le taux d‘absorption des AA qui la
composent (Boirie, 2004; Ten Have et al., 2007). Il est connu que les protéines animales et
végétales n‘ont pas la même biodisponibilité. En effet, il a été démontré que des caséines
avaient une absorption gastro-intestinale 10 – 15 % plus importante que des protéines de
soya chez l‘humain (Baglieri et al., 1995). Les différentes protéines animales ne donnent
pas la même biodisponibilité de leurs AA non plus. Par exemple, il a été démontré que les
protéines du blanc d‘œuf avaient un taux d‘AA totaux postprandial 50 % plus bas que celui
obtenu suivant la consommation de protéines de fromage cottage (Nuttall and Gannon,
1990).
L‘absorption des AA peut modifier les réponses postprandiales. Nilsson et al. (2004) ont
montré que les consommations de protéines de lactosérum et de lait reconstitué donnaient
un indice glycémique moins important que celui du pain (teneurs glucidiques équivalentes)
43
(Nilsson et al., 2004). Les deux produits laitiers n‘ont pas eu la même réponse
insulinémique : les protéines de lactosérum ont augmenté significativement l‘aire sous la
courbe (0 – 90 min) de l‘insuline comparée au lait en poudre (teneurs glucidiques et
protéiques équivalentes) (Nilsson et al., 2004).
La biodisponibilité des nutriments dépend de leur bioaccessibilité lorsque la matrice
alimentaire est digérée dans le tractus GI. Ainsi, il est important d‘analyser la
bioaccessibilité des nutriments de la matrice alimentaire dans le milieu digestif (in vitro)
pour mieux comprendre la biodisponibilité (in vivo) qui en résulte (Hedrén et al., 2002).
Les études de bioaccessibilité préliminaires à celles de biodisponibilité permettent de mieux
cibler ces dernières qui sont des études coûteuses.
1.4.5 L’impact de la microstructure de l’aliment et de la matrice alimentaire sur la
bioaccessibilité et la biodisponibilité des nutriments
La microstructure d‘un aliment est définie par l‘arrangement spatial des moléculesle
constituant et leur interaction à une échelle inférieure à 100 µm (Parada and Aguilera,
2007). La microstructure définit la matrice de l‘aliment ((> 1mm) qui est d‘origine
cellulaire (cellules de plantes par exemple) ou bien résulte d‘un processus de fabrication,
artisanal ou industriel.
1.4.5.1 L’impact de la microstructure de l’aliment
La plupart des études sur l‘effet de la microstructure sur la biodisponibilité ont été réalisées
sur des fruits et légumes et ont montré que la biodisponibilité de plusieurs de leurs
composés d‘intérêt nutritionnel est limitée par leur structure et surtout par leur interaction
avec d‘autres nutriments. Par exemple, les xanthophylles et les folates se lient
respectivement avec les lipides et les protéines diminuant leur biodisponiblité (Parada and
Aguilera, 2007; Sanz and Luyten, 2007).
D‘autres études comparant plusieurs types de diètes ont montré l‘effet de la composition en
nutriments sur la biodisponibilité des nutriments présents dans les diètes. Par exemple,
l‘addition de glucides dans une diète protéique stimulerait la digestion protéique et la
44
rétention intestinale de l‘azote et ainsi limiterait les pertes azotées sous forme
d‘urée (Deutz et al., 1995). De plus, la complexation irréversible de certaines protéines
avec les glucides, lors de réactions de Maillard, rend la Lys inaccessible pour l‘organisme
(Lundin et al., 2008).
Les fibres alimentaires peuvent altérer la digestion et l‘absorption des lipides émulsionnés
par interaction directe avec les lipases et/ou co-lipases, réduisant ainsi leur activité
enzymatique, ou en formant une couche protectrice autour des globules de gras
(McClements et al., 2009). Ou et al. (2001) ont montré in vitro que des fibres solubles et
insolubles peuvent adsorber le glucose en solution lorsqu‘il est à une concentration
supérieure à 0.5 mmole/L, et ainsi pourrait expliquer l‘action des fibres sur l‘absorption du
glucose sanguin in vivo.
Il a aussi été montré que des molécules liposolubles (vitamine D et isoflavones) ont une
absorption positivement corrélée à la présence de lipides dans l‘aliment (Borel, 2003; Sanz
and Luyten, 2006).
L‘ensemble des nutriments forme la microstructure de l‘aliment et définissent ainsi la
matrice alimentaire dont la digestion peut dépendre de ses caractéristiques macroscopiques.
1.4.5.2 L’impact de la matrice alimentaire
À l‘échelle macroscopique, il est connu que les aliments liquides sont généralement digérés
plus rapidement que les aliments solides. Ces derniers ont une digestion en deux étapes
(désintégration et dissolution), contrairement aux liquides qui ne subissent que l‘étape de
dissolution (Kong and Singh, 2008a). Oka et al. (2003) ont montré chez le rat que deux
diètes de même composition nutritionnelle, de même forme et de même taille, l‘une diète
standard et l‘autre molle (standard avec de l‘air), données à des rats, n‘ont pas le même
effet postprandial. En effet, la diminution d‘activité des muscles buccaux avec la diète
molle entrainerait une baisse d‘énergie postprandiale (mesurée par la température du corps)
et augmenterait la mise en réserve des lipides (Oka et al., 2003).
45
La viscosité du bol alimentaire aurait aussi un impact sur sa digestion. Par exemple, l‘ajout
d‘alginate à certains aliments liquides entraînerait la formation d‘une structure gélifiée au
contact du milieu acide de l‘estomac et ralentirait la vidange gastrique. Ce ralentissement
varierait selon le type d‘alginate utilisé (Norton et al., 2006). D‘autres PS, dont des fibres
solubles et insolubles, forment un gel qui emprisonne les nutriments et prolongeraient aussi
le temps de la vidange gastrique du gel, puis retarderaient l‘apparition des nutriments dans
la lumière intestinale et ainsi, retarderaient leur absorption (Howarth et al., 2001). La
digestion de glucides peut être retardée, diminuant alors les niveaux de glucose sanguin.
Dans les modèles de digestion in vitro, il a été démontré que des fibres ralentissaient
également la digestion des caséines et de la β-Lg (Acton et al., 1982; Mouecoucou et al.,
1993; Mouecoucou et al., 2003). In vitro et in vivo, des auteurs ont montré que
l‘augmentation de la viscosité de la solution aqueuse de fibres peut réduire la coalescence
des gouttelettes lipidiques dans l‘estomac et dans le petit intestin ou ralentir le transport des
molécules susceptibles de se fixer aux surfaces des gouttelettes lipidiques, comme les
lipases (Pasquier et al., 1996; McClements et al., 2009). Cependant, toutes les fibres n‘ont
pas le même effet. Par exemple, il a été démontré que des pectines HM induisaient des
baisses plus importantes de la concentration en lipides sanguins que le β-glucan (Sanchez et
al., 2008).
Des aliments contenant les mêmes types de nutriments (protéines laitières par exemple)
issus de procédés de fabrication différents peuvent ne pas donner les mêmes
caractéristiques de digestion (nature des produits de digestion, vitesse de digestion, etc).
1.4.6 L’impact de la structure physico-chimique des nutriments et des procédés
technologiques lors du processus de fabrication des aliments sur la
bioaccessibilité et la biodisponibilité des nutriments
1.4.6.1 L’impact de la structure physico-chimique des nutriments
La structure de chaque nutriment dans l‘aliment peut influencer leur bioaccessibilité
comme par exemple l‘état physique des lipides, leur organisation dans l‘émulsion
(composition interfaciale des gouttelettes, etc), etc. Laforme cristalline des lipides entraine
une hydrolyse lipidique plus lente qu‘avec des lipides sous forme liquide (McClements et
46
al., 2009). En plus de la forme physique des lipides, la composition interfaciale des
gouttelettes lipidiques d‘émulsions est primordiale pour la bioaccessibilité des acides gras,
car elle affecte le taux de digestion des lipides par modulation de l‘adsorption des lipases
gastriques ou pancréatiques, colipases, phospholipides et sels biliaires (McClements et al.,
2009). Malgré l‘importante surface des gouttelettes d‘émulsions de petits diamètres,
l‘hydrolyse des lipides en présence de caséines serait ralentie car les caséines formeraient
un gel avec les gouttelettes finement dispersées (Michalski et al., 2006).
Au niveau des protéines, la majorité de la documentation sur l‘impact de leur structure
physico-chimique sur la digestion porte sur la précipitation des caséines au pH acide de
l‘estomac, et leur nomination de « protéines lentes » comparativement aux protéines du
lactosérum (« protéines rapides ») qui sont solubles (Mahe et al., 1996; Boirie, 2004). Le
brevet « Matière protéique à digestion ralentie et son utilisation » (Ballevre et al., 2001) est
un exemple d‘utilisation d‘une matière protéique dont la vitesse de digestion a été diminuée
pour la préparation d‘une composition permettant de moduler le taux plasmatique
postprandial en AA. Cette matière contient des protéines gélifiées microparticulées,
pouvant être des hydrolysats de caséines (casomorphines) associées à des PS (Ballevre et
al., 2001).
1.4.6.2 L’impact des procédés technologiques
Les processus subis par les lipides (barattage, émulsification, homogénéisation) peuvent
modifier leur digestion (Lai et al., 1995). L‘homogénéisation cause de profonds
changements de la structure physique des lipides du lait lors de la diminution de la taille
des globules de gras (McClements et al., 2009). Michalski (2007) a cité les travaux de
Sieber et al. (1997) qui ont montré que le gras de lait homogénéisé est plus facilement
digestible que le gras de lait non traité chez des patients souffrant de maladies digestives.
Plusieurs étapes des procédés laitiers peuvent influencer la digestion des protéines. Les
traitements de haute pression causent un déploiement des protéines et l‘exposition des sites
actifs pour les protéases, augmentant ainsi les taux de protéolyse (Lundin et al., 2008). La
dénaturation thermique de la β-Lg favorise son déploiement et augmente ainsi sa
47
susceptibilité à la protéolyse pepsique (Mullally et al., 1998). Cependant, des traitements
thermiques sévères favorisent l‘agrégation de la β-Lg et réduisent sa digestibilité
(Carbonaro et al., 1998). La β-Lg peutt aussi s‘associer à la caséine κ lors d‘un chauffage
par un pont disulfure. Dupont et al. (2010a) ont montré avec un modèle de digestion
infantile in vitro que le chauffage des caséines ne fait pas disparaitre leur immunoréactivité
lors de leur digestion GI, signifiant que des zones allergènes de la protéine sont résistantes
à l‘hydrolyse des différentes protéases digestives dans les conditions du modèle. Le même
système de digestion infantile a permis de montrer, par migration électrophorétique sur
gels, une plus faible résistance à l‘hydrolyse pour des protéines d‘un lait stérilisé comparé à
celles d‘un lait non traité thermiquement, d‘un lait pasteurisé et d‘un yogourt fait à partir de
lait pasteurisé (Dupont et al., 2010b). Lacroix et al. (2008) ont montré que l‘utilisation
métabolique postprandiale de l‘N protéique d‘un lait traité à ultra haute température (UHT)
est plus importante que celle de l‘N de protéines d‘un lait pasteurisé. Ce résultat serait
expliqué par la vitesse de digestion protéique plus rapide suivant l‘ingestion du lait UHT
(Lacroix et al., 2008).
La succession d‘unités de production dans un procédé de fabrication peut aussi influencer
la digestion des protéines laitières. Par exemple, dans l‘estomac, les caséines d‘un lait
pasteurisé non homogénéisé coaguleraient et seraient digérées moins vite que celles d‘un
lait stérilisé et homogénéisé (Buchheim, 1984).
La digestion des aliments est fonction de la matrice alimentaire et de sa microstructure.
Ainsi, la digestion d‘un aliment dépend des nutriments qui le composent et de leurs
interactions, et est fonction du processus de fabrication dont l‘aliment est issu. La digestion
in vitro des aliments doit être évaluée avec des modèles de digestion performants afin de
définir la bioaccessibilité et la biodisponibilité de ses nutriments.
1.4.7 La digestion in vitro des protéines
Comme il est difficile d‘entreprendre des études de la digestion GI chez l‘humain (coût,
durée, étapes invasives), les modèles de digestion in vitro ont été très utilisés pour étudier
les systèmes de délivrance des molécules bioactives protégées par encapsulation
48
(McClements et al., 2009). Le largage des nutriments de la matrice alimentaire est de plus
en plus évalué en utilisant des systèmes de digestion in vitro qui permettent de cribler les
effets de la matrice alimentaire sur la digestion de ses nutriments ou autres molécules la
composant (Hur et al., 2010). La bioaccessibilité de mycotoxines d‘aliments solides
(Versantvoort et al., 2005), le transport de minéraux comme le fer (Bering et al., 2006), la
minéralisation de caroténoïdes (Garrett et al., 1999; Huo et al., 2007), la digestibilité
d‘amidons (Wolf et al., 1999) ou du lait (Almaas et al., 2006), ou encore le profil
peptidique de digestats de protéines de viande (Gatellier and Santé-Lhoutellier, 2009) et de
la β-Lg (Moreno et al., 2008) ont été évalués dans différentes études in vitro. Les
conditions de digestion adoptées diffèrent suivant la nature de la matrice alimentaire, le
composé de l‘aliment qui est analysé et le niveau de sophistication du modèle (Hur et al.,
2010), le but de ces modèles étant de mimer les conditions physiologiques humaines.
La présence de protéases est essentielle à la digestion des protéines. Au niveau gastrique, la
pepsine est indispensable pour débuter la protéolyse digestive. Au niveau duodénal, le trio
enzymatique trypsine, chymotrypsine, peptidases augmenterait la protéolyse de 39 à 66 %
par rapport à une digestion avec le duo enzymatique trypsine, chymotrypsine (Abdel-Aal
and Rabalski, 2008). La présence du trio permettrait d‘être plus proche des conditions in
vivo. La présence d‘autres enzymes telles que les amylases et les lipases permet
d‘hydrolyser les autres nutriments de la matrice, amidon et lipides respectivement. Par ces
hydrolyses, la matrice serait plus dégradée et dans un état proche de celui qui serait obtenu
en conditions in vivo.
Les formulations des solutions digestives sont aussi importantes. Les sels entrent en jeu sur
la valeur de pH des solutions, mais aussi dans les interactions avec les nutriments. Les sels
peuvent déstabiliser une matrice alimentaire et aider à sa digestion. Les jus gastriques
peuvent être issus de prélèvements chez l‘humain comme ceux utilisés lors de la digestion
de laits bovin et caprin (Almaas et al., 2006) ou lors de la digestion de lait maternel dans un
modèle de digestion infantile (Chatterton et al., 2004). Certains modèles utilisent des
solutions digestives de composition chimique simple comme des jus gastriques fait de
pepsine dans une solution d‘HCl (Parrot et al., 2003), alors que d‘autres solutions sont de
49
composition complexe par la présence de plusieurs sels (Oomen et al., 2003; Versantvoort
et al., 2005; Dupont et al., 2010a) et des protéines autres que les enzymes digestives comme
la mucine (glycoprotéine) (Versantvoort et al., 2005; Kong and Singh, 2008b). Plus le
milieu de digestion est complexe, plus il est proche des conditions in vivo.
Kong and Singh (2008b) ont développé un modèle, adapté d‘un modèle utilisé en
pharmacie, afin d‘étudier la désintégration d‘aliments solides en conditions gastriques. Les
aliments, de taille représentative de la fin de la digestion buccale, sont placés sur un support
dans un cylindre de verre équipé d‘un analyseur de texture et rempli de la solution
gastrique. La rotation permet la destruction mécanique par des forces de friction, et les
matrices sont en contact avec la pepsine durant 2 h. Afin de mimer les temps de résidence
dans l‘estomac et dans le petit intestin observés pour différents aliments, les durées des
phases gastrique et intestinale peuvent varier selon la matrice alimentaire (Hur et al., 2010).
Par exemple, Parrot et al. (2003) ont mis au point un système de digestion GI pour évaluer
la digestion protéique d‘extraits solubles d‘un fromage Emmental avec une digestion
gastrique de 30 min, suivie d‘une digestion intestinale de 4 h en présence de trypsine et
pancréatine; la digestion a été réalisée dans des erlenmeyers sous agitation. La
bioaccessibilité de composés phénoliques, de glucosinolates et de vitamine C contenus dans
des brocolis, de même que la bioaccessibilité de flavones contenus dans un jus d‘orange ont
été mesurées après 2 h de digestion gastrique en présence de pepsine et 2 h de digestion
intestinale en présence de pancréatine et sels biliaires dans des tubes (Gil-Izquierdo et al.,
2003; Vallejo et al., 2003).
La bioaccessibilité de nutriments de matrices alimentaires complexes est souvent évaluée
dans des modèles de digestion très proches des conditions physiologiques par la
composition des sucs, mais aussi par les différentes étapes digestives du modèle (Cabañero
et al., 2004; Versantvoort et al., 2005). Cabañero et al. (2004) ont étudié la bioaccessibilité
du sélénium dans des poissons avec un modèle mimant la digestion de la bouche à
l‘intestin. Le modèle développé par Versantvoort et al. (2004), adapté de celui d‘Oomen et
al. (2003), a permis d‘étudier la bioaccessibilité de mycotoxines dans des arachides
(Versantvoort et al., 2005) et compte également les trois étapes de digestion GI (buccale,
50
gastrique, duodénale). Ces trois étapes sont essentielles pour l‘étude de la digestion de
protéines présentes dans une matrice alimentaire afin de se rapprocher des conditions
physiologiques humaines. Le modèle de Versantvoort et al. (2004) est aussi intéressant par
les solutions de digestion employées qui contiennent différents sels (minéraux et biliaires)
et toutes les enzymes digestives, conditions se rapprochant également des conditions
physiologiques. Ce modèle de digestion a été utilisé récemment pour la digestion d‘un lait
et a permis de suivre l‘apparition des peptides et des AA libres (Kopf-Bolanz et al., 2012).
La biodisponibilité des nutriments est étudiée pour évaluer l‘impact de son ingestion, en
solution ou dans un aliment, sur l‘organisme. Par exemple, il a été suggéré par plusieurs
auteurs que le lait et les produits laitiers aient des impacts nutritionnels et métaboliques
uniques par l‘influence de leur structure sur la digestion et l‘absorption de leurs nutriments
tels que les AA (Savoie et al., 1989; Hall et al., 2003; Nilsson et al., 2004; Nilsson et al.,
2007; Argov et al., 2008; Lacroix et al., 2008). L‘impact métabolique de l‘ingestion de
nutriments en solution ou dans des matrices alimentaires sera décrit dans les sections
suivantes.
1.5 Les réponses métaboliques suite à la digestion gastro-intestinale
Lorsque les nutriments ingérés gagnent le sang à partir du tractus GI, on parle d‘état
absorptif, suivi de l‘état post-absorptif pendant lequel le tractus GI est vide de nutriments et
l‘énergie vient alors de réserves corporelles. Lors de l‘état absorptif, le glucose sanguin
augmente, ce qui permet de définir la glycémie postprandiale. Deux hormones
pancréatiques, l‘insuline et le glucagon, régissent la transition entre la phase d‘absorption
alimentaire et le jeûne, et vice-versa. La glycémie et les sécrétions d‘insuline, de C-peptide
et de glucagon seront détaillées dans les sections suivantes.
1.5.1 La réponse glycémique
La glycémie est définie comme la concentration de glucose dans le plasma sanguin. À la
suite de l‘ingestion d‘un aliment, cette concentration augmente par rapport à la valeur à
jeun. En 1981, Jenkis et al. ont défini le concept d‘indice glycémique qui quantifie la
réponse glycémique aux glucides suite à la consommation de divers aliments. Cet indice est
51
le pourcentage de l‘aire sous la courbe de réponse de la concentration plasmatique de
glucose par rapport à l‘aire sous la courbe de réponse d‘un aliment de référence, le plus
souvent le glucose dont l‘indice est 100 %. Jenkins et al. (1981) ont montré que les légumes
frais donnent l‘indice le plus fort (70 %) et les légumes déshydratés l‘indice le plus faible
(31 %). Les céréales et les produits laitiers ont des indices intermédiaires de 60 % et 35 %,
respectivement (Jenkins et al., 1981). Les produits d‘une même classe peuvent avoir des
indices glycémiques différents. Par exemple, une poudre de lait réhydratée et des protéines
de lactosérum ont un indice glycémique 62 % et 57 % plus bas que celui de pain blanc,
respectivement (Nilsson et al., 2004).
De nombreuses études portant sur des maladies chroniques tels que le diabète de type-2
prennent en compte cet indice (Barclay et al., 2008), car les glucides sont la classe de
nutriment affectant le plus la sécrétion d‘insuline (développée dans la section 1.5.2) et la
glycémie postprandiale (Järvi et al., 1999; Brand-Miller, 2004). Des diètes de faible indice
glycémique sont associées à une diminution du risque de diabètes et de cancers (Salmerón
et al., 1997a; Salmerón et al., 1997b; Barclay et al., 2008). Il a été montré que la
consommation d‘une diète ad libitum de faible indice glycémique, durant 10 semaines,
diminuent la glycémie postprandiale, l‘insulinémie et l‘envie de manger chez des femmes
en surpoids, comparé à une diète de haut indice glycémique (Krog-Mikkelsen et al., 2011).
Les parties suivantes développeront les principaux facteurs hormonaux en lien avec la
glycémie : l‘insuline, le C-peptide (peptide issu de l‘insuline) et le glucagon.
1.5.2 La réponse insulinémique
L‘insuline, parfois appelée « hormone de stockage », est le principal facteur protéique
contrôlant le métabolisme de l‘organisme. Elle est surtout connue pour son effet régulateur
de la glycémie qui sera développé ici, mais elle a aussi un effet sur l‘homéostasie du
potassium, la croissance et la différenciation cellulaire, etc. Seules de petites molécules
monomériques (monosaccharides, acides gras à longue chaîne, AA de conformation
lévogyre, corps cétoniques) peuvent affecter la sécrétion d‘insuline, le glucose étant le plus
puissant stimulant de cette sécrétion. L‘augmentation de ce glucide (> 5 mM) agit sur les
52
cellules β des îlots de Langerhans et stimule la sécrétion de l‘insuline (phase absorptive),
alors que sa baisse inhibe la sécrétion (phase post-absorptive) (Newgard and Matschinsky,
2010). La sécrétion de l‘insuline est maximale avec 10 mM de glucose (Newgard and
Matschinsky 2010). Cette sécrétion active la captation du glucose plasmatique par les
cellules du muscle, les adipocytes et les cellules du foie, la concentration de glucose tend
alors à rejoindre celle avant le repas. Les récepteurs à l‘insuline des différentes cellules sont
sensibles à l‘hormone, mais peuvent devenir moins sensibles ou insensibles chez certains
sujets, obèses ou diabétiques de type-2, respectivement.
La consommation d‘aliments riches en fibres a été associée à des effets bénéfiques pour des
sujets résistants à l‘insuline (Jenkins et al., 2000). Ces effets ont été attribués à
l‘augmentation de la viscosité de la matrice alimentaire par l‘ajout de fibres solubles.
L‘augmentation de viscosité interfère avec l‘activité enzymatique, la vidange gastrique et le
transport du glucose à l‘épithélium intestinal pour son absorption (Karhunen et al., 2008).
À dose équivalente, il a été démontré qu‘une consommation d‘amidon induisait une
sécrétion d‘insuline plus faible que celle suivant une consommation de glucose (Karhunen
et al., 2008). Des fibres insolubles issues de produits céréaliers, présentes dans des diètes de
faible indice glycémique, ont aussi diminué la sécrétion d‘insuline car elles ne sont pas
digérées par les enzymes digestives humaines mais sont hydrolysées par les bactéries
coliques (Jenkins and Jenkins, 1985).
Les protéines stimulent la sécrétion d‘insuline et ce différemment selon leur source. Les
protéines laitières apportées par la consommation de fromage cottage produisent une plus
forte sécrétion d‘insuline comparé aux réponses suivant la consommation de poisson
(cabillaud) ou de végétaux (isolat de protéines de soya) (von Post-Skagegard et al., 2006).
De plus, les protéines de lactosérum stimulent plus fortement la sécrétion d‘insuline que les
caséines (Nilsson et al., 2007). Ce comportement a été expliqué par une digestion plus lente
et un retard d‘apparition des AA dans le plasma pour les caséines (Dangin et al., 2001). La
nature des AA est aussi importante. Les BCAA (Leu, Ile, Val), ainsi que Ala, Glu, et Lys,
ont été montrés comme molécules stimulant la sécrétion de l‘insuline en présence de
glucose (2.5 à 5 mM) (Floyd et al., 1966; Nilsson et al., 2004; Karhunen et al., 2008).
53
a) b)
Seule la Leu stimulerait cette sécrétion même en absence de glucose (Karhunen et al.,
2008).
Les lipides influencent aussi la sécrétion d‘insuline. L‘augmentation de la concentration
plasmatique d‘acides gras stimulerait la sécrétion d‘insuline à court terme (Newgard and
Matschinsky, 2010). Après un jeûne, la présence d‘acides gras non-estérifiés serait
nécessaire pour que le glucose stimule la sécrétion d‘insuline (Stein et al., 1996). La
sécrétion d‘insuline est plus importante lors de la perfusion d‘acides gras à longues chaînes
que lors de la perfusion d‘acides gras saturés à moyenne chaîne chez des rats (Stein et al.,
1997).
L‘insuline étant une hormone peptidique, ses effets passent par sa fixation sur des
récepteurs spécifiques des membranes plasmatiques des cellules cibles, déclenchant des
changements dans les voies protéiques de transport membranaire et dans les voies
enzymatiques cellulaires. L‘insuline est composée de quatre domaines (A, B, C, D)
représentés à la figure 1.11.
Figure 1.11. Représentation schématique de la conformation tridimensionnelle de la
molécule du peptide insuline a) et b) : domaine A en rouge, domaine B en jaune a) et b) ;
domaine C en bleu, domaine D en vert b) (Saltiel and Pessin, 2007).
54
Le domaine C, appelé C-peptide, est perdu lorsque l‘insuline est sécrétée du pancréas et les
domaines A et B se plissent et se lient par des ponts disulfures. Les récepteurs de l‘insuline
(IR 1, 2, 3, 4) sont des récepteurs tyrosine-kinase (RTKs) sous forme de dimères, composés
de deux sous-unités extracellulaires α (sites de liaison) et deux sous-unités
transmembranaires β (domaines tyrosine kinase). Ces derniers changent de conformation et
sont phosphorylés quand les sous-unités α sont liées. Les tyrosine kinases phosphorylent
plusieurs substrats dans la cellule et activent des voies métaboliques (en surface cellulaire,
dans les vésicules intracellulaires ou dans le cytoplasme).
Parmi les substrats du récepteur d‘insuline, les protéines sont les mieux caractérisées, en
particulier les protéines contenant des domaines SH2 (Src homology 2), c‘est-à-dire une
centaine de protéines humaines impliquées dans la communication cellulaire. Par exemple,
la sous-unité régulatrice p85 de la kinase-1A-PI3 (phosphatidylinositol-3-kinase = PI3K)
entre dans la voie de phosphorylation d‘autres protéines. Elle crée des sites de
reconnaissance pour des protéines contenant des domaines spécifiques (DH) au transport du
glucose dans les cellules musculaires et les cellules adipeuses par translocation des
récepteurs GLUT-4 du cytoplasme au plasma (signal 1 sur la figure 1.12). La voie
métabolique PI3-kinase n‘est pas la seule nécessaire au transport du glucose par GLUT-4
en présence d‘insuline. Par exemple, dans les adopicytes différenciés, la voie CAP-Cbl
(protéine associée au Cbl-Cbl) est nécessaire pour la translocation du glucose (Saltiel and
Pessin, 2007).
55
Figure 1.12. Schéma des voies de signalisation impliquant mTOR dans la régulation de la
synthèse des protéines (Wang and Proud, 2006).
L‘insuline a aussi un rôle majeur dans le métabolisme protéique, à la fois dans les réactions
d‘anabolisme et de catabolisme. En absence d‘insuline, des pertes de poids et l‘absence de
croissance du corps ont été observées (Saltiel and Pessin, 2007). La voie métabolique
impliquée ici agirait sur la stimulation de la traduction des ARNm en protéines. Ce contrôle
de la traduction des ARNm passerait par la voie de signalisation basée sur la protéine
kinase Ser/Thr mammalian target of rapamycine (mTOR, cible de la rapamycine chez les
mammifères). Lors de la traduction, cette voie de mTOR intervient dans les étapes
d‘initiation et d‘élongation. Dans les cellules musculaires et les cellules adipeuses, la
présence d‘insuline activerait la voie PI3-kinase(PI3K)/protéines kinase B (PKB) qui
induirait la phosphorylation de TSC2 (pour tuberous sclerosis complex 2) du complexe
TSC1/TSC2 (figure 1.12). Cette phosphorylation inhiberait le rôle d‘activateur de protéine
du complexe (via une activité GPTase) et mTOR serait activé comme le montre la figure
1.12 (Wang and Proud, 2006). Une autre voie indépendante de l‘insuline activerait la voie
56
mTOR. Les BCAA, et en particulier la Leu, activeraient la voie de signalisation mTOR/p70
S6 kinase et inhiberait la voie PI3K (Tremblay and Marette, 2001) (figure 1.12).
La sécrétion d‘insuline est aussi contrôlée hormonalement, notamment par le peptide
insulinotrope glucodépendant (GIP) sécrété par les cellules du tractus GI après l‘ingestion
d‘un repas (Meier et al., 2002).
1.5.3 La production de C-peptide
Le C-peptide est le domaine peptidique C de l‘insuline qui lie les domaines A et B (figure
1.11). En plus de faciliter la liaison entre ces deux domaines, le C-peptide facilite le pliage
et le transport dans le réticulum endoplasmique de l‘insuline. Le C-peptide est un marqueur
de sécrétion de l‘insuline. Les évolutions des concentrations en insuline et en C-peptide à la
suite d‘un repas sont similaires (Gustafsson et al., 1995; Naslund et al., 1998). Depuis
quelques années, il a été montré que le C-peptide a des effets sur le flux sanguin et la santé
des tissus. Il a des récepteurs en surface de certaines cellules, comme les neurones ou les
fibroblastes, et stimule des voies de signalisation intracellulaires calcium-dépendantes. Ces
voies conduisent à une régulation positive d‘une série de facteurs de transcription, à
l‘augmentation d‘activité de la PI3-kinase, l‘augmentation de la concentration
intracellulaire de calcium et à la stimulation de l‘ATPase Na+/K
+ (pompe à sodium-
potassium) dans différents tissus (Hills and Brunskill, 2008). Utilisé comme marqueur de la
sécrétion de l‘insuline, et parce qu‘il n‘est pas métabolisé par le foie, le C-peptide permet
de suivre la clairance de l‘insuline qui, elle, est utilisée par le foie (Osei et al., 1984). La
clairance de l‘insuline est une voie métabolique qui peut être perturbée chez des diabétiques
(Kotronen et al., 2008).
1.5.4 La production de glucagon
Le glucagon est l‘hormone peptidique synthétisée par les cellules α des îlots pancréatiques
et ses effets sur la glycémie s‘opposent à ceux de l‘insuline. Lorsque l‘insuline inhibe la
sécrétion de glucose par l‘activation de la voie PI3-kinase, la sensibilité des canaux KATP
des îlots α affectant la réponse à la sécrétion du glucagon diminue et cette hormone n‘est
pas sécrétée (Leung et al., 2006b). À l‘opposé, lorsque la concentration intracellulaire en
57
glucose est faible, les canaux KATP sont stimulés et les sécrétions de Na+ et Ca
2+ sont
activées. Ces sécrétions induisent la libération de glucagon par les ilôts α. Le glucagon
élève alors les concentrations plasmatiques du glucose et des corps cétoniques, importants
en phase post-absorptive. Le glucose est incorporé dans les cellules α du pancréas par les
transporteurs SLC2A1 et la sécrétion du glucagon est alors inhibée. Différentes études ont
montré que l‘inhibition de la sécrétion du glucagon par le glucose se fait à des
concentrations en glucose plus faibles (≤ 3mM) que celles nécessaires pour l‘activation des
cellules libérant l‘insuline (> 5 mM) (MacDonald et al., 2007; Vieira et al., 2007). Malgré
la forte affinité du transporteur de glucose SLC2A1, le transport du glucose n‘est pas un
facteur limitant pour le métabolisme du glucose dans les cellules α (Gorus et al., 1984;
Heimberg et al., 1995; Heimberg et al., 1996). L‘expression de la glucokinase (enzyme
hépatique qui met en réserve le glucose sous forme de glycogène) est un facteur limitant
dans ce métabolisme du glucose (Heimberg et al., 1996).
La nature des nutriments a un impact sur la sécrétion du glucagon. Des acides gras
(émulsion d‘huile de fèves de soja avec héparine) inhiberaient la sécrétion basale du
glucagon (Andrews et al., 1975), alors que des études récentes ont montré qu‘un contact
court (4 h) des ilôts α avec du palmitate (50 - 300 µM) en présence d‘un niveau faible de
glucose (2.8 - 5.6 mM) stimulait le largage du glucagon (Bollheimer et al., 2004). Plus la
quantité de palmitate augmente, plus les effets sur les ilôts sont importants (Bollheimer et
al., 2004). Hong et al. (2005) ont montré la même dose-dépendance, mais pour des
concentrations de 0.1 à 0.5 mM de palmitate. Ils ont aussi montré que les acides gras
saturés stimulaient plus fortement la sécrétion du glucagon que les acides gras insaturés ;
les isomères trans ont aussi été montrés plus efficaces sur cette sécrétion que les cis (Hong
et al., 2005). Une exposition à long-terme (10 à 72 h) aux acides gras induirait une
augmentation du largage du glucagon, une diminution du contenu cellulaire des îlots
pancréatiques en glucagon, mais aucun changement sur l‘expression du gène du glucagon
(Gremlich et al., 1997; Dumonteil et al., 2000).
L‘infusion de l‘AA Arg (10 mM) activerait la sécrétion de glucagon alors que le glucose, à
une concentration régulant la sécrétion d‘insuline (11 mM), n‘affecterait pas
58
significativement lasécrétion de glucagon (Dumonteil et al., 2000). Les AA Arg (2 ou 6
mM), Ala (6 mM) et Glu (6 mM), donnés seuls, et le mélange équimolaire Glu + Ala (4
mM) ont montré un effet stimulateur de la sécrétion de glucagon lors de leur incubation
avec des cellules α (Pipeleers et al., 1985). Kuhara et al. (1991) ont montré chez des brebis
que les AA (3 mM/kg) neutres à chaîne courte (Gly, Ala, Ser) stimulaient une sécrétion de
glucagon plus importante que les AA neutres à chaîne longue. La Leu, un des BCAA, a eu
tendance à supprimer la sécrétion du glucagon (Kuhara et al., 1991), alors que Leclercq-
Meyer et al. (1985) ont montré un effet double de la Leu selon sa concentration par
perfusion de pancréas de rats. La concentration physiologique de la Leu (0.2 mM) stimulait
la sécrétion de l‘hormone, alors qu‘un niveau supérieur (15 mM) inhibait cette sécrétion
(Leclercq-Meyer et al., 1985).
La figure 1.13 montre l‘ensemble des peptides hormonaux connus sécrétés par le tractus GI
et régulant la prise alimentaire. Ces peptides sont aussi sécrétés par le cerveau, excepté
l‘insuline, le glucagon, la leptine et l‘amyline (Cummings and Overduin, 2007). La section
1.5.5 présente les incrétines, les hormones les mieux documentées dans la littérature (autres
que l‘insuline, le C-peptide et le glucagon).
1.5.5 La production des incrétines
Les incrétines sont des hormones qui ont un rôle sur l‘homéostasie du glucose (Cobble,
2012) et sont responsables de 50 à 70 % de la sécrétion de l‘insuline (Baggio and Drucker,
2007). Les incrétines regroupent le glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) et
le peptide glucagon-like peptide 1 (GLP1) (Baggio and Drucker, 2007; Phillips and Prins,
2011). D‘autres peptides contrôlent le métabolisme du glucose comme la ghréline, le
peptide tyrosine-tyrosine (PYY) et le polypeptide pancréatique (PP) (Boey et al., 2007;
Hills and Brunskill, 2008; Smeets et al., 2010), qu‘on nommera aussi incrétines ici pour
faciliter la compréhension.
59
Figure 1.13. Principaux peptides hormonaux sécrétés par le tractus GI et impliqués dans la
régulation de la prise alimentaire (Cummings and Overduin, 2007).
1.5.5.1 Le glucose-dependant insulinotropic polypeptide (GIP)
Le GIP est le glucose-dependent insulinotropic polypeptide ou le gastric inhibitory
polypeptide. Il est composé de 42 AA et est sécrété par les cellules intestinales κ présentes
tout au long du tractus GI, mais de façon majoritaire au niveau du duodénum en réponse à
la présence de nutriments dans la lumière de l‘intestin (Mortensen et al., 2003). La
sécrétion du peptide a lieu 15 min après l‘ingestion de l‘aliment (Meier et al., 2002) et
exerce son activité insulinotropique avec le GLP1 (développé dans la section 1.5.5.2) pour
potentialiser la sécrétion d‘insuline du pancréas induite par une diète (Nauck et al., 1993).
Le GIP est rapidement dégradé par une enzyme dipeptidyl-peptidase (DPP4) produisant le
fragment inactif du GIP (GIP3-42). Le GIP perd alors sa fonction d‘incrétine (Kieffer et al.,
1995).
60
Le GIP exerce un rôle sur la digestion des lipides en augmentant l‘activité des lipases
(Eckel et al., 1979). Il a aussi un rôle sur les tissus adipeux périphériques en favorisant le
stockage des lipides (Beck and Max, 1983). Meier et al. (2004) ont montré chez l‘homme
que le GIP n‘affecte pas la vidange gastrique.
1.5.5.2 Le glucagon-like peptide 1 (GLP1)
Le GLP1 est un produit de la coupure du proglucagon (précurseur du glucagon aussi)
présent dans l‘intestin. Les produits de coupure sont différents suivant l‘endroit de sécrétion
du proglucagon (intestin, pancréas, cerveau) (Drucker, 2006). Le GLP1 est l‘hormone
incrétine sécrétée en réponse à l‘ingestion de nourriture par les cellules L du petit intestin
distal et du côlon (Feinle et al., 2003) ; il est le peptide pancréatique le plus impliqué dans
le processus de satiété (Cummings and Overduin, 2007).
Dans le plasma humain et le plasma de rat, il existe deux formes actives du GLP1 : GLP17-
36amide et le GLP17-37, la première forme étant la plus abondante. Une fois dans la
circulation, les deux peptides sont rapidement inactivés par une coupure de l‘enzyme DPP4
en N-terminal, donnant les formes GLP19-36 amide et GLP19-37. La dégradation étant rapide,
les niveaux de GLP1 deviennent bas. L‘effet du GLP1 sur la prise alimentaire est donc à
court-terme.
Chez le rat et chez l‘homme, la sécrétion du GLP1 a été corrélée à l‘inhibition du largage
du glucagon et à la stimulation de la sécrétion d‘insuline après l‘ingestion d‘aliments
(Dunning et al., 2005). Chez des rats, l‘injection intraveineuse de GLP1 avec du glucose
affecterait la fonction des cellules pancréatiques via le système hepatoportal en stimulant
les cellules β sécrétrices d‘insuline (Balkan and Li, 2000).
En plus de jouer son rôle d‘hormone incrétine en accentuant le largage de l‘insuline
dépendamment du glucose, en inhibant la sécrétion du glucose et en augmentant la
croissance des cellules β du pancréas (Orskov et al., 1988; Nauck et al., 1993; Farilla et al.,
2002), il a été montré que le GLP1 joue un rôle important dans l’ileal brake (arrêt de la
61
motilité du jéjunum) par médiation humorale, un mécanisme régulant la vidange gastrique
(Jörg and Burkhard, 2005).
L‘augmentation de GLP1 dans les minutes suivant l‘ingestion de nourriture est différente
selon la nature des nutriments ingérés. Les glucides suscitent un fort stimulus de cette
sécrétion, mais tous les glucides n‘induisent pas la même réponse. Elliott et al. (1993) ont
montré que l‘augmentation de la concentration de GLP1 est significativement plus
importante après l‘ingestion de 75 g de glucose en comparaison avec l‘ingestion de la
même quantité de sucres complexes (riz brun ou orge). Le glucose aurait aussi un effet de
sécrétion plus marqué qu‘un autre sucre simple, le fructose. L‘effet sur l‘appétit est
cependant similaire (Kong, Chapman et al. 1999). Le type et la teneur en fibres des diètes
moduleraient différemment la réponse postprandiale du GLP1. Un mélange de
galactose/gomme guar donné dans un petit déjeuner augmente et prolonge le largage de
GLP1 chez des femmes obèses, en comparaison avec un petit déjeuner contrôle (Adam and
Westerterp-Plantenga, 2005). Il a été montré qu‘un amidon transformé (prégélatinisé, non
résistant) donne une réponse plus élevée de GLP1 qu‘un amidon natif(54 % résistant)
(Raben et al., 1994).
Les protéines stimulent la sécrétion de GLP1 de manière plus importante que les glucides
(Blom et al., 2006; Lejeune et al., 2006). Blom et al. (2006) ont montré qu‘une diète riche
en protéines (yogourt enrichi de protéines de lactosérum), en comparaison à une diète
isocalorique riche en glucides contenant aussi des protéines laitières (yogurt et saccharose),
stimulait plus fortement la sécrétion de GLP1. Les différents types de protéine ne donnent
pas la même réponse de sécrétion du GLP1 comme l‘ont montré Hall et al. (2003) ; les
protéines de lactosérum l‘augmentaient plus que les caséines.
La concentration en GLP1 augmente aussi après la consommation de lipides, mais celle-ci
est retardée par rapport à l‘augmentation observée après la consommation de glucides
(Elliott et al., 1993).
62
1.5.5.3 La ghréline
La ghréline est un peptide dont le nom signifie « qui stimule le largage de l‘hormone de
croissance (GH) ». En effet, ce peptide a été identifié en 1999 d‘estomacs de rats et
d‘humains comme étant le ligand de récepteurs GHS-R (récepteur de sécréteurs de GH) et
activant la libération de Ca2+
dans des cellules du cerveau (Ueno et al., 2005). La ghréline
est un peptide de 28 AA qui peut être acylé sur la Ser 3 par une chaîne d‘acides gras (acide
n-octanoïque). Cette acylation est essentielle pour que la ghréline ait son activité
biologique, c‘est-à-dire se lie et active le récepteur GHS-R (Kojima et al., 1999).
Des récepteurs de la ghréline se trouvent majoritairement dans le cerveau et dans d‘autres
tissus périphériques tels que l‘hypophyse, la glande thyroïde, le pancréas, la rate, le
myocarde et la glande surrénale. D‘autres cellules telles que les adipocytes et les
lymphocytes ont aussi des récepteurs de la ghréline (Gnanapavan et al., 2002). La ghréline
est majoritairement sécrétée par les cellules de l‘estomac et en seconde importance par les
cellules de l‘intestin (Kojima et al., 1999; Date et al., 2000).
L‘élévation préprandiale de la ghréline est un signal d‘initiation à la prise alimentaire
(Muller et al., 2001). Ce signal de faim est transmis au cerveau par le nerf vagal afférent au
niveau gastrique. La concentration de ghréline augmente environ deux fois plus que la
concentration basale avant chaque repas et diminue à la concentration basale environ 1 h
après le repas (Cummings et al., 2001). La ghréline stimule la sécrétion acide et la motilité
dans l‘estomac de façon dose dépendante (Kamegai et al., 2001; Nakazato et al., 2001). La
réponse postprandiale de la ghréline est affectée par la composition énergétique (calories)
du repas. Plus le repas est riche en calories, moins la ghréline est sécrétée (Callahan et al.,
2004).
La ghréline est également importante pour la régulation de l‘homéostase énergétique.
L‘absence de récepteurs à la ghréline diminue la sécrétion de GH, la prise alimentaire et la
masse grasse chez des rats (Shuto et al., 2002). La sécrétion de ghréline induit un gain de
poids et d‘adiposité (Tschop et al., 2000; Nakazato et al., 2001; Shintani et al., 2001; Wren
et al., 2001). L‘effet de cette hormone sur la sécrétion d‘insuline est controversé. Broglio et
63
al. (2001) ont montré que l‘administration intraveineuse du peptide inhibe la sécrétion
d‘insuline malgré une augmentation du niveau de glucose chez l‘homme, alors qu‘une
même administration stimule sa sécrétion chez des rats (Lee et al., 2002).
La nature de l‘aliment influencerait aussi la sécrétion postprandiale de la ghréline (Ueno et
al., 2005) selon un mécanisme qui n‘est pas bien compris. En comparaison avec une diète
isocalorique riche en lipides, les glucides diminueraient plus les concentrations
postprandiales de ghréline (Monteleone et al., 2003) et ce, autant les sucres simples
(dextrose) (Greenman et al., 2004) que les sucres complexes (PS) (Blom et al., 2005), de
même qu‘après la consommation d‘aliment (pain) (Erdmann et al., 2006). Selon la nature
des fibres et ainsi selon leurs propriétés physiques et chimiques, leurs effets peuvent être
contraires. La consommation de 4 g de fibres solubles non caloriques de psyllium en
solution aqueuse données avec un repas de 585 kcal diminue les concentrations
plasmatiques de ghréline (Nedvídková et al., 2003), alors que 23 g des mêmes fibres
ajoutées à une diète moins calorique (300 kcal) ne modifie pas la concentration plasmatique
en ghréline (Karhunen et al., 2010). De même, la concentration de ghréline ne diminue pas
lors de l‘ingestion d‘une solution de gomme de guar (21 g) qui augmente la distension
gastrique, comparé à des diètes riches en protéines, en glucides et en lipides (Erdmann et
al., 2003). Les différentes formes de la ghréline ne répondent pas de la même façon à une
diète riche en fibres. L‘ajout de fibres insolubles de carotte diminuerait la forme acylée de
la ghréline sans dose dépendance, mais n‘aurait pas d‘effet sur les formes totale et non
acylée (Gruendel et al., 2006).
La perfusion chez l‘humain de ghréline avec du glucose ou des acides gras stimulerait
moins la sécrétion de GH que la perfusion de ghréline avec l‘Arg (Broglio et al., 2002). La
longueur de chaîne des acides gras semble avoir un effet sur la sécrétion de la ghréline
(Feltrin et al., 2006). Les acides gras à longue chaîne diminueraient la sécrétion de ghréline,
alors que ceux à courte chaîne n‘auraient pas eu d‘effet (Feltrin et al., 2006).
Les protéines jouent aussi un rôle controversé sur la sécrétion de cette hormone. La
consommation de diètes riches en protéines (dinde ou porc) augmenterait la sécrétion de
64
ghréline (Erdmann et al., 2003; Erdmann et al., 2006), alors que la consommation d‘une
diète de poulet n‘affecterait pas la sécrétion de ghréline (Greenman et al., 2004).
Différentes autres sources protéiques (protéines de lactosérum, de soya ou de gluten)
suppriment la sécrétion postprandiale de ghréline (Bowen et al., 2006a). Des matrices
alimentaires riches en protéines peuvent diminuer la sécrétion de ghréline. Un petit
déjeuner riche en protéines (yogourts liquides enrichis en protéines de lactosérum)
diminueraient plus fortement cette sécrétion qu‘un petit déjeuner riche en glucides (yogourt
isocalorique liquide enrichi de saccharose) (Blom et al., 2006). Contrairement à cette
dernière étude, Cummings et al. (2001) ont montré un effet similaire de deux diètes
isocaloriques riches en protéines ou en glucides (lipides constants) qui ont diminué la
concentration en ghréline
1.5.5.4 Le peptide tyrosine-tyrosine (PYY)
Le PYY est un composé de la famille des neuropeptides Y pancréatiques (PP-fold) dont
font aussi partie le neuropeptide Y (NPY) et le polypeptide pancréatique (PP). Une
différence importante de structure porte sur l‘extrémité N terminale du PYY qui lui permet
de traverser la barrière plasmatique du cerveau, contrairement à PP (Wynne et al., 2004).
PYY est principalement synthétisé et largué en réponse à une prise alimentaire par les
cellules endocrines L de l‘iléum, du côlon et du rectum, et secondairement par les cellules
de la première partie de l‘intestin (Cox, 2007). Le PYY ou PYY1-36 est, comme le GLP1,
rapidement clivé par l‘enzyme DPP4 en PYY3-36, mais ce produit reste bioactif (Cox,
2007). Il existe différents récepteurs du PYY (Y1 à Y5). Les récepteurs Y1 et Y2
influenceraient la sécrétion et la sensibilité à l‘insuline (Yoshinaga et al., 1992; van den
Hoek et al., 2004).
Chez l‘humain, les nutriments stimulent la sécrétion de PYY 30 min après leur ingestion et
la concentration maximale est habituellement atteinte après 60 min (Chan et al., 2006).
Cette sécrétion est proportionnelle à l‘ingestion de calories : plus l‘énergie est importante,
plus la sécrétion de PYY est importante. La sécrétion de PYY est inversement corrélée à la
vitesse de la vidange gastrique. Pironi et al. (1993) ont montré que de faibles doses de
65
lipides ralentissent la vidange gastrique, favorisant l’iléal-brake, et qu‘elles induisent une
augmentation de la sécrétion de PYY.
La composition de la diète affecte la sécrétion postprandiale du PYY. Chez des hommes
obèses ou ayant un poids normal, l‘ingestion d‘une diète à teneur élevée en protéine induit
la plus importante sécrétion de PYY, ainsi que la satiété la plus élevée comparée à des
diètes de lipides ou de glucides (Batterham et al., 2006). La diète de lipides induit une
sécrétion de PYY plus élevée que la diète de glucides pour les hommes au poids normal. Ce
résultat est en accord avec la stimulation plus importante de la sécrétion de PYY lors de la
présence de lipides dans une diète riche en glucides comparée à la même diète pauvre en
lipides (Essah et al., 2007). La sécrétion de PYY serait similaire selon la nature de solutions
protéiques isoénergétiques administrées par perfusion intra-gastrique (protéines de
lactosérum ou caséines, entières ou hydrolysées) (Calbet and Holst, 2004). Cependant,
l‘ingestion d‘un lait entier induirait une sécrétion de PYY plus faible suivie d‘une
diminution de sa concentration plasmatique plus lente en comparaison à un lait fermenté de
même teneur en gras et lactose (Sanggaard et al., 2004).
Suivant la nature des lipides, l‘impact sur la sécrétion de PYY peut être différent. Des
acides gras à longue chaîne comme l‘acide laurique (C12) et des acides gras C18 stimulent
la sécrétion de PYY, alors que l‘acide décanoïque (C10) et d‘autres acides gras à chaînes
moyennes (C8) n‘ont pas d‘effet (Maas et al., 1998; Feltrin et al., 2006).
Les fibres ont également un impact sur la sécrétion de PYY et l‘effet varie selon leur
nature. La présence de fibres de psyllium (23 g) dans des diètes riches ou pauvres en
protéines diminue et prolonge la sécrétion de PYY comparé à une diète sans psyllium
(Karhunen et al., 2010). Weickert et al. (2006) ont montré une sécrétion de PYY plus
importante après la consommation de pain blanc ou de pain enrichi en fibres d‘avoine, en
comparaison avec un pain isoénergétique enrichi de fibres de blé insolubles.
Ce peptide est aussi en relation avec la régulation de la sécrétion de l‘insuline et
l‘homéostasie du glucose (Boey et al., 2007). Des souris n‘exprimant pas le gène PYY
66
(souris KO) ont montré une même tolérance au glucose que des souris contrôle, mais les
niveaux d‘insuline étaient plus élevés pendant la durée du test à la tolérance du glucose
pour les souris KO (Boey et al., 2006).
1.5.5.5 Le polypeptide pancréatique (PP)
Le polypeptide pancréatique (PP) est sécrété par les cellules F du pancréas (Karhunen et al.,
2008), le côlon et le rectum (Wynne et al., 2004). Le PP affecte la balance énergétique en
supprimant la prise alimentaire et la vidange gastrique (Kojima et al., 2007). Certains
récepteurs du PP ont été trouvés dans l‘aire dite postrema qui est un complexe de la région
vagale dorsale (CVD) et un centre modulateur de divers réflexes neurovégétatifs. Le CVD
est une zone avec une barrière incomplète au cerveau permettant le passage des hormones
jusqu‘au système nerveux central (Kojima et al., 2007) ; il serait le site primaire pour la
régulation de fonctions GI telles que la motilité et les sécrétions pancréatiques (Whitcomb
et al., 1990). L‘implication des facteurs neuraux et endocriniens contribuant à la sécrétion
de PP a été confirmée par Karhunen et al. (2008) qui ont montré la stimulation de cette
sécrétion en condition de non déglutition de l‘aliment (aliment ingéré et mâché seulement).
Une étude, dont les sujets goûtaient et mâchaient la diète sans l‘avaler une heure avant ou
après l‘ingestion de la charge lipidique (50 g de triacylglycérols à longues chaînes sous
forme liquide en une fois), a montré la stimulation de la sécrétion du PP dans les deux cas
en comparaison à une diète contrôle (sans ingestion de la charge lipidique) (Robertson et
al., 2002).
La sécrétion du PP dépend aussi de l‘état nutritionnel (Batterham et al., 2003b). En état de
jeûne, la sécrétion est très faible et augmente au long des étapes de digestion (Batterham et
al., 2003b). La distension gastrique, les réponses du nerf vague ou la sécrétion de ghréline
stimulent cette sécrétion (Wynne et al., 2004).
Les facteurs alimentaires qui induisent la sécrétion du PP sont de différentes natures. Les
niveaux de PP augmenteraient suite à l‘hydrolyse de lipides chez des hommes ayant reçu
des triacylglycérols par voie intraduodénale (Feinle-Bisset et al., 2005). Un petit déjeuner
67
comportant 40 % de lipides a augmenté la sécrétion de PP chez des hommes et des femmes
en bonne santé (Lawson et al., 1983). Une étude chez l‘humain a montré que deux diètes
isocaloriques, une riche en lipides et une riche en glucides, augmenteraient la sécrétion de
PP (Holmbäck et al., 2003) comme après l‘ingestion orale de glucose (75 g) (Waldhäusl et
al., 1983). Après 21 jours de consommation quotidienne d‘une même ration de lipides
ajoutée à une diète courante la sécrétion de PP a diminué chez des hommes de poids normal
(Robertson et al., 2004).
Les PS ne semblent pas avoir d‘effet sur la sécrétion de PP chez des sujets diabétiques
(type 2). Il a été démontré que l‘ingestion de gomme guar (5 %) chez ces sujets n‘a pas
d‘effet sur la sécrétion du PP et d‘autres peptides tels que le glucagon (Fuessl et al., 1987).
L‘absence de différence des réponses hormonales (insuline, glucagon, PP, gastrin) suite à
une diète pauvre ou riche en PS a aussi été observée chez le même type de patients après
l‘ingestion de diètes supplémentées en pectine de pomme (3 g et 20 g) (Schwartz et al.,
1988). Chez des hommes obèses, un PS de soya (10 g) a permis de diminuer la sécrétion de
PP en comparaison avec une diète sans (Tsai et al., 1987).
L‘ingestion de protéines stimule aussi la sécrétion de PP avec une corrélation positive entre
la quantité de protéines ingérée et la sécrétion de PP, ce qui serait expliqué par
l‘augmentation de la concentration en AA plasmatiques (Karhunen et al., 2008).
69
Hypothèse et objectifs
Les travaux de la littérature cités dans les sections précédentes montrent que chaque
matrice alimentaire module de façon particulière la bioaccessibilité et la biodisponibilité
des nutriments la constituant et module les réponses métaboliques. Le lait et les produits
laitiers issus de divers procédés technologiques possèdent des microstructures variées.
L‘ajout d‘ingrédients comme des stabilisants (polysaccharides) à des matrices laitières peut
moduler la digestion de certains nutriments laitiers comme les protéines. Les procédés
technologiques ont un impact sur les propriétés physico-chimiques des nutriments d‘une
matrice alimentaire, et ainsi sur la microstructure de ces matrices.
Les matrices laitières gélifiées acides, que sont les yogourts, sont constituées des deux
groupes de protéines laitières aux propriétés physico-chimiques différentes : les caséines et
les protéines de lactosérum. Des PS ayant des effets sur la digestion de ces protéines et sur
des réponses métaboliques peuvent être ajoutés aux yogourts.
Ainsi des yogourts standardisés, contenant des polysaccharides (PS) de natures différentes,
auront une microstructure particulière définissant leur matrice, laquelle pourrait moduler la
digestion de ces yogourts. L‘étude de la digestion GI de ces yogourts permettrait de
connaître l‘effet de l‘ajout de PS dans ces matrices laitières sur la digestion des protéines et
sur les réponses métaboliques postprandiales (glycémie, insulinémie, hormones du tractus
GI).
Un modèle de digestion GI in vitro permettrait d‘étudier la bioaccessibilité des produits de
digestion azotés libérés de matrices laitières. Une étude in vivo permettrait de confirmer les
résultats de la digestion in vitro et de faire le lien entre la bioaccessibilité et la
biodisponibilité des composés azotés libérés, ainsi que d‘étudier des réponses métaboliques
associées à la biodisponibilité.
70
L‘hypothèse de recherche est donc la suivante :
L‘ajout de polysaccharides à des produits laitiers gélifiés acides influencerait la
bioaccessibilité et la biodisponibilité de nutriments azotés et les réponses métaboliques
postprandiales associées (glycémie, insulinémie, sécrétion en incrétines) lors de leur
digestion gastro-intestinale.
Pour répondre à cette hypothèse, les objectifs visés sont :
1) Mettre au point d‘un système modèle in vitro de digestion GI, pour suivre la
dégradation des protéines laitières et la bioaccessibilité de nutriments azotés de
matrices laitières liquide et semi-liquide, afin d‘évaluer l‘impact de la matrice
laitières sur la digestion GI des protéines laitières.
2) Étudier l‘effet de l‘ajout de différents PS à un produit gélifié acide (yogourt) sur la
dégradation des protéines laitières et la bioaccessibilité de nutriments azotés en
utilisant un système modèle in vitro de digestion GI, afin d‘évaluer l‘impact de
l‘ajout de PS de natures différentes sur la digestion des protéines laitières.
3) Étudier dans un modèle animal (rats), l‘effet de l‘ajout de différents PS à un yogourt
sur la biodisponibilité de nutriments azotés et des réponses métaboliques
postprandiales associées, afin d‘évaluer l‘impact de l‘ajout de PS de natures
différentes sur les acides aminés plasmatiques libres et les réponses métaboliques
associées lors de la digestion de ces matrices laitières.
Chapitre II : In vitro gastrointestinal digestion of liquid
and semi-liquid dairy matrixes
Le second chapitre présente les travaux réalisés pour répondre au premier objectif de la
thèse, soit de mettre au point un système modèle in vitro de digestion GI afin de suivre la
dégradation des protéines laitières de matrices laitières liquide (lait) et semi-liquide
(yogourt) et l‘apparition des produits de digestion azotés. Jusqu‘à présent, aucun système
de digestion GI in vitro n‘avait permis d‘évaluer la digestion protéique buccale, gastrique et
duodénale (suivi des protéines intactes, du contenu en protéines et peptides solubles, et des
acides aminés libres) de différents produits laitiers commerciaux. Le traitement thermique
subi par les différents produits commerciaux digérés serait le facteur ayant le plus d‘impact
sur la digestion des protéines. Ces résultats ont permis de valider un modèle de digestion
qui permettra de digérer des matrices laitières fermentées contenant différents PS et de
comparer la digestion de leurs protéines (chapitre III).
72
2.1 Résumé
Le processus de fabrication d‘un aliment définit la structure physico-chimique et
l‘organisation des nutriments dans la matrice alimentaire et peut avoir un impact sur leur
digestion. Dans ce travail, la digestion des protéines dans des matrices laitières liquide et
semi-liquide, soient des laits pasteurisé et stérilisé et un yogourt brassé sans stabilisant, a
été étudiée en utilisant un modèle de digestion gastro-intestinale (GI) in vitro. Après la
digestion buccale, la quantité de protéines solubles mesurée dans le yogourt était
significativement plus faible que celle des deux laits ; ce résultat a été associé à la matrice
gélifiée et au pH acide du yogourt qui ont probablement réduit la solubilité des protéines
dans le fluide buccal étant donné l‘absence de protéase. Cette différence entre les matrices a
diminué durant la digestion gastrique et a complètement disparu à la fin de la digestion
duodénale sous l‘action protéolytique de la pepsine et de la pancréatine, respectivement. Le
profil électrophorétique des protéines laitières dans les mélanges digérés a démontré que la
digestion des caséines débute lors de la phase gastrique ; elle est plus lente dans le lait
pasteurisé alors qu‘elle est similaire dans le cas du lait stérilisé et du yogourt. À la fin de la
digestion duodénale, aucune caséine intacte n‘est présente dans les matrices laitières, alors
que de faibles bandes des protéines du lactosérum sont toujours visibles sur les gels
d‘électrophorèse du lait pasteurisé et du yogourt. Bien qu‘aucune différence significative
dans la quantité d‘acides aminés libérés durant la digestion GI n‘ait été mesurée entre les
matrices laitières, leur libération durant la phase duodénale a varié selon la nature des
acides aminés (acide, basique, neutre ou hydrophobe), et semble être gouvernée par la
spécificité des protéases et peptidases contenues dans la pancréatine. Ces résultats
suggèrent donc que la sévérité du traitement thermique du lait influence la cinétique de
digestion des protéines, surtout durant la phase gastrique, et que l‘impact du procédé de
fabrication doit être considéré lors de l‘étude de la digestion des protéines dans les produits
laitiers.
73
2.2 Abstract
Processing of food defines physicochemical structure and organization of nutrients in the
food matrix and can have an impact on their digestion. In this study, protein digestion in
two liquid dairy matrixes with different heat treatment (pasteurized and sterilized milks)
and in one semi-liquid dairy matrix (stirred yogurt without stabilizer) was investigated
using an in vitro gastrointestinal (GI) digestion model. After buccal digestion, significantly
lower amount of soluble proteins was measured in yogurt than in both milks and this result
was associated to the gel matrix and acidic pH of yogurt, which probably reduced the
solubility of proteins in buccal juice since no protease was present in saliva. This difference
between dairy matrixes decreased during gastric digestion and disappeared at the end of the
duodenal digestion upon the proteolytic action of pepsin and pancreatin, respectively.
Electrophoresis pattern of digested mixtures showed that casein digestion began at the
gastric phase and was slower for pasteurized milk than sterilized milk and yogurt. At the
end of duodenal digestion, no more intact caseins were present in all the dairy matrixes
while faint bands of whey proteins were still visible on the electrophoretic gels in
pasteurized milk and yogourt. Although no significant difference in the amount of free
amino acids released during GI digestion was measured between the dairy matrixes, their
release during the duodenal phase varied according to their nature (acid, basic, neutral or
hydrophobic) and seems to be governed by the specificity of proteases and peptidases in
pancreatin. These results suggest that the severity of milk‘s heat treatment influences the
kinetic of protein digestion, mainly during the gastric phase, and that the impact of
processing has to be considered to study protein digestion in dairy products.
74
2.3 Introduction
Foods are complex nutrient assemblies subject to various industrial processes.
Consequently, food products with same composition have not necessarily the same
structural organisation and the same nutritional value. Food microstructure generally refers
to structural organization of food components to constitute a matrix at the scale level
ranging from 10 – 100 micrometers (Aguilera and Stanley, 1999). The microstructure of
food is important because nutrients are often located in natural cellular compartments or
within assemblies produced during processing and they need to be released during
digestion for their further absorption in the gut. Moreover, processing defines food
structure and the food matrix structural organization can act as a nutrient-release regulator.
Indeed, physical characteristics of food matrix may control the release of the nutrients in
the intestinal lumen (bioaccessibility), their transport across intestinal epithelium into the
serum (bioavailability), and the induction of metabolic responses. The impact of food
matrix on macronutrients nutritional properties was reviewed by Turgeon and Rioux
(2011).
Dairy products are found under various forms from liquid milk, gelled fermented products
and solid cheese matrixes. The main building blocks in dairy matrix are fat globules, casein
micelles and whey proteins, and their different organizations through processing steps as
mechanical, heat, enzyme or acid treatment permit the constitution of various structures
found in dairy products. Nutritional properties of milk and dairy products have been widely
studied through the specific effect of purified dairy nutrients such as proteins or lipids or in
the context of nutrient assemblies such as dairy proteins in the milk fat globule membrane
(Mc Pherson 1983). Dairy proteins are interesting because they have a good nutritional
value: high content in several essential amino acids (AA) and good digestibility (Debry,
2005). Moreover, dairy proteins are recognized to contain bioactive peptides which can be
released during gastrointestinal (GI) digestion (Korhonen and Pihlanto, 2006).
In dairy proteins, there are two groups with different physicochemical properties: casein
micelles which represent 80 % of milk proteins and soluble whey proteins (Debry, 2005).
Some studies in human showed different kinetics of digestion for these dairy proteins.
75
Whey proteins were named ―fast proteins‖ because they induce a rapid and important
stimulation of postprandial protein synthesis after their ingestion while caseins were
considered as ―slow protein‖ as there is a delay in the stimulation of protein synthesis
(Boirie et al., 1997). However, using specific or purified milk proteins cannot be considered
to reflect ―real food‖ and their kinetic of digestion should be different in the presence of
other constituents found in dairy products (Farnfield et al., 2009; Dupont et al., 2010a;
Monogioudi et al., 2010). Nevertheless, other human studies have evaluated the effect of
milk processing on the kinetics of protein digestion. For example, Lacroix et al. (2008)
showed a higher anabolic use of dietary nitrogen (N) after the ingestion of ultra-high
temperature (UHT) milk than pasteurized milk, suggesting a different kinetic of protein
digestion subsequent to particular treatment of milk. Also in human, Gaudichon et al.
(1995) showed that the net gastro-jejunal absorption of exogenous N did not differ
significantly between milk and a yogurt made with the same milk. Moreover, they reported
that the main effect of fermentation was to delay the gastric emptying rate of N (Gaudichon
et al., 1995).
Although clinical studies are considered as the gold standard methods to investigate human
digestive process, in vitro digestion models are useful to screen numerous variables before
clinical trials. In the actual context of developing functional foods containing various added
nutrients or bioactive components, in vitro digestion models enable a first low cost
evaluation of their release during the digestion process and their bioaccessibility and
potential efficacy. For example, using an in vitro digestion model, Sanz and Luyten (2007)
showed that intestinal bioaccessibility of genisitein in enriched custard desserts was
increased in 3 % fat milk compared to milk containing 1 or 5 % fat.
Several in vitro GI models have been proposed depending on the food component being
analyzed and the nature of food matrix (Hur et al., 2010). Modes of disintegration of solid
food in human stomach were investigated by Kong and Singh (2008b) in simulated gastric
environment because this digestive phase is crucial to evaluate the release of nutrients from
solid foods. Also, Sanz and Luyten (2007) studied the in vitro release of nutrients at each
digestive step to understand the complete digestive process of lipophilic compounds
76
(isoflavone) from enriched custards. Another GI model from mouth to duodenum was
developed by Oomen et al. (2003) and further adapted by Versantvoort et al. (2005) to
study the bioaccessibility of nitrogenous component from solid food matrix as peanut and
buckwheat, using digestive solutions with composition closely related to those from human.
Using in vitro digestion models, some studies have shown the relationship between
structure and nutritional properties of phytochemicals from plant food matrix (Parada and
Aguilera, 2007). For example, Edwards et al. (2002) showed that cell disruption of food
matrix during food processing enhanced the release of carotenoids from plant foods.
Dupont et al. (2010b) also showed that the intensity of milk‘s heat treatment has an impact
on the digestion of proteins. Using a simulated infant digestion model, the authors
demonstrated that gastric digestion of caseins was more rapid from sterilized milk than
pasteurized milk or from a yogurt prepared with the same pasteurized milk.
The aim of this study was to evaluate the effect of food matrix on the in vitro GI digestion
of proteins in commercial liquid (milk) and semi-liquid (yogurt) dairy matrixes.
Degradation of proteins was estimated through the analysis of soluble proteins,
electrophoresis pattern of dairy proteins and free amino acids (FAA) release during buccal,
gastric and duodenal phases of digestion using the in vitro GI digestion model proposed by
Versantvoort et al. (2005), which was adapted for the digestion of liquid and semi-liquid
matrixes. Assessing the impact of heat treatment of milk (pasteurization and sterilization)
on protein digestion was also an objective of this study.
2.4 Materials and methods
2.4.1 Reagents and enzymes
Reagents used for the preparation of digestive fluids were the same as described in
Versantvoort et al. (2005), except for their provenance: KCl, NaCl, NaHCO3, CaCl2 and
HCl were from Fisher (Ottawa, ON, Canada); KSCN, NH4Cl, monohydrate glucose,
glucuronic acid and uric acid were from VWR (Missisauga, ON, Canada); NaH2PO4 and
KH2PO4 were from JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA); NaSO4 was from BDH
(Mississauga, ON, Canada); urea was from EMD (Darmstadt, Germany); bile extract
77
porcine, mucin from porcine stomach (Type III), albumin from bovine serum (purity ≥ 98
%), hydrochloride glucosamine and MgCl2 were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
USA).
All the enzymes were purchased from Sigma-Aldrich. Alpha-amylase (EC 3.2.1.1) from
porcine pancreas (type VI-B) contained 28 U/mg solid using starch as substrate. Pepsin (EC
3.4.23.1) from porcine gastric mucosa contained 471 – 305 U/mg solid using hemoglobin
as substrate. Pancreatin from porcine pancreas had an activity of 8 USP specifications.
Lipase (EC 3.1.1.3) from porcine pancreas (type II) contained 30 – 90 U/mg protein using
triacetin as substrate.
Chemicals used for SDS-PAGE analysis were from BioRad (Missisauga, ON, Canada),
except ammonium persulfate from EMD (Darmstadt, Germany), 2-mercaptoethanol from
Sigma-Aldrich, sodium dodecyl sulfate ultrapure from JT Baker, and Tris base from
Promega (Madison, WI, USA). The pre-stained SDS-PAGE MW broad range standard
(7 100 – 290 000 Da) was from BioRad. Purified dairy proteins from Sigma-Aldrich were
also used as standards for SDS-PAGE analysis: α-casein (-Cn) from bovine milk (purity ≥
70 %), β-lactoglobulin (β-Lg) from bovine milk (purity ≥ 90 %), and α-lactalbumin (-La)
from bovine milk (type III, purity ≥ 85 %).
2.4.2 Commercial milks and yogurt
Milks and yogurt were purchased from a local store (Québec, Canada). Pasteurized milk
(72 °C, 16 s) contained 1 % (w/v) milk fat and 3.6 % (w/v) protein. Sterilized milk (138 °C,
4 s) contained 1 % (w/v) milk fat and 3.2 % (w/v) protein. Commercial stirred-yogurt,
without added polysaccharide (stabilizer), contained 2.5 % (w/w) milk fat and 4 % (w/w)
protein.
2.4.3 In vitro GI digestion
In vitro gastrointestinal (GI) digestion of matrixes was performed using the model
described by Versantvoort et al. (2005) with some modifications to adapt the digestion
78
procedure for liquid and semi-liquid dairy matrixes. This model simulates the digestion
process in the human GI tract in a simplified manner by mimicking some physiological
conditions such as the chemical composition and pH of digestive fluids, temperature (37
ºC) and duration of digestion in buccal, gastric and duodenal phases. According to
Versantvoort et al. (2005), the whole digestion process (from mouth to intestine) allowed
the evaluation of bioaccessibility of nutrients and toxic compounds.
The composition of artificial juices (saliva, gastric, duodenal and bile) added at each
digestion step are reported in table 2.1. They were prepared exactly as described in
Versantvoort et al. (2005) using the same constituents (see reagents) and concentrations.
However, pancreatin was prepared in duodenal juice, which was centrifuged (9800 g, 4 °C,
20 min) as suggested by Sanz and Luyten (2006). The experimental conditions used to
digest the different matrixes are summarized in table 2.2. Compared to the in vitro GI
model of Versantvoort et al. (2005), the major modifications applied to the digestion
procedure were the following: i) total digestion time in buccal phase was reduced
respectively at 20 s and 2 min (vs 5 min) for milks and yogurt, based on the previous work
of Sanz and Luyten (2006); ii) total digestion time in gastric phase was fixed respectively at
30 and 60 min (vs 2 h) for milks and yogurt, based on preliminary tests and the results
obtained by Dupont et al. (2010a); iii) both dairy matrixes were digested during 60 min (vs
2 h) in duodenal phase, also based on preliminary tests; iv) type of agitation was modified
(see table 2.2 vs head-over-heels); v) gastric fluid was added twice (vs once) during gastric
phase; vi) a heat treatment (90 °C, 10 min) was applied to inactivate the enzymes (vs no
inactivation treatment) at the end of digestion phases.
Briefly, the experiment was started by adding dairy matrix (9 g) in a beaker (i.d. 4.8 cm)
maintained at 37 °C in a water bath then 6 mL of saliva were added. The mixtures were
agitated by gentle movements with an overhead stirrer (Caframo, model R2R1-64, Wiarton,
ON, Canada) set up with a stainless steel dual-blade paddle (4 × 1.3 × 0.1 cm). For gastric
digestion phase, 6 mL of gastric fluid were added to the beaker and the mixture was
agitated by orbital movements. After 15 min (milks) or 30 min (yogurt), 6 mL of gastric
Table 2.1. Constituents and their final concentration 1 in the various synthetic juices used in the in vitro GI digestion model (adapted
from Versantvoort et al., 2005).
1 Concentration per liter after the combination of organic + inorganic solutions (1:1) then the addition of the other constituents;
2 If necessary, the
pH of the juices is adjusted to the appropriate interval.
Saliva Gastric juice Duodenal juice Bile juice
Inorganic
solution
6 mM KCl 23.5 mM NaCl 60 mM NaCl 45 mM NaCl
1 mM KSCN 1.1 mM NaH2PO4 20 mM NaHCO3 35 mM NaHCO3
3.7 mM NaH2PO4 5.5 mM KCl 0.3 mM KH2PO4 2.5 mM KCl
2.4 mM NaSO4 1.4 mM CaCl2 • 2 H2O 3.7 mM KCl 0.8 mM HCl
1.2 mM NaCl 2.9 mM NH4Cl 0.3 mM MgCl2
10 mM NaHCO3 33 mM HCl 35 µM urea
Organic
solution
1.5 mM urea 1.8 mM glucose 0.8 mM urea 2 mM urea
45 µM glucuronic acid
0.7 mM urea
0.5 mM glucoseamine
hydrochloride
Other
constituents
290 mg/L α-amylase 1 g/L BSA 1 mM CaCl2 • 2 H2O 1 mM CaCl2 • 2 H2O
9 µM uric acid 2.5 g/L pepsin 1 g/L BSA 1.8 g/L BSA
25 mg/L mucin 3 g/L mucin 9 g/L pancreatin 30 g/L bile
1.5 g/L lipase
pH 2 6.8 ± 0.2 1.30 ± 0.02 8.1 ± 0.2 8.2 ± 0.2
80
fluid were added again and the mixture was agitated during an additional 15 min (milks) or
30 min (yogurt). Duodenal phase was started by adding bicarbonate (2 mL), bile (6 mL)
and duodenal (12 mL) juices then the mixture was also agitated by orbital movements
during 60 min for both milks and yogurt.
Table 2.2. Experimental conditions used in the in vitro GI digestion model for milks and
yogurt.
Milk Yogurt
General
Food matrix (g)
Texture
Digestion temperature (°C)
9
Liquid
37
9
Semi-liquid
37
Buccal phase
pH
Saliva (mL)
Agitation
Duration
6.8
6
Stirrer (55 rpm)
20 s
6.8
6
Stirrer (55 rpm)
2 min
Gastric phase
pH
Gastric juice (mL)
Agitation
Duration
2 – 3
T0 min = 6
T15 min = 6
Orbital (55 rpm)
30 min
2 – 3
T0 min = 6
T30 min = 6
Orbital (55 rpm)
60 min
Duodenal phase
pH
Duodenal juice (mL)
Bile juice (mL)
Bicarbonate 1 M (mL)
Agitation
Duration
6 – 7
T0 min = 12
T0 min = 6
T0 min = 2
Orbital (55 rpm)
60 min
6 – 7
T0 min = 12
T0 min = 6
T0 min = 2
Orbital (55 rpm)
60 min
81
Several GI digestions of both milks and yogurt were performed to obtain digested samples
at different times during the digestion process: i) at the end of the buccal phase for both
milks and yogurt; ii) after 2, 5, 15 and 30 min for milks and after 5, 15, 30 and 60 min for
yogurt during the gastric phase; iii) after 5, 10, 30 and 60 min for both milks and yogurt
during the duodenal phase. Each of these experiments was made in three repetitions (n =3)
for a total of 81 independent digestions. At each digestion time, the whole digested sample
in the beaker was homogenized at 9500 rpm during 20 s using a T-18 basic Ultra-Turrax®
equipped with a S25N-18G dispersing tool (IKA, Wilmington, NC, USA). To stop the
enzymatic digestion, the homogenized samples were heat-treated at 90 °C during 10 min
then centrifuged (9800 g, 20 min, 4° C), and the supernatants were kept frozen (–80 °C)
until their chemical analysis. The undigested yogurts were not heated and not centrifuged.
2.4.4 Chemical analysis
Protein content in undigested dairy matrixes and soluble proteins in the supernatant of
digested samples were quantified with the Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay
kit from Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). The amount of protein was
determined from a calibration curve prepared with bovine serum albumin (BSA). This kit
detects proteins and peptides constituted of 3 AA residues. Soluble protein content was
expressed as percentage (%) of protein measured in undigested matrixes. Each sample was
analyzed in duplicate.
The protein profiles in matrixes before (control) and during their digestion (supernatant)
were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
using 15 % Bis/Acrylamide gels under reducing conditions with a stacking gel to
concentrate proteins (4 % Bis/Acrylamide) as described by Laemmli (1970). Briefly,
samples were diluted in deionized water, then added to charge buffer and heated at 85 – 90
°C for 10 min. Diluted samples (10 µL) were loaded onto the gel at concentration of 1
10–6
g protein per well (undigested and buccal samples) or 4 10–5
g protein per well
(gastric and duodenal samples), as previously determined by BCA assay. Migration,
staining (Coomassie blue) and destaining were performed according to standard procedure
(Laemmli, 1970). Individual proteins were identified using a pre-stained SDS-PAGE MW
82
broad range standard, but also from the migration of purified milk proteins (-Cn, β-Lg, -
La) using the same experimental conditions with a concentration of 1 × 10–6
g protein per
well. A blank sample, constituted of digested fluids without added matrix, was also
analyzed at the end (60 min) of the duodenal phase. Each supernatant of digested samples
and each undigested matrix were analyzed in duplicate and the most representative samples
are illustrated in figure 2.2.
FAA were analyzed by gas chromatography (GC) using the EZ-Faast GC/FID AA sample
testing kit from Phenomenex (Torrance, CA, USA). Analysis were performed on a
Shimadzu GC-2010 Plus equipped with an AOC-20i autoinjector and a FID 2010 Plus, and
connected to GC solution software (Mandel Scientific inc., Guelph, ON, Canada). The
column was a Zebron-AAA (i.d. 0.25 mm × 10 m) from Phenomenex, which was
programmed from 110 °C – 320 °C (32 °C/min); detection was at 320 °C. Hydrogen was
used as carrier gas at 27.2 kPa, flow of 23.8 mL/min and linear velocity of 50 cm/sec.
Nitrogen and air were used as make-up gaz. Sample preparation, derivatization and analysis
were performed as described in the EZ-Faast‘s procedure using standards and reagents
supplied with the kit. FAA in samples (2 µL) were determined by one analysis from
calibration curves prepared with FAA standards at three concentrations (50, 100 and 200
nmole/mL). The amount of FAA in digested samples (supernatant) was expressed as mg/g
protein measured in undigested matrixes. According to their physicochemical properties,
FAA were also pooled within the following classes: acid (Asp, Glu), basic (Lys, His, Arg),
neutral (Gly, Thr, Ser, Tyr, Asn), and hydrophobic (Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, Pro, Trp).
Data for FAA‘s pools were expressed as percentage (%) of the amount of FAA (mg/g
protein) measured in digested samples.
2.4.5 Statistical analysis
Data were analyzed for statistical differences between treatments by one-way analysis of
variance (ANOVA) using the LSD multiple comparisons procedure of SAS 9.2 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA). A p value < 0.05 was considered to be statistically
significant.
83
0
20
40
60
80
Buccal Gastric Duodenal
Pasteurized millk Sterilized milk Yogurt
So
lub
le p
rote
ins
(%)
a
a
a
aa
a
b
b
a b
2.5 Results and discussion
2.5.1 Soluble proteins during in vitro GI digestion of dairy matrixes
The amount of soluble proteins measured in the supernatant of digestion mixtures was
expressed as the solubilized protein content in supernatant related to protein content in
undigested matrix. These amounts measured at the end of each GI digestion phases for the
dairy matrixes are shown in figure 2.1.
Figure 2.1. Soluble proteins (%) in digested matrixes after buccal, gastric and duodenal
phases of in vitro GI digestion. Values are means ± SD of three independent experiments (n
= 3). Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between dairy matrixes at
each digestion phase.
As expected the amount of soluble proteins increased during GI digestion for all the
matrixes, due to the presence of digestive enzymes. The highest increase being observed in
yogurt between each digestion phases, suggests that the food microstructure had an impact
on the solubilization of proteins or their hydrolysis during the GI digestion. However, the
significantly (p < 0.05) lowest amount of soluble proteins measured in yogurt at the end of
the buccal phase, compared to both digested milks (pasteurized and sterilized), cannot be
related to proteolysis since no protease is present in saliva. Although a small proportion of
soluble proteins measured in yogurt is certainly constituted of peptides released during the
84
fermentation process, the low amount of soluble proteins measured in yogurt after the
buccal phase (~ 10 %) is probably more related to the solubility of proteins in saliva and
their denaturation upon the heat inactivation treatment (90 °C, 10 min) applied at the end of
the buccal digestion phase. Indeed, yogurt is a viscous dairy food with acidic pH (~ 4.6)
that decreased the final pH (~ 4.9) of saliva (result not shown), which probably reduced the
solubility of caseins based on their low isoelectric point (~ 4.6), but also during the heat
inactivation treatment. Because of the semi-liquid texture of yogurt, the solubilization of its
proteins in saliva is probably slower than liquid milks even if the duration of buccal phase
was adjusted (2 min vs 20 sec) to take into account the texture‘s difference of the dairy
matrixes (table 2.2).
At the end of the gastric digestion phase, a higher amount of soluble proteins was measured
in all the matrixes (figure 2.1), which could be explained by the hydrolytic action of pepsin
(Fu et al., 2002). Also, the dilution resulting from the addition of gastric juice (2 × 6 mL),
combined to the mechanical stirring of the matrixes, have probably contributed to the
solubilization of proteins (Versantvoort et al., 2004; Versantvoort et al., 2005; Kopf-Bolanz
et al., 2012). The amount of solubilized protein of yogurt increased to reach a value similar
to UHT milk but lower than pasteurized milk. Pepsin and gastric juice probably did not
have access to the yogurt matrix as easily as in liquid milk.
At the end of the duodenal digestion phase, no significant difference was observed in
soluble proteins between the three dairy matrixes. Nevertheless, initial proteins were
solubilized in increasing amounts for pasteurized milk (49 %), sterilized milk (55 %), and
yogurt (62 %). The higher amounts of soluble proteins measured in the matrixes can be
related to the presence of pancreatin in duodenal juice. This enzyme extract contained
various endoproteases (trypsin, chymotrypsin, elastase) and peptidases (carboxy-, amino-,
di-, tri-peptidases) which are responsible for releasing peptides and FAA. However, soluble
protein value is underestimated as dipeptides and FAA are not included in the amount of
soluble proteins measured by the BCA assay since this method cannot detect these
components. Interestingly, Kopf-Bolanz et al. (2012) also showed that 54 % of total
proteins from pasteurized milk are degraded at the end of duodenal digestion using the
85
same in vitro digestion model, but measuring FAA and oligopeptides with the OPA method
in perchloric acid supernatants.
2.5.2 Protein profiles during in vitro GI digestion of dairy matrixes
Figure 2.2 shows SDS-PAGE profiles of undigested (Ctl) and digested matrixes during
buccal, gastric and duodenal phases of in vitro GI digestion. The first gel (Std) shows the
migration of purified milk proteins (α-Cn, ß-Lg and α-La) while the last gel (Blk)
corresponds to the analysis of digestive juices without matrix at the end (60 min) of the
duodenal phase. Since samples were analyzed at two different concentrations to improve
the detection of protein/peptide components (1 µg for Ctl and buccal samples and 40 µg for
gastric, duodenal and Blk samples), comparison of the intensity of the bands can be
performed only within the sample‘s group analyzed at the same concentration.
The undigested milks (Ctl) showed similar protein profile for pasteurized and sterilized
milks (figures 2.2a and 2.2b). For both milks, the buccal digestion did not seem to modify
the electrophoresis pattern compared to the corresponding undigested milk sample (Ctl).
This result was expected since no protease was added to the buccal juice.
The gastric digestion phase induced some difference in protein profile of both milks. In
pasteurized milk, the bands corresponding to intact caseins appeared until the end of the
gastric digestion phase (30 min) contrary to sterilized milk. Caseins bands (for both milks)
decreased in intensity between gastric phase times (figure 2.2a), and some undefined bands
appeared in the low molecular weight region (< 10 kDa) of the gels. For sterilized milk,
both β-Lg and α-La are degraded more rapidly by pepsin during gastric digestion than for
pasteurized milk although faint bands are always visible at the end of this digestion phase.
Overall, these results show that both caseins and major whey proteins are degraded more
easily by pepsin in sterilized milk (138 °C, 4 s) than in pasteurized milk (72 °C, 16 s),
suggesting that the sterilization treatment of milk increased the pepsin‘s susceptibility of
milk proteins.
Figure 2.2. SDS-PAGE analysis of undigested (Ctl) and digested matrixes during buccal, gastric and duodenal phases of in vitro GI
digestion. a) pasteurized milk; b) sterilized milk; c) yogurt. Std corresponds to SDS-PAGE analysis of purified milk proteins (α-casein,
α-Cn; β-Lactoglobulin, β-Lg; α-Lactalbumin, α-La). Blk corresponds to SDS-PAGE analysis of digestive juices without matrix at the
end (60 min) of the duodenal phase.
15 min
a) b) c)
60 min 15 min 30 min 2 min 20 s Std
Buccal Duodenal Gastric
α-Cn
β-Lg
α-La
Ctl 2 min 20 s 60 min Ctl 30 min
Buccal Duodenal Gastric
Blk 5 min 2 min Ctl 15 min 30 min 60 min
Buccal Duodenal Gastric
87
At the end of the duodenal phase (60 min), soluble caseins were totally degraded in both
milks since the bands appearing in this region of the gel corresponded to those observed
in the Blk sample without the addition of matrix. For both milks, the disappearance of
casein bands occurred rapidly (5 min) after the addition of duodenal and bile juices
(result not shown). Again, β-Lg and α-La were degraded faster in sterilized milk than in
pasteurized milk for which faint bands remained visible on the gel. The impact of milk‘s
heat treatment on the kinetics of whey proteins digestion thus seemed to persist until the
end of the duodenal digestion phase.
Caseins migration for undigested (Ctl) and digested samples from yogurt along the in
vitro GI digestion (figure 2.2c) was similar to that observed in sterilized milk (figure
2.2b) with their total degradation after 30 min of the gastric digestion phase.
The rapid pepsin hydrolysis of caseins (5 s – 6 min) during in vitro digestion was
reported in some studies (Fu et al., 2002; Mandalari et al., 2009; Dupont et al., 2010a) as
measured by SDS-PAGE analysis. However, in these previous studies, purified caseins
(e.g. β-Cn) were digested using higher pepsin concentrations than in current study, both
conditions certainly not reflecting the behavior of caseins in a complex food upon in vivo
gastric digestion. A much more realistic study was performed by Dupont et al. (2010b)
using a simulated infant digestion model to study caseins digestion in milk. In accordance
with our results, the authors demonstrated that caseins were degraded more rapidly in
sterilized milk (120 °C/30 s) than in pasteurized (82 °C/30 s) or raw milks during gastric
digestion, also suggesting an higher pepsin susceptibility of caseins depending on the
severity of the heat treatment applied to milk (Dupont et al., 2010b). The rapid duodenal
hydrolysis of caseins, as observed in our study for yogurt and milks, was also reported by
Mandalari et al. (2009) and Dupont et al. (2010b), whereas some studies have
demonstrated an uncompleted caseins hydrolysis even after 30 min of duodenal digestion
(Almaas et al., 2006; Inglingstad et al., 2010). However, these latter studies used gastric
and duodenal juices from human for the hydrolysis of caseins and the lower enzyme
activities in these juices could probably explained this result.
88
Native whey proteins are known to resist pepsin hydrolysis whereas heat treatment
increased their susceptibility to pepsin hydrolysis, especially for β-Lg (Kitabatake and
Kinekawa, 1998; Mullally et al., 1998; Sletten et al., 2008). As shown by Mullally et al.
(1998), heating β-Lg at 80 °C for 20 min destabilized its tertiary structure and increased
its hydrolysis by pepsin. The resistance of α-La to pepsin hydrolysis was shown in
pasteurized milk (Dupont et al., 2010b) such as in heat-treated (80 °C/1 h) whey proteins
(Kitabatake and Kinekawa, 1998). For the in vitro duodenal digestion of whey proteins,
Inglingstad et al. (2010) showed that α-La is partially hydrolysed in a commercial
pasteurized milk during gastric digestion, whereas Carbonaro et al. (1998) reported that
the duodenal digestibility of whey proteins in heat-treated milk was impaired depending
on the intensity of the heat treatment. However, Carbonaro et al. (1998) didn‘t include a
gastric phase in their in vitro digestion model and this could decrease the susceptibility of
proteins to duodenal enzymes.
Commercial yogurt is usually produced from milk enriched in whey proteins which was
first homogenized then heat-treated to favor water retention in order to provide a gelling
or semi-liquid texture to the final product (Tamine and Robinson, 1985). Generally, this
type of heat treatment (85 °C/30 min or 95 °C/10 min) is intermediate between
commercial milk pasteurization (72 °C/16 s) and sterilization (138 °C/4 s) treatments.
The behavior of dairy proteins during gastric hydrolysis of commercial yogurt, as
observed in our study, thus could probably be explained by the heat treatment of milk.
However, Dupont et al. (2010b) showed that the SDS-PAGE profile of caseins and major
whey proteins following the gastric digestion of a yogurt produced from a pasteurized
milk (92 °C/10 min) was more closely related to that of the pasteurized milk than a
sterilized milk (120 °C/30 s). Those results suggested that the digestibility of milk
proteins in yogurt is dependent of the type of heat treatment applied to the milk used for
the production of yogurt.
Finally, the observation that the hydrolysis of milk proteins during our in vitro GI
digestion seems to be more related to the milk‘s heat treatment than to the microstructure
89
of the dairy matrixes was also supported by the in vivo study of Lacroix et al. (2008) in
healthy subjects. Indeed, the authors showed a higher anabolic use of nitrogen after the
ingestion of UHT-treated milk (140 °C/5 s) than pasteurized milk (72 °C/20 s) (Lacroix
et al., 2008).
2.5.3 Free amino acids release during in vitro GI digestion of dairy matrixes
Table 2.3 shows the total FAA content per g of protein in the dairy matrixes at the end of
the buccal, gastric, and duodenal phases of digestion. Although samples were analyzed at
different times during the gastric and duodenal digestion phases, similar results were
obtained for all the matrixes. The amount of FAA released during both the buccal and
gastric digestions remains very low (< 4 mg/g), corresponding to less than 0.4 % of
proteins initially present in the dairy matrixes. This result can be explained by the
absence of peptidase in the buccal and gastric juices, which are responsible for releasing
of short peptides and FAA. The slightly higher amount of FAA in yogurt at the end of the
gastric phase (3.6 mg/g protein) could result from the fermentation during the yogurt
processing. The presence of peptidases in pancreatin added in duodenal juice resulted in a
considerable increase of FAA content in all the dairy matrixes. Although no significant
difference was observed between the matrixes, the amount of FAA at the end of the
duodenal phase varied from 114 to 215 mg/g, corresponding to 11 – 22 % of proteins
initially present in the dairy matrixes.
The FAA content tended to be higher in sterilized milk than in the other matrixes, while
the yogurt tended to have the lowest amount. These contents of FAA reflect the SDS-
PAGE pattern obtained for the dairy matrixes. SDS-PAGE patterns revealed few faint
bands in the low molecular weight region and this suggested that protein material was
intensively hydrolysed as short peptides and FAA which are not retained by the gels. This
statement is supported by the study of Kopf-Bolanz et al. (2012) which demonstrated that
peptides in pasteurized milk digested using the same in vitro GI digestion model were
constituted of 5 – 6 AA residues at the end (120 min) of the duodenal phase. As observed
in figure 2.2 at the end of the duodenal phase, the amount of peptides bands appearing in
90
Table 2.3. FAA in dairy matrixes at the end of buccal, gastric and duodenal phases of the
in vitro GI digestion.
Free amino acids (mg/g protein) 1
Buccal Gastric 2
Duodenal 2
Pasteurized milk < 1
2.6 ± 0.6 a 167 ± 38
a
Sterilized milk < 1 2.6 ± 0.8 a 215 ± 86
a
Yogurt < 1 3.6 ± 1.1 a 114 ± 26
a
1 Values are means ± SD of three independent digestion experiments (n = 3).
2 Different superscript letters within a column indicate significant difference at p < 0.05.
the low molecular weight region of the gels followed the same increasing order than the
FAA content in sterilized milk, pasteurized milk then yogurt. These results thus suggest
that a higher proportion of short peptides and FAA were probably released from sterilized
milk than from the other dairy matrixes, supporting again the hypothesis that the severity
of the heat treatment applied to milk has a higher impact than the microstructure of the
dairy matrixes studied on the digestibility of milk proteins.
Since appreciable amount of FAA was released during the duodenal phase, they were
classified according to their physicochemical characteristics (acid, basic, neutral, and
hydrophobic) and expressed as percentage of the total FAA (figure 2.3). Again, no
significant difference was found between the matrixes for each of the FAA classes (result
not shown), but there were significant differences in the nature of FAA released from
each of the matrixes. In fact, a higher proportion of hydrophobic AA were released from
all the matrixes, which is consistent with the AA composition of dairy proteins. As
reported by Payne-Botha and Bigwood (1959), proteins in raw milk are constituted of 29,
13, 17 and 41 % of acid, basic, neutral and hydrophobic AA, respectively. However, the
very low proportion of the acid AA class (< 1.6 %) measured in all the dairy matrixes is
inconsistent with their content in milk proteins, but this result could be explained by the
fact that glutamate (Glu) is not detected with the EZ-Faast method. Figure 2.3 also shows
91
0
20
40
60
80
Pasteurized Sterilized Yogurt
Acid Basic Neutral Hydrophobic
FA
A(%
)
a a a
b
b
b
b
b
b
c
c
cF
AA
(%)
a a a
b
b
b
b
b
b
c
c
c
that neutral and basic AA are released in similar proportions from the matrixes, which
represent the second highest amount of FAA in dairy proteins.
Figure 2.3. FAA (%) pooled in different classes based on their characteristics (acid,
basic, neutral, hydrophobic) in digested matrixes at the end (60 min) of the duodenal
phase of in vitro GI digestion. Values are means ± SD of three independent experiments
(n = 3). Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between FAA classes
for each dairy matrix.
The bioaccessible AA seem to represent the AA composition of dairy proteins (except
acid AA). Concentration of free basic AA tended to be similar to basic AA concentration
in dairy proteins of milk whereas Arg was not detected with the EZ-Faast method. Lys,
the other basic AA from dairy proteins, represents a more important amount than Arg.
Leucine is one of the most abundant AA in dairy proteins and could be the most
important bioaccessible AA at the end of the duodenal digestion for all the matrixes.
Indeed, Kopf-Bolanz et al. (2012) showed that Leu was the most abundant FAA
measured in pasteurized milk at the end of the duodenal digestion, followed by the other
AA targets of chymotrypsin and carboxypeptidase A (Phe, Tyr, Arg, Trp). However, no
significant difference was observed between the proportion of basic and neutral AA in
the matrixes at the end of the duodenal digestion phase. These AA were in low
concentrations (< 1 mmol/L) in the study of Kopf-Bolanz et al. (2012) and these authors
92
showed that Arg and Lys, the two AA targets of trypsin and carboxypeptidase B, were in
highest proportion than neutral or acidic AA at the end of the GI digestion. However, this
discrepancy could be related to the EZ-Faast method used for the quantification of FAA
which is unable to detect Arg. Overall, these results suggested that the release of FAA at
the end of the duodenal digestion is mainly governed by the specificity of proteases
(chymotrypsin and trypsin) and peptidases (aminopeptidases and carboxypeptidases)
contained in pancreatin. Moreover, it seems that neither the microstructure of dairy
produts studied here, nor the heat treatment applied to milk has induced a difference in
the nature of AA released upon the duodenal digestion. However, this conclusion should
be further validated by using another method than EZ-Faast which cannot detect Glu and
Arg, two abundant AA in milk proteins.
2.6 Conclusion
The in vitro GI digestion model used in the present study allowed the differentiation of
the milk‘s protein digestion in two commercial milks (liquid matrix) treated by
pasteurization or sterilization and in a commercial stirred-yogurt (semi-liquid matrix).
Although these dairy products had different food microstructures, it was shown that
processing, notably the severity of the heat treatment, had more impact on milk‘s protein
digestion than the matrix structure and that the differences in both caseins and whey
proteins digestions were mainly governed by the gastric digestion phase. During the
duodenal digestion phase, the specificity of the enzymes in pancreatin should be
considered as the most important factor influencing the release of FAA from milk
proteins. Overall, this work highlighted the importance to carefully control the heating
processes of dairy products in industry and to better understand their impact on the
digestibility of milk proteins.
2.7 Acknowledgement
This research was jointly funded by the research programmes of the Fonds québécois de
la recherche sur la nature et les technologies, Novalait Inc., the Ministère de
l‘Agriculture, des Pêcheries et de l‘Alimentation du Québec, and Agriculture and Agri-
Food Canada.
Chapitre III : In vitro bioaccessibility of peptides and
amino acids from yogurt made with starch, pectin, or β-
glucan
Au chapitre précédent, la mise au point d‘ un système modèle in vitro de digestion gastro-
intestinale a permis de démontrer que la digestion des protéines de matrices laitières
liquide (lait) et semi-liquide (yogourt) est différente particulièrement au niveau de la
cinétique de digestion gastrique. Il a aussi été démontré que la sévérité du traitement
thermique subi par les matrices laitières a un impact plus important que la structure de la
matrice (liquide ou semi-liquide) sur la digestion des protéines laitières.
Le troisième chapitre présente les travaux réalisés pour répondre au deuxième objectif de
la thèse, soit d‘étudier l‘effet de l‘ajout de polysaccharides, comme stabilisants, dans des
produits gélifiés acides (yogourts), sur la digestion protéique et la libération des peptides
et des acides aminés dans le système modèle in vitro de digestion gastro-intestinale mis
au point dans le chapitre précédent.
94
3.1 Résumé
Les propriétés physico-chimiques des nutriments dans une matrice alimentaire sont
fonction de la composition et des procédés technologiques de l‘aliment. Les organisations
moléculaires et structurales des nutriments définissent la microstructure de la matrice
alimentaire. La bioaccessibilité des peptides et des acides aminés (AA) issus de la
digestion gastro-intestinale (GI) des protéines d‘un gel acide laitier (ou yogourt),
contenant différents polysaccharides (PS), a été étudiée. La nature du PS ajouté a modulé
la cinétique de digestion gastrique des protéines, alors que la viscosité n‘a pas eu d‘effet
contrairement aux travaux antérieurs réalisés sur des solutions visqueuses. Les yogourts
avec β-glucan et avec pectine (haute viscosité) ont montré une protéolyse plus rapide, un
largage de gros peptides moins important, et une proportion d‘AA libres plus importante
que les yogourts avec amidon et sans PS. Une ségrégation entre le β-glucan et les
protéines laitières peut expliquer la protéolyse plus rapide due à une concentration des
enzymes et des protéines dans une phase séparée considérée comme des « micro-
réacteurs ». La présence de cations divalents à pH acide a pu favoriser les interactions
pectine-pectine et promouvoir également une ségrégation dans le yogourt avec pectine.
La cinétique de digestion des protéines durant les phases buccale et duodénale n‘a pas été
affectée par la présence de PS dans les formulations de yogourt. À la fin de la digestion
duodénale, les protéines ont été totalement digérées, pas de protéine native résiduelle n‘a
été détectée et des AA sont devenus bioaccessibles (25 % du contenu initial protéique).
Les limites du modèle de digestion (ni vidange gastrique, ni régulation hormonale)
pourraient expliquer les comportements similaires des yogourts à la fin de la digestion
GI, alors que l‘étape gastrique était affectée. La microstructure, et en particulier les
interactions entre les nutriments, a un impact sur la digestion des protéines.
95
3.2 Abstract
Physico-chemical properties of nutrients in food matrix change with the composition and
the manufacturing process of food. The specific molecular and structural organization of
nutrients defines by the microstructure of food matrix. The bioaccessibility of peptides
and amino acids (AA) during in vitro gastrointestinal (GI) digestion of proteins from acid
dairy gel (or yogurt) containing different polysaccharides (PS) was investigated. The
nature of added PS was shown to modulate the kinetics of proteins gastric digestion,
whereas the yogurt viscosities did not as reported in literature with viscous solutions. The
yogurts with β-glucan and with pectin (high viscosity) showed faster proteolysis, release
of large peptides less important, and higher proportion of free AA compared to the
yogurts with starch or without PS. Segregation between β-glucan and dairy proteins could
explain faster proteolysis by concentration of enzymes and proteins in a separated phase
considered as ―micro-reactors‖. The presence of divalent cations at gastric pH could
favor pectin-pectin interactions and also promote segregation in yogurt with pectin.
Kinetics of protein digestion during the buccal and duodenal phases was not affected by
the presence of PS in yogurt formulations. At the end of duodenal phase, the proteins
were fully digested with no native protein left and bioaccessible AA increased (25 % of
initial protein content). The limits of the in vitro digestion model (no gastric emptying, no
hormonal regulation) could explain the similar behaviors at the end of the GI digestion
for all yogurts while the gastric phase was affected. The microstructure, and particularly
the interactions between nutrients, has an impact on protein digestion.
96
3.3 Introduction
Foods are complex system consumed to obtain essential nutrients allowing to sustain
human growth and maintenance. The process of digestion includes mechanical, chemical
and enzymatic steps to release nutrients and facilitate their absorption. Bioaccessibility
refers to nutrients release from the food matrix in the intestinal lumen, while the term
bioavailability involves the transport of nutrients across intestinal epithelium into the
serum. Bioavailability can be different according to food matrix (Edwards et al., 2002;
Parada and Aguilera, 2007). For example, bioavailability of vitamin A was higher for
commercial carrot puree than for boiled-mashed vegetables both containing the same
initial amount of vitamin A (Edwards et al., 2002). As previously observed (Gaudichon et
al., 1994), the N flow rate increased in the proximal jejunum after both milk and yogurt
ingestion but was delayed with yogurt in comparison with milk.
Proteins, and especially dairy proteins, are well known for their nutritional and biological
functions. Dairy proteins influence many regulatory systems as glucose and lipid
metabolism, blood pressure, immune function, food intake, and body weight (Jahan-
Mihan et al., 2011). They contain essential amino acids (AA) not synthesized by the
human organism which are important for protein turn-over (Widmaier et al., 2011).
Branched-chain AA (BCAA), Phe, Tyr, Met, Lys, Thr, Arg, Ala, and Glu from dairy
proteins influence several postprandial metabolic responses. Milk and whey proteins
added to drinks promoted a high insulin secretion (Nilsson et al., 2004; Luhovyy et al.,
2007; Nilsson et al., 2007) in comparison with other foods (cheese, cod, wheat gluten,
and white bread as reference food) (Nilsson et al., 2004; von Post-Skagegard et al.,
2006). Furthermore, this secretion was more important after ingestion of whey proteins
than whole milk (Nilsson et al., 2004) and this has been related to the higher content in
BCAA and other AA like Lys and Thr in whey proteins (Nilsson et al., 2007).
Viscous polysaccharides (PS) in solution like β-glucan can impact the digestion process
(Johansen et al., 1996). A change in the rheological behavior of stomach content as high
viscosity has been shown to slow down small intestine transit of nutrients (Juvonen et al.,
97
2009). Moreover, viscous fluids can modify enzyme accessibility to substrates. Addition
of barley β-glucan (4 g/100 g) decreased bread particles breakdown during in vitro
digestion delaying glucose release (40 %) in comparison with a control bread without β-
glucan (Thondre et al., 2010). This PS was reported to reduce glycemic and insulinemic
responses (Makelainen et al., 2006) and these effects were related to its viscous behavior.
Other PS can also impact the digestion process. Addition of high methoxyl (HM) pectin
(150 mg) in glucose solution reduced up to 80 % of glucose absorption of intestinal
perfused rats after 30 minutes, probably due to the increase in viscosity (Kim, 2005). An
in vitro digestion of a starch (from potato) wiht amylase-enzyme resistant starch (from
maize, 2 % w/v) showed a lower glucose diffusion (16 %) compared to a control (starch
without fibers) (Ou et al., 2001). In addition to the effect of viscosity delaying glucose
diffusion, other added PS as soluble and insoluble fibers from wheat bran, guar gum or
xanthan gum delayed it by adsorbtion to starch (in solution) and so α-amylase activity is
reduced (PS could be a barrier or an inhibitor of enzyme) (Ou et al., 2001).
In vitro studies showed that PS can also modulate the digestion process of other nutrients
such as proteins. Pectin significantly reduced the extent of casein hydrolysis by the
formation of complexes with enzymes and/or substrates (Acton et al., 1982).
Mouecoucou et al. (2003) showed a lower digestibility (peptides with higher molecular
weight) of β-lactoglobulin (β-Lg) by pepsin in presence of gum arabic, xylan, low
methoxyl (LM) pectin or HM pectin because of associative interactions between β-Lg
and PS and due to viscosity increase (Mouecoucou et al., 2003). In the literature, most
studies related to protein digestion in presence of PS were performed on diluted solutions
and the possible effect of the food matrix characteristics were not considered (Acton et
al., 1982; Schmitt et al., 1998; Syrbe et al., 1998; Mouecoucou et al., 2003).
The impact of food matrix organization on the in vitro bioaccessibility of minerals and
vitamins has been shown on several vegetables and cereals (Cámara et al., 2005; Frontela
et al., 2008; Herrero-Barbudo et al., 2009). Other in vitro studies were on the
98
bioaccessibility of contaminants from food matrix (Cabañero et al., 2004; Versantvoort et
al., 2005). However, nutrients bioaccessibility from milk and dairy product is poorly
documented (Breslaw and Kleyn, 1973; Herrero-Barbudo et al., 2009; Barbé et al., 2012;
Kopf-Bolanz et al., 2012). Yogurt is an acid gel matrix in which stabilizers (like PS) are
added to improve mouth feel, textural properties and reduce syneresis. The aim of this
study was to evaluate the effects of added stabilizers in yogurts on protein digestion and
release of peptides and AA using an in vitro gastrointestinal (GI) model (Rinaldi et al.,
chapter II).
3.4 Materials and methods
3.4.1 Reagents, chemicals and enzymes
Reagents and enzymes used for the preparation of digestive fluids, and the chemicals
used for SDS-PAGE analysis were previously described by Rinaldi et al. (chapter II).
The trypsin-chymotrypsin inhibitor from glycine max (soybean) was purchased from
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The Ki of the inhibitor for trypsin and for α-
chymotrypsin were 5.6 107 and 5.0 10
7, respectively.
Chemicals used for RP-HPLC were HPLC grade. Acetonitrile was from EMD
(Darmstadt, Germany) and trifluoroacetic acid from JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA).
Propionic acid (purity ≥ 99.5 %) and isoproanol (purity ≥ 99.5 %) used for MS were from
Sigma-Aldrich. Samples were filtered using PVDF syringe filters (13 mm, non sterile,
0.22 µm) from Chromspec inc. (Brockville, ON, Canada).
3.4.2 Powders for yogurt manufacturing
Skimmed milk powder (protein content 33.56 %, fat content 1.2 % max, total solid 97.67
%) was purchased from Dairytown (Sussex, NB, Canada). Whey protein isolate (WPI)
(protein content 93.95 %, fat content 1.0 % max, total solid 94.43 %) was from Davisco
Food International Inc. (Eden Prairie, MN, USA) and lactose (monohydrate, ACS) was
from Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Thermtex modified corn starch from waxy
99
maize was obtained from National Starch Food Innovation (Brampton, ON, Canada),
GENU pectin type LM-106 AS-YA (degree of methylation (DM) 18 – 22 %, pKa 4,
extracted from citrus peel) was from CP Kelco (San Diego, CA, USA), and β-glucan
(purity 75.6 %, Glucagel, extracted from barley) was purchased from PolyCell
Technologies LLC (Crookston, MN, USA).
3.4.3 Preparation of yogurts
Nonfat yogurts were prepared from skimmed milk, WPI, and lactose powders rehydrated
in deionized water to obtain 4 % (w/w) protein content with a caseins/whey proteins ratio
of 2.8, 0.46 % ash and 14 % dry matter. Control yogurt (without PS) contained 4.47 %
lactose. Lactose concentration was slightly reduced in yogurts made with PS to keep the
dry matter constant to 14 %. The concentrations of added PS were: 0.75 % (w/w) starch,
0.2 % (w/w) pectin, and 0.4 % (w/w) β-glucan. These concentrations were chosen within
the usual content industrially used (0.75 % w/w) and allowing to obtain a stable yogurt as
determined in preliminary experiments. For all yogurts, skimmed milk powder, WPI and
lactose were hydrated in water at 40 °C under stirring until uniform dispersion of
powders (5 min). For control yogurt, stirring continued one hour at room temperature.
For yogurt with pectin, the temperature of milk was lowered to 25 °C, pectin was added,
and stirred for one hour. For yogurt with starch, PS was prehydrated in water at 70 °C
under stirring (1 min), then solution was cooled to 40 °C to add dairy powders and
lactose. For yogurt with β-glucan, PS was added in water at 90 °C under stirring and the
stirring continued 30 min before the addition of dairy powders and lactose at 40 °C. The
water content was corrected for evaporation. The milks were then mixed one hour at
room temperature and were stored at 4 °C overnight. The following day, milk
formulations were brought to ambient temperature, were pasteurized (90 °C, 2 min),
then were cooled to 42 °C. Commercial starters were added to dairy mixture at a
concentration of 0.02 % (Yo mix860, Danisco, Canada) before incubation at 42 °C.
Fermentation was stopped when pH reached 4.60 ± 0.05. The total fermentation time
ranged between 3 h 30 and 4 h 00. The firm yoghurts were cooled in water-ice mixture,
and put at 4 °C until use. Bacterial count in yogurts was 108
UFC/mL as determined by
100
bacterial enumeration of Lactobacillus Bulgaricus and Streptococcus Thermophilus on
De Man, Rogosa and Sharpe medium (MRS) and M17 agar medium, respectively.
3.4.4 Yogurt viscosity determination
Yogurt viscosity was measured to characterize the dairy matrixes. Five days after
production, the viscosity of yogurts was measured at 4 °C using Ares G2 rheometer (TA
instruments, New Castle, DE, USA) with 25 mm-parallel serrated plate geometry.
Yogurts were carefully sampled with a spatula and put in the rheometer. The upper plate
was lowered at low speed (1 mm/s) to the gap 1.0 mm. Measurements were realized at
shear rates ranging from 1 to 100 s-1
. Each yogurt was analyzed in triplicate.
3.4.5 In vitro GI digestion model
In vitro digestion of yogurts was performed (3 days after manufacturing) using the model
developed by Versantvoort et al. (2005) and as adapted by Rinaldi et al. (chapter II) for
semi-liquid dairy matrixes with some further modifications. The modifications (vs
Rinaldi et al., chapter II) were: i) gastric and duodenal orbital stirring was at 75 rpm (vs
55 rpm) to increase the homogeneity of digestive medium; ii) addition of a trypsin-
chymotrysin inhibitor to inactivate the pancreatic enzymes (to substitute the heat
treatment); iii) digested sample‘s pH was adjusted to 7 to all have similar ionic
environment.
To ensure a homogenous sampling, an individual sample was used for each digestion
time studied: end of buccal phase (2 min), and after 5, 15, 30 and 60 min of gastric and
duodenal phases. Each of these experiments was performed on three yogurts from
different daily productions (n = 3) for a total of 108 independent digestions. After
digestion, the whole digested sample was homogenized in the same conditions as Rinaldi
et al. (chapter II), and pH was adjusted to 7.0 with NaOH (1 N and 0.1 N) and HCl (0.1
N). Each sample was then treated to inactivate digestive enzymes and centrifuged (9800
g, 20 min, 4 °C). Alpha-amylase in buccal samples was inactivated by a heat treatment at
90 °C during 10 min (Ujihira et al., 1965). In gastric samples, pepsin was inactivated by
increasing pH to 7, and buccal α-amylase was inactivated due to acid pH during gastric
101
digestion. For duodenal samples, centrifugation was performed before enzyme
inactivation and inhibitor (126 µL) was added to supernatant (4 mL) to obtain 0.024 µg
inhibitor/µL sample. All supernatants were frozen (–80 °C) for further chemical analysis.
3.4.6 Total soluble protein content of digested samples
Total protein content of undigested yogurts and soluble protein content in supernatants of
digested samples were quantified with the Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay
kit from Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA), as our previous study (Rinaldi et
al., chapter II). The soluble protein content of supernatants of digested samples was
expressed as percentage (%) of total protein in undigested yogurts. Each sample was
analyzed in duplicate.
3.4.7 Characterization of soluble protein profile of yogurts and digested samples
using SDS-PAGE
The protein profiles of yogurts before and during digestion (supernatants) were analyzed
by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using 15 %
Bis/Acrylamide gels under reducing conditions with a stacking gel (4 % Bis/Acrylamide)
to concentrate proteins as described by Laemmli (1970). The method used was similar to
Rinaldi et al. (chapter II), except: 1)the protein quantity loaded onto gel: 10 µL of diluted
samples in distilled water were loaded onto the gel at concentration of 2.0 10-5
g protein
per well; 2) the destaining time: 16 h except the undigested yogurt (2 x 20 min). The
volume of supernatant to load on the gel was determined from the protein content
measured by BCA method (see above). Standards (pre-stained SDS-PAGE MW broad
range standard and purified milk proteins) were the same as used in Rinaldi et al. (chapter
II). Each supernatant of digested samples and each undigested yogurt were analyzed in
duplicate.
3.4.8 Peptide analysis of digested samples using RP-HPLC/MS
Products of digestion were centrifuged (10 000 g, 20 °C, 20 min) with 50 % (w/v)
acetonitrile-Milli Q water (90:10) to remove PS. Supernatants were analyzed by liquid
102
chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) to analyze the molecular masses
of peptides. Digested samples (supernatants) were diluted with MilliQ water to obtain
100 ± 2 µg proteins (determined by BCA method) in injected volume (20 µL), and
filtered on 0.22 µm pore size filter. Filtered samples were loaded onto a Phenomenex
Luna C18 (2) 3 µm particle size (150 × 2.0 mm) column equipped with a C18 cartridge
guard (Torrance, CA, USA) and connected to an Agilent 1100 LC/MS Trap VL
(Mississauga, ON, Canada). Gradient elution was carried out with a mixture of 2
solvents. Solvent A contained 0.1 % (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in Milli Q water and
solvent B contained 0.1 % (v/v) TFA in acetonitrile-Milli Q water (80 : 20). The column
was initially equilibrated with 5 % of solvent B, and the samples were eluted using a step
gradient as follows: 0 – 30 min 5 %, 30 – 70 min 20 %, 70 – 100 min 30 %, 100 – 110
min 50 %, 110 – 125 min 100 %, 125 – 145 min 5 %. The elution rate was 0.275 mL/min
at 40.0 °C and the detection was made by UV absorption at 214 nm which was the typical
absorbance of peptide bounds (Ferreira and Caçote, 2003; Mollé and Léonil, 2005;
Ferreira et al., 2007). Eluted samples were injected in trap VL to be analyzed by MS after
mixing of propionic acid-isopropanol (50 : 50) to reduce the charge effect of TFA. The
injection rate was 70 µL/min. Signals were recorded in positive mode with a scan range
of 125 – 2000 m/z. The chromatograms were analyzed by base peak chromatogram
option (BPC) which allows the analysis of the most intense peaks (Gold, 1987). Each
peak obtained by MS was associated to several peptides having different molecular mass
and abundances. The area of each peak was attributed to the peptide having the highest
abundance. The area of each peak was expressed related to the total area of the
chromatogram. For analysis, peptides were pooled by their molecular masses: 300 – 499
Da, 500 – 999 Da, 1000 – 1 499 Da, 1 500 – 2 999 Da, 3 000 – 4 999 Da and 5 000 – 20
000 Da. Peptides inferior to 500 Da corresponded to tri-peptides, the smallest peptides
quantified by BCA method. Peptides between 500 and 1000 Da had 4 – 6 AA, one class
of major peptides detected by Kopf-Bolanz et al. (2012) in duodenal in vitro digestion of
milk. The peptides between 1000 and 5000 Da were studied because they represented the
peptides detected by Kopf-Bolanz et al. (2012) too. However in the current study this
range was separated in order to analyze different peptide classes. Peptides with masses of
1 000 – 1 499, 1 500 – 2 999, and 3 000 – 5 000 Da corresponded to peptides containing
103
approximately 6 – 10, 10 – 20, and 20 – 30 AA, respectively. The approximate molecular
masses are explained by the AA composition of peptides. Because the material was more
sensitive to detect small peptides than the large peptides, the peptides between 5 000 and
20 000 Da were analyzed all together.
3.4.9 Free amino acids analysis of digested samples using GC/FID
Like for RP-HPLC analysis, products of digestion were centrifuged (10 000 g, 20 °C, 20
min) with 50 % (w/v) acetonitrile-Milli Q water (90:10) to remove PS. Free amino acids
(FAA) from supernatants were analyzed by gas chromatography (GC) using the EZ-Faast
GC/FID AA sample testingkit from Phenomenex (Torrance, CA, USA). Analysis were
performed as described in Rinaldi et al. (chapter II) using a Shimadzu GC-2010 Plus
equipped with an AOC-20i autoinjector and a FID 2010 Plus, and connected to GC
solution software (Mandel Scientific inc., Guelph, ON, Canada). The column, sample
preparation and calibration followed the same procedure as Rinaldi et al. (chapter II). The
sum of FAA (Asp, Lys, His, Gly, Thr, Ser, Tyr, Asn, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, Pro,
and Trp), and the amount of BCAA (Leu, Ile, and Val) in digested samples
(supernatants) were expressed as mg per g of total protein in the matrix.
3.4.10 Statistical analysis
Data were analyzed for statistical differences between treatments by one-way ANOVA
using the LSD multiple comparisons procedure of SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC,
USA). A p value < 0.05 was considered to be statistically significant.
3.5 Results
3.5.1 Viscosity of yogurts with different PS
All yogurts showed pseudoplastic behavior (figure 3.1) with a decrease in viscosity as
shear rate increased, characteristic of yogurt structure breakdown due to shear (Duboc
and Mollet, 2001). The control yogurt and the one with starch followed a similar
viscosity profile, the latter having higher values (by 31 % ± 6 % at 1 – 100 s-1
). Pectin
yogurt showed a viscosity pattern similar to the control at shear rates lower than 10 s-1
but
104
1
10
100
1000
1 10 100
Shear rate (s-1)
Vis
cosi
ty (
Pa.
s)
at higher shear rates viscosity values were higher (2.8 vs 0.9 Pa.s at 100 s-1
). The yogurt
with β-glucan showed a different viscosity profile. From 1 to 4 s-1
, the viscosity of yogurt
with β-glucan was barely constant, and then decreased steeply from 8 to 100 s-1
to reach a
final viscosity value similar to the yogurt enriched in pectin. At the shear rate
representative of the GI mixing (20 s-1 – 40 s
-1) (Wood, 2004) the lowest viscosity was
observed for the control yogurt and the yogurt with starch and the highest viscosity for
yogurt enriched with β-glucan and with pectin
Figure 3.1. Effect of shear rate on the viscosity of control yogurt ( ), yogurt with starch
( ), with β-glucan ( ), and with pectin ( ). Values are means ± SD (n = 3).
3.5.2 Soluble protein and peptide content after in vitro GI digestion of yogurts
Figure 3.2 presents the amount of soluble proteins and peptides at the end of the 3
digestion phases related to initial protein content in yogurt.
a,
b a,
b
a
a b a b b
105
0
20
40
60
80
100
Buccal Gastric Duodenal
Control Starch β-glucan Pectin
Solu
ble
pro
tein
s (%
)
a a a a
a a
b b
ab
a a
b
Figure 3.2. Soluble proteins (%) in digested matrixes after buccal, gastric and duodenal
phases of in vitro GI digestion of control yogurt, yogurt with starch, with β-glucan, and
with pectin. Values are means ± SD of three independent experiments (n = 3). Different
letters indicate significant difference (p < 0.05) between dairy matrixes at each digestion
phase.
The amounts of soluble proteins and peptides at the different gastric and duodenal times
(5, 15, 30 and 60 min) for gastric and duodenal phases are not shown because they were
not significantly different. The amount of soluble proteins and peptides increased during
the digestion process, being lower than 15 % at the end of buccal phase (no differences
between the yogurts), and ranging from 25 to 35 % after the gastric digestion phase. The
amount of soluble proteins reached maximal values between 60 and 80 % after duodenal
digestion. At the gastric phase, two groups can be distinguished, the control and the
yogurt with starch had similar soluble protein proportions (25 ± 0.5 and 22 ± 3 %,
respectively) and significantly (p < 0.05) lower than those of β-glucan (34 ± 4 %) and
pectin enriched yogurts (35 ± 5 %). This pattern changed after the duodenal digestion.
Yogurts enriched in PS were all similar to the control. However, the pectin enriched
yogurt had a significantly (p < 0.05) higher proportion (79 ± 13 %) of soluble proteins
and peptides than starch (65 ± 1 %) and β-glucan (61 ± 2 %) enriched yogurts.
106
a)
3.5.3 Soluble protein and peptide profiles after in vitro GI digestion of yogurts
The soluble proteins and large peptides were separated according to their molecular
weight by SDS-PAGE (figure 3.3). The SDS-PAGE protein patterns of undigested
yogurts (figure 3.3a) showed the usual dairy protein profile with a dense region with
caseins (24.0 – 19.0 kDa), β-Lg (18.0 kDa) and α-lactalbumin (α-La) (14.4 kDa) bands.
Patterns were similar for all the undigested yogurts (figure 3.3). The pattern of control
yogurt after buccal digestion (figures 3.4a and 3.4b B2) was different from the undigested
yogurt (figure 3.3). A dark zone can be observed in the low molecular weight region after
the buccal digestion corresponding to peptides produced by lactic acid bacteria. The
buccal SDS-PAGE profiles of yogurts with PS (figures 3.4b, 3.4c, and 3.4d B2) showed
differences with the buccal sample of control yogurt (figure 3.4a B2). Casein and β-Lg
bands can be seen for yogurt with starch and pectin, and were similar to the control
yogurt (figures 3.4a, 3.4b, and 3.4d B2). However, caseins bands disappeared in the
yogurt containing β-glucan.
std1 std2 Ctl Starch Pectin β-glucan
Figure 3.3. SDS-PAGE analysis of undigested matrixes (control yogurt (Ctl), yogurt
with starch, yogurt with β-glucan, and yogurt with pectin). Std1 corresponds to SDS-
PAGE standards, std2 corresponds to SDS-PAGE analysis of purified milk proteins (β-
casein, β-Cn; α-casein, α-Cn; κ-casein, κ-Cn; β-Lactoglobulin, β-Lg; and α-Lactalbumin,
α-La).
κ-Cn
7 kDa
α-La
β-Lg
45 kda
α-Cn β-Cn
d)
std1 std2 B2 G5 G30 G60 D5 D60 std1 std2 B2 G5 G30 G60 D5 D60
Figure 3.4. SDS-PAGE analysis of digested matrixes during buccal (B2), gastric (5 min: G5, 15 min: G15, 30 min: G30, 60
min: G60) and duodenal (D60) phases of in vitro GI digestion. a) control yogurt; b) yogurt with starch; c) yogurt with β-
glucan; d) yogurt with pectin. Std1 corresponds to SDS-PAGE standards, std2 corresponds to SDS-PAGE analysis of purified
milk proteins (β-casein, β-Cn; α-casein, α-Cn; κ-casein, κ-Cn; β-Lactoglobulin, β-Lg; and α-Lactalbumin, α-La).
κ-Cn
a)
c)
b)
7 kDa
α-La
β-Lg
45 kda β-Cn α-Cn
108
At 5 and 30 min of gastric digestion phase, starch enriched yogurt showed similar protein
patterns to control yogurt. For yogurts with β-glucan and with pectin (figures 3.4c and
3.4d, G5 – G60), caseins bands were very thin compared to the other yogurts (figures
3.4a and 3.4b, G5 – G60) Beta-Lg is not distinguished in the low MW region for the
yogurt with β-glucan (figure 3.4c) and the bands are thin for the yogurt with pectin
(figure 3.4d). For all the 4 yogurts, bands of α-La were confused with large spots, it was
not possible to see their evolution at gastric digestion phase.
At duodenal digestion phase, the patterns were similar throughout digestion (D5, D15,
D30 and D60) and only the samples at 5 and 60 min are shown (figures 3.4a, 3.4b, 3.4c,
and 3.4d, D5 - D60). No intact dairy proteins were detected, bands observed resulted
from proteins and enzymes coming from the digestive solutions as observed in previous
study (Kopf-Bolanz and al., 2012). No bands were observed at the bottom of the gel,
suggesting proteins and large peptides (> 7 kDa) were hydrolyzed in smaller peptides (<
7 kDa) and AA.
3.5.4 Bioaccessible peptides from digested yogurts
The size distribution of soluble proteins and peptides after gastric and duodenal digestion
phases is presented in figures 3.5a and 3.5b respectively. Buccal samples were not
analyzed because of the absence of protease in saliva.
At the end of the gastric digestion, the sum of all peptides categories smaller than 3 000
Da (83 – 89 %) was not significantly different between yogurts (figure 3.5a). However,
the small peptides between 500 and 1 000 Da, corresponding to 4 – 6 AA, represented 13
– 28 % of peptides. The amount of these peptides was significantly (p < 0.05) lower for
the control yogurt than the yogurts with starch and with pectin, and the amount tended to
be more important for the yogurt with β-glucan than the yogurt with starch (p = 0.06).
The most abundant peptides (30 – 40 %) were in the range 1 500 – 3 000 Da with similar
amounts for all yogurts. The proportion of peptides ranging from 3 000 to 5 000 Da was
significantly (p < 0.001) higher for the yogurt with β-glucan than the other yogurts while
the proportion of larger peptides (> 5 000 Da) was higher for the control yogurt and the
yogurt with starch than for the yogurt with β-glucan.
109
0
10
20
30
40
50Control Starch β-glucan Pectin
Chro
mat
ogra
m a
rea
(%)
Molecular mass classes of peptides (Da)
a a
b
a
a a
bc
a
a b
b
b
0
10
20
30
40
50
60
70
Chro
mat
ogra
m a
rea
(%)
Molecular mass classes of peptides (Da)
a b
aa
b
b
a
a b
a
a a cb cb
Figure 3.5. Estimated quantity of peptides (MS chromatogram area - %) pooled in
different classes based on their molecular masses at the end of a) gastric digestion, and b)
duodenal digestion, of in vitro GI digestion. Values are means ± SD of three independent
experiments (n = 3). Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between
dairy matrixes for different masse classes. No letters indicate no significant difference (p
< 0.05).
The duodenal digestion (figure 3.5b) resulted in more than 85 % of the peptides being
smaller than 1 000 Da (< 6AA). The yogurt with starch had a proportion of small
b) duodenal
a) gastric
110
0
2
4
6
8
10
12
14
Control Starch β-glucan Pectin
FA
A (m
g)/
g o
f p
rote
in in
yo
gu
rt
a
a
b
a b
0
100
200
300
400
Control Starch β-glucan Pectin
FA
A (m
g)/
g o
f pro
tein
in y
og
urt
a a
a
a
peptides (300 – 499 Da) significantly (p < 0.05) higher than the control yogurt and the
yogurt with pectin. The proportion of peptides between 500 and 999 Da was higher for
control yogurt and yogurt with pectin than yogurt with starch and this proportion tended
to be more important for the yogurt with β-glucan than the yogurt with starch (p = 0.051).
The proportion of peptides ranging between 1 000 and 1 499 Da was significantly (p <
0.05) higher for the control yogurt than the yogurts with starch, and with pectin. This
proportion was significantly (p < 0.05) lower for the yogurt with starch than the yogurt
with β-glucan. The proportions of peptides larger than 1 500 Da were low and similar for
all yogurts.
3.5.5 Bioaccessible amino acids from digested yogurts
The total content values of FAA released from the initial matrix at the end of the gastric
and duodenal digestions are presented in figure 3.6. At the end of gastric digestion,
control yogurt and the yogurt with starch had a low content of FAA (3 mg, and 2 mg/g of
protein respectively) similar to pectin (5 mg/g of protein) but significantly lower than the
FAA content of the yogurt with β-glucan (8 mg/g of protein) (figure 3.6).
Figure 3.6. Total FAA content (mg) per g of initial protein content in yogurt after a)
gastric digestion, and b) duodenal digestion. Values are means ± SD of three independent
experiments (n = 3). Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between
dairy matrixes at each digestion phase.
b) duodenal a) gastric
111
At the end of duodenal digestion the amounts of total FAA released from initial matrix
were similar for all the yogurts with an average of 250 mg/g of total protein content in
matrix (figure 3.6b). These concentrations of FAA represented 25 % of the initial protein
content and were reached in the first minutes of duodenal phase (results not shown) and
then remained constant up to the end of digestion (total GI digestion time of 122 min), in
accordance with fast and completed hydrolysis. The concentrations of individual FAA
were not significantly different at the end of duodenal digestion phases (annexe 1).
3.6 Discussion
Using an in vitro GI digestion model, it has been possible to reveal some differences in
protein digestion from yogurts varying in the nature of added PS. We have shown an
effect of the added PS in yogurts on protein solubilization, and on the amount of released
peptides and AA from the dairy matrix.
During the course of digestion phases, the amount of soluble proteins increased and that
was explained by the addition of proteolytic enzymes and digestive fluids at each
digestion phase. This addition allowed also the release of peptides and AA in accordance
with previous studies using similar in vitro GI digestion model to digest dairy products
(Kopf-Bolanz et al., 2012) (Rinaldi et al, chapter II). The mechanical degradation of the
semi-liquid matrix by stirring helped the release of nitrogenous compounds from these
matrixes as observed by Versantvoort et al. (2005) for mycotoxins release from solid
food matrix. The proportion of soluble proteins at gastric phase (25 - 35 %) and the
hydrolysis of dairy proteins by pepsin were in accordance with in vitro GI digestion of
commercial yogurt (Rinaldi et al., chapter II). As expected with the specificity of pepsin,
large peptides were released from proteins, and the FAA contents were very low at this
step for all yogurts. The most abundant peptides (50 - 62 %) from the different yogurts at
the end of gastric digestion had molecular masses between 500 and 3 000 Da in
accordance with Picariello et al. (2010). These authors showed, using MALDI-TOF, that
in vitro pepsin hydrolysis of caseins, β-Lg, and α-La released peptides from 827 to 3 123
Da (Picariello et al., 2010). At the end of GI digestion the majority of bioaccessible
peptides had molecular masses inferior to 1 000 Da due to trypsin, chymotrypsin, and
112
peptidases activities, in accordance with Picariello et al. (2010). The sum of duodenal
soluble proteins amounts (tri-peptides and larger) and of duodenal FAA tended to 100 %
of initial yogurt protein content. At the different duodenal times, there weren‘t pellet after
centrifugation (not showed) confirming the complete solubility of yogurt proteins. The
high level of hydrolysis was in accordance with Rioux and Turgeon (2012). Using the
same in vitro GI digestion system as the current study, these authors showed a similar
amount of soluble protein after yogurt digestion (casein : whey protein ratio = 2.8)
(Rioux and Turgeon, 2012). The matrixes were totally degraded and the proteolysis was
complete. The similar proportion of soluble proteins, for the gel electrophoresis patterns,
and for the total FAA content between yogurts showed that similar content of soluble
nitrogenous compounds were released from all matrixes and were bioaccessible. This
bioaccessibility of nitrogenous compounds from dairy matrixes at the end of the GI
digestion was in accordance with previous studies (Kopf-Bolanz et al., 2012) (Rinaldi et
al., chapter II).
The different electrophoretic profiles of digested control yogurt after buccal phase
(supernatants) and of undigested control yogurt (not centrifuged and not heat-treated)
showed an impact of centrifugation and heat treatment on caseins detection. Indeed
caseins bands were thin whereas there were no proteases in buccal fluids. The low casein
detection was accentuated with PS in yogurt formulation, especially with β-glucan. In the
case of β-glucan, Kontogiorgos et al. (2009) showed that an homogenized mixture of
unheated whey proteins and β-glucan (0.2 %) precipitated after a centrifugation due to
segregative conditions. The phenomena could be expected when heat treatment is applied
to a protein solution in presence of a PS. The important precipitation of caseins with β-
glucan could be explained by micellar casein-neutral PS incompatibility as observed by
Bourriot et al. (1999) in micellar casein-guar gum mixtures. Corredig et al. (2011)
showed that the optimal ionic equilibrium between dairy proteins and β-glucan is
important to maintain the integrity of the structure of casein micelles and do not involve
depletion-flocculation of micelles. Consequently, after bucal digestion phase, it can be
assumed that the amount of intact dairy proteins is more important in the precipitate when
PS are added in yogurt, and particularly with neutral PS.
113
The yogurt viscosities showed two groups at the high shear rates (80 – 100 s-1
). At the
end of the gastric digestion, the soluble proteins amounts, profiles on gels and the amount
of small peptides (< 5000 Da) suggested a faster proteolysis for yogurts with high initial
viscosity . As soluble protein amounts and profiles were the same at the different times
of gastric phase, the protein degradation was faster from the beginning of the gastric
phase for the viscous matrixes. This fast gastric digestion is in disagreement with several
studies showing a low protein hydrolysis when they are in viscous solution of PS (alone
or added with diet) (Ikegami et al., 1990; Mouecoucou et al., 2003), explained by the
increase of viscosity that slows the diffusion processes, reduces substrates and enzymes
mobility, and delays the transport of nutrients to the epithelial mucosa for their absorption
(Ikegami et al., 1990). However these authors used higher amounts of PS (1 – 10 %
weight proteins or diet) than in the current study.
The fast protein digestion for yogurts with β-glucan and with pectin could suggest a
phase separation phenomena between milk proteins and β-glucan or pectin. For β-glucan,
the segregative behavior could be observed with whey proteins as suggested by
Kontogiorgos et al. (2009) and caseins as suggested by Corredig et al. (2011). The
caseins were accessible to hydrolysisas observed on SDS-PAGE patterns which are in
accordance with size distribution of peptides and FAA contents. For pectin, a similar
phase separation phenomenon during gastric digestion was also possible but has not
previously been reported. In gastric solution, calcium concentrations were high and could
favor pectin-pectin (negatively charged) interactions, conditions fostering segregative
phase separation (Syrbe et al., 1998). Tolstoguzov et al. (2002) suggested that segregative
conditions existing during the digestion favor phase separation in the chyme creating
phases that could be considered as ―micro-reactors‖. These micro-reactors would trap
protein to minimize contact with immiscible medium (with PS) like a water-in-water
emulsion-like system (Tolstoguzov, 2002). In the protein-rich phase, enzymes and milk
proteins are in close contact. Enzyme and substrate concentrations increase, hydrolysis is
facilitated. We could assume that proteins and proteases could be in ―mini reactors‖ and
proteins remain available for proteolysis. The gastric phase could be characterized as an
114
intermediate thermodynamic step for the dairy matrix with β-glucan and with pectin
where the casein hydrolysis was faster than the same dairy matrix with another added PS
(starch) or without PS and with lower initial viscosity. The different digestive behaviors
observed in the current study seem to be explained by the impact of added PS in yogurt
matrix and not related to initial matrix viscosity from PS.
The kinetics of release of soluble peptides and total FAA were different according to the
type of PS at gastric phase whereas the individual AA contents were similar for all
yogurts, this could be explained by the limitations of the in vitro system used compared
to physiologic conditions. This system had fixed conditions for gastric emptying (60 min)
whereas in human physiological digestion, the beginning of duodenal digestion is
controlled by gastric emptying (Boirie et al., 1997). Here, all the matrixes were in contact
with duodenal enzymes and fluids during the same length in the digestion process.
Indeed in this study, the gastric phase was the critical digestion step modulating the
kinetics of release of soluble nitrogenous compounds in accordance with the importance
of gastric emptying in physiologic conditions. Larsen et al. (1994) have shown in rats that
a more viscous carboxymethylcellulose added to a casein-based diet (50 g/kg) delayed
the gastric emptying resulting in higher true ileal digestibility (absorption) for some AA
because protein structure was more damaged by pepsin and the duodenal digestion by
pancreatin was faster (Savoie and Gauthier, 1986; Mullally et al., 1998). Other
differences between our model and physiological conditions lie in the absence of
hormonal controlled-addition of digestive fluids and the lack of absorptive step. The
addition of fluids and the nutrients absorption are controlled by the hormonal pre- and
post-prandial secretion. The digestive enzymes and fluids are secreted when food is
consumed and the secretion is regulated by the absorption of nutrients. Without gastric
emptying and hormonal regulation, nutrients from semi-liquid food matrix as yogurt are
fastly digested, particularly dairy proteins.
3.7 Conclusion
The in vitro GI digestion of proteins from four yogurts matrixes with different PS (as
stabilizer) was different. The kinetics of gastric and duodenal digestions was not linked
115
with the initial viscosity of the yogurt as expected. The nature of added ingredient in
dairy matrix seems more determinant to evaluate the behavior of the nutrients in
microstructure and so the digestion of food matrix. The low stability of dairy food matrix
in gastric environment explained by segregative phenomenon between dairy proteins and
added PS has to be considered. At the end of the GI digestion the added PS had no impact
on protein digestion. The absence of gastric emptying and hormonal regulation in the
current in vitro digestion model could limit the study of added ingredients on protein
digestion. Thus the digestion in in vivo model is necessary to evaluate the protein
digestion from food matrix containing different nutrients and the resulting pre- and post-
prandial metabolic responses like glycemia and insulinemia.
Chapitre IV : Use of polysaccharides in yogurt
formulation: impact on glycemia, insulinemia, incretin
secretion, and free amino acids in rats
Au précédent chapitre, il a été démontré que selon le polysaccharide ajouté à des
yogourts, l‘hydrolyse des protéines et la libération des peptides et des acides aminés se
font selon des cinétiques différentes lors de l‘étape de digestion gastrique. Il n‘y avait pas
de relation entre la viscosité du yogourt et la vitesse de digestion des protéines dans le
système in vitro. La présence de β-glucan dans une matrice laitière fermentée a accéléré
la dégradation des protéines de la matrice et la bioaccessibilité des acides aminés.
Le quatrième chapitre présente les travaux réalisés pour répondre au troisième objectif de
la thèse, soit d‘étudier in vivo l‘effet d‘ajout de polysaccharides, comme stabilisants, dans
des yogourts sur la biodisponiblité de nutriments azotés et les réponses métaboliques
postprandiales associées dans un modèle animal (rats). Ce chapitre permettra aussi de
confirmer l‘impact de l‘ajout de β-glucan au yogourt sur la disponibilité des acides
aminés libres observée au chapitre précédent.
118
4.1 Résumé
L‘addition de polysaccharides, en tant que stabilisants dans des yogourts, a un impact sur
la digestion des protéines laitières. Nous avons étudié les réponses métaboliques
postprandiales (glycémie, insulinémie, C-peptide, acides aminés libres, vidange gastrique
et réponses en incrétines) in vivo en utilisant des rats en bonne santé en réponse à la
consommation de yogourt par un test de tolérance au glucose oral (OGTT). Quatre
yogourts différents ont été testés : avec amidon, avec β-glucan, avec pectine ou sans
polysaccharide (contrôle). Aucune relation entre la viscosité du yogourt et les réponses
métaboliques n‘a été observée. En réponse à l‘OGTT, le yogourt avec β-glucan a réduit la
glycémie et l‘insulinémie après 15 minutes comparé aux trois autres yogourts.
Cependant, la réponse du C-peptide, marqueur de la sécrétion de l‘insuline, n‘a pas été
différente, suggérant une augmentation de la clairance à l‘insuline. À la fin de la
digestion (180 min), la vidange gastrique a été significativement plus faible pour le
yogourt avec amidon comparé au contrôle et au yogourt avec β-glucan. La sécrétion de
l‘incrétine PYY en réponse au yogourt avec amidon a été significativement plus
importante comparé au yogourt contrôle 30 minutes après l‘ingestion. Les concentrations
en acides aminés totaux et en acides aminés branchés libérés durant la digestion n‘ont pas
été différentes entre les 4 yogourts, excepté pour le contenu en acide aminé aromatique
Phe qui a été significativement plus bas après 120 minutes de digestion du yogourt avec
amidon comparé au yogourt contrôle. Cette diminution pourrait être bénéfique face au
risque d‘incidence du diabète de type 2 et serait à confirmer chez des rats obèses. Cette
étude a montré que la nature du stabilisant utilisé dans la fabrication de yogourts peut
influencer les réponses métaboliques postprandiales.
119
4.2 Abstract
The addition of polysaccharide as stabilizer in yogurt has an impact on dairy protein
digestion. We investigated the in vivo postprandial metabolic responses (glycemia,
insulinemia, C-peptide, free amino acids (FAA), gastric emptying and incretin responses)
using healthy rats in response to yogurt consumption in oral glucose tolerance test
(OGTT) situation. Four different yogurts were tested; with starch, β-glucan, pectin or
without added polysaccharide (control). No direct relationship between the yogurt
viscosity and the metabolic responses were observed. In response to the OGTT, the
yogurt with β-glucan was found to reduce glycemia and insulinemia after 15 minutes in
comparison with the three other yogurts. However, C-peptide response, marker of insulin
secretion, was not different, suggesting an increased insulin clearance. At the end of the
digestion (180 min), the gastric emptying was significantly lower for yogurt with starch
as compared to the control and the yogurt with β-glucan. Secretion of the incretin PYY in
response to the yogurt with starch was significantly higher as compared to the control
yogurt 30 min after ingestion. The concentrations of total FAA and branched-chain
amino acids release during digestion were not different between the four yogurts except
for the aromatic amino acid Phe content, which was significantly lower after 120 min
digestion of yogurt with starch as compared to control yogurt. This decrease could be
beneficial to the risks of type 2 diabetes incidence and it should be confirmed with obese
rats. This study showed that the nature of the stabilizer used in yogurt fabrication could
affect the postprandial metabolic responses.
120
4.3 Introduction
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a chronic disease characterized by a chronic
hyperglycemia, the fasting glycemia is ≥ 7.0 mmol/L instead of 4 – 6 mmol/L for normal
subjects. This metabolic disorder is associated with disturbance of carbohydrate, fat and
protein metabolism due to defect in insulin secretion and action (Alberti and Zimmet,
1998). The incidence of T2DM is reaching epidemiologic proportion, and it was
predicted more than 439 millions of diabetics worldwide in 2030(Shaw et al., 2010). This
disease is associated with visceral adiposity which leads to low grade systemic
inflammation. This inflammatory status will cause insulin resistance, hyperinsulinemia,
decrease in insulin clearance and ultimately, pancreatic β-cells destruction. Adoption of
nutritional balanced meal plan, associated with a healthy life style, can contribute to
improve metabolic status. Epidemiologic studies showed that low fat dairy products
could reduce the risk of T2DM in women and men (Choi et al., 2005; Liu et al., 2006).
Nutrients like dairy proteins or fibers can decrease glycemia and activated food intake
regulatory system, so they are a potential functional food components for T2DM subjects
(Makelainen et al., 2006; Luhovyy et al., 2007; Nilsson et al., 2007; Panahi et al., 2007).
However, fibers from different sources showed different metabolic status (Howarth et al.,
2001). Fibers and other polysaccharides (PS) are added in yogurts to stabilize the dairy
matrix. The addition of different stabilizers in yogurt could induce different postprandial
metabolic responses after the consumption of the yogurt dairy matrix.
Food intake elicit multiple metabolic physiological reactions in order to regulate glucose
homeostasis. First of all, the gut reacts with the nutrients and secretes a variety of
incretins (for example glucose dependent insulinotropic peptide (or gastric inhibitory
polypeptide) (GIP), glucagon like peptide (GLP1), pancreatic polypeptide (PP) or peptide
Tyr-Tyr (PYY)) in function of the nature of the food ingested. The concerted actions of
these hormones control gastric emptying, satiety, insulin secretion and insulin sensitivity
(Drucker, 2006).
121
The secretion of incretins aims to activate the insulin secretion resulting from the oral
glucose ingestion (Aaboe et al., 2008). GIP is secreted from K cells in the gut in response
to nutrient ingestion. Its effect to inhibit gastric acid secretion by the inhibition of gastrin
release was controversial (Meier et al., 2004). The principal effect of GIP is its
insulinotropic effect liberating insulin from storage granules in pancreas by binding
specific receptors (Baggio and Drucker, 2007) and it is the incretin that has lost most of
its insulinotropic in T2DM subjects (Meier et al., 2002). GLP1 is secreted from L cells in
the intestine in response to nutrient ingestion and decreases the food intake in humans
(Verdich et al., 2001). GLP1 was shown to stimulate insulin secretion, to inhibit proximal
GI secretions and motility (Aaboe et al., 2008) and to inhibit gastric emptying (Pironi et
al., 1993). In Zucker diabetic rats, GLP1 provided an anti-diabetic action by ameliorating
glucose tolerance associated with the increase of proliferation of islet cell from pancreas
and the decrease apoptosis of these cells (Farilla et al., 2002). PP may influence insulin
sensitivity to inhibit neuropeptide Y neuron (NPY) that is a peptide developing obesity
and insulin resistance in rodents (Zarjevski et al., 1993). PP is secreted from F cells in
pancreas, colon, and rectum. Kojima et al. (2007) showed that PP secretion decreased
food intake and gastric emptying in mice. PYY is another member of the PP family,
secreted from L cells in ileum, colon, and rectum, and has a paracrine and hormonal role;
its level in tissue and plasma increase after meal ingestion (Cox, 2007).
Following glucose absorption by the intestine, plasma glucose concentration raises and
causes insulin secretion by the pancreatic β-cells. Then insulin interacts with liver to
block hepatic glucose production, and with skeletal muscle to stimulate glucose uptake.
These actions will then restore normal glycemia. It is well accepted that a decreased
glycemia and insulin secretion in response to food consumption can be considered
beneficial in terms of glucose metabolism. Indeed, several epidemiologic studies showed
that foods with low glycemic index (index defining the blood glucose level raise of food
compared to standard food as glucose) are associated with lower risk factors for T2DM
and cardiovascular disease (Salmerón et al., 1997b; Frost et al., 1999). Low glycemic
index foods were also related to a satietogenic effect and could prevent overweight
(Ludwig et al., 1999; Bornet et al., 2007). C-peptide is a domain of insulin molecule that
122
is co-secreted with the hormone by pancreas and both are released in equimolar amounts.
So C-peptide is one marker of insulin secretion. Contrary to insulin, C-peptide is not
metabolized by liver and insulin/C-peptide ratio decreases in normal subjects. Diabetics
present disorder in insulin clearance (Shapiro et al., 1987) and the insulin/C-peptide ratio
could not decrease (Kotronen et al., 2008). C-peptide could also regulate glucose
homeostasis by activating glycogen synthesis (Zierath et al., 1991).
Besides glucose, other nutrients will modulate the glycemic index and the postprandial
hormonal secretions. Amino acids (AA) are known for their important impact on glucose
metabolism. For example, dairy proteins can modulate the glycemia and hormones
secretion. Nilsson et al. (2004) explained that the ingestion of branched amino acids
(BCAA) and other AA like Lys and Thr (solution or in whey proteins) could explain the
lower postprandial plasmatic glucose concentration and the higher insulin secretion than
the ones observed after the ingestion of pure glucose drink (Nilsson et al., 2007).
Differences in AA concentrations could explain different metabolic response. It has been
shown that BCAA (Ile, Leu, Val), and aromatic AA (Phe and Tyr) are the strongest
predictors for the development of diabetes and are associated with insulin resistance
(Newgard, 2012). Modulation of protein digestion impacts the AA absorption (Boirie et
al., 1997) and consequently could impact the postprandrial metabolic responses. Gastric
emptying is well known to play an important role in nutrients absorption and will then
have an impact on metabolism. A clinical study from Boirie et al. (1997) showed that a
casein solution precipitates in the stomach and delays the gastric emptying in comparison
to whey proteins. Therefore, the gastric emptying was slower and the casein delayed AA
absorption as compared to whey proteins (Gaudichon et al., 1994; Boirie et al., 1997;
Bowen et al., 2006b). Moreover, the secretion of hormonal peptides could be correlated
with the gastric emptying, like the polypeptides PYY and PP correlated with a slow
gastric emptying (Boey et al., 2007; Kojima et al., 2007).
Stabilizers are added in yogurts to allow controlling yogurts‘ texture and syneresis
(Tamine and Robinson, 1985). They are polysaccharides (PS) having thickening and
gelling properties which contribute to rheological properties and water retention of
123
yogurts. Addition of PS in food could delay protein digestion (Acton et al., 1982;
Johansen et al., 1996; Mouecoucou et al., 2003). Pectin from pear, and other PS as guar
gum or locust bean gum delayed the casein digestion because of their interactions with
digestive enzymes or with proteins (Acton et al., 1982; Kossori et al., 2000).
Mouecoucou et al. (2003) showed that the hydrolysis of β-lactoglobulin (β-Lg) was
reduced in the presence of low methoxyl pectins in solution. Polysaccharides could
contribute to decrease the glycemic and insulinemic indexes too (Björck et al., 2000).
Diets with starch from pea, with high-methoxyl pectin or with oat β-glucan showed lower
postprandial blood glucose concentration and glycemic index in comparison to diets with
low or no fiber content (Tappy et al., 1996; Ratnayake et al., 2002; Kim, 2005). These
authors showed that PS decreased the glucose availability by increasing the viscosity of
digestive juices. Ou et al. (2001) hypothesized that glucose availability from potato
starch, in solution with water insoluble/soluble dietary fibers, could also decrease due to a
low starch hydrolysis by α-amylase. Fibers and potato starch could interact or fibers
could be a barrier between enzyme and potato starch (Ou et al., 2001). Added PS in food
matrix has an impact on glucose homeostasis. Ingesting muffin with added β-glucan (4 g
per serving) showed a decrease of blood glucose peak rise (Tosh et al., 2008). Diets with
added β-glucan were also shown to decrease the insulin responses too (Tappy et al., 1996;
Hallfrisch et al., 2003; Makelainen et al., 2006).
The aim of this study was to investigate the impact of some PS added in dairy fermented
food matrix (yogurt) on the glycemic, insulinemic and incretin responses, and the
bioavailability of AA using animal models. The impact of dairy matrix consumption on
postprandial metabolic status has never been studied in rats. Pectin and starch, common
PS used in dairy industries, and β-glucan, a new fiber, were tested in this study.
4.4 Animal and methods
4.4.1 Animal
Male Winstar rats (Charles River, St Constant, QC, Canada) weighing approximately 215
– 225 g were individually housed in a temperature-and-humidity-controlled room with a
daily 12:12-hour light-dark cycle. Upon arrival, all rats were fed a grounded non purified
124
commercial diet (Purina rat chow; Ralston Purina, Lasalle, Quebec, Canada) for at least 5
days. Following this period, rats were divided in 4 groups: yogurt without PS (control),
yogurt with starch, yogurt with pectin, yogurt with β-glucan. Yogurts were given on the
day of the experiment by gavage. The animal protocol was approved by the Animal Care
Committee of Laval University.
4.4.2 Animal diets: yogurt preparation
The yogurts were prepared from skimmed milk powder protein content 33.56 %, fat
content 1.0 % max, total solid 97.67 %) (purchased from Dairytown (Sussex, NB,
Canada), whey protein isolate protein content 94.43 %, fat content 1.2 % max, total solid
93.95 %) (from Davisco Food International Inc. (Eden Prairie, MN, USA), and lactose
from whey permeate produced by Agropur cooperative (Longueil, QC, Canada). The
yogurts contained 4 % of protein (w/w) with casein/whey protein ratio of 2.8, and 14 %
dry matter. Stabilizers were added at the following concentrations: 0.75 % starch, 0.2 %
pectin, and 0.4 % β-glucan. These concentrations were chosen in a previous in vitro study
to reproduce the industrial limit (0.75 %) and to have stable gel (Rinaldi et al. chapter
III). Table 4.1. presents the composition of the different yogurts.
The yogurts were prepared in 50 mL falcon tubes as described by Rinaldi et al. (chapter
III). Their composition is presented in table 4.1. Briefly, skimmed milk powder, whey
protein isolate (WPI) and lactose were added to water at 40 °C under stirring. The mixes
were kept under stirring one hour at room temperature, then overnight at 4 °C. The milk
was pasteurized (90 °C, 2 min) under mixing, then it was cooled to 42 °C. A commercial
starter (Yo mix860, Danisco, Canada) was added at 0.02 %. Fermentation was stopped
when pH reached 4.60 ± 0.05. Yogurts were cooled in water-ice mixture, and stored at 4
°C. The addition of starch, β-glucan, or pectin was made differently depending on
polysaccharide, as described by Rinaldi et al. (chapter III).
125
Table 4.1. Composition of yogurts without stabilizers (control), with starch 0.75 %,
pectin 0.2 %, and β-glucan 0.4 % 1.
1 Values were calculated considering protein contents of milk powder and whey protein isolate
and a constant dry matter proportion.
4.4.3 Yogurt viscosity determination
Five days after production, the viscosity of yogurts was measured at 4 °C using Ares G2
rheometer (TA instruments, New Castle, DE, USA) with 25 mm-parallel serrated plate
geometry. Viscosity was measured at 4 °C for shear rate ranging from 1 to 100 s-1
and in
triplicate. The experiments were carried out as presented in Rinaldi et al. (chapter III).
Each yogurt was analyzed in triplicate.
4.4.4 Experimental protocol of gavage
The day before the test, rats were fasted at 8:30 PM for 12 hours and water was given ad
libitum. At the end of the fasting period, a 500 µL blood sample was taken by the
saphenous vein with a needle and a microvette coated with EDTA. A basal glycemia
(time 0) was taken using a One touch glucometer from Lifescan (Milpitas, CA, USA). A
500 µL blood sample was also taken at basal time. Animals were then gavaged with 6 g
(6 mL) of yogurt using a 16 mL needle followed by 2 g/kg of dextrose (50 % solution). A
500 µL blood sample and a glycemia were also taken at 15, 30, 60, 90, 120 and 180 min
after the gavage for oral glucose tolerance test (OGTT). All blood samples were kept on
Control Starch β-glucan Pectin
Total proteins (%) 4.02 4.02 4.02 4.02
caseins/whey proteins ratio 2.80 2.80 2.80 2.80
Lactose (%) 4.47 3.62 3.91 4.24
Fat (%) 0.01 0.01 0.01 0.01
Ash (%) 0.46 0.46 0.46 0.46
Dry matter (%) 13.99 13.99 13.99 13.99
126
ice before centrifugation at 5000 g at 4 °C for 5 min. Plasma was separated in aliquots
and frozen at –80 °C until analyzed for insulin, C-peptide, incretins, and AA. The
animals were sacrificed after the OGTT (180 min). The stomachs were flattened to
remove the contents. The total and empty stomach weights were measured in order to
evaluate the gastric content by difference.
4.4.5 Insulinemia, C-peptide
Insulin and C-peptide were measured using an integrated immunoassay analyzer Victor
3V from PerkinElmer (Waltham, MA, USA) by using an enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) kit from Alpco (Salem, NH, USA). Absorbance was read at 450 nm.
4.4.6 GIP, PYY
The analysis of incretins GIP and PYY were performed on plasma samples taken at 0, 15,
and 30 min on analyzer BioPlex 2000 from BioRad (Missisauga, ON, Canada) by using
an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit Milliplex from EMD Millipore
(Billerica, MA, USA).
4.4.7 Amino acids analysis using GC/FID
One hundred microliters of plasma were mixed with 100 µL of acetonitrile 100 % from
EMD (Darmstadt, Germany), and the mix was centrifuged at 9800 g at 4 °C for 20 min to
remove insoluble components. Seventy five microliters of the supernatant were analyzed.
Free amino acids (FAA) in rats plasma were analyzed by gas chromatography (GC) using
the EZ-Faast GC/FID physiological free AA analysis testing kit from Phenomenex
(Torrance, CA, USA) with the same method, equipment, software, column, sample
preparation and calibration as Rinaldi et al. (chapter II).
4.4.8 Calculation and statistical analysis
The four yogurts were prepared once and each experimental group was composed of 10
to 13 animals. The rat body weights were constant between the different diet-group,
allowing metabolic responses comparisons. The AA, GIP and PYY concentrations and
127
1
10
100
1000
10000
1 10 100
Shear rate (s-1)
Vis
cosi
ty (P
a.s)
insulin/C-peptide ratio were related to the basal mean values (0 min) by fold-increased
calculation. The area under the curves (AUC) of FAA, BCAA, Ala, glucose, insulin, and
C-peptide were calculated with GraphPad Prism (version 6) software (La Jolla, CA,
USA) and expressed as means ± SEM. The AUC of FAA was calculated for the 0 120
min recovery period. The other AUCs were calculated for the total measure period 0
180 min and for the beginning period with the most important metabolic changes 0 60
min. The stomach emptying and the AUCs were treated by statistical analysis using a one
way analysis of variance with the mix procedure of Sigma-Plot software (San Jose, CA,
USA). The other metabolic compound measures were treated by statistical analysis using
a two way RM (repeated measures)-analysis of variance with Student Newman-Keuls
post-hoc test.
4.5 Results
4.5.1 Viscosity of yogurts with different polysaccharides
The four yogurts showed a pseudoplastic behavior (figure 4.1). At the low shear rates (0
5 s-1
) yogurt viscosities tended to be similar. Then from 5 to 100 s-1
the viscosity of the
yogurt with pectin decreased faster than the three others, and the viscosity of the control
yogurt tended to decrease slightly faster than the yogurts with starch and with β-glucan.
Figure 4.1. Viscosity of control yogurt ( ), yogurts with starch ( ), with β-glucan ( ),
or with pectin ( ). Values are means ± SD of triplicate (n = 1).
128
0
5
10
15
20
25
30
Control Starch β-glucan Pectin
Sto
mac
h c
onte
nt w
eight
(% y
ogurt
)
a
b
a
a
4.5.2 Stomach content weight
Three hours after yogurt consumption the weight of stomach contents ranged from 800
mg to 1300 mg. The stomach content weights were related to the ingested yogurt weights.
This proportion was significantly higher when yogurt with starch was ingested (p < 0.05)
and represented 22 ± 3 % of initial weight (6 g), compared to an average of ~15% for the
three other yogurts (figure 4.2).
Figure 4.2. Stomach content weight (% ingested yogurt) at the end of the procedure (180
min) with control yogurt (n = 12), yogurts with starch (n = 9), with β-glucan (n = 14), and
with pectin (n = 11). Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between
yogurts, based on one way ANOVA.
4.5.3 Effect of yogurts consumption with different polysaccharides on glucose
tolerance
The impact of the different yogurts on glucose tolerance was measured by OGTT. The
glycemia and insulinemia after consumption of control yogurt increased from 0 to 15
min, then showed a high decrease from 15 to 30 min and from 15 to 60 min for glycemia
and insulinemia respectively, and then both responses gradually decreased until 180 min
(figures 4.3a and 4.3b). Fifteen minutes after gavage, the yogurt with β-glucan showed
significantly lower glycemia (figure 4.3a) and insulinemia (figure 4.3b) compared to the
129
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0 15 30 60 90 120 180G
luco
se (m
mol/L
)
Time (min)
*
**
0
200
400
600
800
1 000
1 200
0 15 30 60 90 120 180
Insu
lin (
pm
ole
/L)
Time (min)
*
***
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 15 30 60 90 120 180
C-p
epti
de
(pm
ol/
L)
Time (min)
#
# #
Figure 4.3. Plasma a) glucose concentration (mmol/L), b) insulin concentration
(pmol/L), and c) C-peptide concentration (pmol/L) as a function of time after gavage with
control yogurt ( ) (n = 10), starch ( ) (n = 13), β-glucan ( ) (n = 10), or pectin ( )
(n = 10). Values are means ± SEM. Symbols indicate significant difference between
yogurts at each digestion time (p < 0.05), based on two way RM ANOVA: * β-glucan vs
others, ** control vs starch, *** control vs starch and β-glucan, # starch vs pectin, ##
starch vs β-glucan.
a)
b)
c)
130
other yogurts (p < 0.001 glycemia, p < 0.05 insulinemia). Thirty minutes after gavage, the
control yogurt showed significantly lower glycemia and insulinemia than the yogurt with
starch (figures 4.3a and 4.3b) and the insulin level was significantly lower than for the
group fed with β-glucan enriched yogurt (figure 4.3b). No significant differences were
observed in AUCs for the 0 – 180 min and 0 – 60 min recovery periods of glucose and
insulin responses to the different yogurts (annexe 2).
4.5.4 C-peptide and insulin clearance
After ingestion of control yogurt, the C-peptide concentration in plasma increased from 0
to 15 min, then abruptly decreased to 30 min and decreased at a lower rate up to 180 min
(figure 4.3c). The ingestion of other yogurts showed similar evolution C-peptide patterns.
However 15 min after gavage, yogurt with starch showed a significantly higher C-peptide
concentration in plasma compared to the yogurt with pectin whereas after 30 minutes it
was significantly higher than for yogurt with β-glucan (p < 0.05), and higher than other
yogurts (p = 0.08).
4.5.5 GIP, PYY
The GIP concentrations increased steeply 15 minutes after the gavage (7 – 9 times) in
comparison to the basal content for each yogurt, but it did not further increase between 15
and 30 minutes (figure 4.4a). There was no significant effect induced by the different
yogurts at each time (basal, 15 min, 30 min) for GIP.
The PYY contents increased between basal and 15 min-levels and remained the same at
30 min for all the yogurts (figure 4.4b). Thirty min after gavage with control yogurt, a
significantly lower PYY content was observed in plasma, compared to the yogurt with
starch (p = 0.015).
131
0
200
400
600
800
1000
1200
basal 15 min 30 min
Control Starch β-glucan Pectin
GIP
in p
lasm
a (f
old
ov
er b
asal
tim
e)
a a a a
a a
a
a
aa
aa
0
100
200
300
basal 15 min 30 min
PY
Yin
pla
sma
(fold
over
bsa
l ti
me)
a
b
a ba b
a a a a
a
a
a a
Figure 4.4. a) GIP and b) PYY in plasma (fold over basal time, 0 min) 15 min, and 30
min after the gavage of the different yogurts. Values are means ± SEM. Different letters
indicate significant difference (p < 0.05) between yogurts at each digestion time, based
on a two way RM ANOVA. For control at 0 and 30 min n = 16 for PYY and GIP, at 15
min n = 14 for PYY and n = 15 for GIP; for starch at 0 and 15 min n = 9, n = 10 at 30
min for PYY and GIP; for β-glucan at 0 min n = 10, at 15 and 30 min n = 12 for PYY
and GIP; for pectin at 0 min n = 12, at 15 and 30 min n = 11 for PYY and GIP.
a
b) PYY
a) GIP
132
4.5.6 Postprandial plasma amino acids
For all digestion times, the total free amino acids (TAA) contents related to the basal
value (table 4.2) and the TAA AUCs (annexe 3) were not significantly different between
the yogurts. However the concentration of some individual AA in plasma showed
differences depending on the type of yogurt ingested. Fifteen minutes after its
consumption, the control yogurt showed a significantly higher concentration of plasmatic
Ala than the other yogurts, whereas at 60 min the concentration was significantly higher
than the yogurt with starch (table 4.2). Fifteen min after gavage, the Gln and the Gly
concentrations increased significantly (p < 0.05) for the control yogurt in comparison
with the yogurt with pectin. At this time, after gavage of pectin enriched yogurt, Gly
concentration was also significantly lower than with the yogurt with starch (table 4.2).
After 60 min, Gln content related to the basal value for the control yogurt was
significantly higher than the yogurts with β-glucan and with pectin (table 4.2). One
hundred and twenty minutes after the consumption of the control yogurt, the Phe content
was significantly higher compared to the yogurt with starch (p < 0.05) and tended to be
higher than the yogurt with β-glucan (p = 0.107) (table 4.2). Because Ala showed
difference in fold change for the control yogurt compared to all yogurts with stabilizers,
we were interested in its AUC for 0 – 120 min recovery period. This Ala AUC tended to
be higher for the control yogurt than with β-glucan (p = 0.069) and with starch (p =
0.108) (annexe 3).
The BCAA contents represented approximately 10 % of the TAA contents (not shown).
The individual BCAA contents and their sum related to the basal values, and their
respective AUCs were similar between yogurts (annexe 3). The BCAA AUCs were all
negative (annexe 3).
Table 4.2. FAA (fold over basal time, 0 min) 15 min, 30 min, 60 min, and 120 min after the gavage with different yogurts.
Ctl: control yogurt, β-gln: yogurt with β-glucan
BCAA: Branched-chain amino acids sum, TAA: Total amino acids sum (fold over basal time)
Different letters indicate significant difference (p < 0.05) between yogurts at each digestion time, based on two way RM ANOVA (n = 9 for starch
and β-glucan, n = 10 for control and pectin).
0 min 15 min 30 min 60 min 120 min
Ctl Starch β-gln Pectin Ctl Starch β-gln Pectin Ctl Starch β-gln Pectin Ctl Starch β-gln Pectin Ctl Starch β-gln Pectin
Ala
Asp
Asn
Gln
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
BCAA
TAA
100±8
100±25
100±10
100±14
100±9
100±16
100±6
100±7
100±12
100±8
100±6
100±6
100±13
100±7
100±9
100±11
100±5
100±5
100±6
100±7
100±50
100±11
100±13
100±6
100±15
100±19
100±6
100±9
100±8
100±6
100±7
100±9
100±12
100±8
100±9
100±6
100±7
100±6
100±9
100±35
100±4
100±6
100±5
100±10
100±5
100±6
100±8
100±6
100±10
100±4
100±7
100±6
100±9
100±11
100±7
100±6
100±7
100±5
100±28
100±6
100±6
100±21
100±13
100±6
100±4
100±9
100±8
100±7
100±4
100±9
100±7
100±4
100±8
100±6
100±5
100±5
146±9a
93±47
113±10
129±13a
102±6a
107±7
100±5
111±8
136±1a
114±7
109±6
136±10
123±12
115±8
127±11
116±9
99±3
103±5
115±8
110±6b
58±23
115±20
108±11ab
99±9a
71±7
90±17
100±7
122±6
96±9
90±5
113±15
104±11
94±11
117±9
94±6
96±5
96±7
99±6
114±9b
137±37
108±9
92±10ab
88±6ab
137±30
108±9
115±10
124±17
112±11
109±12
142±10
98±9
102±8
121±14
120±18
107±9
110±9
110±10
121±5b
90±27
102±7
72±9b
69±3b
83±5
104±6
113±5
106±10
108±8
100±7
135±7
94±10
99±6
137±8
110±12
99±6
104±6
94±5
148±9
80±17
98±10
114±14
85±6
98±9
78±3
87±5
130±10
109±7
102±4
132±8
106±14
102±8
131±14
114±5
86±3
85±3
103±5
130±7
57±22
122±23
115±15
89±6
84±8
82±17
88±4
126±10
99±7
97±4
117±9
106±9
100±12
119±8
100±6
94±3
89±6
102±6
135±7
151±40
111±8
84±8
83±4
168±38
83±6
91±7
138±8
126±9
118±10
152±10
94±8
101±7
130±9
127±13
98±6
93±6
113±9
146±4
68±20
98±5
85±6
70±4
84±7
76±3
87±2
114±8
120±7
102±4
145±4
103±7
102±5
148±10
112±8
90±3
86±2
95±4
162±7a
64±13
113±12
124±17a
82±5
126±16
74±3
85±5
133±13
125±8
112±5
153±3
99±9
100±5
138±13
128±7
88±5
83±3
103±5
128±5b
78±30
116±24
98±5ab
78±7
76±8
79±19
88±4
129±9
105±7
95±4
131±8
97±10
93±13
119±10
105±4
90±7
87±7
99±4
134±10ab
131±37
101±4
81±6b
73±2
132±34
69±7
78±7
131±10
124±11
110±12
157±13
84±5
92±6
120±9
130±19
87±9
81±8
104±10
154±8ab
94±27
90±9
64±7b
66±3
90±11
68±5
79±7
111±10
118±8
105±7
159±10
86±7
97±6
151±11
120±9
85±4
80±5
95±5
146±9
88±18
98±14
105±15
81±5
139±27
74±6
81±4
122±16
127±13
116±10a
160±11
91±7
102±6
117±8
136±16
81±7
80±6
103±6
122±4
96±39
117±24
98±5
76±3
98±10
75±18
81±3
112±8
105±7
97±4b
146±6
11±9
95±11
107±6
107±7
86±5
82±6
101±5
114±5
126±35
93±5
75±10
70±4
130±15
64±3
71±4
128±16
115±5
99±6ab
142±6
79±4
88±7
98±10
112±7
81±3
75±3
97±8
137±7
81±21
98±8
93±9
63±3
95±11
69±3
79±3
112±9
113±5
101±4ab
159±7
92±7
96±6
124±6
106±5
75±3
75±3
94±4
134
4.6 Discussion
The composition and the structure of food matrixes modulate the bioaccessibility of their
nutrients. In this work, we studied the bioavailability of nutrients and postprandial
metabolic responses illustrated with the impact of different PS (as stabilizer) in yogurts on
glycemia, insulinemia, incretins concentrations, gastric emptying, and AA bioavailability
after the gavage of healthy rats.
The high gastric emptying rate and the low glycemia and insulinemia (30 – 180 min)
observed after the consumption of the control yogurt could show control yogurt digested in
stomach could arrive early in the intestine and the postprandial use of exogenous glucose
could be faster.. The higher plasmatic concentrations of Ala and Gln at 15 min and 60 min
for this yogurt could also be related to a fast use of exogenous glucose by the organism
after its absorption in intestine (Ruderman, 1975). Indeed Ala and Gln are the principal
metabolized AA for hepatic gluconeogenesis (Van de Poll et al., 2005) that occurs in post-
absorptive period (Ruderman, 1975). Thus Ala and Gln high plasmatic contents could be
related to a low glucose synthesis while exogenous glucose is metabolized first.
The delayed gastric emptying at 180 min and the higher PYY content at 30 minutes when
starch is added in yogurt compared to the control yogurt could show a role in long-term
effects on satiety and food intake by the addition of starch in yogurts. Indeed delayed
gastric emptying was related with increasing satiety and reducing hunger after the addition
of psyllium fiber in normal meal (Bergmann et al., 1992). PYY infusion also was related to
reduce appetite and food intake in obese and normal subjects (Batterham et al., 2003a).
However the addition of starch in yogurt did not change the total FAA content compared to
control yogurt and the other yogurts with PS. The low values of stomach contents for all the
yogurts after 3 hours compared to the corresponding ingested yogurts showed that more
than 75 % of yogurts were already passed to the intestine at this time, the matrix was
digested and AA were absorbed without differences between matrixes. The low content of
added PS corresponding to industrial practices (≤ 0.75 %) did not delay or decrease the AA
availability and consequently did not modify protein digestion kinetics, between the control
yogurt and the yogurt with added stabilizers. Indeed the effect of PS on protein digestion
135
was previously shown, but with 1 % or more of PS in solution or diet (Kossori et al., 2000;
Ou et al., 2001; Mouecoucou et al., 2003).
The addition of starch in yogurt delayed gastric emptying compared to the other PS. This
effect might be attributed to the high initial viscosity of the yogurt that could slow the
matrix digestion as observed by other authors using other PS (Brennan, 2005b; Kim, 2005).
However with the addition of β-glucan (similar initial yogurt viscosity to with starch) and
with the addition of pectin (the lowest initial viscosity at high shear rates) gastric emptying
was faster than with added starch. The initial viscosity of yogurt did not induce digestion
differences between yogurts. The fast gastric emptying with β-glucan could be explained by
a phase separation phenomena in accordance with in vitro GI digestion of yogurts with the
same composition (Rinaldi et al., chapter III). Rinaldi et al. (chapter III) showed that
soluble protein and bioaccessible AA contents were higher and proportion of larger
peptides was lower after the in vitro gastric digestion of viscous yogurt (β-glucan and
pectin), explained by phase separation between the PS and dairy proteins. Kontogiorgos et
al. (2009) also showed a phase separation in oat β-glucan/whey proteins binary mixtures (4
- 16% w/v proteins/0.3 - 1.2% w/v β-glucan) using turbidity. Phase separation phenomenon
can exist during the digestion and can lead to create new phases like in a water-in-water
emulsion-like system. Proteins (dairy proteins and proteases) would be in protein-rich
phase while the other molecules (β-glucan) would be in PS-rich phase (Tolstoguzov, 2000;
Tolstoguzov, 2002). Moreover Tolstoguzov (2002) has considered the protein-rich phase as
―mini-reactors‖ where the proteolysis can be more intense than in an homogeneous medium
with soluble and insoluble molecules. Consequently yogurt with β-glucan could be instable
and disintegrated more rapidly than the yogurt with starch, since in the stomach and the
chyme with β-glucan could reach duodenum faster than the one with starch.
The AA absorption is different depending AA nature. Contrary to the TAA AUCs, BCAA
AUCs were negative for all yogurts. Some studies have shown the same current tendency
for a decrease of BCAA concentration after feeding in rats (Peng and Harper, 1970; Rubio,
2011). One hundred and five minutes after the ingestion of caseins and α-lactalbumin,
separately, contents of Leu were lower than the basal value in plasma in dorsal vein of rats
136
(Rubio, 2011). This result could be explained by the fast use of these AA, primarily used in
humans for protein synthesis (Van de Poll et al., 2005). In particular Leu stimulates the
mammalian Target of Rapamycin (mTOR) activity which activates a second protein
rapTOR (rapamycin TOR) and thus muscle is able to detect quality and quantity of dietary
proteins and it consequently adjusts the protein synthesis (Kim et al., 2002; Layman and
Baum, 2004). The low changes of TAA plasmatic concentrations between all digestion
times for all yogurts are opposite to most of the studies on dairy protein ingestion that
showed an increase of plasmatic AA. However, the protein content in these studies were
1.5 5 times higher than in the current study (Itoh et al., 1974; Daenzer et al., 2001; Rouch
et al., 2003). The present protein content (4 % or 0.36 g/digestion) could be too low to
show significant differences in AA absorption between yogurts. Also, the similar structure
of yogurts (all are acidic gels) could explain the similar AA content in accordance with
Barbé et al. (2012) that was able to discriminate between rennet-induced gel and milk for
the essential AA absorption in pigs, but not between rennet-induced gels with different heat
treatment.
The nature of PS had different impact on glycemia and hormonal responses. The lower
blood glucose content observed for the yogurt with β-glucan (at 15 min) was in accordance
with previous studies (Jenkins et al., 1978; Battilana et al., 2001; Hallfrisch et al., 2003;
Makelainen et al., 2006). Beta-glucan is known to increase the viscosity of solutions or
yogurt and acts like a viscous barrier to the nutrients absorption (Makelainen et al., 2006).
The low insulinemia value for the yogurt with β-glucan at 15 min was also in agreement
with several studies (Tappy et al., 1996; Battilana et al., 2001; Hallfrisch et al., 2003;
Makelainen et al., 2006), and is explained by the lower amount of circulating glucose
(Newgard and Matschinsky, 2010). However the C-peptide secretion was not lower for this
yogurt than the other yogurts at this time whereas the C-peptide is a peptide fragment from
insulin molecule. Both molecules are in equimolar concentrations when insulin is secreted
(Osei et al., 1984). Contrary to our results, one study showed similar evolution between
these two hormonal peptides after the consumption of β-glucan, but blood was collected 7
days after the beginning of the feeding period (Hooda et al., 2010). In the present study, the
lower insulin response at the beginning of the digestion could be explained by an acute
137
action of β-glucan in an acid gel dairy matrix. The insulin secreted by the pancreas 15 min
after this yogurt consumption could be cleared by the liver where it is stocked. The reduced
glycemia and insulinemia responses after the consumption of the yogurt with β-glucan
could be beneficial for diabetic patients. Kotronon et al. (2008) showed that the clearance
could be 24 % lower in T2DM than healthy subjects. However, this hypothesis needs to be
validated in future work with Zucker diabetic fatty rats. Prospectively, another interesting
behaviour that needs to be validated was observed for yogurts enriched with β-glucan and
starch. The low Phe content at 120 min could suggest a preventive role for T2DM risks.
Long-term accumulation of some AA such as BCAA, Phe and Tyr has been associated to
the risk of developing T2DM (Wang et al., 2011; Newgard, 2012).
4.7 Conclusion
The GI digestion of yogurts with different added PS was investigated in healthy rats. The
metabolic responses were related to the nature of the PS. The addition of starch delayed the
gastric emptying, increased the PYY secretion, and decreased the Phe concentration at 180
min compared to control yogurt. The addition of β-glucan decreased the glucose and insulin
concentrations at 15 min compared to other yogurts while the C-peptide concentration was
similar. The addition of β-glucan in yogurt can show potential benefits for diabetics:
decrease of glycemia and improvement of insulin clearance which have to be confirmed
with Zucker diabetic fatty rats. The added starch in yogurt could have a role on long-term
satiety by delaying the stomach emptying and by enhancing PYY secretion. Future work on
the relation between the addition of starch or other PS with high glycemic index in yogurts
and the low circulating amino acids as Phe could be investigated to understand metabolic
responses and cellular pathways. The metabolic responses after the consumption of a
fermented dairy gel acid matrix with the same both contents of β-glucan and starch should
be investigated in obese rats to verify a synergic role.
139
Conclusion générale
Cette étude présente pour la première fois la digestion in vitro et in vivo de produits laitiers
fermentés (yogourts) contenant différents polysaccharides (PS) dans le but d‘étudier la
bioaccessibilité et la biodisponibilité des composés protéiques et les réponses métaboliques
postprandiales. L‘hypothèse du projet était que l‘ajout de PS à des produits laitiers gélifiés
acides (yogourts) influencerait la bioaccessibilité et la biodisponibilité de nutriments azotés,
et les réponses métaboliques postprandiales associées (glycémie, insulinémie, sécrétion en
incrétines) lors de leur digestion gastro-intestinale. L‘hypothèse a été validée. En effet, il a
été démontré que selon la nature du PS ajouté à un yogourt, la matrice laitière n‘est pas
dégradée à la même vitesse. La bioaccessibilité et la biodisponibilité des nutriments azotés,
et les réponses métaboliques postprandiales associées étaient ainsi différentes suivant le PS
ajouté au yogourt.
Dans un premier temps, un système modèle in vitro de digestion GI pour suivre la
dissolution et la digestion des protéines de matrices laitières liquides et semi-liquides a été
mis au point. Le système de digestion comportait les étapes de digestion buccale, gastrique
et duodénale. Dans cette partie, l‘utilisation de produits commerciaux a permis d‘adapter le
modèle de digestion de Versantvoort et al. (2005) qui avait été développé pour étudier la
bioaccessibilité de toxines de matrices alimentaires solides. La digestion de deux laits, un
pasteurisé et un stérilisé, a permis de valider le modèle. Ces deux matrices liquides ayant
subi des traitements thermiques différents ont montré des différences dans la digestion des
protéines laitières en accord avec une étude chez l‘humain (Lacroix et al., 2008). Les
différences ont particulièrement été marquées à l‘étape gastrique. À la fin de cette étape de
digestion, le lait stérilisé présentait moins de caséines intactes que le lait pasteurisé. La
digestion d‘un yogourt commercial (sans stabilisant) a montré que la digestion des
protéines laitières d‘une matrice laitière semi-liquide était similaire à celle d‘une matrice
liquide stérilisée ou pasteurisée suivant la nature de la protéine. À l‘étape de digestion
gastrique, le yogourt présentait moins de caséines intactes comme le lait stérilisé, alors que
le profil des protéines du lactosérum se rapprochait de celui des protéines du lait pasteurisé
étant moins digérées que pour le lait stérilisé. En fin de digestion duodénale, seules les
140
protéines de lactosérum ne semblaient (en faible proportion) pas toutes hydrolysées pour le
lait pasteurisé et le yogourt. Le yogourt commercial est fait avec un lait ayant subi un
traitement thermique plus sévère que le lait pasteurisé. Ainsi selon la nature des protéines et
le traitement thermique subi par la matrice laitière, les protéines ont montré une évolution
différente de leur protéolyse. Les caractéristiques du modèle de digestion GI utilisé ont
permis de digérer les protéines de matrices laitières liquides et semi-liquides, d‘évaluer la
bioaccessibilité des produits de digestion azotés (peptides et acides aminés), et de
distinguer une matrice laitière semi-liquide par rapport à deux autres matrices laitières
liquides ayant subi des traitements thermiques différents.
Dans un deuxième temps, l‘effet de l‘ajout de PS (comme stabilisant) de nature différente à
un yogourt sur la digestion des protéines de la matrice laitière et la bioaccessibilité des
nutriments azotés dans un système modèle in vitro de digestion GI a été étudié avec des
yogourts standardisés selon les pratiques industrielles. La composition des yogourts variait
par la nature du PS ajouté. La digestion a été réalisée avec le modèle de digestion mis au
point dans le premier volet. Les yogourts les plus visqueux (stabilisés par le β-glucan et la
pectine) ont montré une protéolyse gastrique plus rapide que les yogourts de plus faible
viscosité (yogourt contrôle et stabilisé avec l‘amidon). Ces résultats surprennent puisque les
matrices visqueuses sont connues pour avoir une digestion ralentie. Les instabilités entre les
biopolymères protéines laitières/β-glucan d‘une part et caséines/pectine en présence de
cations d‘autre part, favoriseraient une séparation de phases facilitant la protéolyse dans
l‘estomac. La nature du PS ajouté dans le yogourt serait déterminante pour stabiliser la
microstructure de la matrice laitière gélifiée acide et expliquerait les différences de
cinétique de digestion des protéines laitières des différents yogourts. Il est donc important
d‘utiliser la matrice alimentaire native pour l‘étude de la bioaccessibilité des nutriments ;
transformer la matrice avant sa digestion buccale (par broyage par exemple) supprimerait
les caractéristiques structurales initiales de la matrice. Au temps gastrique, les contenus en
protéines solubles étaient différents entre les yogourts avec β-glucan et avec pectine, et les
yogourts contrôle et avec amidon. Cependant, les contenus en AA libérés du yogourt
contrôle et des yogourts avec amidon et avec pectine, aux digestions gastriques et
duodénales, étaient similaires. Cette observation de l‘évolution des contenus en AA peut
141
montrer la limite du modèle GI in vitro qui ne mime ni la vidange gastrique ni le contrôle
hormonal. Ainsi, il est important de valider in vivo les tendances observées in vitro. La
disparition des protéines intactes et la libération des AA qui ont été significativement plus
rapides lors de la digestion du yogourt avec β-glucan pourraient être vérifiées in vivo, tout
comme le rôle de ce PS ajouté à une matrice laitière gélifiée dans des réponses
métaboliques comme la baisse de la glycémie.
Dans un troisième temps, l‘effet de la composition en PS des yogourts sur la
biodisponibilité des AA, la glycémie, l‘insulinémie et la concentration en incrétines
sécrétées lors du processus de digestion GI a été étudié chez des rats. Les rats ayant
consommé le yogourt avec β-glucan ont montré un comportement métabolique particulier.
Quinze minutes après l‘ingestion du yogourt, la glycémie et l‘insulinémie ont été
significativement inférieures par rapport aux autres yogourts avec PS (amidon ou pectine)
et au yogourt sans PS. La clairance de l‘insuline a également été plus importante pour ce
yogourt. Ces deux résultats observés lors de l‘ajout de β-glucan pourraient être bénéfiques à
des sujets souffrant de diabète de type 2 (T2DM), ce qui serait à vérifier avec des rats
Zucker diabétiques et obèses. La tendance d‘une faible concentration plasmatique de Phe
observée à 120 min avec le yogourt avec β-glucan et la plus faible concentration avec le
yogourt avec amidon (significatif) suggèrent un effet de diminution des risques de T2DM
lors de la consommation de ces deux yogourts avec PS, comparé au yogourt contrôle.
L‘ajout d‘amidon a aussi résulté en une vidange gastrique moins importante que pour le
yogourt avec β-glucan alors que les viscosités apparentes des deux yogourts étaient
similaires et les plus hautes. La nature du PS semble donc avoir plus d‘importance sur la
digestion des matrices laitières gélifiées acides comparativement à la viscosité initiale du
yogourt. La viscosité du chyme serait à étudier pour vérifier cette conclusion. L‘ajout
d‘amidon dans cette matrice laitière fermentée pourrait avoir un effet sur la satiété à long
terme en retardant la vidange gastrique et en augmentant la sécrétion de PYY. Bien que
l‘ajout de β-glucan ou d‘amidon en concentrations utilisées par les industriels n‘ait pas
modulé la biodisponibilité des AA libres totaux, cet ajout pourrait contribuer à de nouveaux
produits laitiers fonctionnels diminuant les risques T2DM. La présence des deux PS dans
une même matrice laitière fermentée pourrait aussi être considérée.
142
Dans cette étude chez l‘animal, les concentrations similaires en AA libres, totales et des
branchés (Leu, Ile, Val) entre les yogourts avec PS et le yogourt contrôle sont contraires
aux résultats de plusieurs études in vitro et in vivo sur la digestion GI des protéines en
présence de PS, en solution ou dans des matrices alimentaires. Les concentrations en PS
utilisées dans ces études étaient plus élevées que celles de notre étude qui reflètent les
concentrations utilisées industriellement. Les résultats sur les AA observés in vivo
rejoignent ceux de notre étude in vitro qui montraient des contenus similaires en AA
bioaccessibles lors de la digestion duodénale des différents yogourts qui n‘avaient pas les
mêmes viscosités initiales. Les quatre yogourts étant de composition identique outre le PS,
cette étude animale a confirmé l‘importance d‘étudier la digestion GI de la matrice laitière
native.
L‘ensemble de ce projet a révélé l‘importance d‘évaluer la bioaccessibilité et la
biodisponibilité des nutriments azotés dans des matrices laitières contenant un PS. L‘ajout
du β-glucan dans les matrices laitières fermentées en est un bon exemple. En effet, l‘ajout
de ce PS dans le yogourt a montré in vitro et in vivo une digestion gastrique accélérée par
rapport au yogourt avec amidon. La proportion d‘AA libérés lors de la digestion gastrique
in vitro était plus importante et les BCAA au niveau duodénal tendaient à être plus
bioaccessibles pour le yogourt avec β-glucan comparé à celui avec amidon. Cependant, in
vivo la concentration plasmatique des BCAA a diminué par rapport au niveau basal. Ces
AA ont pu être utilisés rapidement pour la synthèse protéique dans les muscles
squelettiques suite au jeûne. La cinétique d‘absorption des AA et leur utilisation par
l‘organisme auraient pu être suivies par marquage des AA. Ce marquage pourrait aussi être
utilisé pour étudier les liens entre l‘incidence du T2DM et les voies métaboliques
perturbées chez des sujets malades comme la concentration plasmatique de Phe, la
glycémie et la clairance de l‘insuline (Newgard 2012, Kotronen et al. 2008, Makelainen et
al. 2006).
Dans le but de compléter ces travaux et de comprendre les voies métaboliques impliquées
en présence de β-glucan, il serait intéressant de tester l‘effet de ce PS en solution sur la
143
clairance de l‘insuline par les cellules du foie, et la biodisponibilité et l‘utilisation de la Phe
par les cellules de muscles squelettiques. De plus, tester les chymes des différentes étapes
de digestion (digestion in vitro ou prélèvement in vivo) du yogourt avec β-glucan sur des
modèles cellulaires permettraient de comprendre les effets métaboliques de la matrice
laitière. Ces résultats permettraient de valider si le PS est le seul responsable des réponses
métaboliques ou bien si d‘autres composés des matrices laitières gélifiées acides sont
nécessaires aux réponses métaboliques observées. De plus l‘intensité des réponses pourrait
être évaluée suivant que le β-glucan est en solution ou dans la matrice laitière.
Ces travaux apportent de nouvelles connaissances aux industriels au sujet de l‘impact de la
matrice alimentaire sur l‘absorption de ses nutriments et leur cinétique d‘utilisation par
l‘organisme. Les valeurs nutritionnelles attribuées à chaque catégorie alimentaire ne sont
pas suffisantes pour décrire l‘impact métabolique réel d‘un aliment. Dans le cas des
protéines laitières, ce projet a démontré que les procédés de fabrication comme des
traitements thermiques d‘intensité différente et que l‘ajout d‘ingrédients (PS) à des matrices
laitières fermentées modulent la digestion de ces protéines. Les industriels doivent aussi
être sensibilisés à entreprendre des études in vivo pour connaître l‘effet des aliments sur les
réponses métaboliques postprandiales. D‘autres matrices alimentaires, et en particulier
laitières, telles que les fromages pourraient être étudiées afin de vérifier la cinétique de
digestion des protéines laitières présentes dans des matrices différentes des gels acides. Il
serait important de faire des études similaires sur d‘autres nutriments indispensables
comme les lipides par leur forme particulière en globules de gras.
Une limite à ce projet est l‘absence de caractérisation de la microstructure des matrices
outre la caractérisation rhéologique de la matrice mesurée avec la viscosité apparente
initiale du yogourt. L‘impact de la microstructure des nutriments sur leur digestion pourrait
être étudié par le suivi en continu de la microstructure par microscopie pendant la digestion.
Ces observations permettraient de caractériser la déstructuration des matrices alimentaires
et de comprendre les interactions entre les molécules selon le milieu de digestion. La
microstructure pourrait être étudiée à la fin de chaque étape de digestion dans un premier
temps, puis un modèle de digestion avec une imagerie microscopique en continu pendant
144
toute la durée de la digestion GI apporterait d‘importants détails sur les composantes
physiques et chimiques des microstructures définissant les matrices alimentaires.
Cependant due à la complexité de la composition d‘une matrice alimentaire et celle de la
composition en enzymes des fluides digestifs, caractériser chaque composante du milieu de
digestion constituerait un défi important.
Enfin, une étude nutritionnelle chez l‘humain avec les yogourts ayant montré des résultats
intéressants dans la modulation de la digestion des protéines et des réponses métaboliques
in vitro et chez l‘animal, pourrait confirmer l‘impact de la matrice alimentaire sur la
cinétique de digestion des protéines et les réponses métaboliques associées. La cinétique de
digestion des protéines serait évaluée avec la vidange gastrique et le profil d‘absorption des
AA. La vidange gastrique pourrait être suivie en utilisant du paracétamol ajouté au yogourt
ou par méthode scintigraphique. Le profil d‘absorption des AA pourrait être évalué en
enrichissant le lait utilisé pour fabriquer les yogourts avec de l‘15
N (isotope stable non
radioactif) qui serait détecté dans le plasma par spectrométrie de masse. La détection de l‘N
marqué serait corrélée avec l‘absorption des AA des protéines du yogourt.
145
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Annexe 1 : FAA (mg) per g of initial protein at the end of
in vitro GI digestion of control yogurt, yogurts with
starch, with β-glucan, and with pectin.
Values are means ± SD of three independent experiments (n = 3). The values were not significantly
different between yogurts (p < 0.05).
AA Control Starch β-glucan Pectin
Ala
Asp
Asn
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
824±203
359±14
487±7
869±208
540±140
961±410
5944±2580
8721±2232
975±391
3643±1654
251±87
630±134
696±170
1704±867
4305±2190
1143±417
881±132
897±352
508±441
1107±241
519±345
1360±53
7932±551
10398±6436
1405±266
4729±593
181±215
579±505
861±218
2211±152
3779±2642
1636±73
1139±49
842±488
693±7
1103±278
1881±993
1517±207
8506±250
10620±1087
1594±352
5157±755
439±55
995±121
985±74
3090±1151
6611±1746
1864±202
853±505
697±647
479±421
1039±573
590±321
963±436
6216±3377
9279±2438
1153±448
3669±1793
175±206
731±297
796±411
1859±813
4081±1799
1364±604
170
Annexe 2 : AUC for the 0 – 180 min and 0 – 60 min
recovery periods of glucose, insulin, and C-peptide in
plasma.
Values are means ± SEM. The values were not significantly different between yogurts (p < 0.05).
Control Starch β-glucan Pectin
AUC 180 min
Glucose
Insulin
C-peptide
559±47
89±41
198±108
667±44
171±43
435±87
596±46
90±124
209±59
597±65
83±50
194±73
AUC 60 min
Glucose
Insulin
C-peptide
220±23
80±18
114±46
256±19
128±27
219±57
198±44
120±54
92±38
204±16
79±28
110±42
171
-70000
-50000
-30000
-10000
10000
30000
50000
70000
Control Starch β-glucan Pectin
Tot
al F
AA
AU
C
0
5000
10000
15000
20000
25000
Control Starch β-glucan Pectin
Ala
AU
C
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
Control Starch β-glucan Pectin
Ile Leu Val
BC
AA
AU
C
Annexe 3 : AUC for the 0 – 120 min recovery period of a)
total FAA, b) BCAA, and c) Ala in plasma.
Control yogurt (n = 10), with starch 0.75 % (n = 9), β-glucan 0.4 % (n = 9), and pectin 0.2 % (n =
10). Values are means ± SEM. The values were not significantly different between yogurts (p <
0.05). Figure b) : bars indicate SEM of BCAA sum.
b)
a)
c)