Impiego di un Sistema Impiego di un Sistema

Automatico di Estrazione in Automatico di Estrazione in

Diagnosi PrenataleDiagnosi PrenataleDiagnosi PrenataleDiagnosi Prenatale

Dr.ssa Simona Grotta

U.O.S.D. di Genetica Medica

Ospedale San Pietro FBF

Roma

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SOMMARIO della presentazione

� Estrazione del DNA genomico

� Evoluzione delle tecniche di estrazione

� Estrazione manuale

� La nostra esperienza con un estrattore automatico

� Applicazioni diagnostiche

� Risultati e commenti

� Conclusioni

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Estrazione del DNA genomico

� L’estrazione degli acidi nucleici è la prima tappa nelle analisi di genetica molecolare.

� Una buona qualità dell'estrazione è fondamentale per garantire un buon risultato delle applicazioni.

� Esistono diversi metodi di estrazione e la scelta più adatta � Esistono diversi metodi di estrazione e la scelta più adatta dipende da vari fattori:

� Campione� Acido nucleico da estrarre� Applicazione post-estrazione� Numero di campioni � Risorse

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Evoluzione delle tecniche di estrazione

1950 1960 1970 1980 1900 2000 2010

Fenolo/Cloroformio

Salting Out

Membrane in silice

Biglie magnetiche

ESTRATTORI AUTOMATICI

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Estrazione manuale: membrana di silice

Per 12 campioni

Tempo totale estrazione: 45’(con presenza costante dell’operatore)

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La nostra esperienza: Sistema automatico

� Capacità di processamento :

1 - 12 campioni

� Tempo corsa (LA, CVS, SP):

Introdotto nel nostro Laboratorio da circa due anni per l’estrazione degli acidi nucleici

circa 45’-50'

� Tempo operatore: 5’ -10’

� Materiale di partenza :

qualsiasi campione biologico

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Fasi dell’estrazione

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� Lisi cellulare� Aggiunta di biglie� Lavaggi� Eluizione del DNA nel

tampone

Kit di estrazione

� Sangue periferico in EDTA� Liquido amniotico

DNA da sangue

I kit impiegati comprendono tutto il consumabile necessario per l’estrazione

Sono forniti in una gamma completa per le seguenti applicazioni:

� Villi coriali� Materiale abortivo� Cellule in coltura� Cellule fissate

DNA da compioni forensi

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Estrazione da Sangue PerifericoPermette di estrarre DNA genomico da sangue intero (EDTA, Eparina, Citrato), cellule del sangue e buffy coat

� VOLUME DI CAMPIONE PROCESSABILE: 100-400 µl

� VOLUME DI ELUIZIONE: 50-300 µl

� RESA DA 200 µl DI CAMPIONE: 4-10 µg

� A 260/280: 1,8

� A 260/230: 2,0

50’

� A 260/230: 2,0

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Applicazioni diagnostiche da SP

� MLPA e MS-MLPA

� Kit commerciali per FC, FRAXA, CX26-30

� Studio di microsatelliti per UPD

� Sequenziamento Sanger

� aCGH 60K 180K

� Real time-PCR

VASTA APPLICABILITA’ E BUONI RISULTATI

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Risultati da SP: MLPADMD P034 DMD P035

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Risultati da SP: MS-MLPANUMERO DI COPIE METILAZIONE

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Risultati da SP: Sequenziamento Sanger

SEQUENZA PARZIALE DEL GENE CX26

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Risultati da SP: aCGH

Oligo array 180K

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Estrazione in campo PrenataleIl kit permette di estrarre DNA genomico da tracce biologiche o da campioni poveri di cellule� LA, CVS, materiale abortivo, colture cellulari e fissati

� VOLUME DI ELUIZIONE: 50-300 µl

� Pre-trattamento specifico per tipo di campione

LISI ESTERNA

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10’ a max velocità 10’ a 56°C20 µl PK 200 µl Lysis Buffer 37’

Resa dell’estratto da Liquido Amniotico

� Settimana di gestazione in cui viene fatta l’amniocentesi

� Quantità di LA prelevato� 2 ml ~ 6 ng/µl A260/280: 1,6 A260/230: 0,5� 10 ml ~ 25 ng/µl A260/280: 1,7 A260/230: 0,9

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Resa dell’estratto da Villi Coriali

� Quantità di frustoli prelevati� 2mg ~ 20 ng/µl A260/280: 1,8 A260/230: 2,0� 5 mg ~ 70 ng/µl A260/280: 1,8 A260/230: 2,0

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Applicazioni diagnostiche: Prenatale

� QF- PCR

� Prenatal Bob’s

� MLPA E MS-MLPA

� Kit commerciali per FC, FRAXA,CX2630

� Studio di microsatelliti per UPD

� aCGH 15K 60K 180K

� Real-Time PCR

� Sequenziamento Sanger

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Risultati da Prenatale: QF-PCRLIQUIDO AMNIOTICO: 2 ml

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Risultati da Prenatale: MLPA2 ml

6 ng/µl

5 ml

10 ng/µl

9 ml

25 ng/µl

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Risultati: Prenatal Bob’s

ELUIZIONE IN TRIS-HCl ELUIZIONE IN H2O

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Risultati da Prenatale: aCGH

LIQUIDO AMNIOTICO 10ml Oligo array 60K

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Oligo array 15K

Conclusionid

� Riduzione dell’operatività manuale ed ottimizzazione dei tempi

� Maggiore praticità e rapidità del processo

� Selezione veloce dei protocolli e del caricamento

� Riduzione del rischio di contaminazione

Il Sistema ha trovato una particolare applicazione nel nostro laboratorio per le seguenti caratteristiche:

� Riduzione di errori da parte dell’operatore

� Flessibilità d’uso ed eliminazione degli sprechi

� Qualità dell’estratto equivalente o superiore ai sistemi manuali

� Vasto impiego nelle applicazioni diagnostiche

� Diminuzione dei costi complessivi rispetto ai kit manuali

� Ottima assistenza tecnica

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Il Sistema in uso nel nostro laboratorio è:

MagPurix 12s Systemdella ZinextsZinexts, commercializzato in Italia dalla ResnovaResnova

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Grazie per l’attenzionedd

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