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Importància de la biologia molecular en el
diagnòstic de les NMP Ph-negativas
Beatriz Bellosillo
Hospital del Mar, Barcelona
MPN Preceptorship, February 2013
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Clasificación de la OMS - 2008
• Leucemia mieloide crónica
• Policitemia Vera
• Trombocitemia Esencial
• Mielofibrosis Primaria
• Leucemia neutrofílica crónica
• Leucemia eosinofílica crónica
• Mastocitosis
• Neoplasias mieloproliferativas no clasificables
Clásicas Ph neg
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• Mutaciones adquiridas
–JAK2
–MPL
–Epigenética y splicing
–CALR
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2005 2000 1970-1990
PRV-1
NFE2
JAK2V617F
2008-2011
JAK2 exon 12
MPL(W515;S505)
Citogenética
Clonalidad PICX
Cultivos
2013
Marcadores moleculares en NMPs
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Mutación V617F JAK2
James et al, Nature 434, 1144, 2005; Baxter et al, Lancet 365, 1054, 2005; Kralovics et al, N Engl J Med 352,
1779, 2005; Levine et al, Cancer Cell 7, 387, 2005; Zhao et al, J Biol Chem 280,22788, 2005
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Familia de proteínas JAK
• Formada por 4 miembros:
– JAK1
– JAK2
– JAK3
– Tyk2 (tyrosine kinase 2)
• Tirosinacinasas
• Interacciona con el dominio intracitoplasmático de
receptores de membrana
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JAK2 JAK2
NÚCLEO
CITOPLASMA
Receptor de citocinas tipo I
EPOR
TPOR
G-CSF
EPO
TPO
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STAT STAT
JAK2 JAK2
P P
NÚCLEO
CITOPLASMA
Receptor de citocinas tipo I
EPOR
TPOR
G-CSF
Transcripción de genes
EPO
TPO
P
P
P P
P
P
P P
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STAT STAT
JAK2 JAK2
P P
NÚCLEO
CITOPLASMA
Transcripción de genes
EPO
TPO
P
P
P P
P
P
P P
G>T
GTC TTC
Val (V) Phe (F)
Receptor de citocinas tipo I
EPOR
TPOR
G-CSF
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Frecuencia de la mutación JAK2V617F
en NMs Ph-negativas
PV 95%
TE 60 %
MFP 60 %
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JAK2 V617F
Sangre periférica Aspirado MO
Biopsia medular Colonias hematopoyéticas
Granulocitos
Detección de la mutación JAK2V617F
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Detección de la mutación V617F JAK2
Técnicas de detección
– Secuenciación directa
• Terminadores marcados y análisis en secuenciador ABI 3100
– PCR alelo-específica (Baxter et al, 2005)
• ADN de granulocitos
• Análisis en gel de agarosa
202 pb G
A
T
A
363 pb 202 pb
363 pb
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Detección de la mutación V617F JAK2
Técnicas de detección
– Secuenciación directa
• Terminadores marcados y análisis en secuenciador ABI 3100
– PCR alelo-específica (Baxter et al, 2005)
• ADN de granulocitos
• Análisis en gel de agarosa
– PCR alelo-específica en tiempo real
Mutados
No mutados
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• Secuenciación directa (Sanger) 10-20% Conocidas + Nuevas
• Pirosecuenciación 5% Conocidas + Nuevas
• High Resolution Melting 2,5-5% Conocidas + Nuevas
• PCR alelo-específica
– ARMS 3% Conocidas
– TaqMan 0,1% Conocidas
– FRET 0,1% Conocidas
• Técnicas de enriquecimiento de alelo mutado
– PNA-LNA clamp 1% Conocidas
– Digestión con enzimas de restricción 0,2% Conocidas
– COLD-PCR 1-10% Conocidas + Nuevas
• CAST-PCR 0,01% Conocidas
• d-HPLC 0,1-1% Conocidas + Nuevas
• PCR-RFLP 5-10% Conocidas
Técnicas de detección de mutaciones
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Carga alélica de JAK2V617F en PV
Experiencia del Hospital del Mar
Porcentaje de alelos JAK2V617F en granulocitos
No
detectada
n=60
3
2
3 3
10 10
6
7
6
4
6
0
2
4
6
8
10
12
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
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No
detectada
n=85
Carga alélica de JAK2V617F en TE
Experiencia del Hospital del Mar
Porcentaje de alelos JAK2V617F en granulocitos
25
6
17
22
7 6
1
0
5
10
15
20
25
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
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Passamonti & Rumi. Haematologica, 94,7, 2009
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Wild type
V617F
V617F C618R
C616C V617F
Mutaciones diferentes/adicionales a c.1849 G>T
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N Engl J Med 356:459,2007
FERM SH2 JH1 JH2
V617F
pseudocinasa cinasa
Exón 12
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Scott, Am J Hematol 86, 668,2011
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Bennett et al. J Transl Med 4:41,2006
Mutaciones descritas en el gen MPL
MPL W515K ; W515L
W515A
MPL S505N
MPL K39N Baltimore
TE: 1-3%
8-15% JAK2V617F neg
MFP: 5-9%
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Criterios diagnósticos de las NMs OMS 2008
CRITERIA FOR POLYCYTHEMIA VERA POLYCYTHEMIA VERA (PV)
CRITERIA FOR POLYCYTHEMIA VERA PRIMARY MYELOFIBROSIS (PMF)
CRITERIA FOR ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA (ET)
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2005 2000 1970-1990
PRV-1
NFE2
JAK2V617F
2008-2011
TET2 ASXL1 c-CBL IDH1, IDH2 IKZF1 LNK EZH2 SF3B1 SRSF2 U2AF1
JAK2 exon 12
MPL(W515;S505)
Citogenética
Clonalidad PICX
Cultivos
2013
Marcadores moleculares en NMPs
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Otros genes implicados en NM
Señalización
LNK
CBL
Epigenética
Metilación ADN
TET2
IDH1/2
DNMT3A
Remodelación
de la cromatina
ASXL1
EZH2
Splicing ARNm
SF3B1
SRSF2
U2AF1
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STAT STAT
JAK2 JAK2
P P
NÚCLEO
CITOPLASMA
Receptor de citocinas tipo I
EPOR
TPOR
G-CSF
Transcripción de genes
EPO
TPO
P
P
P P
P
P
LNK
Mutaciones LNK : PV Infrecuente
TE 3 - 6 %
MFP 3 - 6%
CBL Internalización
y degradación
MutacionesCBL : PV Infrecuente
TE Infrecuente
MFP 5 – 10 %
Ub
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Señalización
LNK
CBL
Epigenética
Metilación ADN
TET2
IDH1/2
DNMT3A
Remodelación
de la cromatina
ASXL1
EZH2
Splicing ARNm
SF3B1
SRSF2
U2AF1
Otros genes implicados en NM
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CH2OH CH2OH
TET2
-KG
isocitrato
IDH1/IDH2*
2-HG
H3K27me3
DNMT3a
ASXL1
PRC2
EZH2
Mutaciones Epigenéticas en NM
CH3 CH3 CH3
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Señalización
LNK
CBL
Epigenética
Metilación ADN
TET2
IDH1/2
DNMT3A
Remodelación
de la cromatina
ASXL1
EZH2
Splicing ARNm
SF3B1
SRSF2
U2AF1
Otros genes implicados en NM
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Ebert & Bernard. N Engl J Med 365:2534, 2011
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Gen PV TE MF
JAK2V617F 95-97 60 60
JAK2 exón12 1-2 0 0
MPL 0 3-5 5-10
CALR Infrecuente 30 23-35
LNK/SH2B3 1 3-6 3-6
CBL Infrecuente Infrecuente 5-10
TET2 10-20 5 10-20
IDH1/IDH2 Infrecuente Infrecuente 6
DNMT3A 5-10 1-5 5-10
IKZF1 Infrecuente Infrecuente Infrecuente
ASXL1 2-5 2-5 13-20
EZH2 1-3 1 5-10
SF3B1 Infrecuente 3 4-7
SRSF2 Infrecuente Infrecuente 17
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46/1
MF Post-PV MF Post-ET
JAK2
MFP # * *
Homocigoto
Heterocigoto
No haplotipo JAK2 46/1
TET2
SF3B1
SRSF2
U2AF1
ASXL1
MPL
CALR
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EZH2 ASXL1
SRSF2
P= 0.0008 P< 0.0001
P< 0.0001
Hazard Risk
(95% CI range) P
EZH2 1.91 (1.08-3.36) 0.025
ASXL1 2.21 (1.57-3.11) <0.0001
SRSF2 2.60 (1.63-41.6) <0.0001
Mutaciones asociadas con supervivencia global inferior en MFP– análisis multivariado
WT
Mut
WT Mut
WT
Mut
Vannucchi et al, Leukemia 2013
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Valor pronóstico del número de genes mutados en MFP
(ASXL1, SRSF2, EZH2 e IDH)
Guglielmelli et al, 2014
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2005 2000 1970-1990
PRV-1
NFE2
JAK2V617F
2008-2011
TET2 ASXL1 c-CBL IDH1, IDH2 IKZF1 LNK EZH2 SF3B1 SRSF2 U2AF1
JAK2 exon 12
MPL(W515;S505)
Citogenética
Clonalidad PICX
Cultivos
2013
Marcadores moleculares en NMPs
CALR
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Secuenciación de exoma
6 MFP
Klampfl et al; NEJM 2013;369:2379 ; Nangalia et al; NEJM 2013;369:2391
Secuenciación de exoma
151 NMPs:
48 PV
62 TE
39 MF
2 uMPN
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Calreticulina
• Chaperona codificada por gen
CALR
• Localización en retículo
endoplasmático (RE):
– Plegamiento de las
glicoproteínas
– Homeostasis Ca2+
• Fuera del RE:
– Regulación de
proliferación, apoptosis,
fagocitosis y respuesta
inmune
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Función chaperona
C-domain
P-domain
KDEL
N domain
Ca2+ binding
Aminoacidos ácidos
Ca2+ buffering
Señal retención RE
C-domain
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Mutaciones en CALR
Nangalia et al; NEJM 2013;369:2391
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Las mutaciones en CALR originan un
nuevo extremo C terminal
Nangalia et al; NEJM 2013;369:2391
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Rumi et al, Blood 2014;123:1544
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Las mutaciones en CALR originan una
independencia de factores de crecimiento
Klampfl et al; NEJM 2013;369:2379
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Klampfl et al, NEJM 2013;369:2379 ; Rampal et al, Blood April 16 2014
Las mutaciones en CALR activan la vía
JAK-STAT
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No mutada
Deleción 52 pb – mutación tipo 1
Inserción 5 pb – mutación tipo 2
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Distribución de mutaciones en CALR
en NM Ph negativas
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Klampfl et al; NEJM 2013;369:2379
Pueden existir otras mutaciones que coexisten con JAK2V617F, MPL y CALR:
TET2, ASXL1, DNMT3A, SF3B1, LNK, EZH2 , CBL, IDH1/IDH2
Distribución de mutaciones en JAK2, MPL y
CALR en las NM Ph-negativas
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Mutaciones en CALR en pacientes con TE - Hospital del Mar
Mutación CALR Nº pacientes
p.L367fs - (tipo 1; deleción 52 bp) 14
p.K385fs - (tipo 2; inserción 5 bp) 12
p.E369fs (del 34) 1
p.E373fs (del 31) 1
p.K377fs (del 22) 1
p.K375fs (del 7 + ins 9) 1
p.K368fs (del 47 + ins T) 1
p.E383fs (del 6 + ins 5bp) 1
p.E370fs (del 1) 1
Total de pacientes con mutaciones en CALR 33
Cohorte 74 pacientes con TE , negativos para JAK2V617F y MPL
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MPL-pos
n = 7
3,2%
JAK2V617F
n= 138
63,3%
CALR-pos
n = 30
13,8%
JAK2, MPL y CARL WT
n = 43
19,7%
Marcadores moleculares en TE al diagnóstico
Experiencia del Hospital del Mar
n=218
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0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30 35 40
CA
LR
mu
tad
a (
%)
Mutaciones en CALR en pacientes con TE - Hospital del Mar
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Klampfl et al, N Engl J Med 2013;369:2379
CALR vs. JAK2 (P=0.003)
Las mutaciones en CALR se asocian a
mejor pronóstico
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Rotunno et al, Blood 2014;123:1552 ;
Rumi et al, Blood 2014;123:1544
Las mutaciones en CALR se asocian a
mejor pronóstico
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Las mutaciones en ASXL1 se asocian con mal
pronóstico en MFP CALR negativa
Tefferi et al, 2014
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![Page 54: Importància de la biologia molecular en el diagnòstic de ... · Importància de la biologia molecular en el diagnòstic de les NMP Ph-negativas Beatriz Bellosillo Hospital del Mar,](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022011804/5ba1761009d3f2666b8c5e12/html5/thumbnails/54.jpg)
Tefferi et al, Leukemia 2014
Propuesta de revisión de criterios diagnósticos de las NMs
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• JAK2V617F
- Todos los casos con sospecha de NM
- Es necesario un ensayo que detecte la mutación con
una sensibilidad del 1-3%
- Un resultado positivo confirma el diagnóstico de NM,
pero no informa del subtipo
- Un resultado negativo no excluye el diagnóstico de
una NM
Modificado de Cross, ELN Munich meeting 2012
¿Qué mutaciones génicas se deben determinar en
los pacientes con NMs en el diagnóstico de rutina?
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• JAK2 - mutaciones exón 12
– Sólo en los casos JAK2V617F negativos con evidencia
clínica de PV
• CALR mutaciones exón 9
– Sospecha de MFP o TE en pacientes negativos para
JAK2V617F
• MPL mutaciones exón 10
– Sospecha de MFP o TE en pacientes negativos para
JAK2V617F y CALR
• TET2, ASXL1, EZH2, SRSF2, SF3B1,etc
– Su papel diagnóstico/pronóstico está por determinar
¿Qué mutaciones génicas se deben determinar en
los pacientes con NMs en la rutina diagnóstica?
Modificado de Cross, ELN Munich meeting 2012
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¿Qué mutaciones génicas se deben determinar en
los pacientes con NMs en la rutina diagnóstica?
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Servicio de Hematología Clínica Servicio de Patología
Carlos Besses Luz Martínez-Avilés
Alberto Álvarez-Larrán Raquel Longarón
Grup de Recerca Aplicada en Hematologia Erica Torres
Silvia Pairet Laura Camacho Sergi Serrano
Anna Angona Conchi Fernández
Águeda Ancochea