Imunohistochemie (IHC)

IHC

principy imunohistochemie

princip imuno- metod = vazba molekul

imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami

• imunohistochemie (ihc): všechny techniky využívající mono-či polyklonální značené protilátky (Ab), kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáň. antigeny (Ag)

• vztah klíče (Ab, volná) a zámku (Ag, tkáň. Ag)

základní typy ihc metod

1) přímá: primární Ab značená přímo

2) nepřímá dvojstupňová: imunologická vazba sekundární značené Ab na Ab primární

3) nepřímá trojstupňová: např. streptavidin-biotin-komplex (SABC)

ad 1) přímá metoda

• primární Ab značená přímo• nutná dostatečná koncentrace

hledaného Ag ve tkáni• nativní řezy (pro parafín málo

citlivé)

ad 2) nepřímá dvojstupňová

• komplikovanější na přípravu x citlivější

1. první „vrstva“: neoznačená Ab (Ig nebo sérum) specifická pro hledaný tkáň. Ag = primární Ab

2. druhá „vrstva“: značená Ab proti Fc fragmentu primární protilátky = sekundární Ab, vazba imunologická

ad 3) nepřímá trojstupňová

• amplifikační = zesílení signálu při malém množství molekul Ag ve tkáni

1. primární specifické antisérum proti Ag prokazovanému ve tkáni

2. neznačená specifická Ab proti primární = spojovací = můstek

3. značený komplex streptavidinbiotin(SABC)

typy Ab

• polyklonální:– mnoho aktivovaných klonů B

lymfocytů proti různým oblastem určitého Ag nebo proti směsi Ag

– vysoká senzitivita x nízká specifita

• monoklonální:– 1 klon– nízká senzitivita x vysoká specifita

značení Ab

• fluorescenční značky• enzymy: např. peroxidáza

obecné schéma ihc protokolu

1) odběr a fixace tkáně2) krájení a napínání řezů3) optimalizace prezentace Ag4) blok aktivity endogenních

enzymů5) blok pozadí

obecné schéma ihc protokolu

1) vazba primární Ab2) vazba sekundární Ab3) detekční systém4) demaskování komplexu Ag-Ab5) barvení pozadí (buň. jader)6) dehydratace a montáž preparátu

ad 1) odběr a fixace

• pro ihc skloubení zachování morfologie x zachování antigenicity a minimalizace artefaktů

• průkaz Ag nutno in situ (v místě norma výskytu ve tkáni

• během fixace artefakty• fixace pufrovaným neutrálním

formalínem

ad 2) krájení a napínání

• napnutí na kapce vody• skla potažená lepivou hmotou

– bílek-glycerin– želatina– poly L-lysin– APES (3-amino-propyl-triethoxysilan)

• účinná a trvanlivá! (var v MT, lázni)

ad 3) optimalizace prezentace Ag

• lepší fixace x horší prokazatelnost tkáň. Ag

• ošetření tkáň. řezů, aby povrchy lépe „nabízely“ Ag = regenerace Ag (Ag retriever)

• snižují přilnavost k povrchům

ad 3) optimalizace prezentace Ag

• použití proteáz• MT• vodní lázeň

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů

• pro průkaz vazby Ag-Ab běžně použití Ab značených enzymem (peroxidáza…)

• přirozený výskyt ve tkáni – falešně pozitivní výsledky reakcí

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů

• blok endogenní peroxidázy! – 1-3% H2O2 v methanolu nebo destil.

H2O po dobu 20 – 30 min

• blokování avidinu a biotinu (ledviny a játra)– blok s 0,1 – 0,01% avidin v PBS 20

min a následně blok 0,01 – 0,001% biotinem v PBS 20 min

ad 5) blok pozadí

• nespec. reakce pozadí – falešná pozitivita• falešně pozit. nespecifická reakce pozadí:

– aktivita endogenních tkáň. enzymů (vysycení enzymů jejich substrátem)

– endogenní avidin-biotinová reakce (endogenní biotin: játra, ledviny, tuk. tkáň., mléčná žláza)

– kontaminace řezů nebo reagencií cizorod. látkami

ad 5) blok pozadí

– křížové reakce (zkřížená reaktivita) Ab s podobnými epitopy na různých Ag

– nespecif. vazba primární Ab na kolagen, laminin, elastin, proteoglykany, keratin, tuk. tkáň a jiné pojiv. struktury (důsledek fixace aldehydy)

– nespecif. vazby v důsledku elektrostat. interakcí

– poškození řezu (vyschnutí!)

ad 5) blok pozadí

– difúze tkáň. Ag do okolí– nespec. reakce sekundární, popř.

terciární Ab s Fc receptory imunoglobulinů ve tkáni (cytoplazmat. membrány, často makrofágy a granulocyty)

– Ag pohlcen makrofágy– nekróza tkáně (vylití cytoplazmat.

obsahu do mezibuň. prostoru)

ad 5) blok pozadí

• nespecifickému vychytávání spec. Ab předcházíme vysycením tkáně bílkovinami (nespec. sérem nebo mlékem) – tkáň se saturuje „neškodnými“ bílkovinami a nespec. přibarvování pozadí je menší

ad 6-8) vazba Ab a detekčního systému

• reakce tkáň. Ag s primární – sekundární – terciární Ab = přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke spec. vazbě

• reakce Ag-Ab nejlépe při neutrálním pH

• příbalový leták spec. Ab (fixovaná x zmražená tkáň, doporučené ředění…)

ad 9) vizualizace komplexu

Ag-Ab, chromogeny• vazba Ag-Ab bez viditelné reakce!• pro využití světel. mikroskopu

nutno vizualizovat = použití chromogenů– imunofluorescenční– imunoenzymové: peroxidáza

• produkt činnosti peroxidázy je nerozpustný pigment

ad 9) vizualizace komplexu

Ag-Ab, chromogeny• enzymatická reakce = vhodné

podmínky (optimální teplota, pH, iont. síla roztoku, poměr mezi enzymem a substrátem, nepřítomnost inhibitorů…)

• peroxidáza + DAB = stabilní hnědý produkt, nerozpustný v alkoholu (nevyplaví se při dehydrataci řezů)

ad 10) dobarvování pozadí

• orientace v preparátu – dobarvení jader hematoxylinem