imunologia -...
TRANSCRIPT
www.ensino.uevora.pt/imuno
IMUNOLOGIA
ManualdeapoioàsSessõesLaboratoriais
Fevereiro,2017
CarlosSinogas
IMUNOLOGIA2016/17 2
ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA..........................................................................................................................................3
Riscoquímico/radiológico/biológico........................................................................................................................3RegrasePlaneamento..........................................................................................................................................................4Procedimentosgerais............................................................................................................................................................5
REGISTOSERELATÓRIOS............................................................................................................................................................6ANTICORPOSMONOCLONAIS.....................................................................................................................................................7
Introdução..................................................................................................................................................................................7Imunização.................................................................................................................................................................................7FusãoCelular............................................................................................................................................................................8SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológica..................................................................................................................8ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutoras.....................................................................................................9CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonais......................................................................................9EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais...........................................................................10
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.............................................................................................................................................111. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..............................................................................................................112. TESTEÀIMUNIDADENATURAL...........................................................................................................................163. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL........................................................................................................................................194. RECOLHADESANGUE...............................................................................................................................................20PreparaçãodoSoro.............................................................................................................................................................20PreparaçãodeEritrócitos................................................................................................................................................21
5. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(Humanas)...............................................................................226. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–Precipitaçãodiferencial.......................................................237. IMUNOPRECIPITAÇÃO-Qualitativa....................................................................................................................24Testedoanel..........................................................................................................................................................................24Testeemlâmina...................................................................................................................................................................25
8. IMUNOPRECIPITAÇÃO–Quantitativa................................................................................................................26Curvadeprecipitação........................................................................................................................................................26
9. IMUNODIFUSÃO...........................................................................................................................................................27Imunodifusãosimples........................................................................................................................................................27Imunodifusãodupla(Ouchterlony).............................................................................................................................28
10. HEMAGLUTINAÇÃO....................................................................................................................................................2911. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(Rápido)...................................................................................................3012. IMUNOELECTROFORESE..........................................................................................................................................3113. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)............................................................................................32“Checkerboard"....................................................................................................................................................................32Teste..........................................................................................................................................................................................35RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA..............................................................................................................38
IMUNOLOGIA2016/17 3
PROCEDIMENTOSDESEGURANÇAOtrabalholaboratorialemImunologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,oriscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesquesecolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticasapropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.
Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenasalgumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas.
Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipodiferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoserobservadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.
Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdassituaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.
Riscoquímico/radiológico/biológicoOsprodutosquímicosempreguesnosensaiosimunológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentesriscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendoentãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,etc.
AspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderiscoconhecidoparaaSaúdeHumana.
Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdeimunologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éaradioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemservistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãodeprodutosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Àsexigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminaçãodosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.
Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.
Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfecciosas,emparticularasquesãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfecciososnãoexiste.Asoutrasespéciesanimaismaisusadasemtrabalhosdeimunologia,oscoelhos,oscaprinoseosroedores,sãomamíferosafastadosdoHomemquenãorepresentamqualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratóriosdeimunologia.
Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfecçõesocorrememgolpesabertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasouporinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodiretocomamostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidoseconvenientementeimpermeabilizados.
Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofarãousodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigemhumana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentesinfecciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocasoésempreaconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfecciososparaooperadoreadoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".
IMUNOLOGIA2016/17 4
AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,ondemicrorganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodassuperfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.
RegrasePlaneamentoParaalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidadeparaalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnãoestabelecidas.Importa,porisso,prevenir.
Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:
Bata
Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereemlaboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusadaapenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,abataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfecciososparaoexteriordolaboratório.
Mãos
Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizarpotenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvaspoderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.
Comerebeber
Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecuçãodeexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquirirohábitodemanterasmãoslongedaboca.
Bancadadetrabalho
Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantesdeiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosdesessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentesinfecciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.
Livrosecadernos
Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comooprotocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.
Materiais
Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostonolocalindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostrasdeorigembiológicadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.
IMUNOLOGIA2016/17 5
Acidentes
Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtromaterialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserdeimediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável.
Planeamento
Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.
Procedimentosgerais
Todososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoeaformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.
IMUNOLOGIA2016/17 6
REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturaparaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosfacilitarãoaaprendizagem,ainterpretaçãodosresultadosobtidosearedaçãoposteriordorelatóriodotrabalho.
Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjectivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:
Título Identificadordoconteúdodorelatório
Resumo Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusõesobtidas
Objectivo Razãodeserdotrabalhorealizado
Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada
Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho
Materialereagentes
Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado
Protocoloexperimental
Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito
Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos
Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos
Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedosresultadosobtidos
Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas
Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho
Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo
IMUNOLOGIA2016/17 7
ANTICORPOSMONOCLONAIS
Introdução
Anticorposmonoclonaissãoimunoglobulinashomogéneascomespecificidadedefinida,possíveisdeproduziremlargasquantidades.PodemserobtidasporimortalizaçãodelinfócitosB,clonadoseexpandidosemculturascelularescontínuas(anticorposmonoclonaispropriamenteditos)ouporrecombinaçãodeDNA,expressonoutraslinhascelulareseucarióticas(anticorposmonoclonais“engineered”).
Em1975KöhlereMilsteindescobrirameempregarampelaprimeiravezatecnologiadoshibridomas:fizeramcombinaromaterialgenéticodecélulasnormaisprodutorasdeanticorposcomodecélulasdeorigemmalignadamesmalinhagem.Iniciaramentãoumanovametodologiaquedesdeentãonãoparoudeevoluireconduziuaodesenvolvimentodatecnologiaparaaproduçãodequantidadesvirtualmenteinesgotáveisdeanticorposcomníveisdepurezanuncaantesatingidos.Trata-sedeumatecnologiadeaplicaçãohorizontalemtodasasáreascientíficasdaBiologia,cujoimpactosóécomparávelaodatecnologiadarecombinaçãodoDNA.
OsanticorpossãoproteínasproduzidasporlinfócitosB,destinadasaintervirnosprocessosdedefesaimunitáriadosorganismossuperiores:asimunoglobulinas.Têmcomoprincipalcaraterística,numaperspectivadeaplicaçãocientífica/biotecnológica,acapacidadedeseligaremaoantigénioquereconhecem.Atualmente,paraasuaobtenção,recorre-sequaseexclusivamenteàchamadatecnologiadoshibridomasparaapreparaçãodeanticorposmonoclonais.
Oshibridomassão,comoonomeindica,célulashíbridas,imortalizadasemculturadetecidos,produtorasdeanticorposmonoclonaiscomespecificidadeúnicaepré-determinadapeloprocessodasuapreparação.
Noprocessoclássicoparaaobtençãodehibridomasutilizam-secélulasdebaçodemurganhosimunizadoscomoantigénioquesepretendereconhecer.Esteslinfócitosativadossãofundidoscomcélulasdemielomadamesmaorigemanimal,mutantesnãoprodutoresdeimunoglobulinas,napresençadepolietilenoglicol.Ascélulasentãofundidassãocultivadasemmeioseletivo(contendoHAT)emcondiçõesquedeterminamapenasasobrevivênciadoshíbridosformadosentrelinfócitosecélulasdemieloma.Oshibridomascomascaraterísticaspretendidas,nomeadamentenoqueserefereàespecificidadeantigénica,taxasdeproduçãoecrescimentoetipodeimunoglobulinasãoselecionadospormétodosimuno-enzimáticosepreservadosporclonagemecongelamento.Acaraterizaçãodoanticorpoproduzidoeodesenvolvimentodoprocessoparaasuaproduçãoemlargaescaladependemdosobjectivosfinaisdoinvestigador.
ImunizaçãoOprocessodeimunizaçãodestina-seaconseguirlinfócitosBativadosparaparticiparnafusãocelular.Aespécieanimaleórgãosdondepodemserobtidos(baço,timo,nóduloslinfáticos,sangueperiférico),bemcomoosprotocolosdeimunizaçãodoanimaldependemdaorigemdoantigénio,dasuaimunogenicidadeedodestinoadaraosanticorposapreparar.
OmurganhoBalb/C,espécieanimaldereferência,éaquemaisfrequentementeéutilizadanaobtençãodeanticorposmonoclonais,porsetratardeumanimalpequeno,defácilmanutençãoemanipulaçãonolaboratório,comumsistemaimunitáriobastantebemconhecidoeparaoqualexistemdisponíveislinhascelularesdemielomaadequadasàobtençãodehibridomashistocompatíveiseenxertáveisnoanimal.
Oesquemadeimunizaçãoaadoptardependetambémdotipoeorigemdoantigénioedotipodeanticorpospretendidos.EmgeralumaadministraçãoúnicadeantigénionomurganhoconduzàobtençãodeumamaiorpercentagemdeIgMrelativamenteaIgG.Noqueserefereaoslinfócitosprodutoresespecíficosobtêm-seemmaiorabundâncianobaçonasequênciademúltiplasadministraçõesdeantigénio.Paraantigéniossolúveisdeelevadopesomolecular,éregraproceder-seaumaimunizaçãoemdosesrepetidasdeantigénio,separadasentresicercadetrêssemanasaummês.
IMUNOLOGIA2016/17 8
Aeficáciadoprocessodeimunizaçãoéavaliada2semanasapósumadasúltimasadministrações,poranálisedotítulodosorodoanimalemanticorposcapazesdereconheceroantigénio.AexpansãoclonaldoslinfócitosB,induzidapelapresençadoantigénio,determinaumaconcentraçãomáximadaquelascélulas,produtorasdeanticorposespecíficos,nobaçodoanimal2a3diasapósaadministraçãodoantigénio.
Paraoutrotipodeantigénios,previsivelmenteeliminadosdoorganismopormecanismosemqueosistemaimunitárionãodesempenhaopapelprincipal,comosãooscasosdemoléculashidrofóbicas,hidrofílicasdebaixopesomolecularoufracaantigenicidade,énecessáriorecorreràadiçãodeoutroscompostosqueiniciemarespostaimunitária(haptenos,“carriers”).
FusãoCelularAfusãoentreascélulasdeumamistura,destinadaaimortalizaroslinfócitosprodutoresdeanticorpos,podeocorrerespontaneamente,mascomumamuitobaixaprobabilidade.Paraaumentaressaprobabilidadeintroduzem-seoutrosagentesnamisturadecélulas.
Ascélulasdobaçodosanimaisimunizadossãorecolhidasemisturadascomcélulasdemieloma,damesmaespécieanimal,nãoprodutorasdeanticorposeportadorasdasmutaçõesHGPRT-ouTK-.Ascélulasdamistura,quandonapresençadeagentesfusogénicos,comoproteínasdovírusSendai,PEGoucampoeléctrico(electrofusão,electroporação),fundemosseusconteúdos,determinandooaparecimentodehíbridosintra-einterespecíficos.Aimortalizaçãodoslinfócitos,emparticularquandosetratadecélulasdeorigemhumana,podetambémserconseguidaportransformaçãocomvírustumorigénicos(EBV).
SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológicaApósoprocessodefusãoobtém-seumamisturadecélulasdediversostipos:linfócitosecélulasdemielomanãointervenientesemqualquerfusão,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumlinfócito,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumacélulademielomaehíbridosresultantesdafusãodecélulasdemielomacomlinfócitos.Nascondiçõesdeculturasubsequentesnãosobrevivemoslinfócitosoriginaiseoshíbridosentrelinfócitos,pornãoteremcapacidadeparacresceremculturanaausênciadosconvenientesfatoresdecrescimento.Ascélulasdemielomaeoshíbridosresultantesdefusõesentreestastambémnãopoderãosobreviver,dadoque,apesardepossuíremacapacidadedecresceremcultura,sãoportadorasdemutaçõesdasenzimasHGPRToudaTKe,napresençadeaminopterina,nãoconseguemsintetizarosprecursoresparaasíntesedoDNA.Sópodemcresceremculturaoshíbridosentrecélulasdemielomaelinfócitosquehajamadquiridoacapacidadedecresceremcultura,dosprimeiros,eacapacidadedesintetizarosprecursoresdoDNAatravésdasviasmetabólicasqueutilizamaHGPRTeaTK,provenientesdoslinfócitos.Sãooshibridomas.
Osmétodosimunológicosparaadeteção,quantificaçãoecaraterizaçãodasimunoglobulinasincluemaimunoprecipitação,ensaiosimuno-enzimáticos,imuno-radiométricosedeimuno-fluorescênciaecromatografias.Particularmentenoqueserefereàseleçãoinicialdoshibridomasresultantesdafusãoimpõe-seaadopçãodemétodosderápidaexecução,aplicáveisacentenasdeamostrasedecustosreduzidos.
Deentreoshibridomasresultantes,háqueidentificaraslinhascelularesprodutorasdeanticorposespecíficosdoantigénio.OsmétodosmaisfrequentementeutilizadosnestaseleçãoimunológicasãoaELISA("EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay"),RIA("RadioImmunoAssay"),IRMA("ImmunoRadio-MetricAssay"ou"Sandwich")eImuno-fluorescência.Ométododeprimeiraescolha,aELISA,baseia-senumafixaçãodoantigénioaumsuportesólidoseguidadoreconhecimentodestepelosanticorposproduzidospeloshibridomas.Apresençadosanticorposespecíficoséreveladaporoutrosanticorpos,específicosdaespécie(domíniosconstantesdasimunoglobulinas),econjugadoscomenzimascapazesdealterarascaraterísticascromáticasdeumsubstrato.Sãoselecionadasasculturascujossobrenadantesapresentemreaçãoenzimáticapositivanoensaio.
IMUNOLOGIA2016/17 9
ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutorasUmavezidentificadasasculturasprodutorasdosanticorposconvenientesháquepreservá-lase,frequentemente,caraterizá-lasantesdasuautilizaçãoparaaproduçãodosanticorposmonoclonais.
Apartirdomomentoemquepelaseleçãoimunológicasãodetectadoshibridomasprodutores,estasculturasdeverãosercongeladas,mesmoantesdaclonagem,paraevitarasuaperda.
Sendooshibridomascélulaspoliploides,têmumatendêncianaturalparasegregaroscromossomasquepossuememexcesso,razãopelaqualseriaconvenientemanterumapressãoseletivaparapreservaroDNAresponsávelpelasíntesedosanticorpos.Nãoexistindoqualquerantibióticooumetabolitoquepossaexercerestapressãoseletiva,amanutençãodaexpressãoéconseguidaatravésdaclonagem,processoparaisolamentoeexpansãodeumaculturaapartirdeumasócélula.
Ométodomaisexpeditoparaaclonagemdoshibridomaséaclonagempordiluiçãolimite,emqueaculturaédiluídaedistribuídapormicroplacasemconcentraçõesinferioresaumacélulaporpoço.Outrosmétodos,comoaclonagememagarosesãomenosfrequentementeutilizadosporquemaislaboriosos.
Oshibridomas,talcomooutrascélulaseucarióticasestabelecidasemcultura,podemconservar-seporcongelaçãoemazotolíquido,ondesemantémviáveisduranteváriosanos.
CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonaisAcaraterizaçãodoanticorpoobtidoconstituiumrequisitoessencialparaasuaconvenienteutilização.
Aisotipagem,queconsistenadeterminaçãodotipodeimunoglobulinapresente,obtêm-seporreaçãoimunológicacomanticorposdeoutraespécieanimalespecíficosdosdiferentestiposdecadeiasconstantesdemurganho(IgA,IgM,IgG1,IgG2,...).
Aespecificidadeepitópicarelativadediferentesmonoclonaiscontraomesmoantigéniodetermina-seporensaioimunológicoemquecomumaquantidadefixadadeantigéniosefazemreagirmisturasdeanticorposemdiferentespercentagensrelativas.Doisanticorposreconhecerãodiferentesepitoposseumamisturadosdoisoriginaumsinalsuperioraodequalquerdelesisolado,nasaturaçãodoantigénio.
Tambémaafinidaderelativadeumanticorpoparaoantigéniopoderáserrelevante.Determina-sefazendoreagiroantigénio,radioativamentemarcado,comumadeterminadaquantidadedeanticorpo.Oantigéniofixadoporunidadedemassadoanticorporefleteaafinidadeentreosdois,nascondiçõesexperimentaisusadas.Estaquantidadedeantigénio,quandoreferidaaunidadedevolumedosobrenadantedaculturadorespectivohibridoma,constituiumindicativodaprodutividadedestacultura.
Oconhecimentodascaraterísticasfísico-químicas,comoamassamoleculare/ouopontoisoeléctricopoderãoserimportantesparaodesenhodorespectivoprocessodepurificação.
Partindodelinhascelularesdehibridomasprodutores,osanticorposmonoclonaispodemobter-seporculturadecélulas“invitro”epurificaçãoapartirdosobrenadante(comrendimentosdaordemdos100µg/mL)ouapartirdeascitesesorosdeanimaisportadoresdetumoresinduzidospelainjeçãodosrespectivoshibridomas(rendimentosdaordemdos2mg/mL).
Sãométodosdeeleiçãoparaapurificaçãodeanticorposmonoclonaisascromatografiasdeafinidade,nomeadamentecomaProteínaASepharose,sesetratardeimunoglobulinastipoG,oucomoantigéniofixadoaumsuportesólido.
IMUNOLOGIA2016/17 10
EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais
IMUNOLOGIA2016/17 11
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS
1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)enasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.
Materialereagentes
¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos¾ Espectrofotómetro
Procedimento(porgrupo)
Diluiçõesdecimais
1. Marquemicrotubosde1a82. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8Solvente(mL) 0 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,5Corante(mL) 1,5 0,15 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,
namesmacuvete.Últimaamostra:controlo).
Diluiçõescentesimal
1. Marquetubosdeensaiode1a62. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos
IMUNOLOGIA2016/17 12
5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)
Diluiçõesdetrêsemtrês
1. Marquetubosdeensaiode1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Solvente(mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1,5Corante(mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamais
diluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete)
Diluiçãoúnica(TPC)
¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLde
cadaumadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:a. Diluiçãode5x102b. Diluiçãode5x10-2
Preparaçãodesoluções(TPC)
¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:
a. NaOH0,1Nb. SO4H20,1Nc. NaCl0,1Md. NaCl100mMe. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6)g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2)
Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.
IMUNOLOGIA2016/17 13
RegistodeObservaçõeseResultados
PIPETAGENSEDILUIÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Diluiçõesdecimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1 2 3 4 5 6 7 8
Diluiçõescentesimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1 2 3 4 5 6
Diluiçõesdetrêsemtrês Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentração
calculada Observações
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
IMUNOLOGIA2016/17 14
Gráfico
Observações:
IMUNOLOGIA2016/17 15
SOLUÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Componentes Peso/volume
Diluição5X102
Diluição5X10-2
NaOH0,1N(100mL)
H2SO40,1N(100mL)
NaCl0,1M(100mL)
NaCl100mM(100mL)
Glicerol10%(100mL)
Glucose10%(100mL)
Etanol70%(100mL)
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 16
2. TESTEÀIMUNIDADENATURAL
Materialereagentes
¾ SuspensãodeMicrococos¾ Sorofisiológicoestéril¾ Lisozimapó¾ Espectrofotómetroetubos¾ Pipetasemicropipetas¾ Placasdepetricomagarnutritivo
Procedimentoexperimental
TesteàLisozima(1grupoporturma)1. Preparar8diluiçõesdecimaisdelisozima,emmicrotubos:
Tubo L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10Lisozimapó(mg) 100 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) 1000 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900Diluição 2. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboL93. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana4. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma5. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadaamostraa540nm(tempo0)6. Incubara37ºC7. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.8. Expressarosresultadosemgráfico.
IMUNOLOGIA2016/17 17
TesteàSaliva(restantesgruposdaturma)1. Recolhercercade2.5mLdesalivaemplacadepetriesterilizada2. Preparardiluiçõesdecimaisdesaliva,emmicrotubos:Tubo S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6Saliva(µL) 1000 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) - 900 900 900 900 900 900Diluição 3. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboS54. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana5. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma6. Avaliarmortebacterianaporcultura:
a. Tomarparaeppendorfsnovos100µLdostubospar(S0;S2;S4;S6);b. Incubara37ºCdurante30minutosc. Inocularporespalhamentoemplacadeagarnutritivo;d. Incubara37ºCdurante,pelomenosumanoite;e. Contarcolónias
7. Avaliaramortebacterianapordensitometria:a. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadadiluição(S0;S1;S2;S3;S4;S5;S6)a
540nm(tempo0)b. Incubara37ºCc. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.
8. Expressarresultadosemgráfico.9. Avaliaraconcentraçãorelativadebactericidinasnasalivaporcomparaçãocomocontrolopositivo
delisozima
IMUNOLOGIA2016/17 18
Registoderesultados
TESTEÀIMUNIDADENATURAL
LISOZIMA Absorvência
Tempo(min)
L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10
0
10
20
30
40
SALIVA Absorvência
Tempo(min)
S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6
0
10
20
30
40
Crescimentobacteriano(nºcolónias)
S0 S2 S4 S6
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 19
3. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL
Materialereagentes
¾ Galinhas¾ Excipienteoleoso(AdjuvantedeFreund,Parafinalíquida)¾ Soluçãodeantigénio(BSAa10mg/mLemSF)¾ Seringaseagulhashipodérmicas
Procedimentoexperimental
Preparaçãodaemulsãoparaimunização
1. Adicionar5mLdesoluçãodeantigénioemtubodeensaio2. Adicionar5mLdeadjuvanteoleoso3. Misturarvigorosamente,comauxíliodeumaseringacomagulha4. Verificaroestadodaemulsãocomumagotasobreasuperfíciedeáguafria
(nãodevemisturar-sedeimediato)
Imunização
Dia1 Recolheramostradesangueparateste
Injetar1mLdeemulsãoporviasubcutâneaemdiversospontos(4a6picadas)
Dia15 Recolheramostradesangueparateste
Dia30 Recolheramostradesangueparateste
Repetirainjeçãodamesmaquantidadedeantigénioemulsionadoemadjuvanteincompleto
Dia45 Recolhersangueparaanálise
Dia60 Recolhersangueparaanálise
Registartodososdadosdeidentificaçãodosanimais,volumesdesangueesoro,datasdasoperaçõeseoutrasocorrências
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 20
4. RECOLHADESANGUE
PreparaçãodoSoro
Materialereagentes.
¾ Animaisimunizadose/ounãoimunizados(galinhas)¾ Seringasestéreis¾ Centrífuga¾ Microtubos¾ Azidadesódioa10%
Procedimentoexperimental
1. Picaraveiajugularouaveiadaasaetomaramostradesangueporaspiração(máximo2mL)2. Compensaroanimalcomsorofisiológicoestéril,senecessário3. Marcarotuboehomogeneizarosanguerecolhido.4. Aguardarde20a30minutosatemperaturaambiente5. Arrefecernofrigoríficodurante1hora6. Centrifugar4000rpmdurante10min7. Pipetaraté1mLdesoroporcadamicrotubodevidamenteidentificado8. Adicionarazidadesódioa0,02%final(sock100X)9. Conservarcongeladoa-20ºC.
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 21
PreparaçãodeEritrócitos
MaterialeReagentes
¾ Soluçãoanticoagulante(ACD):o Acidocítrico–4.0g/Lo Citratodesódio–22,6g/Lo D-Glucose–22.0g/L)o Autoclavar
¾ PBS-A¾ Seringas(2,5mL)eagulhaspararecolhadesangue¾ Centrífugadebaixarotação
Procedimentoexperimental
1. Pipetar300µLdesoluçãoACDparatubosEppendorf(2porgalinha)2. Tomarosanguevenosodaveiajugularoudaasadagalinha(até2,0mLporave)3. Removeragulhadaseringa4. AdicionarimediatamenteacadatuboACDcercade0,9mLdesangue5. Homogeneizarsuavementeporrotação6. Transferirosangueparatubodecentrífugacontendo10mLdePBS-A(pipetaPasteur)7. Centrifugar500gX10minutos8. Removerosobrenadante9. Lavarmaisduasvezesascélulascom10mLdePBS-A,homogeneizandosuavemente10. Ressuspenderosedimentodecélulascom5mLdePBS-A11. Avaliarhematócrito(10%v/v)12. Conservara4ºC
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 22
5. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(HUMANAS)
ColoraçãodeWright
Materialereagentes
¾ Sanguetotalcapilar,fresco¾ SoluçãodeWright(corante)¾ Soluçãotampão(6.63gKH2PO4;2.56gNa2HPO4;H2Oad.1L)¾ Lâminasdemicroscópionovas(lavadasedesengorduradas)
Procedimentoexperimental(individual)
(Trabalhoindividualaefetuarcomoprópriosangue)1. ColocarIgotadesanguefrescoa1/3daextremidadedalâmina2. Espalharuniformementeaamostracomauxíliodeoutralâmina(veresquema)3. Deixarsecaraoar4. CobriroesfregaçocomsoluçãocorantedeWright5. Deixaratuardurante2minutos6. Adicionarigualvolumedesoluçãotampão7. Homogeneizarmovimentandoocorantecomjactodeardepipeta8. Deixaratuardurante3a4minutos
(asmargensdeverãoapresentarumacoravermelhadaeocentroumbrilhometálicoesverdeado)9. Removerocoranteporlavagememáguacorrente.Lavaralâminacomáguadestilada10. Deixarsecaraoar.Observaraomicroscópio.Registarobservações,desenhandoeidentificandoos
diferentestiposdecélulas
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 23
6. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–PRECIPITAÇÃODIFERENCIAL
MaterialeReagentes
¾ Soroapurificar¾ SoluçãosaturadadeSulfatodeamónioemágua¾ PBS-A(pH7,2)
o 0,8%NaClo 0,02%KH2PO4o 0,144%Na2HPO4.2.H2O
¾ Microtubos¾ Mangadediálise
Procedimentoexperimental(porgrupo)
1. Pipetar500µLdesoroapurificarparamicrotubo2. Adicionar400µLdesulfatodeamóniosaturado(40-45%)3. Misturareconservarnogelodurante30minutos4. Centrifugar5minnaeppendorf5. Pipetarerejeitarosobrenadante6. Escorrerbemotubo7. Dissolverosedimentocom250µLdePBS8. DialisarcontraPBS-Acontendo0,02%deazidadesódio,pelomenosduranteumanoite9. Recuperaroconteúdodamangadediálise10. Congelara-20ºC.
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 24
7. IMUNOPRECIPITAÇÃO-QUALITATIVA
Testedoanel
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Glicerola10%¾ Microtubosdeensaioemvidro¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Equilibrartodasassoluçõesetubosa37ºC2. Pipetar200µLdesoroatestare/ouimunoglobulinasparaofundodotubo3. Adicionar20µLdeglicerol,homogeneizandocomapipeta4. Pipetar200µLdesoluçãodeantigénioparaasuperfíciedosoro,cuidadosamenteesemmisturar
asfases5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeumprecipitadoemanelnazonadainterfaceentreasduassoluções
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 25
Testeemlâmina
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Lâminasdemicroscópio¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Equilibrartodasassoluçõeselâminasa37ºC2. PipetarIgotadesoluçãodeantigénionocentrodeumalâmina3. PipetarIgotadesoroatestarsobreagotaprecedente4. Repetircomasimunoglobulinaspurificadas5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeprecipitado7. Registarobservação
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 26
8. IMUNOPRECIPITAÇÃO–QUANTITATIVA
Curvadeprecipitação
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar(diluídoa1:10)¾ Soluçãodeantigénio(1mg/mL)¾ PBS-A¾ Microtubos¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Preparardiluiçõesdoantigénio:10-0,3X10-1,10-1,3X10-2,10-2,3X10-3,PBS2. Pipetar200µLdesoroatestaremcadatubo3. Repartir200µLdecadadiluiçãoportubo4. Misturarnovortex5. Incubaremestufaa37ºCduranteumahora6. Centrifugar2minutos7. Observareregistarosníveisdeprecipitadoemcadatubo
(quantificarosprecipitadospordeterminaçãodoazotooupesagemdossedimentosapesoseco)8. Definiropontodeequivalênciadosororelativamenteaoantigénio
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 27
9. IMUNODIFUSÃO
Imunodifusãosimples
MaterialeReagentes
¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas
¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseparaerlenmeyerb. Adicionar9mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Adicionar1mLdesoluçãodeantigénio.Homogeneizar.e. Aplicarcuidadosamenteemcadalâminaumaquantidadequepermitaumaalturade
±2a3mm(5mLporlâminademicroscópio)f. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalg. CompipetaPasteurtruncadaperfuraraagarose(~1,5mmØ)em3locais
equidistantesecentrados.Removeroagarcortadoporaspiração2. Ensaio
a. Distribuirasamostrasdesorosouimunoglobulinasatestarpelosorifícios(~15µLporpoço)
b. Cobriralâminacomfilmeplásticotransparentec. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora
3. Observaraprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração(senecessário)
a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Observareregistarosresultados
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 28
Imunodifusãodupla(Ouchterlony)
MaterialeReagentes
¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas
¾ Soluçãodeantigénio10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseb. Adicionar10mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Aplicarcuidadosamenteemcadalâmina5mLdegel(±5mmdealtura)e. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalf. Perfuraraagarose,conformeàilustração(empontosequidistanteseseparadosde1
cmdoorifíciocentral).Aspiraroagarcortadocompipeta.2. Ensaio
a. Encheroorifíciocentralcomsoluçãodeantigéniob. Colocaremcadaumdosoutrosorifíciosvolumesiguaisdesoroatestare
imunoglobulinaspurificadas(nãodiluídoediluídoa1:10)c. Cobrirlâminacomfilmeplásticotransparented. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora
3. Observarlinhasdeprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração
a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Secaroagarcompapelabsorvente(compressãoprolongadacommúltiplascamadas
deabsorvente)5. Observareregistarosresultados
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 29
10. HEMAGLUTINAÇÃO
MaterialeReagentes
¾ Eritrócitosdegalinhalavados¾ Sorosatestar¾ Soluçãodeantigénio(10mg/mL)¾ PBS-A¾ Tubosdevidropequenosdefundoredondo
Procedimentoexperimental
1. Ressuspendersuavementeoseritrócitoslavados;2. Tomar1mLdesuspensãohomogéneaparatudodecentrífuga;3. Centrifugar500GX10minutos;4. Removererejeitarosobrenadante;5. Ressuspenderascélulascom1mLdePBS-A6. Porcadasoroatestar,marcar4tubosedistribuir:
1 2 3 4
PBS-A(µL) 200 100 100 -Suspensãodeeritrócitoslavados(µL) 200 200 200 200Soluçãoantigénio(µL) - - 100 100Soroatestar - 100 - 100
Controlocélulas
Controlosoro
Controloantigénio TESTE
7. Agitarsuavementeostubosparamisturaroconteúdo8. Repousaratemperaturaambienteatéàsedimentaçãodascélulas(verificarsedimentação
completaemtubo1)9. Observareregistarosresultadosemtodosostubos
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 30
11. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(RÁPIDO)
MaterialeReagentes
¾ Amostraatestar¾ Dispositivoimunocromatográficodescartável
Procedimentoexperimental
1. Tomarodispositivoedeixaraqueceràtemperaturaambiente2. AplicarIIIgotasdaamostraaestudarnoreceptáculodaamostra3. Observaramigraçãodaamostrapelamatriz4. Observaraformaçãodeumaouduasbandascoradas5. Registaraobservação
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 31
12. IMUNOELECTROFORESE
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa
10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV
(ouII)¾ Azidadesódio10%¾ Barbitaldesódio
(Veronal)0,2M
¾ Tampãobarbital(2X):- Barbitaldesódio0,2
M-50mL- HCl0,2M-6,0mL- H2Odestiladaad100
mLpH8,6
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescoranteo Ác.acéticoglacial10%o Metanol-50%
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
Preparaçãodogel
1. Pesar0.15gdeagarlavadoouagaroseparaerlenmeyer2. Adicionar5mLdeáguadestilada.Fundiremfornodemicro-ondas.Arrefeceracercade50ºC3. Adicionar5mLdeT.Barbital2X.Misturar.4. Posicionarperpendicularmenteàlâminaopenteparaformaçãodospoçosdeaplicação5. Aplicaremcadalâmina5mLdesoluçãodeagar1,5%6. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontal.Removeropente
Electroforese
1. Adicionaracadaamostradesoro20%deglicerol50%2. EncherosdepósitosdoseléctrodoseospoçosdogelcomT.Barbital3. Aplicaraamostradesoroatestarsobotampãodebarbitalemcadapoço4. Colocaralâminanatinadeelectroforese.5. FazeraspontesentreoseléctrodoseogelcompapeldefiltroembebidonoT.Barbital6. Cobriralâminacomlarfilm,sembolhasdear7. Aplicaracorrenteeléctrica(8mAporlâmina)durante30minutos8. Removeralâminaecorar
Coloração
1. CorarogelcomazuldeCoomasie2. Diferenciaremsoluçãodescorante.3. LavaremPBS4. Observareregistarosresultados
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 32
13. ELISA(ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY)
“Checkerboard"
Materialereagentes
¾ MicroplacasparaELISA(2X8poços)
¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL(BSA)
¾ Soroatestar¾ 2°.Anticorpo
Soroanti-galinhaconjugadocomperoxidase(diluídoemTampãodebloqueio1:5000)
¾ TampãodeFixaçãopH9,6-0,159%Na2CO3-0,293%NaHCO3-0,02%NaN3
¾ TampãodeBloqueio-5%LeiteempódesnatadoemPBS-A
¾ TampãodeLavagempH7,2-0,8%NaCl-0,02%KH2PO4-0,144%Na2HPO4.2.H2O-0,05%Tween20
¾ TampãodeSubstratopH5,0-1,118%Na2HPO4-0,56%Ácidocítrico
¾ SoluçãoOPD(extemp.)OPD(O-fenileno-diamina)-20mgH2O2-10μlTampãodesubstrato--60mL
¾ 4NH2SO4
Procedimentoexperimental
1. Marcar8tuboseppendorf(1a8)2. Fazerdiluições:
Tubo(filas) 1 2 3 4 5 6 7 8Tampãodefixação(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1Antigénio–BSA10mg/mL(mL) 0,5 - - - - - - -Soluçãoprecedente(mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
3. Usartodosospoços(de1a8)detrêsfilas(A...H)deumamicroplaca4. Distribuir100µLdecadadiluiçãoparaorespectivopoçodecadaumadastrêsfilasdamicroplaca
(exemplo:colunasA,B,C;poçosdasfilas1a8)5. Anotarasdiluiçõesdeantigéniodecadapoçoutilizado6. Incubar4ºCdurante,pelomenos,24horas,aoabrigodadissecação7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez8. Fazerasdiluiçõesdosoroausar:
Tubo(colunas) A B CTampãodebloqueio(μl) - 900 900Soroatestar(μl) 1000 100 -Soluçãoprecedente(μl) - - 100
9. Distribuir100µLdecadatuboparaospoçosrespectivosdastrêscolunasdamicroplaca10. Incubar37ºCdurante30minutos(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação11. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez12. Distribuir100µLdasoluçãodo2ºAnticorpoporcadapoçodamicroplacautilizado(Cadagrupo
utilizadiferentessoluçõesdiluídas-1:1000;1:2000;1:5000;1:7500;1:10000)13. Incubar37ºCdurante30minutos,aoabrigodadissecação14. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez
IMUNOLOGIA2016/17 33
15. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço16. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,observandoatéaosurgimento
decornalgunsdospoços17. Adicionar50µLdeH2SO4emcadapoço18. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura
autónoma)19. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço20. DefinirasmelhoresconcentraçõesdeantigénioeanticorpoausarnotestedeELISAarealizarcom
ossorosdecadagrupo
IMUNOLOGIA2016/17 34
Registoderesultados
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 35
Teste
Materialereagentes
(osmesmosqueparaCheckerboard)¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ Soroatestar¾ 2ºAnticorpo-GACIG-HRPO
Diluircadasoluçãodeacordocomosresultadosdaexperiênciaanterior
Procedimentoexperimental
1. Diluiroantigéniodeacordocomaavaliaçãoefetuadano“checkerboard”.2. Distribuir100µLdesoluçãodeantigénioporpoçodemicroplaca3. Incubar4ºCdurante,pelomenos24horas,aoabrigodadissecação4. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez5. Distribuir200µLdeTampãodeBloqueioporpoço.6. Incubardurante30minutosa37ºC7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez8. Preparardiluiçõessequenciaisde3em3decadasoroatestar:Amostra(poço) 1(B) 2(C) 3(D) 4(E) 5(F) 6(G) 7(H)T.Bloqueio 120 120 120 120 120 120 120Soroatestar - 60 Diluiçãoanterior - - 60 60 60 60 609. NospoçosdafilaAaplicar100µLdeTampãodebloqueio10. NospoçosdafilasBaHaplicar100µLdasdiluiçõesdosoroatestar(conformetabela)11. Fazerréplicas(repetirpassos8a10emcolunasdiferentes)12. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação13. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez14. Distribuir100µLdasoluçãodiluídado2°.Anticorpoporcadapoçodamicroplaca15. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação16. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez17. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço18. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,atéaoaparecimentodecor
nalgunspoços19. Adicionar50µLdeH2SO4porpoço20. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura
autónoma)21. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço22. Avaliartítuloaproximadodosoro(últimadiluiçãopositivadiferentedocontrolonegativo)
IMUNOLOGIA2016/17 36
Registoderesultados
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Observações
IMUNOLOGIA2016/17 37
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
MÉDIADOSRESULTADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Amostra:_________________________
Títulosdossoros.
Pré-imune
15dias
30dias
45dias
60dias
IMUNOLOGIA2016/17 38
RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA
CarlosSinogas